ES2337455T3 - Constructos de fusion, que contienen secciones activas de ligandos tnf. - Google Patents

Abstract

Proteína de fusión recombinante, que contiene una secuencia de aminoácidos, que comprende: (a) en la sección de la proteína de fusión situada por el extremo N-terminal, la sección Fc de una inmunoglobulina o una parte de una sección Fc de una inmunoglobulina que mantiene su capacidad de dimerización como componente (A), (b) en la sección de la proteína de fusión más C-terminal la parte extracelular de un ligando TNF o una secuencia parcial de la parte extracelular de un ligando TNF como componente (B) y, si se desea, una zona de transición entre el componente (A) y el componente (B), que contiene un ligador, caracterizada porque, el componente (B) es la parte extracelular del ligando TNF EDA1 o una secuencia parcial de la parte extracelular del ligando TNF EDA1 que presenta por lo menos la secuencia de aminoácidos 246 a 391 de la secuencia nativa de EDA1.

Description

Constructos de fusión, que contienen secciones activas de ligandos TNF.

En el estado de la técnica, se conocen un gran número de receptores que pertenecen a la clase de los receptores de TNF y que cada uno interactúa con por lo menos un ligando TNF como ligando fisiológico. Los receptores de la familia de receptores de TNF son proteínas de membrana del tipo I (Nagata et al, Science, 267: 1449, 1995). Un ejemplo de un sistema de receptor de TNF/ligando TNF bien investigado es el receptor Fas (Fas, FasR, CD95), que entra en interacción con el ligando natural Fas y por ese camino dispara una señal intracelular. En particular, se ha investigado detalladamente la importancia del sistema FasL/FasR para la muerte celular específica de la célula. El ligando Fas de la rata (Suda et al, Cell 75. 1169, 1993; Lynch et al, Immunity 1: 131, 1994) y la forma humana (Takahashi et al, International Immunology 6: 1567, 1994) se han clonado a nivel de ADNc. Como miembro de la familia de los ligandos TNF, FasL pertenece a la categoría de las proteínas de membrana del tipo II, es decir, FasL presenta un dominio carboxi-terminal extracelular y un dominio amino-terminal intracelular. A la familia de los ligandos TNF pertenecen también, por ejemplo, las proteínas TNFa (factor de necrosis tumoral a) o TNF\beta (factor de necrosis tumoral \beta, Eck et al, Journal of Biological Chemistry 264: 17595, 1989). Cada ligando TNF se une a su receptor de TNF fisiológico. Entre los otros ejemplos de ligandos de este tipo del estado de la técnica, se incluyen OX40L (se une a OX40R), CD27L (se une a CD27R), CD30L (se une a CD30R), RANKL (se une a RANK-R), CD40L (se une a CD40R), TRAIL (se une a TRAIL-R1, R2, R3 o R4) o TWEAK (se une a Fn14).

Sin embargo, las formas nativas de los ligandos de la familia de proteínas de membrana del tipo II no son aptas como tales para ser utilizadas en la medicina. Como proteínas de membrana, no pueden administrarse como tales, en particular también debido al dominio transmembrana hidrófobo. Por tanto, en el estado de la técnica, se ha intentado poner a disposición fragmentos de ligandos TNF que todavía podrían presentar una actividad fisiológica, pero sin presentar las secciones intracelulares o el dominio transmembrana. Por ejemplo, se han realizado experimentos in vitro e in vivo con fragmentos de FasL que presentaban exclusivamente zonas de los dominios FasL dispuestas en su forma nativa en la parte extracelular (sFasL, "soluble FasL", FasL soluble). Sin embargo, los fragmentos de proteína de este tipo han podido cumplir la función fisiológica de los ligandos, en particular en el caso de FasL, sólo de forma insuficiente, observándose en parte incluso efectos inversos no deseados del dominio de FasL soluble extracelular frente a la proteína transmembrana FasL, que en las condiciones fisiológicas estaba presente en su forma activa obviamente como trímero.

En la patente US nº 6 316 256, se han descrito proteínas de fusión que contienen una parte de un ligando FasL así como una región Fc. En la patente US nº 6.046.310 se han descrito también proteínas de fusión con un ligando Fc:Fas. Bulfone-Paus et al. (Transplantation, 2000, 7: 1386-1391) han descrito una proteína de fusión con un ligando IL-2-IgG-Fas. Fanslow et al. (Seminars in Immunology, 1994, 5: 267-278) han descrito una proteína de fusión CD40L-Fc. Baum et al. (EMBO J., 1994, 13: 3992-4001) ha descrito una proteína de fusión murina OX40L-Fc. En el documento WO 01/83525, se han descrito proteínas de fusión que contienen una sección Fc y una sección de un ligando de la familia TNF. En el documento WO01/49866, se han descrito proteínas de fusión que contienen una sección de una TNF-citoquina y una sección multimerizante de una proteína seleccionada del grupo constituido por la familia de proteínas C1q y de las collectinas. Holler et al. ha descrito proteínas de fusión Fas:COMP y CD40:COMP.

Los documentos citados anteriormente no describen ninguna proteína de fusión según la reivindicación 1 de la presente solicitud de patente.

Por tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar secuencias que no sólo imiten y reproduzcan los efectos fisiológicos de los ligandos TNF, sino también sean solubles y, por tanto, aptas para ser utilizadas como agente farmacéutico, en particular también para la preparación de un medicamento.

Según la invención, se proporcionan constructos de fusión, es decir, tanto secuencias de nucleótidos como las secuencias de proteínas derivadas a partir de las mismas, que permiten en particular también eliminar el fenotipo de las enfermedades causadas por factores genéticos. Los constructos de fusión del tipo según la invención presentan una estructura según la reivindicación 1. La sección de inmunoglobulina (Ig) situada en el constructo de fusión en el extremo N-terminal, es decir, el componente (A), no presenta, según la invención, la región variable característica de las inmunoglobulinas, que es responsable del reconocimiento de antígenos, sino exclusivamente dominios o secciones de dominios de la región constante de las inmunoglobulinas, por ejemplo el dominio o los dominios de CH_{1}, CH_{2} y/o CH_{3}. Por tanto, según la invención, las secciones de los dominios CH citados anteriormente pueden unirse según la invención entre sí como componente (A), es decir, por ejemplo el dominio CH_{1} y el dominio CH_{3}, con lo cual el componente (A), al ser utilizado según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento en útero, no debería perder su capacidad de unirse a los receptores Fc fisiológicos. En caso de ser utilizado para la preparación de un medicamento para el tratamiento postnatal, la situación puede ser tal que fuese ventajoso si los constructos según la invención no se uniesen a los receptores Fc. Por tanto, al ser utilizado para la preparación de un medicamento destinado a la terapia postnatal, puede ser preferible si el componente (A) precisamente ya no presenta la propiedad de unirse funcionalmente a los receptores Fc. Una pérdida de funcionalidad de este tipo puede conseguirse, por ejemplo, por inserción, deleción o sustitución de las secuencias Fc funcionales.

