DE10205583A1

DE10205583A1 - Fusionskonstrukte, enthaltend aktive Abschnitte von TNF-Liganden

Info

Publication number: DE10205583A1
Application number: DE10205583A
Authority: DE
Inventors: Oliver Gaide; Pascal Schneider; Juerg Tschopp
Original assignee: Apoxis SA
Current assignee: Topotarget Switzerland SA
Priority date: 2002-02-10
Filing date: 2002-02-11
Publication date: 2003-08-21
Also published as: DK1516054T3; ATE450614T1; DE50214059D1; PT1516054E; ES2337455T3

Abstract

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit Fusionskonstrukten, enthaltend aktive Abschnitte von TNF-Liganden, wobei die Fusionskonstrukte (a) den Fc-Abschnitt oder einen Teil eines Fc-Abschnitts eines Immunglobulins als Komponente (A), (b) den extrazellulären Teil eines TNF-Liganden oder eine Teilsequenz des extrazellulären Teils eines TNF-Liganden als Komponente (B) und gegebenenfalls (c) ein Übergangsbereich zwischen Komponente (A) und Komponente (B) mit einem Linker enthalten. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen, die einem erfindungsgemäßen Fusionskonstrukt zugrunde liegen, Expressionsvektoren mit derartigen DNA-Sequenzen, entsprechend transfizierte Wirtszellen und Arzneimittel, die auf einem der vorgenannten Gegenstände beruhen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung derartiger Arzneimittel oder rekombinanter Fusionskonstrukte zur Behandlung von genetischen Erkrankungen, ganz besonders zur Behandlung von ektodermaler Dysplasie.

Description

Aus dem Stand der Technik ist eine Vielzahl von Rezeptoren bekannt, die der Klasse der TNF-Rezeptoren angehören und jeweils mit mindestens einem TNF-Liganden als physiologischem Liganden interagieren. Bei den Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie handelt es sich um Typ I Membranproteine (Nagata et al. Science, 267: 1449, 1995). Ein Beispiel eines gut untersuchten TNF-Rezeptor-TNF-Ligandensystems ist der Fas- Rezeptor (Fas, FasR, CD95), der mit dem natürlichen Liganden FasL in Interaktion tritt und auf diesem Weg ein intrazelluläres Signal auslöst. Insbesondere die Bedeutung des FasL/FasR-Systems für den zellspezifischen Zelltod ist eingehend untersucht worden. Der Fas-Ligand der Ratte (Suda et al. Cell 75: 1169, 1993; Lynch et al. Immunity 1: 131, 1994) und die humane Form (Takahashi et al. International Immunology 6: 1567, 1994) sind auf der cDNA-Ebene kloniert worden. FasL gehört als Mitglied der Familie der TNF- Liganden zur Kategorie der Typ II Membranproteine, d. h. FasL weist eine extrazelluläre carboxyterminale Domäne und eine intrazelluläre aminoterminale Domäne auf. In die Familie der TNF-Liganden gehören bspw. weiterhin die Proteine TNFa (Tumornekrosefaktor a) oder TNFß (Tumornekrosefaktor ß, Eck et al. Journal Biological Chemistry 264: 17595, 1989). Die TNF-Liganden binden jeweils an ihren physiologischen TNF-Rezeptor. Weitere Beispiele von derartigen Liganden aus dem Stand der Technik sind OX40L (bindet an OX40R), CD27L (bindet CD27R), CD30L (bindet an CD30R), RANKL (bindet an RANK-R), CD40L (bindet CD40R), TRAIL (bindet an TRAIL-R1, R2, R3 oder R4) oder TWEAK (bindet an WSL-1-R).

Die nativen Formen der Liganden aus der Typ II Membranproteinfamilie sind jedoch als solche für den medizinischen Einsatz nicht geeignet. Als Membranproteine können sie als solche nicht verabreicht werden, insbesondere auch auf Grund der hydrophoben Transmembran-Domäne. Es wurde daher im Stand der Technik versucht, solche Fragmente von TNF-Liganden zur Verfügung zu stellen, die die physiologische Wirkung noch aufweisen könnten, ohne jedoch die intrazellulären Abschnitte oder die Transmembran-Domäne aufzuweisen. Bspw. wurden in vitro und in vivo Experimente mit FasL-Fragmenten durchgeführt, die ausschließlich Bereiche der nativ extrazellulär angeordneten FasL-Domänen aufwiesen (sFasL, "soluble FasL", lösliches FasL). Derartige Proteinfragmente konnten jedoch die physiologische Funktion der Liganden, insbesondere im Falle von FasL, nur unzureichend erfüllen, wobei tw. sogar unerwünschte inverse Effekte der löslichen extrazellulären FasL-Domäne gegenüber dem unter physiologischen Bedingungen in aktiver Form offenbar als Trimer vorliegenden FasL- Transmembranprotein beobachtet werden mussten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher solche Sequenzen zur Verfügung zu stellen, die nicht nur die physiologischen Effekte von TNF-Liganden, bspw. FasL, imitieren und abbilden, sondern auch löslich sind und sich daher für den Einsatz als Pharmazeutikon, insbesondere auch zur Herstellung eines Arzneimittels, eignen.

Erfindungsgemäß werden Fusionskonstrukte, d. h. sowohl Nukleotid-Sequenzen als auch die aus den Nukleotid-Sequenzen abgeleiteten Proteinsequenzen zur Verfügung gestellt, die es insbesondere auch erlauben, den Phänotyp genetisch bedingte Erkrankungen aufzuheben, wobei hierfür spezifische erfindungsgemäße therapeutische Verfahren zum Einsatz kommen können. Fusionskonstrukte erfindungsgemäßer Art weisen typischerweise eine Struktur, wie gemäß Fig. 1 dargestellt, auf. Ein erfindungsgemäßes Konstrukt enthalten mindestens zwei Komponenten (A) und (B), nämlich einen im Konstrukt N-terminal gelegenen Abschnitt, der die Sequenz der konstanten Region eines Immunglobulins oder ein Fragment oder eine Variante, bspw. eine Deletions-, Substitutions- oder Insertionsmutante, enthält (Komponente A) und eine im Fusionskonstrukt weiter C-terminal gelegene Sequenz oder Teilsequenz eines Liganden der TNF-Ligandenfamilie (Typ II, Komponente (B)). Der im Fusionskonstrukt N-terminal gelegene Abschnitt des Immunglobulins (Ig), also die Komponente (A), weist erfindungsgemäß nicht die für Immunglobuline charakteristische variable Region, die für die Antigen-Erkennung verantwortlich ist, auf, sondern ausschließlich Domänen oder Abschnitte von Domänen der konstanten Region von Immunglobulinen, beispielsweise die Domäne(n) CH₁, CH₂ und/oder CH₃. Es können also erfindungsgemäß Abschnitte der vorgenannten CH-Domänen erfindungsgemäß als Komponente (A) miteinander Verbunden werden, also bspw. die Domäne CH1 und die Domäne CH3, wobei die Komponente (A) ihre Fähigkeit, an physiologische Fc-Rezeptoren zu binden, erfindungsgemäß nicht verlieren darf.

Die als Komponente (A) im erfindungsgemäßen Fusionskonstrukt vorliegende Immunglobulin-Sequenz aus der Fc-Region kann zu einer Dimerisierung mit einem anderen Fusionskonstrukt in der Lage sein oder als Monomer vorliegen. Vorzugsweise ist die Komponente (A) zu Dimerisierung mit einem vorzugsweise identischen erfindungsgemäßen Fusionskonstrukt, alternativ aber auch mit einem anderen erfindungsgemäßen Fusionskonstrukt, bspw. einem Fusionskonstrukt mit einer anderen Komponente (B). Die Dimerisierung kann durch die nativ zwischen der Domäne CH1 und CH2 gelegene "Hinge"-Region über eine Disulfidbrücke erfolgen oder aber auch über eine artifiziell eingeführt Sequenz (oder Substitution/Insertion eines Cysteins), die kovalent (Disulfibrücke) oder non-kovalent (bspw. Leucin-Zipper) dimerisieren kann. Wahlweise kann das erfindungsgemäße Fusionskonstrukt aber auch als "single chain" Antikörper vorliegen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die konstante Region des Antikörpers im Fusionsprotein humanen Ursprungs sein, beispielsweise vom Antikörper GI2765420 stammen, und der Familie Immunglobuline aus der Immunglobulinklasse IgG angehören, insbesondere aus den Klassen IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4, bevorzugt aus den Klassen IgG2 oder IgG4. Alternativ können auch konstante Regionen von Immunglobulinen der IgG-Klasse anderer Säugetiere zum Einsatz kommen, insbesondere von Nagetieren oder Primaten, aber auch konstante Regionen der Immunglobulinklassen IgD, IgM, IgA oder IgE können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Typischerweise werden die im erfindungsgemäßen Konstrukt enthaltenen Antikörperfragmente die Fc-Domäne CH3 oder Teile hiervon und zumindest einen Teilabschnitte der Fc-Domaine CH₂ umfassen. Wahlweise sind auch erfindungsgemäße Fusionskonstrukte denkbar, die die CH₃-Domäne und die "Hinge"-Region zur Dimerisierung als Komponente (A) aufweisen.

