CN100400548C - 具有增强的体内红细胞生成素活性的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于增加EPO体内半寿期活性的融合蛋白，其在人红细胞生成素(EPO)的羧基末端包括一种具有在人绒膜促性腺激素(HCG)β亚基的羧基末端肽(CTP)片段中的1-4个氨基酸取代的突变体。该体内半寿期可在不增加糖链含量的情况下被极大地延长，而保持EPO固有的活性。

Description

具有增强的体内红细胞生成素活性的融合蛋白
发明背景
发明领域
本发明涉及一种融合蛋白，其具有一种增强的抗恶性贫血药，红细胞生成素(在下文中，它也被称为“EPO”)的体内活性。更特别地，本发明涉及一种融合蛋白，其具有通过用它自身的氨基酸序列，即，不增加糖基化含量，增加它的体内半寿期而增强的EPO活性，其中该融合蛋白包含与体内天然存在的特定的肽融合的EPO分子。
相关领域的描述
EPO是一种具有在30,000-34,000道尔顿范围内的分子量的糖蛋白，并且是一种促进红细胞的生产和分化的造血因子。该糖蛋白结合到红细胞的前体细胞的受体上以启动它的造血活性并引起胞内钙离子数量的增加，DNA生物合成的增强和刺激血色素形成。同样，重组人EPO(rhEPO)已被批准用于治疗与肾衰竭，早熟，甲状腺机能减退，营养不良等有关的贫血，并且rhEPO的临床用途正在不断地增加。然而，rhEPO的广泛应用可能由于不方便和高的费用而受到限制，因为由于其短的半寿期使得一周要给药大约三次。因而，通过保持EPO的体内活性更长的时间可以减少用于治疗的rhEPO给药的频率。
EPO的体内生物活性是与它的体内半寿期成比例的，而该体内半寿期已知与定位于EPO糖链末端的唾液酸的含量有关。因而，该EPO的体内生物活性极大地依赖于糖链的存在与否。糖链的类型随着细胞类型的不同而发生改变。因而，当相同的糖蛋白表达在不同的细胞中时，该蛋白的糖链类型随着细胞类型的不同是特性上不同的。已知细菌细胞，例如，大肠杆菌不能在它的蛋白上加上糖链。由于已知表达在大肠杆菌中的蛋白不具有任何糖链，所以在大肠杆菌中表达的EPO不包含糖链。在这种情况下，证实EPO在体外是有生物活性的，但在体内根本是无活性的。这是由于与有糖链的EPO相比，没有糖链的EPO被更快地从体内消除，从而导致一个极短的半寿期。因而，EPO中糖链的存在与否在EPO的生物活性中起重要作用。
迄今，人类已努力地进行了很多研究以增加EPO的生物活性。这些研究的大部分集中在通过使用诱变技术诱导EPO基因变异来取代一些氨基酸。例如，Amgen公司提交的名称为“红细胞生成素类似物”的PCT/US94/09257公开了通过诱变增加EPO中的糖链含量来增加体内半寿期的方法。也已尝试了通过形成EPO二聚体来增加体内半寿期(A.J.Sytkowski等.J.B.C.vol.274，No.35，pp 24773-24778)。其它增加EPO的体内生物活性的方法包括利用遗传工程融合一种新的氨基酸，肽或蛋白片段到EPO，增加EPO中的糖链含量，尤其唾液酸的数量。然而，用于这种方法的氨基酸，肽或蛋白片段的种类是很有限的。在大多数情况下，这种遗传修饰可能导致蛋白的特定活性的减少或丧失，或当在体内使用那些物质时，导致抗原性问题常常发生。
已进行了融合蛋白或嵌合蛋白，而不是EPO的研究，并且它们的一个实例是促卵泡激素，其为一种性激素(Furuhashi等.1995，Mol.Endocrinol)。然而，由于利用遗传工程进行遗传修饰的蛋白产生了几个问题，所以这种蛋白还没有应用于本领域。被修饰的靶蛋白本身不易获得，需要高度专业的技能。同样，大多数情况下，通过新的氨基酸的增加或取代可能不利地降低或去除蛋白的活性。
在这种情况下，本发明人开始广泛的研究，开发了一种通过将新的氨基酸，肽或蛋白融合到EPO分子来增加EPO体内活性的新方法。在进行这些研究过程中，发现通过将一种在体内天然存在的蛋白，人绒膜促性腺激素(在下文中，它也被称为“HCG”)的β亚基的羧基末端肽(在下文中，它也被称为“CTP”)片段与EPO融合而获得的融合蛋白明显地增加了该EPO的体内半寿期。同样，该EPO包含具有增加糖基化位点而保留EPO固有活性的功能的氨基酸(参见韩国专利申请第10-2000-0075230)。
发明概述
本发明人已意外地发现其肽内的糖基化位点已被去除的CTP变异体也明显地增加EPO的体内半寿期。作为这个发现的一个结果，已开发了可通过利用氨基酸序列，不增加EPO中糖链的含量而增加EPO体内稳定性的CTP变异体，导致本发明人完成本发明。
其中使用其糖基化位点已被去除的CTP变异体的本发明与其中通过增加EPO中糖链的含量来增加体内半寿期的现有技术是可区别的，并且是基于发现CTP变异体能增加EPO的体内稳定性。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有增强的人EPO体内活性的融合蛋白，其中该融合蛋白包括一个在它的羧基末端融合到HCGβ亚基的CTP变异体的EPO分子。
本发明的另一个目的是提供编码该融合蛋白的核苷酸，包含该核苷酸的重组载体，和该重组质粒转染的细胞系。
