CN110393801A

CN110393801A - 靶向促黄体生成素促进机体造血的应用

Info

Publication number: CN110393801A
Application number: CN201810374931.6A
Authority: CN
Inventors: 周波; 彭义
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for excellence and innovation of molecular cell science, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2019-11-01

Abstract

本发明提供了靶向促黄体生成素促进机体造血的应用，具体地，本发明提供了一种促黄体生成素或其受体的抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于促进哺乳动物成年后的机体造血。本发明的特定的性激素即促黄体生成素LH及其相应受体(Lhcgr)可有效地调控成年后HSC细胞的稳态和功能。

Description

靶向促黄体生成素促进机体造血的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及靶向促黄体生成素促进机体造血的应用，尤其是通过靶向促黄体生成素及其受体来促进机体造血。

发明背景

众所周知，对于哺乳动物等高等生物而言，在不同的发育阶段，基因的表达是不同的。一些研究表明，在不同的发育阶段以及在不同的病理状态下，血液中的各类细胞受到的调控因素是有所区别的或截然不同的。

以造血干细胞(HSCs)为例，HSC是一种能够自我更新的多能性祖细胞，在正常发育阶段及损伤过程中，它能生成所有血液谱系的细胞。在整个生命过程中，造血干细胞的多种特性会呈现时序性的变化，比如其转录图谱，自我更新能力，细胞周期状态及分化潜能。在小鼠胚胎发育第10.5天，主动脉-性腺-中肾区(AGM)是前体造血干细胞(pre-HSCs)的来源，随着发育过程的进行，前体造血干细胞在胚胎发育第11.5天迁移至胎盘和胎肝。此后，直至骨髓造血系统建立，胎肝成为造血干细胞扩增和成熟的主要器官。大部分胚胎造血干细胞都保持自我更新能力并不断进入细胞周期，它们通过不对称分裂的方式持续地扩增造血干细胞池。在进入骨髓后，HSCs仍保持高速扩增，直到出生后三周，其数量开始维持稳定。成年后，骨髓中的造血干细胞则处于静息状态，它们以缓慢分裂的方式维持适宜大小的造血干细胞池。

在发育过程中，细胞自主性机制参与了造血干细胞发育变化的调控。多个基因被证实是胚胎造血干细胞自我更新的必需因素，而它们并不作用于成体造血干细胞。表达于胚胎造血干细胞的转录因子Sox17在成体干细胞中不表达，而它是胚胎及新生造血干细胞维持的必需因子。在成体造血干细胞中，原位表达Sox17可以有效增强成体造血干细胞的自我更新能力并提高胚胎造血干细胞相关基因的表达⁸。与此相反，许多其它基因，如Bmi1，Gfi，Tel/Etv6和C/EBPa等，则只为成体造血干细胞功能维持所必需。HSC特征在不同发育阶段出现时序性变化，这一领域一个关键的基础问题是：外源性的因子是否同样参与了这些特征转变的时序调节以及其起始、维持的调控。

目前，虽然有一些药物能够用于上调或下调部分血细胞或HSC，然而仍存在一些不足，例如存在某些副作用，或对于成年后的机体造血的影响有限或很小。例如，某些性腺分泌的性激素对于成年后机体造血的几乎没有影响。

因此，本领域迫切需要开发新的能够有效调控成年后哺乳动物的机体造血的活性物质及其应用方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的能够有效调控成年后哺乳动物的机体造血的活性物质及其应用方法。

在本发明的第一方面，提供了一种促黄体生成素或其受体的抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于促进哺乳动物成年后的机体造血。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于(i)增加稳态情况下的淋巴细胞的数量；和/或(ii)加速骨髓移植后的淋巴组织的恢复。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括患病和非患病的哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)。

在另一优选例中，所述的促进机体造血包括促进HSC细胞、促进白细胞、促进MPP细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体以及(a1)促黄体生成素LH的抑制剂；和/或(a2)促黄体生成素受体Lhcgr的抑制剂。

在另一优选例中，所述组分(a1)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％,较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。

在另一优选例中，所述组分(a2)占所述药物组合物总重量的60.0％-99.5wt％，较佳地70.0-99.5wt％，更佳地80.0％-99.5wt％。

在另一优选例中，所述促黄体生成素LH的抑制剂选自下组：促黄体生成素受体Lhgcr的胞外可溶片段、抗体、小分子化合物、反义核酸、或其组合。

在另一优选例中，所述促黄体生成素LH的抑制剂选自下组：地加瑞克(Degarelixacetate)、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide acetate)、亮丙瑞林(Leuprorel in)、或其组合。

在另一优选例中，所述促黄体生成素受体Lhgcr的抑制剂包括：阻断抗体、小分子化合物、反义核酸、或其组合。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。

在另一优选例中，所述的组合物为液态组合物。

在另一优选例中，所述组合物为口服制剂。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物或制剂在促进哺乳动物成年后机体造血的应用中，可单独使用，或联合使用。