Es können allerdings auch Derivate der nativ auftretenden Immunglobulin-Sequenzen eingesetzt werden, insbesondere solche Varianten, die mindestens eine Substitution, Deletion und/oder Insertionen aufweisen (hier unter dem Begriff "Variante" zusammengefasst). Ganz besonders bevorzugt sind solche Modifikationen vorgenannter Art, die die Bindung an membranständige Fc-Rezeptoren zumindest nicht beeinträchtigen, ggf. aber sogar optimieren. Da erfindungsgemäße Fusionskonstrukte als Komponente (A) Sequenzen enthalten müssen, die die Fähigkeit zur Bindung an die jeweiligen physiologischen Rezeptoren für den konstanten Abschnitt von Immunglobulinen beibehalten müssen, werden also in dem als Komponente (A) eingesetzten Antikörperfragment eines erfindungsgemäßen Fusionskonstrukts die Aminosäuren insbesondere an den Positionen 230 bis 240, stärker bevorzugt an den Positionen 234 bis 237 der Domäne CH₂ nicht verändert sein, oder nur mit solchen Sequenz-Variationen versehen sein, die das Bindungsverhalten an bspw. Fc-Rezeptoren unbeeinträchtigt lassen. Substitutionen oder Deletionen sind hingegen gegenüber der nativen Sequenz von konstanten Regionen von Immunglobulinen insbesondere an jenen Positionen bevorzugt, die zu Folge haben, daß Glykosilierungsstellen eliminiert oder eingeführt werden, Disulfidbrücken eingeführt oder eliminiert werden, die Stabilität oder Löslichkeit beeinträchtigen oder die Zellmembran-Passage nach Bindung nach Fc-Rezeptoren verbessern.

C-terminal vom Immunglobulinfragment enthält ein erfindungsgemäße Fusionskonstrukt typischerweise, aber nicht notwendigerweise, einen Übergangsbereich zwischen den Komponenten (A) und (B), der wiederum eine Linkersequenz enthalten kann, wobei diese Linkersequenz, vorzugsweise eine Peptidsequenz ist. Diese Peptidsequenz kann eine Länge von zwischen 1 und bis zu 70 Aminosäuren, ggf. auch mehr Aminosäure, aufweisen, vorzugsweise 10 bis 50 Aminosäuren und besonders bevorzugt zwischen 12 und 30 Aminosäuren. Beispiele für besonders stark bevorzugte Übergangssequenzen sind in den Fig. 1b bis 1j dargestellt (entsprechen markiert). Der Linkerbereich der Übergangssequenz kann von weiteren kurzen Peptidsequenzen, die bspw. DNA- Restriktionsschnittstellen entsprechen können, eingerahmt sein. Alle dem Fachmann aus der Molekularbiologie geläufigen Restriktionsschnittstellen können hierbei zum Einsatz kommen. Als Linkersequenzen kommen vorzugsweise artifizielle Sequenzen in Betracht, die eine hohe Anzahl an Prolin-Residuen aufweisen (beispielsweise an jeder zweiten Position im Linkerbereich) und darüber hinaus vorzugsweise insgesamt hydrophilen Charakter haben. Der hydrophile Charakter kann bevorzugt durch mindestens eine Aminosäure mit positiver Ladung, beispielsweise Lysin oder Arginin, oder negativer Ladung, beispielsweise Aspartat oder Glutamat, hervorgerufen werden. Insgesamt weist der Linkerbereich bevorzugt auch eine hohe Anzahl an Glycin- und/oder Prolinresten auf, um dem Linkerbereich die erforderliche Flexibilität und/oder Steifigkeit zu verleihen.

Als Linker kommen jedoch auch native Sequenzen in Betracht, beispielsweise jene Fragmente von Liganden der TNF-Liganden-Familie die extrazellulär, jedoch unmittelbar an, d. h. vor der Zellmembran angeordnet sind, ggf. auch nach Substitution, Deletion oder Insertion der nativen Abschnitte. Bei diesen Fragmenten handelt es sich vorzugsweise um die - nach der Transmembran-Region extrazellulär folgenden - 50 AS oder Unterfragmente dieser ersten 50 AS. Bevorzugt sind jedoch mindestens 85% Sequenzidentität dieser Abschnitte mit den entsprechenden natürlichen humanen Sequenzen, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% und insbesondere bevorzugt mindestens 99% Sequenzidentität, um die Immunogenizität dieser Linkerbereiche im erfindungsgemäßen Fusionsprotein zu begrenzen und keine körpereigene humorale Abwehrreaktion hervorzurufen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gilt, daß der Linkerbereich vorzugsweise keine Immunogenizität besitzen sollte.

Alternativ zu Peptidsequenzen, die über amidartige Bindungen mit dem Antikörperfragment und dem TNF-Liganden oder ein Fragment eines solchen TNF- Liganden verbunden sind, können jedoch auch Verbindungen, die nicht-peptidischer Art oder pseudopeptidischer Art sind oder auf nicht-kovalenten Bindungen beruhen, zum Einsatz kommen. Hierbei werden als Beispiele insbesondere N-Hydroxysuccinimidester und heterobifunktionale Linker, wie zum Beispiel N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)- proprionat (SPDP) oder ähnliche Crosslinker genannt.

Typischerweise carboxyterminal vom Übergangsbereich folgt in einem erfindungsgemäßen Fusionsprotein eine Sequenz eines Mitglieds der TNF-Liganden- Familie oder ein Fragment oder eine Variante desselben als Komponenten (B) in einem erfindungsgemäßen Fusionskonstrukt. Bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Fragmente, die insbesondere den äußerst carboxyterminal gelegenen Teil des extrazellulären Abschnitts eines Mitglieds der TNF-Liganden-Familie aufweisen. Die folgenden Mitglieder TNF-Liganden-Familie, Varianten bzw. Fragmente derselben sind insbesondere bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung: FasL, TNFα/β, TRAIL, Tweak, LIGHT, CD40L, RANKL, CD30L, OX40L, CD27L, EDA1, BAFF oder EDA2. In Hinblick auf die nativen Sequenzen der extrazellulären Abschnitte der vorgenannten Proteine wird auf die entsprechenden Einträge in der Datenbank SwissProt (http:/ / www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html) verwiesen.

Im Hinblick auf FasL sind Fragmente der Aminosäuren 100 bis 281 der nativen Sequenz oder am N-Terminus stärker verkürzte Fragmente (bspw. AS 101 oder 102 bis 281), insbesondere 120 bis 281 und ganz besonders 139 bis 281 als Komponente (B) oder am N- Terminus noch stärker verkürzte Fragmente bevorzugt, im Hinblick auf EDA1 Fragmente der Aminosäuren 180 bis 391 oder am N-Terminus stärker verkürzte Fragmente (bspw. 181 oder 182 bis 391), insbesondere 200 bis 391, ganz besonders, 245 bis 391 oder am N- Terminus noch stärker verkürzte Fragmente (bspw. 246 bis 391), in Hinblick auf EDA2 die Aminosäuren 180 bis 389 oder am N-Terminus stärker verkürzte Fragmente (bspw. 181 oder 182 bis 389), weiter bevorzugt 200 bis 389 und noch stärker bevorzugt 245 bis 389 oder am N-Terminus noch stärker verkürzte Fragmente, in Hinblick auf TNFa die Aminosäuren 50 bis 228 oder am N-Terminus stärker verkürzte Fragmente (bspw. AS 51 oder 52 bis 228), stärker bevorzugt 70 bis 228 und am stärksten bevorzugt 80 bis 228 oder am N-Terminus noch stärker verkürzte Fragmente, in Hinblick auf CD40L Fragmente der Abschnitte der 80 bis 261 oder am N-Terminus stärker verkürzte Fragmente (bspw. 81 oder 82 bis 261), stärker bevorzugt 100 bis 261, und am stärksten bevorzugt 116 bis 261 oder am N-Terminus stärker verkürzte Fragmente (oder am N-Terminus noch stärker verkürzte Fragmente), in Hinblick auf TRAIL die Aminosäuren 70 bis 281 oder am N- Terminus stärker verkürzte Fragmente (bspw. AS 71 oder 72 bis 281), stärker bevorzugt 80 bis 281 und am stärksten bevorzugt 95 bis 281 oder am N-Terminus noch stärker verkürzte Fragmente, in Hinblick auf BAFF die Aminosäuren 100 bis 285 oder am N- Terminus stärker verkürzte Fragmente (bspw. AS 101 oder 102 bis 285), stärker bevorzugt 120 bis 285 und am stärksten bevorzugt 137 bis 285 oder am N-Terminus noch stärker verkürzte Fragmente, in Hinblick auf APRIL die Aminosäuren 80 bis 233 oder am N- Terminus stärker verkürzte Fragmente (bspw. 81 oder 82 bis 233), stärker bevorzugt 90 bis 233 und am stärksten bevorzugt 98 bis 233 oder am N-Terminus noch stärker verkürzte Fragmente. Im N-terminalen Bereich der im erfindungsgemäßen Fusionsprotein als Komponente (B) enthaltenen Sequenzen sind allerdings auch alle zwischen den jeweils oben als bevorzugt genannten Bereichsangaben liegenden Sequenzabschnitte einsetzbar, wobei ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein typischerweise C-terminal mit dem nativen C-terminalen Ende des TNF-Liganden abschließt. Ggf. können allerdings auch im C- terminalen Bereich des als Komponente (B) eingesetzten extrazellulären TNF-Liganden- Fragments im erfindungsgemäßen Fusionsprotein mindestens eine Aminosäure deletiert sein, typischerweise 2 bis 10, in seltenen Fällen auch mehr als 10 Aminosäuren.