本发明的另一个目的是提供一种通过培养该转化的细胞系制备具有增强的人EPO活性的融合蛋白的方法。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种具有增强的人EPO体内活性的融合蛋白，其中该融合蛋白包括一个EPO分子，在它的羧基末端融合HCG β亚基的CTP变异体(在下文中，它也被称为“ATP”)。优选地，该CTP包括相应于HCG β亚基112-145位置，优选118-145位置的所有或部分氨基酸，SEQ ID No.1(HCG β亚基的位置112和145分别相应于SEQ IDNo.1中的位置1和34)描述了这些氨基酸。
为CTP变异体的ATP具有用它自身的氨基酸序列，即不增加EPO的糖链含量，增加该EPO分子半寿期的功能。
因而，如果不对靶融合蛋白的增加体内EPO活性的作用产生负面影响，则在上述位置范围内经历变化的氨基酸的位置和种类不受特别限制。换句话说，只要该融合蛋白保持增加体内EPO活性的活性，位于属于上述范围的各位置上的氨基酸可在任何位置，用任何氨基酸取代。
例如，优选地，ATP在HCG β亚基的121，127，132和138位置具有一种或多种氨基酸取代，最优选地，在HCGβ亚基的121，127，132和138位置具有用丙氨酸(Ala)残基取代丝氨酸(Ser)残基(SEQ ID No.11：HCGβ亚基的位置121，127，132和138分别相应于SEQ ID No.11中的位置4，10，15和21)。既然是这样，按照本发明的该融合蛋白具有SEQ.ID No.2描述的氨基酸序列。基于上述位置的丝氨酸残基可用Ala残基取代的发现，对于本领域的技术人员显而易见的是，任何具有与丙氨酸相似的大小和电荷的其它的氨基酸，如甘氨酸(Gly)，可以取代丝氨酸。
在本发明的另一个实施方案中，提供了编码该融合蛋白的核苷酸，包含该核苷酸的重组载体，和该重组质粒转染的细胞系，优选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种通过培养该转化的细胞系制备具有增强的人EPO活性的融合蛋白的方法。
附图简述
本发明的上述目的和优点通过参照附图详细描述它的优选的实施方案将变得更加明显，其中：
图1是说明产生表达载体pcDNA3.1-EATP的图示；
图2是纯化的EATP的电泳照片；和
图3图解描述EATP和EPO的药物动力学分析结果。
发明详述
现在本发明将被更详细地描述。本发明通过靶融合蛋白的基因的获得和克隆，靶基因的表达载体的构建，动物细胞的转染和EATP表达，表达的EATP的纯化和活性测量步骤而完成。
(1)基因的获得
EPO的互补DNA(cDNA)可通过利用购自韩国Bioneer公司的RT-PCT预混合试剂盒，使用常规的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术而获得，其中使用与先前从人胚肝cDNA文库(购自Invitrogen公司)中制备的EPO cDNA的两个末端互补的引物EP1和EC2。
EP1：ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(序列ID NO：3)
EC2：GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(序列ID NO：4)
将EPO cDNA克隆到克隆载体pGEM-T(普洛麦格公司)，命名为pGEMT-EPO，并且鉴定它的碱基序列以在随后的操作中作为模板使用。
本发明使用的HCGβ亚基的CTP变异体基因通过人工合成和自身引导PCR(self-priming)获得。合成的基因片段是EA1，A2，A3和A4：
EA1：AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACTCCTCTTCCG(序列ID NO：5)
A2：GGAAGGGCGGGGGGAGGGGCCTTGGCGGAAGAGGA(序列ID NO：6)
A3：CCGCCCTTCCAAGCCCAGCCCGACTCCCGGGGCCC(序列ID NO：7)
A4：TTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTCGGCGGGCCCCG(序列ID NO：8)
(粗体部分指用于氨基酸取代的部分)
取各1μL四种基因(50pmole/μ L)，使用高保真Taq系统(BoehringerManheim公司)进行PCR。
用1％的琼脂糖凝胶鉴定大小约100bp的基因片段(修饰的CTP基因)。这些基因编码一个肽，该肽通过用丙氨酸残基取代在HCGβ亚基的118-145位置的28个羧基末端氨基酸中第121，127，132和138位置的四个丝氨酸残基而获得(参见SEQ ID No.11：HCGβ亚基的位置121，127，132和138分别相应于SEQ ID No.11中的位置4，10，15和21)。
使用pGEMT-EPO作为模板，EP1和EC2作为引物进行PCR，仅产生EPO基因。然后，使用EPO基因和修饰的CTP基因两者作为模板，使用EP11和EP12引物，利用高保真Taq系统进一步进行PCR，从而获得有大约630bp的基因片段(命名为EATP基因)的期望的融合蛋白。
EP11：TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(序列ID NO：9)