在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其它促进哺乳动物成年后机体造血的药物联合使用。

在另一优选例中，所述促黄体生成素的直接作用靶点是骨髓内造血干细胞。

在另一优选例中，所述促黄体生成素受体Lhcgr的表达在造血干细胞HSCs和多潜能祖细胞MPPs。

在本发明的第二方面，提供了一种组合物，包括：

(a1)用于促进成年后机体造血的第一活性成分，所述第一活性成分为促黄体生成素抑制剂；

(a2)用于促进成年后机体造血的第二活性成分，所述第二活性成分为促黄体生成素受体抑制剂；和

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为1:100至100：1，较佳地为1:10至10：1。

在另一优选例中，所述产品组合中，所述组分(a1)和组分(a2)占所述产品组合总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述组合物还包括其它促进成年后机体造血的药物。

在本发明的第三方面，提供了一种用于促进成年后机体造血的药盒，包括：

(i)第一容器，以及位于第一容器中的用于促进成年后机体造血的第一活性成分(a1)促黄体生成素LH抑制剂，或含有活性成分(a1)的药物；和

(ii)第二容器，以及位于第二容器中的用于促进成年后机体造血的第二活性成分(a2)促黄体生成素受体Lhcgr的抑制剂，或含有活性成分(a2)的药物。

在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含促黄体生成素LH抑制剂的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含促黄体生成素受体Lhcgr的抑制剂的单方制剂。

在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了给予活性成分(a1)和/或(a2)从而促进成年后机体造血的说明。

在本发明的第四方面，提供了一种筛选或确定促进成年后机体造血的潜在治疗剂的方法，包括步骤：

(i)在测试组中，在培养体系中，在存在测试化合物并外源加入促黄体生成素LH的情况下，培养表达Lhcgr的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的LH和Lhcgr结合的复合物的含量C1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的LH和Lhcgr结合的复合物的含量C2；和

(ii)将上一步骤所检测的C1、C2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是促进机体造血的潜在治疗剂；

其中，如果C1显著低于C2，则表示所述测试化合物是促进机体造血的潜在治疗剂。

在另一优选例中，所述“显著低于”指C2/C1≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述方法是非治疗性的和非诊断性的。

在另一优选例中，所述时间T1的范围是4至7天。

在另一优选例中，所述培养细胞是造血干细胞HSC或造血祖细胞MPP。

在本发明的第五方面，提供了一种筛选或确定促进成年后机体造血的潜在治疗剂的方法，包括步骤：

(i)向模型小鼠施用待测试化合物，一段时间T2后，检测模型小鼠体内促黄体生成素LH的含量C3与促黄体生成素受体Lhgcr的含量C4；

并且在不存在所述测试化合物且其它条件相同的对照组中，检测对照组所述促黄体生成素LH的含量C5与促黄体生成素受体Lhgcr的含量C6；和

(ii)将上一步骤所检测的C3与C5，C4与C6分别进行比较，从而确定所述测试化合物是否是促进机体造血的潜在治疗剂；

其中，如果C3显著低于C5，和/或C4显著低于C6，则表示所述化合物是促进机体造血的潜在治疗剂。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指C5/C3≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指C6/C4≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述方法是非治疗性的和非诊断性的。

在另一优选例中，所述时间T2的范围是2至4周。

在另一优选例中，所述施用包括口服、注射或外用。

在本发明的第六方面，提供了一种促进成年后机体造血的方法，包括步骤：给需要的对象施用(a)促黄体生成素LH的抑制剂；和/或(b)促黄体生成素受体Lhcgr的抑制剂，本发明第二方面所述的组合物或本发明第三方面所述的药盒。

在另一优选例中，所述方法用于非诊断和非治疗性目的。

在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。

在另一优选例中，所述促黄体生成素LH的抑制剂的施用剂量0.1-200mg/kg体重，较佳地为1-100mg/kg体重，最佳地为10-30mg/kg体重。

在另一优选例中，所述促黄体生成素受体Lhcgr抑制剂的施用剂量0.1-100mg/kg体重，较佳地为1-50mg/kg体重，最佳地为5-20mg/kg体重。

在另一优选例中，所述促黄体生成素LH的抑制剂施用频率为0.1-3次/天，较佳地为1天/次。

在另一优选例中，所述促黄体生成素LH抑制剂施用时间为7-28天，较佳地为14-28天，最佳地为21-28天。

在另一优选例中，所述促黄体生成素受体Lhcgr抑制剂施用频率为0.1-3次/天，较佳地为1天/次。

在另一优选例中，所述促黄体生成素受体Lhcgr抑制剂施用时间为7-28天，较佳地为14-28天，最佳地为21-28天。

在另一优选例中，所述促黄体生成素LH抑制剂与促黄体生成素受体Lhcgr抑制剂同时或先后施用。

在本发明的第七方面，提供了一种促黄体生成素或其促进剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于下调成年后哺乳动物机体内的白细胞。

在另一优选例中，所述的“下调”指下调白细胞的数量和/或频率。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于抑制炎症反应。

在另一优选例中，所述白细胞选自下组：单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述制剂或组合物中，含有促黄体生成素和/或其促进剂作为活性成分。