Der im erfindungsgemäßen Fusionsprotein enthaltene TNF-Ligand kann gleichfalls gegenüber der nativen Sequenz mindestens eine Substitution, Deletion und/oder Insertion aufweisen, um erwünschte biologische Wirkungen zu entfalten, wie zum Beispiel Löslichkeit, Stabilität oder veränderte Immunogenizität. Alternativ zur nativen TNF- Ligandensequenz kann erfindungsgemäß als Komponente (B) eine gegenüber der nativen Sequenz typischerweise zu mindestens 75%, vorzugsweise 85% und besonders bevorzugt zumindest 95% sequenzidentische Variante im erfindungsgemäßen Fusionsprotein eingesetzt werden, die die gleiche biologische Wirkung entfaltet. Alternativ kann schließlich aber auch als Komponente (B) eine Substanz eingesetzt werden, die die Wirkung von physiologischen Liganden imitiert, bspw. ein organisches Molekül, das agonistisch auf den entsprechenden Rezeptor aus der TNF-Familie wirkt oder einen Antikörper, der agonistisch an einen TNF-Rezeptor binden und nach Interaktion mit dem Rezeptor die biologische Funktion des physiologischen TNF-Liganden auslösen kann. Als Beispiel sei die Funktion von FasL genannt, die in einem erfindungsgemäßen Fusionskonstrukt auch durch einen Antikörper, wie zum Beispiel APO-1 als Komponente (B), erreicht werden kann. Polypeptide, die die physiologische Wirkung von TNF- Liganden abbilden können, können bspw. durch entsprechende "Phage Display Methoden" identifziert werden (s. US 5,223,409, deren Lehre vollinhaltlich in die vorliegende Offenbarung einbezogen wird).

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Reversion genetisch bedingter Erkrankungen bzw. ein Verwendung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins zur Herstellung und Konfektionierung eines Arzneimittels für ein entsprechendes erfindungsgemäßes therapeutisches Verfahren. Dieses erfindungsgemäßes Verfahren ist bei allen Plazentaliern, also Wirbeltieren mit Plazenta, insbesondere in der Human- und Veterinärmedizin, anwendbar. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, nach Diagnose einer genetisch bedingten Erkrankung im Embryo, beispielsweise durch Chorionbiopsie oder Amnionzentese, oder bei Verdacht auf eine genetisch bedingte Erkrankung beim Embryo aufgrund der genetischen Disposition von Vater und/oder Mutter bereits prophylaktisch, den Embryo zu behandeln und dessen erbgenetischen Phänotyp zu revertieren. Die Behandlung erfolgt über ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, so wie oben offenbart, ggf. in entsprechender Konfektionierung, und wird idealer Weise zum frühestmöglichen Zeitpunkt der Schwangerschaft/Trächtigkeit der Mutter bzw. dem Muttertier verabreicht wird. Vorteilhafterweise erfolgt die Verabreichung eines solchen erfindungsgemäßen Fusionsproteins parenteral, vorzugsweise intravenös oder intraarteriell.

Erfindungsgemäß bindet nach Verabreichung eines Arzneimittels ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein der zuvor beschriebenen Art über seinen Fc-Anteil als Komponente (A) an die Fc-Rezeptoren der Plazenta und erreicht auf diese Weise nach Internalisierung den Embryo, typischerweise über die Plazentagefäße, die den Embryo an den mütterlichen Blutkreislauf anschließen.

Die Dosierung ist abhängig von der genetischen Erkrankung selbst und vom Zeitpunkt der Verabreichung (also vom Entwicklungsstadium des Embryos), wobei die Behandlung vorteilhafter Weise zum frühestmöglichen Zeitpunkt der Embryonalentwicklung einsetzen sollte. Die Verabreichung derartiger erfindungsgemäßer Fc:Ligandenkonstrukte, bspw. Fc:EDA1 oder Fc:EDA2, erfolgt mindestens einmal, stärker bevorzugt regelmäßig während des ersten, zweiten und/oder dritten Monats der Schwangerschaft/Trächtigkeit, ganz besonders bevorzugt bspw. an jedem zweiten Tag für die Dauer von mindestens 14 Tagen beim Humanembryo, ggf. aber auch in größeren Abständen abhängig von der gewählten Dosierung.

Grundsätzlich ist eine Dosierung eines erfindungsgemäßen Fusionskonstrukts jedoch abhängig von der Behandlungsmethode. Im Falle der Behandlung durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, also während der Embryonalentwicklung, sind typischerweise Dosierungen des verabreichten Konstrukts von weniger als einem Zehntel, vorzugsweise weniger als einem Hundertstel und noch stärker bevorzugt weniger als einem Tausendstel der nativen Konzentration des TNF-Liganden im Neugeborenen angeraten. Im Falle einer Behandlung des Neugeborenen oder des Kleinkinds mit erfindungsgemäßem Fusionsprotein werden die Dosierungen mindestens 1/100, stärker bevorzugt mindestens 1/10 (stets bezogen auf die TNF-Ligandenaktivität), der für den gesunden Patienten gleichen Alters typischen Serumkonzentration betragen.

Ganz besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren bzw. die Verwendung eines erfindungsgemäßen Fusionsprotein für die Konfektionierung als Arzneimittel in einem derartigen Verfahren dann, wenn ein erfindungsgemäßes Fusionskonstrukt, das einen Fc-Anteil am N-Terminus des Fusionskonstrukts und am C-Terminus einen Abschnitt des TNF-Liganden EDA1 oder EDA2 als Komponente (B) trägt, insbesondere von EDA1 oder EDA2 humanen Ursprungs, vor allem einem extrazellulären Abschnitt dieser Proteine, der sich von mindestens Aminosäure 200 bis zur Aminosäure 391 (EDA1) oder bis zur Aminosäure 389 (EDA2) erstreckt, ganz besonders bevorzugt von Aminosäure 245 bis 391 (EDA1) und Aminosäure 245 bis 389 (EDA2), verabreicht wird. Noch stärker bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Fusionskonstrukte für ein erfindungsgemäßes Verfahren oder für eine entsprechende Verwendung, wie sie in den Fig. 1d und 1e dargestellt sind.

Mit Hilfe dieser erfindungsgemäßen Fusionskonstrukte kann in der Veterinärmedizin der Phänotyp der Nachkommenschaft von Tabby-Mäusen durch verfahrensgemäße Behandlung während der Schwangerschaft/Trächtigkeit revertiert werden. Entsprechend ist ein erfindungsgemäßes Verfahren bzw. die Verwendung erfindungsgemäßer Fusionsproteine für die Herstellung von Arzneimittel, die verfahrenstauglich sind, auch zur therapeutischen Behandlung der analogen Humanerkrankung, also einer Erberkrankung, die auf dem gleichen genetischen Defekt basiert, nämlich der X- gekoppelten hypohydrotischen ektodermalen Dysplasie (XLHED), der häufigsten Form ektodermaler Dysplasien, einsetzbar. XLHED beruht auf einem Defekt des Gens ED1, das in der Humanmedizin mit folgendem klinischen Krankheitsbild korrespondiert: Kleinwuchs, Demenz unterschiedlichen Ausmaßes, Sattelnase, Anhydrosis, fehlende Zähne oder abnorme Entwicklung der Zähne, Hypertrichosis oder Alopezie, oder Fehlfunktion ekkriner Schweißdrüsen zu nennen, weswegen die betroffenen Patienten gegenüber Hyperthermie ausgesprochen empfindlich sind. Neben XLHED sind auch andere ektodermale Dysplasien, denen andere erbgenetische Ursachen zugrunde liegen, auf die erfindungsgemäße Weise oder herkömmlich durch Verabreichung an den Neugeborenen oder das Kleinkind behandelbar.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung erfindungsgemäßer Fusionskonstrukte zur Behandlung genetisch bedingter Erkrankungen, insbesondere nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, wie oben dargestellt, oder zur Herstellung eines Arzneimittels. Insbesondere kommen erfindungsgemäße Fusionskonstrukte, insbesondere Konstrukte, die Abschnitte des TNF-Liganden EDA1 oder EDA2 enthalten, beispielsweise die Fusionskonstrukte gemäß Fig. 1d und Fig. 1e, generell zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung) von genetisch bedingten Hautanomalien, insbesondere Anomalien der Hautstruktur oder auch Anomalien ektodermaler Strukturen, wie beispielsweise Anomalien des Haares, der Zähne oder der Drüsen in Betracht. Als Beispiel sei die Verwendung erfindungsgemäßer Fusionsproteine im kosmetischen Bereich, z. B. zur Behandlung von Alopezie oder Hirsutismus genannt. Erfindungsgemäße Fusionskonstrukte können allerdings ganz allgemein zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung aller Formen ektodermaler Dysplasien eingesetzt werden. Daher sind erfindungsgemäße Fusionskonstrukte, insbesondere jene unter Beteiligung von EDA1 oder EDA2 besonders geeignet zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Stimulation des Haarwachstums, der Inhibition des Haarwachstums, der Behandlung von Wachstumsstörungen der Zähne oder auch zur Behandlung von Störungen der Drüsenfunktion, einschließlich der Schweiß- und/oder Talgdrüsen. Die Verwendung derartiger Fusionskonstrukte kann auf herkömmlichen Weg durch Verabreichung an die den Patienten oder durch das erfindungsgemäß beschriebene Verfahren durch Verabreichung an die Mutter erfolgen. Die erfindungsgemäßen Fusionskonstrukte können auch zur Behandlung einzelner vorgenannter Syndrome bei einem Patienten oder beim Muttertier eingesetzt werden.