La secuencia de inmunoglobulina presente en el constructo de fusión según la invención como componente (A) y constituida por la región Fc es capaz de dimerizar con otro constructo de fusión. Preferentemente, el componente (A) es capaz de dimerizar con un constructo de fusión según la invención preferentemente idéntico, pero, de forma alternativa, también con otro constructo de fusión según la invención, por ejemplo un constructo de fusión que contiene otro componente (B). La dimerización puede realizarse por medio de la región "hinge", situada en su forma nativa entre los dominios CH_{1} y CH_{2}, a través de un puente de disulfuro o también a través de una secuencia introducida artificialmente (o, por ejemplo, también por sustitución/inserción de una cisteína), que puede dimerizar de forma covalente (puente de disulfuro) o no covalente (por ejemplo cremallera de leucina u otras secciones de secuencias aptas para dimerizar).

En una forma de realización preferida, la región constante del anticuerpo en la proteína de fusión puede ser de origen humana, por ejemplo proceder del anticuerpo GI2765420, y pertenecer a la clase de inmunoglobulinas IgG, en particular de las clases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferentemente de las clases IgG2 o IgG4. De forma alternativa, pueden utilizarse también regiones constantes de inmunoglobulinas de la clase IgG de otros mamíferos, en particular de roedores o primates, pero pueden utilizarse según la invención también regiones constantes de las clases de inmunoglobulinas IgD, IgM, IgA o IgE. Típicamente, los fragmentos de anticuerpos contenidos en el constructo según la invención comprenden el dominio CH_{3} de la región Fc o partes del mismo y por lo menos secciones parciales del dominio CH_{2} de la región Fc. Opcionalmente, constructos de fusión según la invención que presentan el dominio CH_{3} y la región "hinge" como componente (A) para la dimerización también son posibles.

Sin embargo, pueden utilizarse también derivados de las secuencias de inmunoglobulinas que ocurren en su forma nativa, en particular las variantes que presentan por lo menos una sustitución, deleción y/o inserción (aquí denominadas globalmente con el término "variante"). Típicamente, las variantes de este tipo presentan una identidad de secuencia con la secuencia nativa de por lo menos un 90%, preferentemente de por lo menos un 95%, y de forma particularmente preferida de por lo menos un 98%. Las variantes particularmente preferidas son variantes de sustitución típicamente con menos de 10, preferentemente menos de 5 y de forma particularmente preferida menos de tres sustituciones en comparación con la secuencia nativa correspondiente. Entre las sustituciones que pueden citarse como preferidas, se incluyen: Trp por Met, Val, Leu, Ile, Fen, His, Tir o viceversa; Ala por Ser, Tre, Gli, Val, Ile, Leu o viceversa; Glu por Gln, Asp, Asn o viceversa; Asp por Glu, Gln, Asn o viceversa; Arg por Lis o vicevesa; Ser por Tre, Ala, Val, Cis o viceversa; Tir por His, Fen, Trp o viceversa; Gli o Pro por uno de los otros 19 aminoácidos nativos o viceversa.

Para la utilización para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento en útero, se prefieren en particular las modificaciones del tipo citado anteriormente si la unión a los receptores Fc en posición membrana queda por lo menos no perjudicada, o incluso optimizada. En cambio, cuando los constructos según la invención se utilizan para la preparación de un medicamento para la terapia postnatal, se prefiere minimizar o incluso eliminar su capacidad de unión a los receptores Fc. Puesto que los constructos de fusión según la invención deben contener, como el componente (A), secuencias que deben conservar su capacidad de unión para los receptores fisiológicos correspondientes para la sección constante de las inmunoglobulinas, los aminoácidos en el fragmento de anticuerpos de un constructo de fusión según la invención utilizado como componente (A) no estarán modificados en particular en las posiciones 230 a 240, más preferentemente en las posiciones 234 a 237 del dominio CH_{2}, o estarán provistos sólo de las variantes de secuencias que no perjudican el comportamiento de unión por ejemplo a los receptores Fc. En cambio, se prefieren sustituciones o deleciones en comparación con la secuencia nativa de las regiones constantes de las inmunoglobulinas en particular en las posiciones que dan lugar a una eliminación o introducción de sitios de glicosilación y una introducción o eliminación de puentes de disulfuro, que perjudican la estabilidad o solubilidad o mejoran el paso por la membrana celular, una vez efectuada la unión a los receptores Fc. Se prefieren en particular las variantes que no presentan modificaciones de la estructura o sólo modificaciones mínimas en comparación con el plegamiento tridimensional de la secuencia nativa. Una identidad estructural de este tipo (y por tanto homología funcional) puede determinarse registrando espectros adecuados, por ejemplo un espectro de dicroismo circular de la secuencia nativa o de la variante correspondiente. La curva de los espectros, especialmente en un intervalo de longitudes de onda medido entre 190 y 240 nm, permite determinar la identidad estructural en todo momento. En este contexto, se hace referencia en particular a la literatura corriente de los fabricantes de los aparatos de medición de DC (por ejemplo Jasco,
Japón).

En el extremo C-termial del fragmento de inmunoglobulina, un constructo de fusión según la invención contiene típicamente, pero no necesariamente, una zona de transición entre los componentes (A) y (B), que por su parte puede contener una secuencia de ligador, siendo dicha secuencia de ligador preferentemente una secuencia peptídica. Dicha secuencia peptídica puede presentar una longitud comprendida entre 1 y hasta 70, si se desea, también más aminoácidos, preferentemente entre 10 y 50 aminoácidos, y, de forma particularmente preferida, entre 12 y 30 aminoácidos. En las Figuras 1b a 1j, se han representado ejemplos de secuencias de transición particularmente preferidas (marcados adecuadamente en dichas figuras). La zona de ligador de la secuencia de transición puede ser enmarcado por otras secuencias peptídicas cortas, que pueden ser por ejemplo puntos de corte de restricción de ADN. Pueden utilizarse, para esto, todos los puntos de corte de restricción conocidos por los expertos en la técnica de la biología molecular. Las secuencias de ligador preferidas son secuencias artificiales que presentan un gran número de radicales de prolina (por ejemplo en cada segunda posición de la secuencia de ligador) y además de estos preferentemente los con un carácter global hidrófilo. Se prefiere una secuencia de ligador con un contenido de por lo menos un 30% de radicales de prolina. El carácter hidrófilo puede ser causado preferentemente por al menos un aminoácido con carga positiva, por ejemplo lisina o arginina, o carga negativa, por ejemplo aspartato o glutamato. En total, otra razón por la cual la zona de ligador presenta preferentemente un gran número de radicales de glicina y/o prolina es para conferir a la zona de ligador la flexibilidad y/o rigidez necesarias.

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Sin embargo, los ligadores utilizados pueden ser también secuencias nativas, por ejemplo los fragmentos de ligandos de la familia de ligandos TNF que están dispuestos en la zona extracelular, pero directamente en, es decir delante de, la membrana celular, si se desea, también después de una sustitución, deleción o inserción de las secciones nativas. Dichos fragmentos son preferentemente los 50 AA que siguen a la región transmembrana o subfragmentos de dichos primeros 50 AA. Sin embargo, se prefiere una identidad de secuencia de dichas secciones con las secuencias humanas naturales correspondientes de por lo menos un 85%, de forma particularmente preferida de por lo menos un 95%, y de forma especialmente preferida de por lo menos un 99%, con el fin de limitar la inmunogenicidad de dichas zonas de ligadores en la proteína de fusión según la invención y no provocar un reacción de defensa humoral endógena. Para los fines de la presente invención, la regla general es que la zona de ligador preferentemente no debería presentar inmunogenicidad alguna.