在另一优选例中，所述的促黄体生成素和/或其促进剂对所述成年后哺乳动物的红细胞或血小板的总数基本上无变化。

在另一优选例中，所述的LH促进剂包括：促黄体生成素释放激素(LHRH)。

在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体以及(b)促黄体生成素或其促进剂。

在另一优选例中，所述组分(b)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％,较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。

在另一优选例中，所述的组合物为液态组合物。

在另一优选例中，所述组合物为口服制剂。

在另一优选例中，所述组合物或制剂在下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的应用中，可单独使用，或联合使用。

在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其它下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的药物联合使用。

在本发明的第八方面，提供了一种药盒，包括：

(i)第一容器，以及位于所述第一容器中的用于下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的活性成分(a)促黄体生成素或其促进剂，或含有活性成分(a)的药物；

(ii)说明书，所述说明书中记载了给予活性成分(b)从而下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的说明。

在本发明的第九方面，提供了一种筛选或确定下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的潜在治疗剂的方法，包括步骤：

(i)在测试组中，在培养体系中，在存在测试化合物并外源加入促黄体生成素LH的情况下，培养表达Lhcgr的细胞一段时间T3，检测测试组所述培养体系中的LH和Lhcgr结合的复合物的含量C7；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的LH和Lhcgr结合的复合物的含量C8；和

(ii)将上一步骤所检测的C7、C8进行比较，从而确定所述测试化合物是否是下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的潜在治疗剂；

其中，如果C7显著高于C8，则表示所述测试化合物是下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的潜在治疗剂。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指C7/C8≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述时间T3的范围是4-7天。

在另一优选例中，所述方法是非治疗性的和非诊断性的。

在本发明的第十方面，提供了一种筛选或确定下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的潜在治疗剂的方法，包括步骤：

(i)向模型小鼠施用待测试化合物，一段时间T4后，检测模型小鼠体内促黄体生成素LH的含量C9与促黄体生成素受体Lhgcr的含量C10；

并且在不存在所述测试化合物且其它条件相同的对照组中，检测对照组所述促黄体生成素LH的含量C11与促黄体生成素受体Lhgcr的含量C12；和

(ii)将上一步骤所检测的C11、C12进行比较，从而确定所述测试化合物是否是下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的潜在治疗剂；

其中，如果C9显著高于C11，和/或C10显著高于C12，则表示所述化合物是下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的潜在治疗剂。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指C9/C11≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指C10/C12≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述方法是非治疗性的和非诊断性的。

在另一优选例中，所述时间T4的范围是2-4周。

在另一优选例中，所述施用包括口服、注射或外用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图简要说明

图1显示了在出生四周后，骨髓内HSC数量达到稳定。

图2显示了造血系统中性激素的表达情况

图3显示了Lhcgr的表达高度局限于HSCs和MPPs

图4显示了性激素敲除不影响成年后骨髓造血或HSC稳态

图5显示了Lhcgr敲除增加了8周龄小鼠骨髓中HSC的数量和造血，而对4周龄小鼠没有产生影响。

图6显示了HSCs是骨髓中LH的直接作用靶点

图7显示了Lhcgr敲除导致外周血中白血球增多

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地发现，一种特定的性激素即促黄体生成素LH及其相应受体(Lhcgr)可有效地调控成年后HSC细胞的稳态和功能，而性腺分泌的各种性激素则对成年后HSC细胞的稳态和功能无影响。实验表明，通过LH抑制剂或Lhcgr抑制剂，或者通过Lhcgr基因的下调或敲除，可促进成年后造血干细胞数量和频率(frequency)的大幅上升；此外，还可有效促进血液谱系的重构，尤其是可显著促进嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞等的上升。因此，通过阻断促黄体生成素信号通路，可导致机体造血干细胞数量上升以及造血能力增强。在此基础上完成了本发明。

术语

造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)

造血干细胞(HSCs)是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。

造血干细胞有两个重要特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化成所有类型的血细胞。造血干细胞采用不对称的分裂方式：由一个细胞分裂为两个细胞。其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性，从而保持身体内干细胞数量相对稳定，这就是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各类血细胞、前体细胞和成熟血细胞，释放到外周血中，执行各自任务，直至衰老死亡，这一过程是不停地进行着的。

造血干细胞是能自我更新、有较强分化发育和再生能力、可以产生各种类型血细胞的始祖细胞。造血干细胞来源于红骨髓，可以经血流迁移到外周血液循环中，不会因献血和捐献造血干细胞而损坏造血功能。

促黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)

促黄体生成素(LH)由腺垂体细胞分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，它在青春期之初由垂体腺分泌，能促进雄性和雌性生殖系统的成熟，并且它可促进胆固醇在性腺细胞内转化为性激素。对于女性来说，与促卵泡激素(FSH)共同作用促进卵泡成熟，分泌雌激素、排卵，以及黄体的生成和维持，分泌孕激素和雌激素。对于男性来说，促黄体生产素促成睾丸间质细胞合成和释放睾酮。