EP22：TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT(序列ID NO：10)
将这些基因克隆到pGEM-T克隆载体，然后鉴定碱基序列(命名为pGEMT-EATP)(参见图1和SEQ ID No.12)。
(2)表达载体的构建
pcDNA3.1载体(Invitrogen公司)被用作表达载体。pGEMT-EATP中EATP基因的两个末端均具有来自引物EP11和EP22的HindIII和BamHI限制酶位点。用HindIII和BamHI处理pcDNA3.1和该获得的pGEMT-EATP。使用Qiagen洗脱试剂盒，从琼脂糖凝胶获得线性化的pcDNA3.1和EATP基因，然后连接，从而转化E.coli NM522。从在LB-氨卞青霉素固体培养基中过夜温育后产生的菌落中分离质粒，并用限制酶HindIII和BamHI处理。然后，通过1％琼脂糖凝胶电泳选择仅插入EATP的菌落。获得的质粒命名为pcDNA3.1-EATP(参见图1)。
(3)CHO细胞的转染和EATP的表达
CHO细胞(DG44)在60mm平皿中生长以制备40-80％铺满的细胞(1-4×105个细胞/60mm平皿)。将3μL的superfection试剂(BoehringerManheim公司)和97μL的培养基(含培养基，不含血清和无抗生素的α-MEM)充分混合，大约2μg的质粒pcDNA3.1-EATP DNA(大于0.1μg/μL)和0.2μg包含二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的载体pLTRdhfr26(ATCC37295)加入到获得的混合物中并且在室温下反应5-10分钟，然后加到细胞中。一天后，用不含培养基(包含500μg/mL G418)的含10％FBS的α-MEM代替该培养基。用含500μg/mL G418的培养基填满细胞并且培养7-10天。然后，不含G418抗性基因的细胞和阴性对照组的细胞全部死亡。充分培养选自G418培养基的细胞后，使用EPO酶联免疫吸附测定试剂盒(Boehringer Manheim公司)确定表达自该培养基的EATP蛋白。
(4)表达的EATP的纯化
利用抗-EPO单克隆抗体(R&D公司)，如下制备用于纯化的亲和树脂。
0.3克CNBr-活化的琼脂糖4B在1mM盐酸中溶胀20分钟并装柱，然后用1mM盐酸洗涤。然后，将获得的树脂在4mL偶联缓冲溶液(0.1MNaHCO3和0.5M NaCl，pH 8.3)中进一步洗涤，移到一个管中并立即在偶联缓冲溶液(500μg/小瓶)中与抗-EPO单克隆抗体混合，然后室温反应2小时。在这时，充分地摇动该管。然后，获得的产品用封闭缓冲剂(0.2M甘氨酸，pH 8.0)置换，搅拌下室温反应2小时。获得的树脂用6.5mL偶联缓冲溶液，6.5mL乙酸盐缓冲溶液(0.1M乙酸，0.5M氯化钠，pH 4)和6.5mL偶联缓冲溶液顺序地洗涤。将制备的树脂填充到一个柱中然后进行如下纯化。
细胞在无血清的培养基中生长一天，然后使用超滤滤器，如Centriprep(具有10,000的标称分子量截止)(Millipore公司)，浓缩仅该培养基大约5倍。然后，将该浓缩溶液装入一个用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)以流速约20mL/hr平衡的柱中，并用PBS再洗涤。该靶蛋白被洗脱到洗脱缓冲溶液中(0.1M甘氨酸，pH 2.8)，然后立即用1M Tris溶液滴定以调至pH7.5。如同通过SDS-PAGE并银染所证实的，纯化的EATP的纯度是97％或更高(参见图2)。
(5)通过生物测定检测和生化分析的活性检测
通过使用苯肼处理的鼠脾细胞的生物测定测量该表达的和适当纯化的EPO和EATP的生物学活性。结果表明EATP的活性比EPO的活性高，提示在EATP中加入的羧基末端的存在不抑制EPO的活性。
(6)药物动力学检测
为确定是否该制备的候选物质实际地具有更长的体内半寿期，在小鼠上进行药物动力学检测。这里，以每只小鼠20单位的剂量对四只小鼠静脉内给药该候选物质。为评价在血液中的浓度分布曲线，从鼠取血，并用EIA试剂盒(Boehringer Manheim公司)测量收集的血液的浓度。在小鼠中进行的药物动力学检测表明候选物质EATP具有比对照物质EPO长得多的半寿期(参见图3)。
在下述实施例中进一步说明本发明，这些实例不应被误解为限制本发明的范围。
实施例1：基因的获得
EPO的cDNA通过利用RT-PCT预混合试剂盒(Bioneer公司，韩国)，使用常规的RT-PCR技术而获得，其中使用的引物EP1和EC2与先前从人胚肝cDNA文库(Invitrogen公司)制备的EPO cDNA的两个末端互补。在55℃(退火)35秒，72℃40秒和94℃20秒的条件下进行30个循环的PCR反应，产生EPO cDNA。将获得的EPO cDNA克隆到克隆载体pGEM-T(普洛麦格公司)。换句话说，将该PCR产物从1％琼脂糖中洗脱下来，连接到pGEM-T，然后转化E.coli NM522。在涂有X-gal/IPTG的LB-氨卞青霉素固体培养基上过夜温育后，从白色菌落中分离质粒DNA，并与限制酶SacI和SacII反应以选择其中具有EPO cDNA插入的菌落。获得的载体被命名为pGEMT-EPO，并鉴定它的碱基序列以在随后的操作中作为模板使用。