Sin embargo, alternativamente a las secuencias peptídicas unidas al fragmento de anticuerpo y al ligando TNF o un fragmento de un ligando TNF de este tipo a través de enlaces del tipo amida, también es posible utilizar compuestos del tipo no peptídico o del tipo seudopeptídico o que se basan en enlaces no covalentes. Entre los ejemplos de compuestos de este tipo, pueden citarse en particular ésteres de N-hidroxisuccinimido y ligadores heterobifuncionales, tales como por ejemplo N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP) o reticuladores similares.

En una proteína según la invención hacia la parte carboxi-terminal de la zona de transición sigue el componente (B). Para los fines de la presente invención, se prefieren fragmentos que presentan en particular la parte de la sección extracelular del ligando EDA1, situada por la parte carboxi-terminal más extrema. Con relación a la secuencia nativa de la sección extracelular de la proteína citada anteriormente, se hace referencia a las entradas correspondientes en la base de datos SwissProt (http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html).

Con relación a EDA1, se prefieren los fragmentos de los aminoácidos 140 a 391 o fragmentos más acortados en el extremo N-terminal (por ejemplo 157, 160, 181 ó 182 a 391), en particular 200 a 391, especialmente 245 a 391 o fragmentos acortados aún más en el extremo N-terminal (por ejemplo 246 a 391). Sin embargo, en la zona N-terminal de las secuencias contenidas en la proteína de fusión según la invención como componente (B), pueden utilizarse también todas las secciones de secuencias entre los intervalos citados anteriormente como preferidos, terminando una proteína de fusión según la invención en el extremo C-terminal típicamente con el extremo C-terminal nativo del ligando TNF EDA1. Sin embargo, si se desea, por lo menos un aminoácido, típicamente de 2 a 10, en casos raros también más de 10, aminoácidos pueden haberse eliminado por deleción en la zona C-terminal del fragmento extracelular EDA1 utilizado como componente (B) en la proteína de fusión según la invención.

El ligando TNF EDA1 contenido en la proteína de fusión según la invención puede presentar igualmente por lo menos una sustitución, deleción y/o inserción en comparación con la secuencia nativa, con el fin de desplegar efectos biológicos deseados, tales como por ejemplo solubilidad, estabilidad o una inmunogenicidad modificada. Alternativamente a la secuencia del ligando TNF nativa, en la proteína de fusión según la invención, puede utilizarse según la invención, como componente (B), una variante que presenta una identidad de secuencia típicamente de un 75%, preferentemente de un 85%, y de forma particularmente preferida de por lo menos un 95%, en comparación con la secuencia nativa, y despliegue la misma acción biológica y por tanto es en este sentido funcionalmente homóloga. Una identidad estructural de este tipo (y por tanto homología funcional) puede determinarse registrando espectros adecuados, por ejemplo un espectro de dicroismo circular de la secuencia nativa o de la variante correspondiente. La curva de los espectros, especialmente en un intervalo de longitudes de onda medido entre 190 y 240 nm permite determinar la identidad estructural en todo momento. En este contexto, se hace referencia en particular, a la literatura corriente de los fabricantes de los aparatos de medición de DC (por ejemplo Jasco, Japón).

Las variantes particularmente preferidas son variantes de sustitución típicamente con menos de 10, preferentemente menos de 5 y de forma particularmente preferida menos de tres sustituciones en comparación con la secuencia nativa correspondiente. Entre las sustituciones que pueden citarse como preferidas, se incluyen: Trp por Met, Val, Leu, Ile, Fen, His, Tir o viceversa; Ala por Ser, Tre, Gli, Val, Ile, Leu o vice versa; Glu por Gln, Asp, Asn o viceversa; Asp por Glu, Gln, Asn o viceversa; Arg por Lis o vicevesa; Ser por Tre, Ala, Val, Cis o viceversa; Tir por His, Fen, Trp o viceversa; Gli o Pro por uno de los otros 19 aminoácidos nativos o viceversa.

La invención se refiere asimismo a la utilización de una proteína de fusión según la invención para la preparación y confección de un medicamento para la reversión de enfermedades provocadas por causas genéticas. Dicha utilización según la invención es aplicable a todos los vertebrados con placenta, en particular en la medicina humana y veterinaria. Dicha utilización según la invención para la preparación de un medicamento es apta, tras un diagnóstico de una enfermedad provocada por causas genéticas en el embrión, por ejemplo por corionbiopsia o amniocentesis, o cuando se sospecha una enfermedad provocada por causas genéticas, debido a una disposición genética de parientes, en particular del padre y/o de la madre, para tratar el embrión y revertir su fenotipo heredo-genético ya como profilaxis. La utilización para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento se realiza a través de una proteína de fusión según la invención, tal como se ha descrito anteriormente, si se desea, en una confección adecuada, administrándose el medicamento idóneamente en el momento más temprano posible del embarazo a la madre o de la preñez al animal madre. Ventajosamente, la administración de una proteína de fusión según la invención de este tipo se realiza por vía parenteral, preferentemente por vía intravenosa o intraarterial.

Según la invención, una proteína de fusión según la invención del tipo descrito anteriormente se une como componente (A) a los receptores Fc de la placenta a través de su parte Fc, llegando de esta manera al embrión tras internalización, típicamente a través de los vasos de la placenta, que conectan el embrión a la circulación maternal.

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La dosificación depende de la enfermedad genética misma y del momento de administración (es decir, del estadio de desarrollo del embrión), siendo apto el medicamento preparado para el tratamiento en el momento más temprano posible del desarrollo del embrión. El medicamento preparado permite administrar constructos de Fc:ligando según la invención de este tipo, por ejemplo Fc:EDA1 o Fc:EDA2, por lo menos una vez, más preferentemente regularmente durante el primer, segundo y/o tercer mes del embarazo/preñez, de forma particularmente preferida por ejemplo cada segundo día durante por lo menos 14 días en caso del embrión humano, pero, si se desea, también en intervalos mayores, en función de la dosificación seleccionada.

Sin embargo, en principio, la dosificación de un constructo de fusión según la invención depende del procedimiento de tratamiento. En caso de ser utilizado para la preparación de un medicamento para el tratamiento del desarrollo embrionario, se recomiendan típicamente dosificaciones del constructo administrado de menos de una décima parte, preferentemente menos de una centésima parte y de forma aún más preferida menos de una milésima parte de la concentración nativa del ligando TNF en un neonato. En caso de ser utilizado para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un neonato o bebé con la proteína de fusión según la invención, las dosificaciones serán por lo menos 1/100, más preferentemente por lo menos 1/10 (siempre relativo a la actividad del ligando TNF) de la concentración de suero típica para un paciente sano de la misma edad.