本发明首次发现，骨髓内造血干细胞的数量在出生四周后达到稳态，促黄体激素参与了这个时期内造血干细胞稳态的调控，而下游的性激素则没有在此过程中发挥相关作用。

在本发明中，提供了关键性的证据显示骨髓造血干细胞是促黄体生成素信号的直接作用靶标，敲除促黄体生成素受体将对HSC的自我更新产生直接影响。同时，本发明人发现促黄体生成素信号能够防止出生后骨髓HSC过度扩增，这一“刹车”信号确保了成年后骨髓造血干细胞数量的稳定，通过阻断促黄体生成素信号通路，机体造血干细胞数量上升，造血能力增强。这一系列实验证据提示LH信号通路可以作为潜在的分子靶标提高机体造血功能。

如本文所用，术语“促黄体生成素”、“LH”、“促黄体生成素(LH)”可互换使用。

促黄体生成素受体(Lhcgr luteinizing hormone/choriogonadotropinreceptor,Lhcgr)是指细胞表面能够与促黄体生成素结合并引起细胞功能变化的蛋白质。

本发明首次发现，当促黄体生长素受体Lhcgr被敲除后，造血干细胞的数量在出生四周后仍然保持增长，最终导致骨髓中造血干细胞过多以及外周血白细胞增生。在造血谱系内，Lhcgr的表达高度局限于造血干细胞及多能性祖细胞中，在造血系统中敲除Lhcgr能高效地阻断促黄体生长素对造血干细胞的作用。

如本文所用，术语“促黄体生成素受体”、“Lhgcr”、“促黄体生成素受体(Lhgcr)”可互换使用。

性激素

性激素是内分泌细胞制造的。性激素在分子水平上的作用方式，与其他甾体激素一样，进入细胞后与特定的受体蛋白结合，形成激素-受体复合物，然后结合于细胞核，作用于染色质，影响DNA的转录活动，导致新的、或增加已有的蛋白质的生物合成，从而调控细胞的代谢、生长或分化。性激素为小分子物质，具有脂溶性，主要通过自由扩散(被动运输)进入细胞内，与胞浆受体结合，形成激素-胞浆受体复合物，通过构象变化和热休克蛋白解离获得进入细胞核内的能力，并由胞浆转移至核内，激素与核内受体结合，形成激素-核受体复合物，从而激发DNA的转录过程，生成特异mRNA，然后进入胞浆，在核糖体内翻译形成蛋白质，发挥生物效应。

激素的作用是从激素与受体结合开始的。靶细胞介导激素调节效应的专一性激素结合蛋白，称为激素受体。受体一般是糖蛋白，有些分布在靶细胞质膜表面，称为细胞表面受体；有些分布在细胞内部，称为细胞内受体。性激素与受体有很高的亲和力，因而性激素可在极低浓度水平与受体结合，引起调节效应。而且激素是通过调节酶量与酶活发挥作用的，可以放大调节信号。激素效应的强度与激素和受体的复合物数量有关，所以保持适当的激素水平和受体数量是维持机体正常功能的必要条件。

本发明意外地发现，全身性激素，尤其是性激素，参与了造血系统的调节。而受促黄体生成素调控的下游性激素，并不会参与到骨髓内造血干细胞的自我更新和造血稳态的调控。

在雌雄啮齿动物中，分别进行卵巢摘除和阉割来阻断性激素的分泌会导致B淋巴细胞增殖。与此一致，敲除雌激素或雄激素受体同样会导致B淋巴细胞增殖。此外，性激素对上游造血祖细胞也具有调控作用，卵巢摘除或雌激素受体alpha(Esr1)敲除会导致骨髓内短期造血干细胞和淋巴祖细胞数量增加。尽管HSCs不表达雄性激素受体和孕酮受体，阉割会导致中年小鼠中功能性造血干细胞数量增多，这提示HSCs可能受到这一过程的间接性影响。此外，Esr1被发现在长期造血干细胞(LT-HSCs)中表达。雌性激素可以通过Esr1依赖性途径促进怀孕雌鼠中HSC的增殖，这一现象显示性激素对干细胞能产生直接作用。然而，Esr1敲除对骨髓内HSCs的自我更新并没有显著性影响。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：促黄体生成素抑制剂和促黄体生成素受体抑制剂。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳地0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明的主要优点包括：