Grundsätzlich sind zahlreiche genetische Erkrankungen auf die erfindungsgemäße Weise behandelbar, insbesondere Erberkrankungen, die auf einer Fehlfunktion der Expression von Mitgliedern der TNF-Ligandenfamilie beruhen. Als Beispiel für eine weitere genetische Errankung, die unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Fusionskonstruktes, das einen Fc-Anteil und einen biologisch aktiven Abschnitt von CD40L als Komponente (B) enthält, ist eine X-chromosomal gekoppelte Immundefizienz mit HyperIgM (HIGM1), ein Immunoglobulin-Isotypschalterdefekt, der charakterisiert ist durch erhöhte Konzentrationen von Serum IgM und verringerten Konzentrationen anderer Ig-Isotypen. Diese Erkrankung beruht auf einem Defekt im Gen TNFSFS. Das hierdurch verursachte Krankheitsbild von HIGM1 beruht auf einer defekten Expression des CD40- Liganden, wodurch im Ergebnis ein Defekt des Immunglobulin-Isotypenwechsels vorliegt. Ein derartiger genetischer Defekt betrifft insbesondere männliche Patienten in jungen Jahren (innerhalb der ersten 5 Lebensjahre), die vor allem gegenüber opportunistischen Infektionen anfällig sind und daher einer infausten Überlebensprognose anheimfallen. Durch die Verwendung von erfindungsgemäßem Fusionskonstrukt, das einen aktiven Abschnitt der extrazellulären CD40L-Domäne als Komponente (B) enthält, kann, beispielsweise durch Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Behandlung während der Embryonalentwicklung, eine partielle Rekonstitution der Precursor-T-Zellen, die fähig sind, den funktionalen CD40-Liganden zu exprimieren, erreicht werden, wodurch die klinischen Symptome dieser genetischen Störung aufgehoben werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auf die den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen zugrundeliegenden rekombinanten DNA-Konstrukte gerichtet. DNA- und Proteinkonstrukt werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemeinsam unter dem Begriff "Fusionskonstrukt" behandelt. So kann beispielsweise ein erfindungsgemäßes Nukleotidkonstrukt für die Domänen CH2 und CH3 von IgG als Komponente (A) und bspw. für CD40L oder EDA1 oder BAFF oder FasL kodieren, ggf. verbunden durch einen Übergangsbereich, enthaltend einen Linker. Die zugrundeliegenden erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleotid-Sequenzen codieren demnach für all jene erfindungsgemäßen Proteinfusionskonstrukte, die zuvor offenbart worden sind. Insbesondere bevorzugt sind die Nukleotidsequenzen der in Fig. 1 offenbarten Fusionskonstrukte. Die erfindungsgemäßen Nukleotidkonstrukte sind mit Hilfe von Klonierungsverfahren oder über chemische Synthese erhältlich, und zwar als cDNA, genomische DNA oder in synthetischer Form, wobei eine Vielzahl von Methoden aus dem Stand der Technik in Betracht kommt. Im Hinblick auf die Sequenzen der Domäne des Fc-Anteils von Immunglobulinen, die in einem erfindungsgemäßen Nukleotidkonstrukt auftreten können, wird beispielsweise auf die Veröffentlichung "Sequences of Proteins of Immunologic Interest", ist Edition, Kabat et al., US Department of Health and Human Services, 1991" verwiesen, wobei diese Veröffentlichung vollinhaltlich der vorliegenden Offenbarung zugerechnet wird.

Die Sequenzen, die in einem erfindungsgemäßen Nukleotidkonstrukte enthalten sind, werden typischerweise in Segmenten vorliegen, die durch Restriktion und Ligation zusammengefügt werden. Typischerweise wird eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz von Expressionkontrollsequenzen, die operabel mit der erfindungsgemäßen Nukleotid- Sequenz für ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein verbunden sind, enthalten, einschließlich Promotoren, Ribosomen-Bindungsstellen, Polyadylierungs- und/oder Transkriptionsterminationsstellen, und ggf. Enhancer. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kann durch Transfektion derartiger regulatorische Elemente enthaltender DNA-Segmente exprimiert werden, z. B. auf Plasmidvektoren, in bakterielle Zellen, Hefezellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und vorzugsweise Säugerzellen, und zwar bspw. unter Verwendung der Calciumphosphat-Methode, Elektroporation oder ähnlicher Techniken. Zur Expression in eukaryotischen Zellen wird der Promotor und ggf. die Enhancer-Sequenz von beispielsweise Immunglobulin-Genen, SV40, Retroviren, Zytomegalovirus, dem Elongationsfaktor 1α etc. eingesetzt werden. Bevorzugte Wirtszellinien schließen CHO-Zellen, COS-Zellen, Hela-Zellen, NIH3T3-Zellen und verschiedene Myeloma- oder Hybridoma-Zellinien, einschließlich des P2/0 und NS/0, ein. Sowohl derartige erfindungsgemäße DNA-Sequenz, die für ein erfindungsgemäßes rekombinantes Fusionsprotein codieren als auch Expressionsvektoren, die eine derartige erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthalten, als auch Wirtszellen, die mit einem derartigen erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfiziert sind, sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Sämtliche vorgenannten Indikation können auch mit den erfindungsgemäßen DNA- Konstrukten, Expressionsvektoren oder Wirtszellen behandelt werden. Insbesondere wird hierbei auf die entsprechenden therapeutischen Verfahren der in vivo oder ex vivo (bspw. Transfektion von Knochenmarkszellen) Gentherapie verwiesen. Ganz besonders bevorzugt sind hierbei gentherapeutische Verfahren beim sich entwickelnden Embryo, also bspw. Entnahme von embryonalen Zellen, bspw. auch embryonalen Stammzellen, mit nachfolgender ex vivo Transfektion mit erfindungsgemäßem Material, bspw. einem erfindungsgemäßen Expressionvektor, bspw. einem retro- oder adenoviralen Trägers, und Reimplantation in den Embryo. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße DNA- Konstrukt hinter einen regelbaren Promotor geschaltet sein.

Der Plasmidvektor mit erfindungsgemäßem DNA-Konstrukt wird im allgemeinen einen selektierbaren Marker enthalten, wie z. B. gpt, neo, hyg oder DHFR und ein amp, tet, kan etc. Gen zur Expression in E.coli. Eine Vielzahl von Plasmidvektoren, die geeignet sind zur Expression von heterologen Proteinen, ist im Stand der Technik verfügbar. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein enthält vorteilhafter Weise eine N-terminale Sequenz, beispielsweise eine Sequenz aus Hämagglutinin und/oder Tag Sequenzen und/oder oder mindestens eine weitere "LEADER"-Sequenz am Aminoterminus des Fusionsproteins, um die Sekretion der Fusionsproteine aus der Zelle zu erleichtern, insbesondere die Passage über das ER in den extrazellulären Raum bzw. in das Medium.

Verfahren zur Konstruktion von erfindungsgemäßen Nukleotidkonstrukten, die für erfindungsgemäße Proteinkonstrukte codieren, deren Verbindung mit Expressionskontrollsequenzen und/oder die Insertion im Plasmide, die Transfektion in Zellen und die Selektion und wahlweise Genamplifikation der Fusionsprotein exprimierenden Zellinie kann durch Methoden durchgeführt werden, die aus der Gentechnologie bekannt sind, einschließlich Restriktionsenzymverdauung, Ligation Oligonukleotidsynthese und PCR-Reaktion (Sambrook et al., Molekular Cloning: Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), wobei auf diese Veröffentlichung diesbezüglich vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Eine transfizierte Zellinie, die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert und sekretiert, wird selektiert und kann ggf. in serumfreien Medium (Hybridoma SFM) aufgezogen werden, indem sie durch abnehmende Konzentration von Serum geführt wird und kann schließlich subkloniert werden. Erfindungsgemäßes Fusionsprotein kann nach der Sekretion gereinigt werden (aus vorzugsweise serumfreiem Medium), indem die exprimierende Zellinie aufgezogen worden ist. Standardverfahren zur Proteinreinigung schließen die Filtration, Präzipitation, Protein A-Affinitätschromatographie, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, elektrophoretische Methoden oder ähnliches ein. Im wesentlichen reine Fraktionen des Fusionsproteins von mindestens 90 bis 95% Homogenität und vorzugsweise von mindestens 98 bis 99% oder höherer Homogenität werden dann bevorzugt zum pharmazeutischen Gebrauch eingesetzt.

Die Herstellung eines Arzneimittels, das das erfindungsgemäße Fusionsprotein enthält, wird typischerweise die Formulierung in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial einschließen. Bei diesem Trägermaterial wird es sich typischerweise um wässrige Trägermaterialien handeln, wobei Wasser zur Injektion (WFI) oder Wasser gepuffert mit Phosphat, Zitrat oder Acetat etc. verwendet wird, und ein pH von typischerweise 5,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0 eingestellt wird. Der pharmazeutisch akzeptable Träger wird zusätzlich vorzugsweise Salzbestandteile enthalten, z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder andere Komponenten, die die Lösung isotonisch machen. Weiterhin kann der Träger zusätzliche Komponenten, wie z. B. humanes Serum Alumin, Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren, enthalten.