通过人工合成和自身引导PCR获得HCGβ亚基的被修饰的CTP基因。合成的基因片段是EA1，A2，A3和A4。
取各1μL四种基因(50pmole/μL)，使用高保真Tag系统(BoehringerManheim公司)在55℃(退火)40秒，72℃40秒和94℃20秒的条件下进行15个循环的PCR。在1％琼脂糖凝胶中鉴定大小约100bp的基因片段(被修饰的CTP基因)。
这些基因编码一个肽，该肽通过在HCGβ亚基的28个羧基末端氨基酸中的第121，127，132和138位置用丙氨酸残基取代四个丝氨酸残基而获得(参见SEQ ID No.11：HCG β亚基的位置121，127，132和138分别相应于SEQ ID No.11中的位置4，10，15和21)。
使用pGEMT-EPO模板和EP 1和EC2引物进行PCR，仅产生EPO基因。然后，使用EPO基因和获得的被修饰的CTP基因两者作为模板，并使用EP11和EP22引物，利用高保真Tag系统，在57℃(退火)42秒，72℃60秒和94℃20秒的条件下进一步进行30个循环的PCR。从而，获得约630bp的融合基因片段(命名为EATP基因)。使用上述提到的方法将这些基因克隆到pGEM-T中(命名为pGEMT-EATP)，并鉴定它的序列(参见SEQ IDNo.12)。
实施例2：表达载体pcDNA3.1-EATP的构建
使用pcDNA3.1载体(Invitrogen)作为表达载体。在pGEMT-EATP中的EATP基因两端均具有来自引物EP11和EP22的HindIII和BamHI限制位点。
用限制酶HindIII和BamHI处理pcDNA3.1和获得的pGEMT-EATP。使用Qiagen洗脱试剂盒，自琼脂糖凝胶获得线性化的pcDNA3.1和EATP基因，然后连接，从而转化E.coli NM522。从在LB-氨卞青霉素固体培养基中温育过夜后产生的菌落中分离质粒，并用限制酶HindIII和BamHI处理。然后，通过1％琼脂糖凝胶电泳选择仅插入EATP的菌落。获得的质粒被命名为pcDNA3.1-EATP(参见图1)。
实施例3：CHO细胞的转染和EATP的表达
CHO细胞(DG44)在60mm平皿中生长以制备40-80％铺满的细胞(1-4×105个细胞/60mm平皿)。将3μL的superfection试剂(BoehringerManheim公司)和97μL的培养基(α-MEM，含培养基，不含血清和无抗生素)充分混合，并且将大约2μg的质粒pcDNA3.1-EATP DNA(大于0.1μg/μL)和0.2μg包含二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的载体pLTRdhfr26(ATCC37295)加入到获得的混合物中并且在室温下反应5-10分钟，然后加到细胞中。一天过后，用不含培养基(包含500μg/mL G418)的含10％FBS的α-MEM代替该培养基。用含500μg/mL G418的培养基填满细胞并且培养7-10天。然后，不含G418抗性基因的细胞和阴性对照组的细胞都死亡。充分培养选自G418培养基的细胞后，使用EPO酶联免疫吸附测定试剂盒(Boehringer Manheim公司)确认表达自该培养基的EATP蛋白。
实施例4：表达的EATP的纯化
利用抗-EPO单克隆抗体(R&D公司)，如下制备用于纯化的亲和树脂。
将0.3克CNBr-活化的琼脂糖4B在1mM盐酸中溶胀20分钟并装柱，然后用1mM盐酸洗涤。然后，获得的树脂在4mL偶联缓冲溶液(0.1MNaHCO3和0.5M NaCl，pH 8.3)中进一步洗涤，转移到一个管中并立即在偶联缓冲溶液(500μg/管瓶)中与抗-EPO单克隆抗体混合，然后搅拌下室温反应2小时。在这时，充分地摇动该管。然后，获得的产品用封闭缓冲剂(0.1M甘氨酸，pH 8.0)置换，室温反应2小时。获得的产品用6.5mL偶联缓冲溶液，6.5mL乙酸盐缓冲溶液(0.1M乙酸，0.5M氯化钠，pH 4)和6.5mL偶联缓冲溶液顺序地洗涤。将制备的树脂填充到一个柱中然后进行如下纯化。
细胞在无血清的培养基中生长一天，然后使用Centriprep(具有10,000的标称分子量截止)(Millipore公司)超滤滤器浓缩仅仅该培养基大约5倍。然后，将该浓缩溶液装入一个用PBS以流速约20mL/hr平衡，并用PBS再洗涤的柱中。该靶蛋白被洗脱到洗脱缓冲溶液中(0.1M甘氨酸，pH 2.8)，然后立即用1M Tris溶液滴定以调至pH 7.5。如同通过SDS-PAGE并银染所证实的，纯化的EATP的纯度是97％或更高(参见图2)。
实施例5：通过生物测定检测的活性测量
以60mg/kg的剂量一天一次，对小鼠给药苯肼两天。三天后，从鼠中分离增大的脾，用均浆器磨碎以获得脾细胞。将脾细胞稀释至6×106细胞/mL的浓度，并将每100μL的稀释样品移至96孔平板。将标准的EPO(0-500mU/mL)和表达的EPO和EATP(各100mU/mL)加到各自的孔中。然后，将平板贮藏在保持在37℃下的二氧化碳培养箱中22小时。每孔中加入50μL的二甲基-3H-胸苷(20μCi/mL)。该获得的平板进一步反应2小时，然后将每孔的样品溶液吸收至玻璃滤器(Nunc1-73164)。用盐水洗涤该滤器3次，并用贝它(β)计数器测量滤器的放射性。测量显示EATP的活性基本上等于或稍高于EPO的活性，表明在EATP中加入的羧基末端的存在不抑制EPO的活性。