1)本发明首次发现，促黄体生成素或其受体的抑制剂可有效促进哺乳动物成年后机体造血。

(2)本发明首次发现，抑制促黄体生成素及其受体的结合可有效促进哺乳动物成年后机体造血。

(3)本发明首次发现，促黄体生成素或其受体的促进剂可显著下调成年后哺乳动物机体内的白细胞。

(4)促黄体生成素抑制剂均是临床认可安全的药物。

(5)血液中促黄体生成素水平易于检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

通用方法

小鼠：野生型小鼠，Lhcgr^+/+和Lhcgr^-/-小鼠由中国科学院上海生物化学和细胞研究所动物平台进行饲养管理。对于BrdU细胞增殖检测实验，小鼠以每6g体重注射1mg Brdu的剂量接受腹腔注射，随后以含有1mg/ml BrdU的饮用水进行持续喂养维持给药。对于雄性小鼠阉割，小鼠阴囊切开后，睾丸和相连的睾丸脂肪垫从切口拉出，吸收性缝线(4-0chromic gut)用来进行结扎，随后阴囊切口用非吸收性的手术缝合线(3-0Tevdek II)进行缝合。对于雌性小鼠卵巢切除，小鼠肋骨后边缘尾部靠近背中线附近的毛发被剃除，进行切口后，双侧卵巢暴露，吸收性缝线(4-0chromic gut)用来分离、结扎卵巢，随后卵巢被切除，非吸收性手术缝合线(3-0Tevdek II)用来缝合切口。假手术组(Sham-treated)小鼠接受同样的手术操作，但生殖腺未经切除并保持完整。对促黄体生长素给药，每只小鼠接受连续14天的重组hLH注射(5IU/只/天)。对于NAC给药，新配置的NAC以80mg/kg的剂量进行小鼠皮下注射。所有的小鼠实验流程均经过所内动物管理使用委员会批准。

流式细胞分析：骨髓细胞由25G的针头从骨髓中吹出并分散成单细胞悬液，随后经40微米尼龙网过滤至干净流式细胞管中。HSCs识别利用多种抗体联合染色，包括：anti-CD150(TC15-12F12.2),anti-CD48(HM48-1),anti-Sca1(E13-161.7),anti-c-kit(2B8)andlineage antibody cocktail(anti-Ter119(TER-119),anti-B220(6B2),anti-Gr-1(8C5),anti-CD2(RM 2-5),anti-CD3(17A2),anti-CD5(53-7.3)and anti-CD8(53-6.7))。DAPI用来区分死细胞。抗体均购自eBoiscience或Biolegend公司。对于Lhcgr抗体(Santa Cruz)染色，细胞经0.01％多聚甲醛固定十五分钟，随后使用含0.5％Triton-X的PBS进行通透处理再进行下一步的染色。

长期竞争性重构实验：成年的受体小鼠分别接受RS2000X-ray辐照仪两次相隔两小时，单次剂量为540rad的辐照处理。骨髓细胞经眼静脉窦注射移植进麻醉后的受体小鼠。受体小鼠定期进行采血以测定供体来源血液细胞的比例。用来进行细胞染色分析所使用的抗体包括：anti-CD45.2(104),anti-CD45.1(A20),anti-Ter119(TER-119),anti-Gr-1(8C5),anti-Mac-1(M1/70),anti-B220(6B2),and anti-CD3(KT31.1)。

实时定量PCR：细胞经分选后直接加入Trizol(Life Technologies)抽提RNA。RNA使用SuperScript III Reverse Transcriptase(Life Technologies)进行反转。实时定量PCR利用SYBR green探针在罗氏公司LightCycler 96 system平台上完成。

所用引物序列见下表。

骨骼切片，免疫荧光染色，共聚焦成像：新分离的骨头利用4％多聚甲醛固定过夜后在10％的EDTA中进行3天的脱钙处理。骨骼切片在CryoJane tape-transfer system(Instrumedics)平台完成，随后利用anti-CD41-APC(eBioscience,clone eBioMWReg30,1:200),goat-anti-c-kit(R&D,1:400),rabbit-anti-Lhcgr(Santa Cruz,1:50),rabbit-anti-laminin(Abcam,1:400)等抗体进行染色。Donkey-anti-goat Alexa Fluor 488,Donkey-anti-rabbit Alexa Fluor 555等作为二抗进行二次染色。anti-fade prolonggold(Life Technologies)用来封片，成像分析利用Leica SP8共聚焦显微镜完成。

实施例1：骨髓HSCs保持连续扩增状态直至出生后四周

本实施例聚焦于出生后调控骨髓HSCs发育性变化的相关机制。出于这个目的，本发明人首先测定了出生后不同时间点骨髓细胞的总量和HSC的数量。在出生后一周，两根股骨和两根胫骨总共有12±2.5×10⁶细胞，随后骨髓内细胞数量逐渐增长直至小鼠成熟(图1，A)。在小鼠出生八周后，这一数量增长至95±12×10⁶并在小鼠此后的生命周期内基本保持稳定。通过流式细胞分析，本发明人测得小鼠出生后一周，骨髓内CD150⁺CD48^-Lineage^-Sca-1⁺c-kit⁺HSCs频率为每1,000,000骨髓细胞含217±45个HSCs，这一频率在小鼠达到4周龄之前没有出现明显减少(图1，B)。小鼠出生八周后，HSC频率减少至每1,000,000骨髓细胞93±11个，此后这一数值达到稳定。两根股骨和两根胫骨的HSC总量在小鼠出生一周后为2.7±1.0×10³，这一数量逐渐增长，在小鼠出生四周后最终达到7.8±1.7×10³，并在此后整个生命过程中保持稳定(图1，C)。因此，小鼠骨髓内细胞总量在小鼠出生八周后达到稳态，小鼠骨髓内HSC的数量在小鼠出生后四周达到稳态。