La utilización de una proteína de fusión según la invención para la confección como medicamento en un procedimiento de este tipo es especialmente preferida cuando se administra un constructo de fusión según la invención que lleva en el extremo N-terminal del constructo de fusión una parte Fc y en el extremo C-terminal una sección del ligando TNF EDA1 como componente (B), en particular de EDA1 de origen humano, especialmente una sección extracelular de dichas proteínas que se extiende por lo menos del aminoácido 200 al aminoácido 391 (EDA1), de forma particularmente preferida del aminoácido 245 a 391 (EDA1). Los constructos de fusión según la invención de este tipo son aún más preferidos para la utilización correspondiente tal como se ha representado en las Figuras 1d.

Dichos constructos de fusión según la invención son aptos para revertir en la medicina veterinaria el fenotipo de la descendencia de los ratones tabby por tratamiento durante el embarazo/preñez. Según esto, la utilización de las proteínas de fusión según la invención para la preparación de medicamentos que son aptos para dicho procedimiento, es aplicable también al tratamiento terapéutico de la enfermedad humana análoga, es decir, una enfermedad genética que se basa en el mismo defecto genético, es decir, la displasia ectodérmica hipohidrótica ligada a X (XLHED, síndrome de Christ-Siemens-Touraine), la forma más frecuente de displasias ectodérmicas. XLHED se basa en un defecto del gen ED1, que corresponde en la medicina humana con el siguiente cuadro clínico: enanismo, demencia de grado distinto, nariz en silla de montar, anhidrosis, falta de dientes o desarrollo anormal de los dientes, hipertricosis o alopecia, o disfunción o falta de glándulas sudoríparas ecrinas, por lo cual las pacientes afectadas son especialmente sensibles a la hipertermia. Además de su aptitud para XLHED, los medicamentos según la invención son aptos también para otras displasias ectodérmicas basadas en otras causas heredogenéticas.

Por tanto, la presente invención se refiere asimismo a la utilización de los constructos de fusión según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades provocadas por causas genéticas en el ser humano y los animales, siendo aptos en particular los constructos de fusión según la invención que contienen secciones del ligando TNF EDA1, por ejemplo, constructos de fusión según la Figura 1d, generalmente para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de anomalías de la piel provocadas por causas genéticas, en particular anomalías de la estructura de la piel o también anomalías de las estructuras ectodérmicas, tales como por ejemplo las anomalías del pelo, de los dientes o de las glándulas (anhidrosis o dishidrosis de diferente génesis). Un ejemplo que puede citarse es la utilización de los constructos de fusión según la invención para la preparación de un medicamento en el sector cosmético, por ejemplo para el tratamiento de alopecia (adquirida por ejemplo en forma de alopecia areata, alopecia atrófica, alopecia seborreica o alopecia prematura) o innata (especialmente como síndrome de la anhidrosis hipotricótica) o hirsutismo. Sin embargo, los constructos de fusión según la invención pueden utilizarse también generalmente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de todas las formas de displasias ectodérmicas. Por tanto, los constructos de fusión según la invención, en particular los en los que participa EDA1, son aptos para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la estimulación del crecimiento del pelo, de la inhibición del crecimiento del pelo, el tratamiento de trastornos de crecimiento de los dientes o también para el tratamiento de trastornos de la función de glándula, incluidas las glándulas sudoríparas y/o sebáceas, o también para la formación de folículos pilosos o para la curación de heridas, en particular para la curación de heridas de pacientes para asegurar un crecimiento del pelo adecuado en la parte del pelo afectada. Los constructos de fusión según la invención de este tipo pueden utilizarse para la preparación de un medicamento para ser administrado al paciente, preferentemente en fase postnatal, de forma particularmente preferida en la terapia humana dentro del primer año de vida, de forma aún más preferida durante los primeros 6 meses de vida, de forma aún más preferida durante los primeros dos meses de vida, de forma aún más preferida durante las primeras 2 semanas de vida, de forma aún más preferida durante los primeros 3 días tras el nacimiento, o para ser administrado a la madre embarazada (o al animal madre preñada), por ejemplo, por inyección en útero. Por tanto, los constructos de fusión según la invención pueden utilizarse también para la preparación de un medicamento para el tratamiento de los síndromes citados anteriormente, enfermedades genéticas o trastornos durante el desarrollo embrionario por administración a la madre o al animal madre, con la excepción de los procesos en los que la identidad genética de la línea germinal del ser humana queda modificada.

En caso de preparar un medicamento destinado al tratamiento en particular de la alopecia o en particular para la curación de heridas, por ejemplo tras quemaduras de la piel o enfermedades de la piel inflamatorias, por ejemplo durante el tratamiento de partes de la piel neurodermíticas o afectadas de forma atópica, en particular del cuero cabelludo, utilizando los constructos según la invención, también es posible la administración de los mismos a adultos, si se desea, utilizando sustancias auxiliares, vehículos o aditivos adicionales, si se desea, también otras sustancias activas (por ejemplo para el tratamiento de alopecia: relaxina, sustancias con efecto antiandrógeno, por ejemplo finasterida, SKL-105657, estrógeno, acetato de ciproterona, espironolactona, flutamida, minoxidil y/o RU58841), por ejemplo por administración intravenosa o intraarterial o subcutánea, tras procesamiento (confección) adecuado, pero también por vía oral o como crema, loción, ungüento para la aplicación tópica.

Otro campo de aplicación posible de los constructos según la invención es su utilización durante la preparación de tejido de la piel ex vivo. Por ejemplo, los constructos según la invención pueden utilizarse, por ejemplo en forma de proteínas, ácidos nucleicos o vectores de expresión para (re)generar la funcionalidad natural de la piel de pacientes que sufren de enfermedades de la piel (por ejemplo úlceras diabéticas) o quemaduras con la formación de glándulas ecrinas, folículos pilosos y pelo. Esto se consigue adicionando los constructos según la invención a células o tejidos in vitro. Por ejemplo, los constructos según la invención pueden utilizarse dentro del procedimiento tradicional de "skin grafting", es decir, por ejemplo el tejido de la piel autólogo no enfermo del paciente, el tejido de la piel alógeno de personas fallecidas o de donantes ajenos o el tejido de animales puede estimularse, antes de ser trasplantado, por tratamiento con los constructos de fusión según la invención para la formación de folículos pilosos, glándulas ecrinas, por ejemplo dentro de un tratamiento previo o dentro de un cultivo extracorpóreo, Sin embargo, también es posible aislar células precursoras multipotentes a partir del tejido de la piel no enfermo (o de otro tejido) del paciente mismo. Dichas células se convierten en tejido de la piel adicionando factores de diferenciación adecuados. Dichas células precursoras multipotentes pueden transfectarse por transfecciones adecuadas con las secuencias según la invención o vectores de expresión, o bien a las mismas pueden adicionarse constructos de fusión durante la formación del tejido de la piel. Esto permite utilizar los constructos según la invención en el denominado "tissue engineering" (ingeniería tisular, cultivo tisular), antes de retrasplantar el tejido cultivado al paciente. En principio, a tal fin, primero se aísla el tejido a trasplantar (célula precursora, célula madre, célula tisular (en particular queratinocitos de la epidermis) o células madre embrionarias no humanas (autólogas o alógenas) y, a continuación, se cultiva en un sistema abierto en una matriz (natural, sintética o xenógena) o estructura biodegradable, adicionando un suministro suficiente de las células con nutrientes, oxígeno, factores de crecimiento y los constructos según la invención y eliminando los metabolitos nocivos. Por ello, la presente invención se refiere también a un procedimiento in vitro para el cultivo de tejido de la piel que presenta glándulas ecrinas y un crecimiento del pelo natural.