Die Konzentration des erfindungsgemäßen Fusionsproteins in derartigen Formulierungen kann innerhalb eines weiten Bereichs von 0,001 bis 100 µg pro ml variieren. Die Formulierung wird vorzugsweise parenteral, also beispielsweise intravenös, intraarteriell subkutan, intramuskulär dem Patienten oder der schwangeren Mutter injiziert. Alternativ kann bei Behandlung durch ein erfindungsgemäßes Verfahren auch direkt die Formulierung in das Plazentagefäßsystem des Embryos eingeführt werden oder in die Fruchtblase injiziert werden.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert:

Fig. 1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von erfindungsgemäßen und erfindungsgemäß verwendeten Fc:Ligand-Konstrukten.

Fig. 1a stellt dabei beispielhaft schematisch die Sequenzabschnitte von besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Fc:-Ligand-Konstrukten dar. Im N-terminalen Bereich eines von einer zugrundeliegenden Nukleotidsequenz kodierten erfindungsgemäßen Fusionsproteins befindet sich typischerweise ein Signalpeptid, gefolgt von einem Fc- Abschnitt von IgG (Komponente (A)), gefolgt von einem (optionalen) Linkerbereich, weiter C-terminal von einer (optionalen) Protease-Schnittstellensequenz und weiter C- terminal (und am C-Terminus eines erfindungsgemäßen Fusionskonstrukts) von einer Sequenz, die typischerweise eine Teilsequenz eines Mitglieds der TNF-Ligandenfamilie darstellt (Komponente (B)). Diese als Komponente (B) dienende Teilsequenz schließt wiederum typischerweise den C-terminalen Teil des extrazellulären Abschnitts eines Liganden aus der TNF-Familie ein.

Die Teilfiguren 1b bis 1j zeigen spezifische Sequenzen von erfindungsgemäßen Konstrukten unter Verwendung verschiedener Mitglieder der Familie der TNF-Liganden, nämlich FasL (Fig. 1b und 1c, mit und ohne Proteaseschnittstelle), EDA1 und EDA2 (Fig. 1d und 1e), TNFa (Fig. 1f), CD40L (Fig. 1g), TRAIL (Fig. 1h), BAFF (Fig. 1j) und APRIL (Fig. 1i). Die Teilsequenzen der vorgenannten Mitglieder der TNF- Ligandenfamilie sind sämtlich humanen Ursprungs und weisen jeweils die C-terminal gelegenen extrazellulären Sequenzabschnitte der nativen Liganden bis zum nativen C- Terminus auf. Die N-terminal gelegene Fc-Domäne (Komponente (A)) ist mit dem im Fusionsprotein C-terminal gelegenen Abschnitt des TNF-Liganden (Komponente (B)) über eine Linkerregion mit den Aminosäuren PQPQPKPQPKPEPE verbunden. Darüber hinaus enthalten die in Fig. 1b, 1i und 1j dargestellten Sequenzen von erfindungsgemäßen Fusionskonstrukten eine Protease-Schnittstelle, jeweils mit der Sequenz LEVLFQGP, so dass die Protease PreSCISSION (Amersham-Pharmacia) die mit einer derartigen Protease-Schnittstelle aus gestalteten Fusionskonstrukte schneiden kann und damit die Immunglobulin-Domäne des Fusionskonstrukts von dem TNF- Ligandenabschnitt abgetrennt werden kann. Als Sequenz einer Protease-Schnittstelle kommen jedoch alle mindestens 4 AS langen Sequenzen in Betracht, die von einer beliebigen Protease, bspw. einer Cystein- oder einer Aspartatprotease, erkannt werden können. Zwischen der Fc-Domäne und dem Linker bzw. dem Linker und der TNF- Ligandendomäne können weitere, typischerweise kurze, d. h. zwei bis acht Aminosäuren lange Sequenzen enthalten sein. Die Sequenzen der Teilfiguren 1b bis 1j enthalten zwischen Fe-Abschnitt und Linker die Aminosäuren ARG-SER und in den Teilfiguren 1c, 1d, 1e, 1f, 1g und 1 h befindet sich N-Terminal von der Komponente (B) zumindest das Tetrapeptid GSLQ, ggf. C-terminal von Q verlängert um weitere Aminosäuren. Jene Fusionskonstrukte, die auch eine Protease-Schnittstelle aufweisen, also die Fusionskonstrukte der Teilfiguren 1b, 1i und 1j enthalten das vorgenannte Tetrapeptid C- terminal von der Protease-Schnittstelle. Linker und Protease-Schnittstelle werden typischerweise auch durch mindestens zwei Aminosäuren voneinander getrennt, Figurengemäß durch das Dipeptid GS. Der gesamte Bereich zwischen der Komponete (A) und der Komponente (B) wird als Übergangsbereich bezeichnet.

Alle Fusionskonstrukte der Fig. 1b bis 1j weisen am N-Terminus, also N-terminal von der Fc-Domäne ein Pentadekapeptid auf (MAIIYLILLFTAVRG), das in den dargestellten Fällen einer Hämagglutinin-Sequenz entspricht. Verbunden ist diese Signalsequenz in allen dargestellten Fällen über das Dipeptid LD mit dem Fc-Abschnitt des Fusionskonstrukts (Komponente (A)).

Die nicht eingerahmten Verbindungssequenzen der Fig. 1b bis 1j entsprechend typischerweise Restriktionsenzymschnittstellen, mit deren Hilfe die einzelnen Sequenzkomponenten zusammengefügt werden.

Alle in den Teilfiguren dargestellten Fusionskonstrukte wurden in einem PCR-3- Säugetierexpressionsvektor (Invitrogen) kloniert.

Fig. 2 zeigt eine Western-Blot-Darstellung, in der die Aufreinigung von erfindungsgemäßen Fusionskonstrukt Fc:FasL dargestellt ist. Das aufgereinigte Protein (5 µg/Spur) wurde auf 12%-SDS-Page unter reduzierenden (+DTT) oder nicht reduzierenden (-DTT)-Bedingungen untersucht, und zwar mit dem Fusionskonstrukt TRAILR2:Fc (also einem Konstrukt einer Immunglobulindomäne und eines TNF-Rezeptors) als Kontrolle in den oberhalb von Western-Blot durch eine (+)-Markierung angezeigten Spuren. Links vom Western-Blot sind Marker des Molekulargewichts in kDa angegeben und rechts vom Western-Blot durch Pfeilmarkierung die für erfindungsgemäßes Fusionskonstrukt Fc:FasL angezeigten Molekulargewichte (110 KDA bzw. 57 Kda), die in Abhängigkeit von der Ausbildung von Disulfidbrücken (nur unter nicht reduzierenden Bedingungen) zwischen den Fc-Domänen erwartungsgemäß variieren.

Fig. 3 stellt das Ergebnis der Gelpermationschromatographie von erfindungsgemäßen Fc:FasL dar. Hierzu wurde Fc:FasL (300 µg in 200 µl PBS) auf eine Superdex-200 Säule, äquilibriert in PBS, aufgetragen und bei einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert. Das UV-Profil wurde "online" bei 280 nm aufgenommen und 0,5 ml Fraktionen wurden jeweils gesammelt. Die Elutionsposition ist unterhalb von Fig. 3 aufgetragen und das Molekulargewicht (in kDa) sowie die Kalibrationsstandards sind oberhalb vom Profil aufgetragen. Das apparente Molekulargewicht der beiden Peaks von Fc:FasL wurde aus der Kalibrationskurve, die in der rechten Darstellung von Fig. 3 gezeigt ist, abgeleitet. Das Ergebnis ist oberhalb der beiden Peaks (850 kDa bzw. 440 kDa) dargestellt. Unterhalb vom Profil sind die Maßzahlen der untersuchten Fraktionen in der Reihenfolge der Elution dargestellt.

In Fig. 4 sind elektronenmikroskopische Aufnahmen dargestellt, und zwar in der Reihenfolge der Teilfiguren von FasL (Fig. 4a), von ACRP?-FasL (Fig. 4b), ACRP- FasL (Fig. 4c) und schließlich Fc-FasL (Fig. 4d). Die einzelnen Teilfiguren enthalten jeweils verschiedene Präparationen der injizierten Aminosäuresequenzen in alternativen Aufsichten, wobei unterhalb der Aufnahmen eine schematische Interpretation des elektronenmikroskopisch bestimmten Bildes dargestellt ist. Hierbei ergibt sich aus den elektronenmikroskopischen Aufnahmen gemäß Fig. 4a ein Punktmodell für FasL (3 ch, also der erwartete Trimer von multimerisierendem FasL), für ACRP?:FasL (Fig. 4b), ein stäbchenförmiges Modell mit Punktende, wobei der Punkt den FasL-Bestandteil markiert und die Stäbchenform die Kollagendomäne von ACRP?. Gemäß Fig. 4c ergibt sich für ACRP:FasL eine zwillingskirschenartige Struktur zweier verbundener Stäbchen (ACRP30-Kollagendomäne mit angefügter FasL-Domäne). Schließlich ist gemäß Fig. 4d die Struktur von erfindungsgemäßen Fc:FasL erkennbar, die hellen Punkte stehen für FasL, die dunklen Punkte für den Fc-Anteil von IgG1. Die verbindende Weißlinie gibt die Konnektivität zwischen den verschiedenen Untereinheiten wieder.