实施例6：药物动力学检测
为确认是否该制备的候选物质实际地具有更长的体内半寿期，在小鼠中进行了药物动力学检测。这里，以每只鼠20单位的剂量对四只鼠静脉内给药按实施例5中描述的方法纯化的该融合蛋白。为评价在血液中的浓度分布曲线，按固定的时间间隔，即开始时每30分钟，2小时后每2小时从鼠中采集血液，并用EIA试剂盒(Boehringer Manheim公司)测定采集的血液中的浓度。图3表示药物动力学检测的结果。如图3所示，该候选物质EATP具有比对照物质EPO长得多的(长2.5倍以上)半寿期。
按照本发明，能通过用其自身的氨基酸，即不增加EPO的糖链含量，增加体内半寿期而保持该EPO固有活性从而增强EPO的体内活性。
<110>第一制糖株式会社
<120>具有增强的体内红细胞生成素活性的融合蛋白
<130>OV017299
<150>KR 10-2001-75994
<151>2001-12-03
<160>12
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>34
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(34)
<223>位于人绒膜促性腺激素(HCG)β亚基的112-145位置的氨基酸
<400>1
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
  1               5                  10                  15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
             20                  25                  30
Pro Gln
<210>2
<211>220
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>红细胞生成素(EPO)和人绒膜促性腺激素(HCG)β亚基的羧基末端肽的变
异体(ATP)的融合蛋白(EATP)
<400>2
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1                 5                  10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
             20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
         35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
     50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
                 85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
            100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
        115                 120                 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
    130                 135                 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
                165                 170                 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Ala Lys Ala Pro Pro Pro Ala Leu Pro Ser Pro Ala Arg
        195                 200                 205
Leu Pro Gly Pro Ala Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
    210                 215                 220
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有与EPO cDNA末端序列互补的核苷酸序列的引物EP1
<400>3
atgggggcac gaatgtcctg cctggctgg           29
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有与EPO cDNA末端序列互补的核苷酸序列的引物EC2
<400>4
gtcccctgtc ctgcaggcct                     20