La presente invención ser refiere también a los constructos de ADN recombinantes que forman la base de las proteínas de fusión según la invención. Para los fines de la presente invención, los constructos de ADN y de proteínas se tratarán juntos bajo el término "constructo de fusión". Así, por ejemplo, un constructo de nucleótidos según la invención puede codificar para los dominios CH2 y CH3 de IgG como componente (A) y EDA1, si se desea, ligados por una zona de transición que contiene un ligador. Por tanto, las secuencias de nucleótidos recombinantes según la invención que sirven de base codifican para todos los constructos de fusión de proteínas según la invención que se han citado anteriormente. Se prefieren en particular las secuencias de nucleótidos de los constructos de fusión citados en la Figura 1d. Los constructos de nucleótidos según la invención pueden obtenerse por medio de procedimientos de clonaje o por síntesis química como ADNc, ADN genoma o en forma sintética, para los que son aptos un gran número de procedimientos del estado de la técnica. Con relación a las secuencias del dominio de la parte Fc de inmunoglobulinas que pueden ocurrir en un constructo de nucleótidos según la invención, se hace referencia por ejemplo a la publicación "Sequences of Proteins of Immunologic Interest", 1st Edition, Kabat et al., US Department of Health and Human Services, 1991'', incorporándose dicha publicación con todo su contenido en la presente memoria de patente por referencia.

Las secuencias contenidas en un constructo de nucleótidos según la invención estarán típicamente presentes en segmentos ligados por restricción y ligación. Típicamente, una secuencia de nucleótidos según la invención contendrá secuencias controladoras de la expresión que están unidos operativamente a la secuencia de nucleótidos para una proteína de fusión, e incluirá promotores, sitios de unión de ribosomas, sitios de poliadenilación, y/o sitios de terminación de transcripción y, si se desea, enhancers. Una proteína de fusión según la invención puede expresarse, por ejemplo en vectores plasmídicos, en células bacterianas, células de levadura, células de plantas, células de insectos y preferentemente células de mamíferos por transfección de segmentos de ADN que contienen elementos reguladores de este tipo, utilizando, por ejemplo, el procedimiento de fosfato cálcico, electroporación o técnicas similares. Para la expresión en células eucarióticas, se utilizarán el promotor y, si se desea, la secuencia de enhancer por ejemplo de genes de inmunoglobulina, SV40, retrovirus, citomegalovirus, del factor de elongación 1\alpha, etc. Las líneas de células huésped preferidas comprenden células CHO, células COS, células Hela, células NIH3T3 y varias líneas de células mieloma o hibridoma, incluidas P2/0 y NS/0. La presente invención se refiere tanto a las secuencias de ADN según la invención de este tipo que codifican para una proteína de fusión recombinante según la invención como a los vectores de expresión que contienen una secuencia de ADN de este tipo y a las células huésped transfectadas con un vector de expresión según la invención de este tipo.

El vector plasmídico que contiene un constructo de ADN según la invención contendrá por lo general un marcador seleccionable, tales como por ejemplo gpt, neo, hig o DHFR, y un gen amp, tet, kan, etc., para su expresión en E. coli. Un gran número de vectores plasmídicos que son aptos para la expresión de proteínas heterólogas están disponibles en el estado de la técnica. Ventajosamente, una proteína de fusión según la invención contiene una secuencia N-terminal, por ejemplo una secuencia constituida por hemaglutinina y/o secuencias tag y/o por lo menos otra secuencia "LEADER" en el extremo amino-terminal de la proteína de fusión, con el fin de facilitar la secreción de las proteínas de fusión hacia fuera de la célula, en particular el paso al espacio extracelular o al medio a través del RE.

Los procedimientos para la construcción de constructos de nucleótidos según la invención que codifican para los constructos de proteína según la invención, su ligación con secuencias de control de expresión y/o su inserción en plásmidos, su transfección en células y la selección y opcionalmente amplificación génica de la línea de célula que expresa la proteína de fusión puede realizarse por medio de procedimientos conocidos de la ingeniería génica, incluidas la digestión de las enzimas de restricción, ligación, síntesis de oligonucleótidos y reacción PCR (Sambrook et al, Molecular Cloning: Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), incorporándose dicha publicación al respecto con todo su contenido por referencia.

Una línea de células transfectada que expresa y secreta una proteína de fusión según la invención se selecciona y puede, si se desea, cultivar en un medio libre de suero (hibridoma SFM), reduciendo continuamente la concentración, y puede finalmente subclonarse. La proteína de fusión según la invención puede ser purificada después de la selección a partir del medio preferentemente libre de suero en el que la línea de célula se ha cultivado. Los procedimientos estándares para la purificación de proteínas comprenden la filtración, precipitación, cromatografía de afinidad de proteína A, filtración en gel, cromatografía de intercambio de iones, procedimientos electroforéticos o similares. Las fracciones sustancialmente puras de la proteína de fusión con una homogeneidad comprendida por lo menos entre un 90 y un 95% y preferentemente por lo menos entre un 98 y un 99% o más alta se utilizan a continuación preferentemente para su utilización farmacéutica.

La preparación de un medicamento que contiene la proteína de fusión según la invención típicamente incluye su formulación en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Típicamente, dicho vehículo será un vehículo acuoso, utilizándose agua para su inyección (WFI) o agua en un tampón de fosfato, citrato, o acetato, etc. y ajustándose el pH a un valor comprendido típicamente entre 5,0 y 8,0, preferentemente entre 6,0 y 7,0. El vehículo farmacéuticamente aceptable contiene además preferentemente componentes de sal, por ejemplo cloruro sódico, cloruro potásico u otros componentes que hacen la solución isotónica. Además, el vehículo puede contener componentes adicionales, tales como por ejemplo albúmina de suero humana, polisorbato 80, azúcar o aminoácidos. Una composición de este tipo según la invención puede combinarse en forma de una inyección o también de un kit en una combinación adecuada con un vehículo farmacéuticamente aceptable o un mediador, tal como por ejemplo agua esterilizada o solución fisiológica de cloruro sódico, aceites vegetales, aceites minerales, alcoholes de alto peso molecular, ácidos de grasa de alto peso molecular, disolventes orgánicos no tóxicos y proveerse, si se desea, de aditivos adicionales. Entre los ejemplos de aditivos adicionales aptos, se incluyen cargas (por ejemplo sacáridos (lactosa, sucrosa, manitol o sorbitol), fosfato cálcico, celulosa o sus derivados), aglutinantes (por ejemplo almidón, gelatina, polivinilpirrolidina), estabilizantes, conservantes, antiadsorbentes, sustancias tensoactivas, colorantes o aromatizantes, emulsionantes, tampones, agentes isotónicos, antioxidantes, analgésicos o similares. Preferentemente, en las formulaciones se incorporan por ejemplo alginato sódico, polietilenglicol y/o dióxido de titanio. Las formulaciones correspondientes de un medicamento son conocidas de Remington (1980), a la que se hace referencia al respecto.