为了精确比较4周龄和8周龄小鼠骨髓内功能性HSCs的数量和频率，本发明人进行了长期竞争性重构实验。首先将4周龄和8周龄小鼠等量的骨髓细胞(300,000个)各自和500,000个与受体基因型相同的竞争骨髓细胞移植进辐照过的受体小鼠。结果显示，与8周龄小鼠相比，来自4周龄小鼠的供体骨髓细胞能够显著地进行更高水平的全造血谱系重构(图1，H)。这一结果与此前观察到的4周龄小鼠HSCs频率高于8周龄小鼠一致(图1，B)。

随后，本发明人收集了相同比例(0.5％)的4周龄小鼠和8周龄小鼠的骨髓细胞，各自和500,000个与受体基因型相同的竞争骨髓细胞移植进辐照后的受体小鼠。在这一情况下，来自4周龄和8周龄小鼠的骨髓细胞在受体小鼠中呈现了相同的造血谱系重构能力(图1，D)。这些数据显示4周龄和8周龄小鼠含有相同数量的功能性造血干细胞，和此前的HSCs流式细胞分析结果相吻合(图1，C)。

本发明人进行了白血球、红血球、血小板的全血细胞计数。结果显示，白血球的数量和骨髓细胞总量高度相关，它们在出生8周后均达到稳态(图1，E)。相反，从出生后3周到24周，红血球的数量没有出现明显的变化(图1，F)。在出生后6周左右，血小板的数量达到稳定(图1，G)。

实施例2：造血干/祖细胞表达多种性激素受体

本实施例检测了HSCs，限制性祖细胞，终端分化血液细胞中性激素受体的表达情况。雌激素受体α(由Esr1编码)在造血干细胞，多能造血祖细胞(MPPs)，造血祖细胞(HPCs)，髓系共同祖细胞(CMPs)，粒单系造血祖细胞(GMPs)和淋巴系共同祖细胞(CLPs)中高表达，而在巨核系-红系祖细胞，红系细胞，髓系细胞，B细胞和T细胞中不表达(图2，A)。相反，雌激素受体β(由Esr2编码)在所有细胞群内都只显示本底表达水平(图2，B)。孕酮受体(Pgr)在HSCs,MPPs以及一些限制性祖细胞中低表达，但在终端分化的血液谱系细胞中不表达(图2，C)。雄激素受体(Ar)在HSCs或MPPs中不表达，但是在HPCs和CLPs中表达(图2，D)。这些数据显示雌激素和孕酮可能对HSC性质有着直接影响。

实施例3：在血液系统里，Lhcgr表达局限于HSCs和MPPs

促黄体激素(LH)同样与青春期的起始有关，其对雌雄小鼠性腺发生均有重要作用。对小鼠进行LH释放激素抑制剂给药会增加稳态情况下淋巴细胞的数量，同时也可以加速骨髓移植后淋巴组织的恢复，这些研究显示LH在造血系统中有着关键作用。然而，本发明人发现在成年小鼠中，只有原始HSCs和MPPs表达Lhcgr，在淋巴细胞和淋巴系祖细胞中均检测不到Lhcgr的表达(图3，A)。同时，Lhcgr在HSCs中的表达没有出现性别异质性(图3，B)。这些数据提示LH信号以直接作用于干细胞的方式来调控造血过程。

为了调查不同造血阶段Lhcgr的表达变化，本发明人从胎肝(E16.5)和出生后不同发育阶段的小鼠骨髓中纯化分离了HSCs，分析Lhcgr的相对表达水平。本发明人发现，胎肝HSCs只表达本底水平的Lhcgr，而4周龄小鼠骨髓HSCs中Lhcgr的表达水平显著高于胚胎HSCs(图3，C)。Lhcgr的表达水平保持持续增长，直至出生后8周趋于稳定(图3，C)。这些数据显示，出生后，HSCs中Lhcgr的表达被激活，性成熟后其表达水平达到峰值。

本发明人同样检测了骨髓HSCs中Lhcgr蛋白的表达情况。骨髓细胞经固定和通透后进行流式细胞分析，结果显示82％±8.3％的HSCs表达Lhcgr(图3，D)。股骨的共聚焦成像分析显示，只有极少的具有造血细胞样形态的骨髓细胞可以染上抗Lhcgr抗体(图3，E)。大部分Lhcgr阳性细胞处在离VE-cadherin阳性血管10微米的距离以内，这和HSCs靠近血管附近的物理定位是一致的(图3，F)。

实施例4：卵巢切除或阉割对骨髓内造血干细胞的自我更新没有显著性影响

为了直接检测性激素是否可以调节骨髓内HSC的稳态，本发明人在8周龄的雌性小鼠上实施了卵巢切除手术以阻断雌性性激素的分泌。手术实施八周后，可以观察到，实验组和假手术组小鼠骨髓和脾脏内的细胞总量(图4，A)、HSCs频率(图4，B)、HSCs数量(图4，C)均没有明显差异。与假手术组小鼠相比，卵巢摘除小鼠骨髓内有更多的MPPs(图4，D),CLPs(图4，E)和B细胞(图4，F)。在长期多谱系重构能力方面，卵巢摘除小鼠的骨髓细胞和对照小鼠的骨髓细胞无任何差别(图4，G)。因此，与此前的研究一致，本实施例的数据表明，雌性小鼠性激素敲除会导致MPPs数量增加，淋巴细胞增生，而对骨髓内HSCs没有任何影响。