Fig. 4e ist eine modellhafte Darstellung der dreidimensionalen Struktur eines erfindungsgemäßen Fc:Liganden-Komplexes. Als Ligand wurde die Struktur von Lymphotoxin A (PDB-Zugangsnummer 1TNR) und als Fc-Komponente IgG 2a (PDB- Zugangsnummer 1IGT) gewählt.

Fig. 5 zeigt die Spezifizität der Bindung von Fc-Liganden an ihre jeweiligen Rezeptoren. Hierbei wurde die Bindung der Liganden an ihre Rezeptoren (in Gestalt von Rezeptor: COMP-Fusionsprotein) mit Hilfe eines ELISAs gemessen, und zwar unter Verwendung der folgenden Schritte: (a) Beschichtung mit murinem antihumanen IgG, (b) Hinzufügen der jeweiligen Fc-Liganden, in der gewünschten Konzentration (als Zellüberstände), (c) Hinzufügen des jeweiligen Rezeptor-COMP-Fusionskonstrukts (welche jeweils eine Tag- Markierung tragen und ebenfalls als Zellüberstände hinzugefügt wurden), (d) Hinzufügen von biotinyliertem Anti-Tag-monoklonalem Antikörper, (e) Hinzufügen von Horse Raddish peroxidase (HRP)-gekoppeltem Streptavidin, (f) Entwicklung des Assays mit OPD-Reagenz und Messung der Absorbanz bei 490 nm.

Aus den in Fig. 5 dargestellten Diagrammen ist deutlich erkennbar, daß eine starke Spezifizität der erfindungsgemäßen Fusionskonstrukte für die jeweiligen spezifischen TNF-Rezeptoren der im erfindungsgemäßen Konstrukt enthaltenen Liganden (oder Ligandenabschnitte) besteht, nämlich von FasL für Fas, Trail für Trail R2, EDA1 für den EDA-Rezeptor, erwartungsgemäß BAFF und APRIL für den insoweit bifunktionalen Rezeptor BCMA, TNF für TNFR2 und CD40L für CD40R. Die Darstellung als Konstrukt mit Fc-Anteil hat also keine Auswirkung auf das Bindungsverhalten der Komponente (B) eines Konstrukts an den entsprechenden Rezeptor.

Fig. 6 stellt die Ergebnisse von Bindungsexperimenten mit erfindungsgemäßem Fc:BAFF dar. Gemäß Fig. 6a wurden B3AB-Zellen (BAFF-R positive Zellen und HEK- 293-Zellen (BAFF-R negative Zellen) in einem Endvolumen von 100 Mikroliter mit 0,05, 0,2, 0,5, 2,5, 20 oder 50 µl von Zellüberständen, die Fc:BAFF enthielten, inkubiert. Gebundenes Fc:BAFF wurde mit PE-konjugierten antihumanem Ig-Antikörper und FACS-Analyse identifiziert. Das Ergebnis einer Quantifizierung der durchschnittlichen Fluoreszenz (MFI) ist in der rechten Darstellung von Fig. 6a dargestellt. Hierbei zeigt sich nach Auswertung der direkten Auftragungen für BJAB- und HEK 293-Zellen in der Sekundärauftragung (Fig. 6a ganz rechts) deutlich, daß die mittlere Fluoreszenz als Maß für die Bindung an die Zellen im Falle von BJAB-Zellen deutlich steigt, während die BAFF-R negativen HEK-293-Zellen auch bei hohen Konzentrationen des erfindungsgemäßen Fc:BAFF keine signifikant erhöhte mittlere Fluoreszenz aufweisen. Die nicht erwartete Bindung von Fc:BAFF an die BAFF-R negativen Zellen findet also im Gegensatz zur Situation bei BAFF-R positiven Zellen auch nicht statt.

Gemäß Fig. 6b finden sich die Ergebnisse von Immunopräzipitationsexperimenten aufgetragen. Hierzu wurden BJAB-Zellen (5 × 10⁷ pro Ansatz) für 15 Minuten in 2 ml eines Mediums in Gegenwart von 3 µg von Fc:FasL oder von Fc:BAFF inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, in PDS gewaschen, in Lysepuffer lysiert (enthaltend 1% NP-40 und mit Protein A-Sepharose immunopräzipitiert. IPs und Gesamtzellextrakte wurden durch Western-Blot-Technik unter Verwendung von murinem anti-hBAFF-R-monoklonalem Antikörper analysiert. Hierbei zeigte sich, daß die BAFF-R-positiven BJAB-Zellen während der Inkubation Fc:BAFF (rechte Spur in Fig. 6b) binden und daher im IP- Ansatz durch entsprechende Antikörper nachweisbar sind.

In Fig. 7 wird die Cytotoxizität von Fc:FasL dargestellt, und zwar mit Hilfe von Reihenverdünnungen von erfindungsgemäßen Fc:FasL (wahlweise das auf die Säule zugeführte Material, die 850 kDa-Fraktion und die 440 kDa-Fraktion, wie gemäß Fig. 3 dargestellt). Diese Reihenverdünnungen wurden auf FasL-sensitive Jurkat-Zellen gegeben und für die Dauer von 16 Stunden bei 37° inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde danach mit einem PMS/MTS-Essay beobachtet. Hierbei zeigte sich, daß die Gesamtfraktion ebenso wie die Einzelfraktionen ein sehr ähnliches Profil im Hinblick auf die Überlebensfähigkeit der Zellen aufweisen.

Fig. 8 zeigt die phänotypischen Unterschiede zwischen erfindungsgemäß mit Fc:EDA1 (s. Fig. 1d) behandelten oder unbehandelten Tabby-Mäusen 10 Tage nach der Geburt. Als Kontrolle dienten WT-Mäuse (rechts). Hierzu wurde trächtigen Tabby-Mäusen intravenös 200 µg von Fc:EDA1 am Tag 11, 13, und 15 der Trächtigkeit injiziert. Nachkommen von behandelten Tabby-Mäusen, nicht behandelten Tabby-Mäusen und Wildtypmäusen wurden untersucht. Hierbei stellt gemäß Fig. 8a auf das Erscheinungsbild der Ohrpartie, insbesondere auf den Haarwuchs der Ohrpartie ab. Der Haarwuchs bei behandelten Tieren entspricht dem Haarwuchs bei WT-Tieren. Auch die Schwanzpartie bei behandelten Mäusen weist wie bei WT-Mäusen sowohl eine entsprechende Behaarung als auch die gewohnte Form auf. Der Unterschied zu nicht behandelten Mäusen ist direkt offensichtlich.

Gemäß Fig. 8b sind histologische Gewebeschnittdarstellungen der retroorikularen Region, der Körperseite, des Schwanzes und der Tatze in Paraffin unter Verwendung von Hämatoxylin-Eosinfärbung. Unter dem Ohr von unbehandelten Tabby-Mäusen ist eine ausgeprägte kahle Region zu erkennen. Behandelte Tabby-Mäuse gleichen insoweit phänotypisch dem WT. Die Körperseite von behandelten Tabby-Mäusen zeigt eine WT- artige Vergrößerung der Zahl der Haarfollikel gegenüber unbehandelten Tabby-Mäusen. Im Schwanzbereich weisen die behandelten Mäuse den Haarwuchs von WT-Mäusen auf. Nicht behandelte Tabby-Mäuse sind dagegen im Schwanzbereich haarlos. Im Gewebe der Tatze von behandelten Mäusen (Mitte) sind, wie durch die Pfeile angedeutet, Schweißdrüsen zu erkennen, wie auch im WT. Nicht behandelte Tabby-Mäuse entwickeln demgegenüber keine Schweißdrüsen. Die folgenden Merkmale wurden verglichen:

Fig. 9a zeigt einen Vergleich von mit dem erfindungsgemäßen Konstrukt gemäß Fig. 1d behandelten Tabby-Mäusen (Mitte) und nicht behandelten Tabby-Mäusen (links) im ausgewachsenen Alter (6 Wochen nach Geburt). Die Behandlung erfolgte so wie gemäß Ausführungsbeispiel 4 dargestellt. Rechts ist das Erscheinungsbild von gesunden Mäusen als Kontrolle festgehalten. Die behandelten Tiere besitzen ein Fell wie die WT-Tiere (auch in dem kritischen Abschnitt hinter den Ohren), der Schwanz der behandelten Mäuse zeigt keine gezacktes Erscheinungsbild, die Haare von behandelten Mäusen zeigen zumindest tw. die für WT-Mäuse typische Heterogenität (4 Haartypen: monotrish, owl, auchene, zigzag), während die unbehandelten Tabby-Mäuse nur einen Haartyp aufweisen.

Fig. 9b vergleicht die Kiefer- und Zahnstruktur von behandelten, unbehandelten Tabby- Mäusen und WT-Mäusen. Die unbehandelten Tabby-Mäuse weisen eine abnorme Kieferstruktur auf und auch die Zähne zeigen Deformitäten, insbesondere wenig ausgeprägte Zahnhöcker. Die Behandlung durch ein erfindungsgemäßes Verfahren während der Trächtigkeit (Behandlung des Muttertieres) hat die natürliche Zahnform wiederherstellen können.