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HCGβ亚基CTP基因片段EA1的变异体
<400>5
aggggaggcc tgcaggacag gggactcctc ttccg    35
<210>6
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HCGβ亚基CTP基因片段A2的变异体
<400>6
ggaagggcgg ggggaggggc cttggcggaa gagga    35
<210>7
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HCGβ亚基CTP基因片段A3的变异体
<400>7
ccgccct tccaagcccagcc cgactcccgg ggccc    35
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HCGβ亚基CTP基因片段A4的变异体
<400>8
ttattgtggg aggatcgggg tgtcggcggg ccccg    35
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于为了获得期望的融合基因EATP而进行PCR的引物EP11
<400>9
taagcttatg ggggtgcacg aatgt               25
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于为了获得期望的融合基因EATP而进行PCR的引物EP22
<400>10
tggatcctta ttgtgggagg atcggggt                 28
<210>11
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
Ser Ser Ser Ala Lys Ala Pro Pro Pro Ala Leu Pro Ser Pro Ala Arg
  1               5                  10                  15
Leu Pro Gly Pro Ala Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
                 20                  25
<210>12
<211>663
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct    60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag    120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc    180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg    240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct    300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg    360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga    420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc    480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg    540
aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggactcct cttccgccaa ggcccctccc    600
cccgcccttc caagcccagc ccgactcccg gggcccgccg acaccccgat cctcccacaa    660
taa                                                                  663

Claims (4)

1.一种融合蛋白，其包含具有羧基末端的人红细胞生成素(EPO)和连接到该羧基末端的突变体，所述突变体是具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的人绒膜促性腺激素(HCG)β亚基的羧基末端肽(CTP)片段。
2.按照权利要求1的该融合蛋白，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.一种核苷酸，其编码按照权利要求1-2中的任一项要求的融合蛋白。
4.一种制备具有增强的体内EPO活性的融合蛋白的方法，其包含培养一种用包含权利要求3中要求的核苷酸的重组体载体转染的细胞系。
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