本发明人接下来在8周龄雄性小鼠上进行了阉割手术以阻断雄性性激素的分泌。手术实施8周后，在骨髓和脾脏细胞数量(图4，H)、HSCs频率(图4，I)、HSCs数量(图4，J)等方面，假手术组小鼠和实验组小鼠无明显差异。来自阉割组小鼠和假手术组小鼠的骨髓细胞移植进辐照小鼠后，进行了相同水平的全血液谱系细胞重构(图4，N)。与此相反，阉割小鼠骨髓细胞中MPPs和B细胞(图4，K-M)的数量显著高于假手术组小鼠。这些数据显示，雄性小鼠性激素敲除会导致MPPs数量上升，淋巴细胞增生，而HSCs稳态没有受到影响。

实施例5：Lhcgr敲除促进成年小鼠骨髓中HSC自我更新和造血作用，而对青春期小鼠没有影响

本发明人敲除Lhcgr基因后，对小鼠性成熟前骨髓内HSCs自我更新和造血功能进行了检测。在出生后4周，Lhcgr^-/-小鼠骨髓和脾脏细胞总量(图5，A)，骨髓、脾脏内HSCs频率(图5，B)和数量(图5，C)，骨髓内MPPs(图5，D)、限制性祖细胞(图5，E)、成熟细胞(图5，F)数量等均处于正常水平。相应地，4周龄Lhcgr^-/-小鼠骨髓细胞长期造血重构能力和对照组小鼠相比无明显差异(图5，G)。总的来说，这些数据显示，青年小鼠骨髓HSC发挥自我更新和造血功能不依赖于Lhcgr。

出生后8周，Lhcgr^-/-小鼠骨髓细胞数、HSC频率显著高于对照组中同窝出生小鼠(图5，I)。8周龄Lhcgr^-/-小鼠骨髓内HSCs的总数大约是正常小鼠的2.7倍(图5，J)，其MPPs、B细胞、T细胞数量也显著高于对照组(图5，K-M)。8周龄Lhcgr^-/-小鼠的骨髓细胞在移植进受体辐照小鼠后，其主要造血谱系供体细胞重组率显著高于对照组小鼠(图5，N)。这些数据阐明LH信号在性成熟过程中下调了功能性HSCs的数量。

通过对酶消化的骨髓细胞进行流式细胞分析，可以发现8周龄Lhcgr^-/-小鼠CD45/Ter119^-VE-cadherin⁺上皮细胞和CD45/Ter119^-PDGFRα⁺血管外周细胞频率正常(图6，A-D)。通过对50微米厚的股骨切片进行共聚焦成像分析(图6，E)，可以发现Lhcgr^-/-小鼠骨髓中CD41⁺巨核细胞(图6，F)，VE-candherin^brightLaminin^dim血窦(图6，G)，VE-cadherin^dimLaminin^bright小动脉(图6，H)密度均和对照组小鼠无明显区别。这些数据显示Lhcgr调控HSCs功能并非通过微环境进行。

实施例6：Lhcgr调控HSC自我更新不依赖于性激素

将卵巢摘除8周后，Lhcgr^-/-雌性小鼠骨髓细胞量及HSCs的频率和数量都显著高于Lhcgr^+/+雌性小鼠(图6，I-K)。相似的，结扎8周后，Lhcgr^-/-雄性小鼠骨髓细胞量(图6，L)及HSCs的频率和数量同样显著高于Lhcgr^+/+雄性小鼠(图6，M-N)。这些数据显示性激素不参与Lhcgr调控HSC自我更新的过程。

实施例7：造血细胞特异性敲除Lhcgr阻断LH对HSCs的影响

本实施例建立了在造血细胞中特异性敲除Lhcgr的嵌合小鼠。首先，收取了Lhcgr^+/+或Lhcgr^-/-小鼠一百万骨髓细胞并移植进辐照后的野生型小鼠中；移植4周后，受体小鼠接受为期2周的重组LH连续给药(图6，O)。在移植了Lhcgr^+/+骨髓细胞的小鼠中，2周的LH给药没有影响骨髓和脾脏的细胞数量(图6，P-Q)，但是显著减少了骨髓和脾脏中HSC的数量。这些数据显示LH给药能有效耗竭骨髓HSCs(图6，S-U)。

在对移植了Lhcgr^-/-骨髓细胞的受体小鼠进行LH给药后(图6，O)，所有造血相关的参数均没有发生改变，包括骨髓、脾脏细胞总量，HSCs数量和频率(图6，Q-U)。总之，这些数据表明Lhcgr在造血谱系细胞中的表达对LH调控HSC自我更新是必要的。而在造血谱系中，本发明人发现Lhcgr特异性表达于HSCs和MPPs，因此LH对HSCs自我更新的调控依赖于HSCs中Lhcgr的表达。