Die Ergebnisse von 10 Tage alten Mäusen entsprechen also dem Erscheinungsbild bei ausgewachsenen Mäusen. Die nach der Geburt beobachtete Reversion des Phänotyps verschwindet also beim ausgewachsenen Tier nicht mehr.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Ausführungsbeispiele 1. Ausführungsbeispiel Herstellung von Fc:Liganden-Fusionsproteinen

Bevorzugte erfindungsgemäße Fusionsproteine bestehen aus einem Fc-Anteil von humanem Immunglobulin (Komponente (A)), wobei die zugrundeliegende DNA- Sequenz das Stopcodon des Immunglobulin-Fragments nicht enthält, und einem C- terminalen Abschnitt eines Fragments eines Liganden der TNF-Familie (Komponente (B)) (mit Stop-Codon der zugrundliegenden DNA-Sequenz). Hierbei weisen bevorzugte erfindungsgemäße Fusionsproteine die folgende Struktur auf am N- Terminus ein Signalpeptid, dann einen Fc-Abschnitt bspw. von IgG, einen Übergangsbereich, enthaltend einen Linkerbereich und eine Protease-Schnittstelle und einen C-terminalen Abschnitt eines Mitglieds der TNF-Ligandenfamilie. Eine schematische Darstellung eines bevorzugten erfindungsgemäßen Fusionsproteins ist in Fig. 1a dargestellt.

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins, bspw. eines Fusionsproteins mit einer bevorzugten Struktur gemäß Fig. 1% insbesondere der in den Fig. 1b bis 1j dargestellten Sequenzen, wurden Nukleinsäurekonstrukte in Expressionsvektoren von Säugetieren kloniert und in stabilen humanen embryonalen Nierenzellinien (in HEK-293 oder in CH₀ (Chinese hamster ovary)-Zellen) exprimiert. Die sekretierten rekombinanten Fusionsproteine wurden aus dem konditionierten Medium durch Affinitätschromatographie auf einer Protein-A- Sepharose-Säule gewonnen. Die Ausbeuten betrugen bis zu mehreren mg pro Liter des eingesetzten Mediums.

2. Ausführungsbeispiel Biochemische Charakterisierung von Fc:FasL

Die biochemische Charakterisierung von FasL erfolgt durch SDS-PAGE-Analyse, wobei ein apparentes Molekulargewicht von 57 kDa bzw. ungefähr 110 kDa unter reduzierenden bzw. nicht reduzierenden Bedingungen ermittelt wurde. Hierdurch wurde die Gegenwart von über Disulfidbrücken verbundenen Dimeren (2 ch) nachgewiesen, wie es von Fc-enthaltenden Fusionsproteinen mit "Hinge-Region" zu erwarten war (siehe auch Fig. 2).

Eine entsprechende Untersuchung durch Gelpermationschromatographie zeigte, daß zwei gut definierte "Peaks" von Fc:FasL mit apparentem Molekulargewicht von ungefähr 440 kDa (Hauptpeak) bzw. ungefähr 850 kDa (Nebenpeak) eluierten (siehe Fig. 3). Unter der Annahme einer globulären Gestalt von Fc:FasL betrug die berechnete Multimer-Struktur von FasL 7,7 (7,7 ch) für die Hauptspezies im Elutionsprofil. Im Falle eines nicht idealtypisch globulären Proteins beruht diese Berechnung jedoch mit hoher Wahrscheinlichkeit auf einer Überschätzung des Molekulargewichts, so daß eine dimere Ligandenstruktur (6 ch) durchaus möglich wäre. Die dem 440 kDa Peak entsprechende Form von Fc:FasL wurde mit Hilfe der Elektronenmikroskopie untersucht, wobei zum Vergleich FasL (3 ch), oligomeres ACRP30:FasL (6+ ch) und eine Deletionsmutante von ACRP30:FasL, nämlich ACRP?:FasL (3 ch) herangezogen wurden. FasL (3 ch) weist eine ballähnliche Gestalt auf (siehe Fig. 4a), ACRP?:FasL (3 ch) hat eine ballähnliche Gestalt mit einem "Griff" (siehe Fig. 4b) und ACRP30: FasL sieht aus wie eine "Zwillingskirsche", was im Ergebnis mit einer dimeren FasL (6 ch)-Struktur (siehe Fig. 4c) übereinstimmt.

Erfindungsgemäßes Fc:FasL nimmt regelmäßig eine Ringstruktur mit S "Bällen" oder eine offene Struktur mit 5 "Bällen" an (siehe Fig. 4d). Dies wiederum entspricht einem dimeren FasL (6 ch), wobei die beiden Bälle FasL und die drei übrigen Bälle die Fc-Bestandteile von IgG (3 Polypeptiddimere: 6 ch) sind. Eine modellhafte Darstellung eines Fc-Liganden wurde unter Verwendung der bekannten Kristallstruktur von Lymphotoxin a (ein Mitglied der TNF-Familie) und des Fc- Bestandteils von IgG2a (PDB-Zugangsnummern 1TNR und 1IGT) entwickelt, wobei der Linker-Bereich als durchgezogene Linie eingezeichnet ist (siehe Fig. 4e). Hierdurch wird eindeutig gezeigt, daß die Liganden und die Fc-Anteile ungefähr ähnliche Größen besitzen, in Übereinstimmung mit der beobachteten 5-Ballstruktur von Fc:FasL. Alles in allem zeigen diese Ergebnisse an, daß der 440 kDa Peak von Fc:FasL ein dimeres FasL (6 ch) ist.

Die Bezeichnung "ch" steht in der vorliegenden Offenbarung für "chain" und spiegelt damit die Zahl der Ketten des TNF-Liganden (bspw. APRIL, FasL, BAFF, EDA oder Tweak) im Molekül wider (unabhängig davon, ob ein Fusionskonstrukt betrachtet wird oder nicht). Liegt ein TNF-Ligand in trimerer Form vor, hat er drei Ketten (3 ch), ein Dimer eines Liganden (bspw. über die erfindungsgemäße Fc-Konstruktion) hat 6 Ligandenketten (6 ch),

Analog erfolgte auch die Charakterisierung der übrigen in den Fig. 1b bis 1j dargestellten erfindungsgemäßen Fusionsprotein-Sequenzen.

3. Ausführungsbeispiel Biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Fc:Liganden-Konstrukte in vitro

Erfindungsgemäß wurde ein ELISA-basierter Assay entwickelt, um die biologischen Eigenschaften von Fc:Liganden-Konstrukten, nämlich an ihre entsprechenden Rezeptoren zu binden, zu untersuchen. In diesem Assay wurden die Fc:Liganden- Konstrukte zunächst mit einem murinen antihumanen IgG monoklonalen Antikörper gefangen. In einem zweiten Schritt wurden die löslichen Rezeptoren an die Oligomerisierungsdomäne des "cartilage oligomeric matrix protein (COMP) (s. DE 199 63 859 und DE 10 12 2140, die jeweils vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung sind) fusioniert und eine Flag-Sequenz wurde hinzugefügt. Rezeptoren mit gebundenen Liganden wurde mit Hilfe ihrer jeweiligen Flagtags identifiziert (siehe Fig. 5). Durch diese modifizierte Vorgehensweise eines ELISA-Assays wurde gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Fc:Liganden-Konstrukte in der Tat an ihre jeweiligen nativen Rezeptoren binden, also ihre Bindungsfähigkeit durch die Konstruktstruktur nicht verlieren, und die Bindung erfolgt auch mit einer hohen Selektivität.

Ferner wurde erfindungsgemäß gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Fc-Liganden- Konstrukte auch an oberflächenexprimierte, endogene Rezeptoren binden können. Experimentell konnte gezeigt werden, daß erfindungsgemäße Fc:BAFF-Konstrukte BAFF-R-positive BJAB-Zellinien in dosisabhängiger Weise markieren, allerdings nicht die BAFF-R-negative Jurkat-Zellinie (siehe Fig. 6a). Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß Fc:BAFF den endogenen BAFF-Rezeptor von BJAB-Zellen spezifisch immunopräzipitieren kann (siehe Fig. 6b).

Weiterhin wurde die Cytotoxizität von Fc:FasL auf einer FasL-sensitiven Jurkatzellinie untersucht. Fc:FasL erwies sich als hochcytotoxisch auf Jurkatzellen, mit einem IC₅₀ von 1 ng/ml (siehe Fig. 7). Zudem wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß keine signifikanten Unterschiede in Hinblick auf die spezifische Aktivität zwischen der Gesamtpräparation von erfindungsgemäßem Fc:FasL und der im 440 kDa Peak isolierten dimeren Form von Fc:FasL (6 ch) bzw. der im 850 kDa Peak identifizierten oligomeren Form von Fc:FasL (12 ch) besteht. Diese Ergebnisse zeigen, daß dimeres FasL (6 ch) bereits ein vollständig aktives Molekül ist und daß größere Komplexe die diesbezügliche Aktivität nicht mehr verstärken.

4. Ausführungsbeispiel

Biologische Aktivität von erfindungsgemäßen Fc:Liganden-Konstrukten in vivo

Es wurden die Fusionsproteine Fc:FasL und Fc:EDA in vivo getestet

Die Injektion von Fc:FasL in Mäuse ergab, daß dieses Fusionsprotein in vivo Cytotoxizität zeigt.