La concentración de la proteína de fusión según la invención en las formulaciones de este tipo puede variar en un intervalo amplio comprendido entre 0,001 y 10 mg por ml, preferentemente en un intervalo comprendido entre 0,5 y 5 mg/ml. La formulación se inyecta al paciente o a la madre embarazada preferentemente por vía parenteral, es decir, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular. Alternativamente, en un tratamiento por medio de un procedimiento según la invención, también es posible introducir la formulación directamente en el sistema de vasos de la placenta del embrión o inyectarla en la bolsa amniótica.

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A continuación, la invención se ilustrará con mayor detalle por medio de las siguientes figuras:

La Figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los constructos Fc:ligando.

La Figura 1a representa esquemáticamente a título de ejemplo las secciones de secuencia de los constructos Fc:ligando. En la parte N-terminal de una proteína de fusión codificada por una secuencia de nucleótidos que sirve de base, se encuentra típicamente un péptido señal, seguido de una sección Fc de IgG (componente (A)), seguida de una zona de ligador (opcional), por la parte más C-terminal seguida de una secuencia de punto de corte de proteasa (opcional), y por la parte más C-terminal (y en el extremo C-terminal de un constructo de fusión según la invención) seguida de una secuencia que típicamente representa una secuencia parcial de un miembro de la familia de ligandos de TNF (componente (B)). Dicha secuencia parcial que sirve de componente (B) incluye otra vez típicamente la parte C-terminal de la sección extracelular de un ligando de la familia TNF.

Las subfiguras 1b a 1j muestran secuencias específicas de constructus utilizando varios miembros de la familia de los ligandos de TNF, es decir, FasL (Figuras 1b y 1c, con y sin punto de corte de proteasa), EDA1 y EDA2 (Figuras 1d y 1e), TNFa (Figura 1f), CD40L (Figura 1g), TRAIL (Figura 1h), BAFF (Figura 1j) y APRIL (Figura 1i). Las secuencias parciales de los miembros de la familia de ligandos de TNF citados anteriormente son todas de origen humano y presentan cada una las secciones de secuencias extracelulares situadas en el extremo C-terminal de los ligandos nativos hasta el extremo C-terminal nativo. El dominio Fc situado en el extremo N-terminal (componente (A)) está unido a la sección del ligando TNF (componente (B)) situada en el extremo C-terminal de la proteína de fusión a través de una región de ligador que contiene los aminoácidos PQPQPKPQPKPEPE. Además de esto, las secuencias de los constructos de fusión según la invención representadas en las Figuras 1b, 1i y 1j contienen un punto de corte de proteasa, cada uno con la secuencia LEVLFQGP, por lo cual la proteasa PreSCISSION (Amersham-Pharmacia) es capaz de cortar los constructos de fusión provistos de un punto de corte de proteasa de este tipo, permitiendo separar el dominio de inmunoglobulina del constructo de fusión de la sección de ligando TNF. Sin embargo, entre las secuencias aptas como puntos de corte de proteasa, se incluyen todas las secuencias con una longitud de por lo menos 4 AA que pueden ser reconocidas por cualquier proteasa, por ejemplo una proteasa de cisteína o aspartato. Entre el dominio Fc y el ligador o el ligador y el dominio del ligando TF, pueden estar presentes otras secuencias, típicamente cortas, es decir, con una longitud de dos a ocho aminoácidos. Las secuencias de las Subfiguras 1b a 1j, contienen los aminoácidos ARG-SER entre la sección Fc y y el ligador, mientras que en las Subfiguras 1c, 1d, 1e, 1f y 1h, en el extremo C-terminal del componente (B), se encuentra por lo menos el tetrapéptido GSLQ, si se desea, prolongado en el extremo C-terminal de Q con otros aminoácidos. Los constructos de fusión que presentan también un corte de fusión de proteasa, es decir, los constructos de fusión de las Figuras 1b, 1i y 1j contienen el tetrapéptido citado anteriormente en el extremo C-terminal del punto de corte de proteasa. El ligador y el punto de corte de proteasa estarán separados entre sí típicamente por lo menos por dos aminoácidos, según la figura por el dipéptido GS. Toda la zona entre el componente (A) y el componente (B) se denomina zona de transición.

Todos los constructos de fusión de las Figuras 1b a 1j presentan en el extremo N-terminal, es decir, en el extremo N-terminal del dominio Fc un pentadecapéptido (MAIIYLILLFTAVRG), que corresponde en los casos representados a una secuencia de hemaglutinina. En todos los casos representados, dicha secuencia señal está unida a la sección Fc del constructo de fusión a través del dipéptido LD (componente (A)).

Las secuencias unidas de las Figuras 1b a 1j no enmarcadas corresponden típicamente a puntos de corte de enzimas de restricción utilizadas para unir los componentes de secuencia individuales.

Todos los constructos de fusión representados en las subfiguras se clonaron en un vector de expresión PCR-3 de mamífero (Invitrogen).

La Figura 2 muestra una representación de Western Blot en la que se ha representado la purificación del constructo de fusión Fc:FasL. La proteína purificada (5 \mug/traza) se investigó en condiciones reductoras (+DTT) o no reductoras (-DTT) en SDS-Page de 12%, utilizando el constructo de fusión TRAILR2:Fc (es decir, un constructo de un dominio de inmunoglobulina y de un receptor de TNF) como control en las trazas indicadas por encima del Western Blot con una marca (+). A mano izquierda del Western Blot se han indicado marcas del peso molecular en kDa y a mano derecha del Western Blot se han indicado con una marca de flecha los pesos moleculares (110 kDa y 57 kDa, respectivamente) para el constructo de fusión Fc:Fas, que varían, como es de esperar, en función de la formación de puentes de disulfuro (sólo en condiciones no reductoras).

La Figura 3 representa el resultado de la cromatografía de permeación en gel. A tal fin, Fc:FasL (300 \mug en 200 \mul de PBS) se aplicó a una columna Superdex-200 equilibrada en PBS y se eluyó con una velocidad de 0,5 ml/min. El perfil UV se registró "online" a 280 nm y se recogieron fracciones de 0,5 ml en cada caso. La posición de elución se ha trazado por debajo de la Figura 3, y el peso molecular (m kDa) y los estándares de calibración se han indicado por encima del perfil. El peso molecular aparente de los dos picos de Fc:FasL se derivó de las curvas de calibración trazadas en la representación derecha de la Figura 3. El resultado se ha representado por encima de los dos picos (850 kDa y 440 kDa, respectivamente). Por debajo del perfil, se han representado las cotas de las fracciones examinadas en su orden de elución.