实施例8：Lhcgr敲除导致外周血中淋巴增生

本实施例中，检测了Lhcgr^-/-小鼠中HSC自我更新和造血功能的变化如何影响血液生成。结果显示3周龄或4周龄Lhcgr^-/-小鼠白细胞总数和Lhcgr^+/+对照组小鼠相比无明显差异(图7，A)。而六周龄Lhcgr^-/-小鼠的白细胞总数持续高于Lhcgr^+/+对照组小鼠(图7，A)。在小鼠出生8周后，Lhcgr^-/-小鼠的白细胞总数每微升超过了20000个，高出正常水平两倍多(图7，A)。在所有的白细胞谱系细胞中，包括中性粒细胞(图7，D)、淋巴细胞(图7，E)、单核细胞(图7，F)、嗜酸性粒细胞(图7，G),嗜碱性粒细胞(图7，H)等均发现了不同程度的数量升高，进一步地验证了白细胞总数显著上升的现象。相反，在出生后3周到24周内，Lhcgr^-/-小鼠外周血中红细胞总量和血小板总数与Lhcgr^+/+对照组小鼠相比都无明显区别(图7，B,C)。因此，Lhcgr敲除导致了与白细胞增多症类似的白细胞过量症状。

总结与讨论

1、通过流式细胞分析的结果显示，出生后小鼠骨髓内造血干细胞数量保持高速增长，在出生四周后达到稳态，这一时期正好是小鼠青春期的起始之际。通过实时定量荧光PCR分析，本发明人在造血干细胞及多种造血谱系祖细胞中检测到雌激素受体α及孕酮受体(Pgr)的表达，在造血祖细胞(HPCs)和淋巴系共同祖细胞(CLPs)中检测到雄激素受体(Ar)表达。促黄体激素受体表达则高度局限于造血干细胞(HSCs)和多能造血祖细胞(MPPs)之中。

2、对8周龄小鼠进行卵巢切除或阉割手术阻断雌雄小鼠性激素分泌后，通过流式细胞分析检测了手术8周后小鼠体内不同造血谱系细胞群的数量变化。本发明人发现，性激素敲除导致骨髓和脾脏内MPPs数量上升，淋巴细胞增生，而HSCs稳态没有受到影响。通过长期造血谱系重构实验，本发明人检测到性腺摘除小鼠骨髓内功能性造血干细胞的数量及造血功能与对照组相比也没有出现明显变化。

在Lhcgr^-/-小鼠中，Lhcgr敲除则导致了8周龄成年小鼠造血干细胞数量和频率的大幅上升。骨髓中HSC总数增长至正常小鼠的2.7倍，MPPs和终末分化的B细胞、T细胞等数量也显著高于正常小鼠。通过长期谱系重构实验，本发明人发现来自8周龄Lhcgr^-/-小鼠相同数量骨髓细胞的血液谱系重构能力明显高于对照组小鼠。

这些数据显示性激素不影响成年后HSC稳态和造血功能，而LH信号则对成年后小鼠骨髓HSC稳态和功能有着关键的调控作用。

3、流式分析的结果显示，LH给药显著减少了经Lhcgr^+/+小鼠骨髓细胞移植后，辐照受体小鼠骨髓和脾脏内HSC的数量。而移植入Lhcgr^-/-小鼠骨髓细胞的受体小鼠则没有受到影响。这进一步说明HSC是骨髓内LH的直接作用靶点。通过对外周血检测分析可以发现，Lhcgr^-/-小鼠外周血中白血球数量明显增加，这提示阻断LH信号通路能对外周造血产生显著影响。总之，本发明的一系列数据表明LH信号直接调控了成年后HSC的稳态和功能，阻断LH信号通路能促进成年后机体的造血功能，促黄体生成素可以作为有效靶标以促进机体造血。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 靶向促黄体生成素促进机体造血的应用

<130> P2018-0267

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

ccttctagac ccttcagtga agcc 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

cgagaccaat catcagaatc tcc 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ccagccctgt tactagtcca agc 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ggtacactga ttcgtggctg g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ccagctcaca gcgcttctac c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gaaagaggag cggcttcacc 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

ggtgtgtgcc ggacatgaca ac 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ggtcatccac atgcaagttg cgg 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

cgtcgacaac ggctccggca tg 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gggcctcgtc acccacatag gag 23

Claims

1.一种促黄体生成素或其受体的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于促进哺乳动物成年后的机体造血。

2.一种组合物，其特征在于，包括：

(b)药学上可接受的载体。

3.一种用于促进成年后机体造血的药盒，其特征在于，包括：

4.一种筛选或确定促进成年后机体造血的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：

5.一种筛选或确定促进成年后机体造血的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：

6.一种促进成年后机体造血的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用(a)促黄体生成素LH的抑制剂；和/或(b)促黄体生成素受体Lhcgr的抑制剂，权利要求2所述组合物或权利要求3所述的药盒。

7.一种促黄体生成素或其促进剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于下调成年后哺乳动物机体内的白细胞。

8.一种药盒，其特征在于，包括：

9.一种筛选或确定下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：

10.一种筛选或确定下调成年后哺乳动物机体内的白细胞的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：