Fusionskonstrukt Fc:EDA: EDA ist ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, das physiologisch für die Entwicklung und Funktion, insbesondere auch für die Morphogenese von ektodermalen Strukturen verantwortlich ist, ganz besonders für Schweißdrüsen, Haare und Zähne als epitheliale Strukturen des Ektoderms. Umgekehrt ist bekannt, daß Fehlfunktionen von EDA das Krankheitsbild XLHED beim Menschen verursacht, während bei Mäusen die Fehlfunktion zu dem sogenannten Tabby-Phänotyp führt, im wesentlichen charakterisiert durch (i) abnorme Struktur des Fells, (ii) Fehlen der unterschiedlichen nativen Haartypen, (iii). Haarverluste am Schwanz und im Hautbereich hinter den Ohren, (iv) Abwesenheit von Schweißdrüsen in den Tatzen, (v) abnorme Zahnbildung und -durchbruch (vi) charakteristische Verdrehung an der Schwanzspitze und (vii) geringere Gewichtszunahme bei Jungmäusen.

Erfindungsgemäß wurde den weiblichen Tabby-Mäusen intravenös 200 µg von Fc:EDA1 am 11., 13. und 15. Tag der Trächtigkeit injiziert. Die Toleranz gegenüber diesem Fusionsprotein war ausgezeichnet und es wurden keine kontraindizierenden Wirkungen bei den behandelten Mäusen beobachtet. Während die Fc:EDA1- Behandlung bei den behandelten weiblichen ausgewachsenene Mäusen selbst keine erkennbaren Wirkungen zeigte, wurde eine eindeutige und starke Reversion des Tabby-Phänotyps in der Nachkommenschaft der behandelten trächtigen Muttertiere beobachtet. Diese Reversion des Phänotyps war am 10. Tag nach der Geburt offensichtlich. Die Größe der Nachkommen der während der Trächtigkeit behandelten Tabby-Mäuse war erheblich größer als jene der Kontrollmäuse, ihr Fell war glatt, schwarz und glänzend (siehe Fig. 8/9). Im Gegensatz zu den Tabby-Mäusen erwies sich auch der retroorikulare Bereich der behandelten Tabby-Mäuse als haarig, und sie zeigten normale, ungebogene haarige Schwänze mit zahlreichen Haarfolikeln, die auf der Haut der Schwanzregion beobachtet werden konnten (siehe Fig. 8b). Darüber hinaus konnten ekkrine Schweißdrüsen, die von den entsprechenden Wildtyp- Schweißdrüsen nicht unterscheidbar waren, auf den Fußtatzen von behandelten, nicht aber von unbehandelten Tabby-Mäusen im Gewebschnitt erkannt werden (siehe Fig. 8b).

Der revertierte Phänotyp war stabil, wie durch die Analyse von behandelten Tabby- Mäusen im ausgewachsenen Zustand bestätigt werden konnte (s. Fig. 9). Sie waren signifikant größer als Tabby-Mäuse und ihr Fell zeigte alle vier Wildtyp-Haararten (monotrisch, owl, auchene und zigzag). Sie hatten keine kahlen Stellen in der retroorikularen Region, die Fußtatzen enthielten ekkrine Schweißdrüsen, nicht unterscheidbar vom Wildtyp. Die Zähne von behandelten Tabby-Mäusen hatten eine normale Größe und zeigten ein Wildtypmuster von Zahnhöckern. Der dritte Molar ist in Wildtypmäusen klein und in Tabby-Mäusen nicht vorhanden. Dieser dritte Molar fehlte auch in behandelten Tabby-Mäusen. Die Ergebnisse zeigen, daß erfindungsgemäßes Fc:EDA1 gemäß Fig. 1d, trächtigen Mäusen verabreicht, in den sich entwickelnden Embryo gelangen kann, und zwar via Fc-Rezeptoren der Placenta und an EDA-Rezeptoren die Induktion der Bildung von nativen epithelialen Strukturen auslösen kann. Diesbezüglich ist die Dimerisierung von EDA1 (6 ch) mit hoher Wahrscheinlichkeit von zentraler Bedeutung, da genetische und biochemische Untersuchungen anzeigen, daß die Oligomerisierung von EDA für dessen Aktivität essentiell ist. Weiterhin wurde erfindungsgemäß gezeigt, daß funktionelles EDA nach Induktion und Etablierung epithelialer Strukturen im sich entwickelnden Embryo für die Aufrechterhaltung des revertierten nativen Phänotyps dem erwachsenen Tier nicht mehr zugefügt werden muß.

Zusammengefaßt läßt sich feststellen, daß die erfindungsgemäße Experimente eine quasi vollständige Reversion eines Phänotyps, der genetisch auf die Absenz des TNF-Liganden EDA zurückzuführen ist, hervorrufen kann.

Claims

1. Rekombinantes Fusionsprotein, enthaltend eine Aminosäuresequenz, die umfasst: (a) den Fc-Abschnitt oder einen Teil eines Fc-Abschnitts eines Immunglobulins als Komponente (A) oder eine funktionelle Variante von Komponente (A), (b) den extrazellulären Teil eines TNF-Liganden oder eine Teilsequenz des extrazellulären Teil eines TNF-Liganden als Komponente (B) oder eine funktionelle Variante von Komponente (B) und ggf. (c) einen Übergangsbereich zwischen Komponente (A) und Komponente (B), enthaltend einen Linker.

2. Rekombinantes Fusionsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (B) eine Teilsequenz des TNF-Liganden FasL, TNFα, TNFβ, TRAIL, Tweak, LIGHT, CD40L, 41-BB, RANKL, CD30L, OX40L, CD27L, EDA1, BAFF, RANKL, GITRL, VEGI oder EDA2 oder ein funktionelles Derivat der vorgenannten Sequenzen ist.

3. Rekombinantes Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (A) die "Hinge"-Region, die CH2 und die CH3-Domäne des Fc-Abschnitts eines Immunglobulins aus der Klasse der IgG, insbesondere von humanem IgG, aufweist.

4. Rekombinantes Fusionsprotein nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Übergangsbereich zwischen Komponente (A) und Komponente (B) die Sequenz PQPQPKPQPKPEPE enthält.

5. Rekombinantes Fusionsprotein nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Übergangsbereich eine Protease-Schnittstelle aufweist.

6. Rekombinantes Fusionsprotein nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der N-Terminus des rekombinanten Fusionsproteins eine Signalsequenz, bspw. eine Sekretionssignalsequenz, und/oder eine Tag- Markierung (bspw. Flag- oder His-Tag) aufweist.

7. Rekombinantes Fusionsprotein nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der N-Terminus die Sequenz MAIIYLILLFTAVRG aufweist.

8. Rekombinantes Fusionsprotein nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Fusionsprotein eine der in Fig. 1b bis 1j dargestellten Aminosäuresequenzen aufweist.

9. Rekombinantes Fusionsprotein nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Sequenz des rekombinanten Fusionsproteins funktionell 6 Komponenten (B) miteinander verbunden werden.

10. Komplex aus Fusionskonstrukten nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex 6 Ketten der Komponente (A) aufweist.

11. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein rekombinantes Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 codiert.

12. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor eine DNA- Sequenz nach Anspruch 11 enthält.

13. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 12 transfiziert ist.

14. Arzneimittel, enthaltend ein rekombinantes Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eine DNA-Sequenz nach Anspruch 11, einen Expressionsvektor nach Anspruch 12 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 13.

15. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 14 zur Behandlung von genetischen Erkrankungen, insbesondere einer ektodermalen Dyplasie.

16. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 1 S. dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel der Mutter/dem Muttertier während der Schwangerschaft/Trächtigkeit parenteral verabreicht wird.

17. Verwendung eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Komplexes nach Anspruch 10, einer DNA-Sequenz nach Anspruch 11, eines Expressionsvektors nach Anspruch 12 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung genetischer Erkrankungen, die auf einem genetischen Defekt der Expression von funktionalem TNF-Ligand beruhen.

18. Verwendung eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Komplexes nach Anspruch 10, einer DNA-Sequenz nach Anspruch 11, eines Expressionsvektors nach Anspruch 12 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ektodermaler Dysplasie, insbesondere XLHED.

19. Verwendung eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Komplexes nach Anspruch 10, einer DNA-Sequenz nach Anspruch 11, eines Expressionsvektors nach Anspruch 12 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Alopezie, Hirsutismus oder Schweiß- bzw. Talgdrüsenfehlfunktion.

20. Verwendung eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Komplexes nach Anspruch 10, einer DNA-Sequenz nach Anspruch 11, eines Expressionsvektors nach Anspruch 12 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei das zur Verfügung gestellte Arzneimittel der Mutter/dem Muttertier während der Schwangerschaft/Trächtigkeit parenteral in entsprechender Dosierung verabreicht wird.

21. Verfahren zur Behandlung genetischer Erkrankungen, insbesondere zur Behandlung ektodermaler Dysplasien, dadurch gekennzeichnet, dass der Mutter/dem Muttertier im Falle einer (potentiellen) genetisch bedingten Erkrankung, insbesondere einer ektodermalen Dysplasie oder HIGM1, der Nachkommenschaft während der Schwangerschaft/Trächtigkeit ein rekombinantes Fusionsprotein parenteral in entsprechender Dosierung verabreicht wird.