En la Figura 4, se han representado las fotos tomadas con microscopio electrónico en el orden de las subfiguras de FasL (Figura 4a), de ACRP\Delta-FasL (Figura 4b), ACRP-FasL (Figura 4c) y finalmente Fc-FasL (Figura 4d). Cada una de las subfiguras individuales contiene preparaciones distintas de las secuencias de aminoácidos inyectadas en vistas de arriba alternativas, estando representada por debajo de las grabaciones una interpretación esquemática de la foto tomada con microscopio electrónico. De las fotos tomadas con el microscopio electrónico según la Figura 4a se obtiene un modelo de puntos para FasL (3 ch, es decir, el trímero esperado del FasL multimerizante), para ACRP\Delta-FasL (Figura 4b) un modelo en forma de barra con un extremo en forma de punto, marcando el punto el componente FasL y la forma en barra el dominio de colágeno de ACRP\Delta. Según la Figura 4c, para ACRP:FasL se obtiene una estructura en forma de cerezas gemelas de dos barras conectadas (dominio de colágeno ACRP30 con la adición del dominio FasL). Finalmente, por la Figura 4d, puede apreciarse la estructura de Fc:FasL, donde los puntos claros representan FasL y los puntos oscuros la parte Fc de IgG1. La línea blanca que conecta las diferentes subunidades reproduce su conectividad.

La Figura 4e es una representación en forma de modelo de la estructura tridimensional de un complejo Fc:ligando. Para el ligando se seleccionó la estructura de linfotoxina A (número de acceso PDB: 1TNR) y para el componente Fc de IgG 2a (número de acceso PDB: 1IGT).

La Figura 5 muestra la especificidad de la unión de los ligandos Fc con sus respectivos receptores. En este caso, la unión de los ligandos a sus receptores (en forma de la proteína de fusión constituida por el receptor y la proteína COMP) por medio de un ELISA, utilizando las siguientes etapas: (a) recubrimiento con IgG murina anti-humana, (b) adición de los ligandos Fc correspondientes en la concentración deseada (como sobrenadantes celulares), (c) adición del constructo de fusión correspondiente constituida por el receptor y la proteína COMP (que en cada caso lleva una marca del tipo "tag" y se adicionó también como sobrenadante celular), (d) adición del anticuerpo monoclonal anti-tag biotinilado, (e) adición de esteptavidina ligada a "horse raddish peroxidase" (peroxidasa de rábano picante, HRP), (f) desarrollo de la coloración del ensayo por adición del reactivo OPD y medición de la absorbancia a 490 nm.

Por los diagramas representados en la Figura 5, puede apreciarse claramente que existe una fuerte especificidad de los constructos de fusión para los receptores de TNF específicos respectivos de los ligandos (o secciones de ligandos) contenidos en el constructo según la invención, es decir, de FasL para Fas, de Trail para Trail R2, de EDA1 para el receptor EDA, y, como era de esperar, de BAFF y APRIL para el receptor BCMA aquí bifuncional, de TNF para TNFR2 y de CD40L para CD40R. Esto significa que la representación como constructo con una parte Fc no repercute en el comportamiento de unión del componente (B) de un constructo al receptor correspondiente.

La Figura 6 representa los resultados de los experimentos de unión con Fc:BAFF. Según la Figura 6a, células BJAB (células BAFF-R positivas) y células HED-293 (células BAFF-R negativas) se incubaron en un volumen final de 100 microlitros con 0,05, 0,2, 0,5, 2,5, 20 ó 50 \mul de sobrenadantes celulares que contenían Fc:BAFF. El Fc:BAFF unido se identificó por medio de un anticuerpo antihumano conyugado con PE y análisis de FACS. El resultado de una cuantificación de la fluorescencia media (MFI) se muestra en la representación derecha de la Figura 6a. Tras el análisis de las aplicaciones directas de las células BAFF-R negativas y HEK 293, puede apreciarse claramente por la aplicación secundaria (Figura 6a, extremo derecho) que la fluorescencia media como medida de la unión a las células en caso de las células BJAB aumenta claramente, mientras que las células BAFF-R negativas y HEK-293 no presentan una fluorescencia media sustancialmente aumentada incluso cuando las concentraciones de Fc:BAFF según la invención son altas. Esto quiere decir que la unión de Fc:BAFF no esperada a las células BAFF-R negativas no se produce, al contrario de la situación con las células BAFF-R positivas.

En la Figura 6b, se han representado los resultados de los experimentos de inmunoprecipitación. A tal fin, células BJAB (5x10^{7} por experimento) se incubaron en 2 ml de un medio en presencia de 3 \mug de Fc:FasL o de Fc:BAFF durante 15 minutos. Las células se cosecharon, se lavaron en PDS, se lisaron en un tampón de lisis (que contiene NP-40 al 1%) y se sometieron a una inmunoprecipitación con proteína-A-sefarosa. Los IPs y los extractos celulares totales se analizaron por medio de la técnica de Western Blot utilizando anticuerpos monoclonales murinos anti-hBAFF-R. Resulta que las células BJAB BAFF-R positivas se unen a Fc:BAFF durante la incubación (traza derecha en la Figura 6b) y, por tanto, pueden detectarse en la mezcla de IP a través de anticuerpos adecuados.

En la Figura 7, se ha representado la citotoxicidad de Fc:FasL, utilizando diluciones en serie de Fc:FasL según la invención (opcionalmente el material introducido en la columna, la fracción de 850 kDa y la fracción de 440 kDa, tal como se ha representado en la Figura 3). Dichas diluciones en serie se pusieron sobre células Jurkat sensitivas a FasL y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. A continuación, la viabilidad de las células se observó por medio de un ensayo PMS/MTS. Resulta que tanto la fracción total como las fracciones individuales presentan un perfil muy similar con relación a la supervivencia de las células.

La Figura 8 muestra las diferencias fenotípicas entre ratones tabby tratados según la invención con Fc:EDA1 (ver la Figura 1d) y ratones tabby sin tratar 10 días tras su nacimiento. Como control servían ratones WT (a mano derecha). A tal fin, a ratones tabby preñados, se les inyectaron 400 \mug de Fc:EAD1 los días 11, 13 y 15 de su preñez. Se examinaron las descendencias de ratones tabby tratados, ratones tabby sin tratar y ratones de tipo salvaje (WT). La Figura 8a se centra en la apariencia de la parte de la oreja, en particular en el crecimiento del pelo. El crecimiento del pelo en los animales tratados corresponde al crecimiento del pelo en los animales WT. Igual que en los ratones WT, la parte de la cola de los ratones tratados también presenta tanto una pilosidad correspondiente como la forma usual. La diferencia de los ratones sin tratar es directamente obvia.

La Figura 8b muestra imágenes de cortes de tejido histológicos de la región retroauricular, del lado corporal, de la cola y de la garra en parafina utilizando una coloración de hemotoxilina y eosina. Por debajo de la oreja de los ratones tabby sin tratar puede apreciarse una región calva pronunciada. Con relación a su fenotipo, los ratones tabby tratados se parecen a los ratones WT. El lado corporal de los ratones tabby tratados muestra un aumento del número de los folículos pilosos de tipo salvaje (WT) frente a los ratones tabby sin tratar. En la zona de la cola, los ratones tratados presentan la misma pilosidad que los ratones WT. En cambio, los ratones tabby sin tratar carecen de pelo por la zona de la cola. En el tejido de la garra de los ratones tratados (centro), pueden apreciarse, indicadas por flechas, glándulas sudoríparas igual que en los animales WT. En cambio, los ratones tabby sin tratar no han desarrollado glándulas sudoríparas.

Las siguientes características se compararon:

En la Figura 9, se han comparado los resultados del tratamiento de ratones tabby en útero con el constructo según la invención según la Figura 1 d y de los animales de control correspondientes.

La Figura 9a muestra una comparación de ratones tabby tratados (centro) y de ratones tabby sin tratar (a mano izquierda) adultos (6 semanas tras su nacimiento). El tratamiento se realizó tal como se ha representado según el Ejemplo de Realización 4. A mano derecha, se ha incluido la apariencia de ratones sanos como control. Los animales tratados presentan la misma piel que los animales WT (también en la parte crítica de la cola), la cola de los ratones tratados no presenta una apariencia dentellada, el pelo de los ratones tratados muestra el tipo de pelo "monótrico" típico en particular para los ratones WT, especialmente un pelo de cubierta largo monótrico, que está ausente por completo en los ratones tabby sin tratar.

La Figura 9b compara la estructura de mandíbula y de dientes de los ratones tabby tratados, no tratados y ratones WT. Los ratones tabby sin tratar presentan una estructura de mandíbula anormal, y los dientes también presentan deformaciones, en particular cúspides poco pronunciados. El tratamiento por medio del procedimiento según la invención durante el periodo de preñez (tratamiento del animal madre) ha sido capaz de restaurar la forma dental natural.

La Figura 9c muestra unos cortes de tejido del párpado y de la cornea de ratones sin tratar, ratones tabby tratados según la invención con Fc:EDA1 y animales WT de control. En los ratones tabby sin tratar, faltan las glándulas Moebius del párpado de forma característica. Sin embargo, tras un tratamiento según la invención, dichas glándulas reaparecen. Dicha regeneración de las glándulas Moebius también evita la queratinización de la cornea, tal como ocurre en los ratones tabby sin tratar, lo cual puede apreciarse claramente por el corte de tejido según la Figura 9c.

En la Figura 9d, se han representado los resultados de las pruebas del sudor, que demuestran que en los ratones tabby tratados según la invención pueden observarse glándulas sudoríparas funcionales en la garra, que están principalmente ausentes en los ratones tabby sin tratar. Glándulas sudoríparas recuperadas de este tipo tras un tratamiento con Fc:EAD1 permiten comprobar las reacciones fisiológicas típicas a estímulos tales como por ejemplo calor y estrés. La prueba del sudor misma se ha descrito en el Ejemplo de forma de Realización 4.

La Figura 10 representa los resultados del tratamiento postnatal intraperitoneal de los ratones tabby con el constructo de fusión según la invención Fc:EDA1 en comparación con ratones tabby sin tratar y animales WT de control.

En la Figura 10a, se han comparado distintas partes corporales en los tres grupos de animales citados anteriormente con relación a su fenotipo. La parte de la piel detrás de las orejas no presentó pilosidad alguna incluso en los animales adultos tratados postnatalmente al contrario de los animales WT. En cambio, una inyección postnatal de Fc:EDA1 permitió regenerar por un lado casi por completo la pilosidad de la cola igual que en los animales WT y por otro lado el tamaño de la abertura de los ojos típica de los animales WT. El tratamiento postnatal según la invención permitió eliminar casi por completo la forma de cola "doblada". Además de esto, los cortes de tejido de la cola colorados con hemotoxilina y eosina muestran tanto un gran número de folículos pilosos como glándulas sebáceas asociadas a los folículos pilosos.

La Figura 10b representa los fenotipos de los tres grupos con relación a las glándulas sudoríparas de las garras tanto microscópica como macroscópicamente. Se observaron un gran número de glándulas sudoríparas en las garras tras el tratamiento de los animales tabby adultos tratados postnatalmente, que eran distinguibles de las glándulas sudoríparas de los animales WT, tal como puede apreciarse por los cortes de tejido de la Figura 10b colorados con hemotoxilina y eosina. Dichas glándulas sudoríparas en los animales tabby tratados resultaban funcionales en una prueba del sudor correspondiente y respondían a estímulos tales como por ejemplo calor o estrés.

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Por tanto, en resumen, puede constatarse que la reversión del fenotipo observada tras el nacimiento - en caso de un tratamiento en útero - ya no desaparece en el animal adulto igual que las reversiones del fenotipo que ocurren tras un tratamiento postnatal con las sustancias según la invención en el animal joven se mantienen también en el animal adulto.

A continuación, la presente invención se ilustrará con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos de formas de realización.

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Ejemplos de formas de realización

1. Ejemplo de Forma de Realización 1

Preparación de proteínas de fusión Fc:ligando

Las proteínas de fusión según la invención preferidas se componen de una parte Fc de inmunoglobulina humana (componente (A)), en la que la secuencia de ADN que sirve de base no contiene el codón de parada del fragmento de inmunoglobulina, y de una sección C-terminal de un fragmente de una familia de ligandos de TNF (componente (B)) (con el codón de parada de la secuencia de ADN que sirve de base). Las proteínas de fusión según la invención preferidas presentan la siguiente estructura: en el extremo N-terminal, se encuentra un péptido señal, luego siguen una sección Fc, por ejemplo de IgG, una zona de transición, que contiene una zona de ligador y un punto de corte de proteasa y una sección C-terminal del ligando TNF EDA1. Una representación esquemática de una proteína de fusión según la invención se ha representado en la Figura 1d.

Para la preparación de una proteína de fusión según la invención, por ejemplo de una proteína de fusión que presenta una estructura preferida según la Figura 1d, se clonaron constructos de ácido nucleico en vectores de expresión de mamíferos y se expresaron en líneas celulares de riñón humanas embrionarias estables (en células HEK-293 o CHO (Chinese hamster ovary)). Las proteínas de fusión recombinantes secretadas se obtuvieron a partir del medio acondicionado por cromatografía de afinidad sobre una columna de proteína-A-sefarosa. Los rendimientos eran de varios mg por litro del medio utilizado.

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2. Ejemplo de Forma Realización 2

Caracterización bioquímica de Fc:FasL

La caracterización bioquímica de Fc:FasL se realizó por análisis de SDS-PAGE, que dio un peso molecular aparente de 57 kDa y aproximadamente 110 dDa en condiciones reductoras y no reductoras, respectivamente. Esto demuestra la presencia de dímeros (2 ch) unidos a través de puentes de disulfuro, tal como era de esperar de proteínas de fusión que contienen Fc y una "región hinge" (ver también la Figura 2).

Una investigación a tal efecto por cromatografía de permeación en gel demostró que se eluyeron dos picos bien definidos de Fas:FasL con un peso molecular aparente de aproximadamente 440 kDa (pico principal) y aproximadamente 850 kDa (pico secundario) (ver la Figura 3). Suponiendo una forma globular de Fc:FasL, la estructura multimérica calculada de FasL era de 7,7 (7,7 ch) para la especie principal en el perfil de elución. En caso de una proteína globular que no corresponde al tipo ideal, este cálculo se basa con gran probabilidad en una sobreestimación del peso molecular, con lo cual un estructura de ligando dimérica (6 ch) sería absolutamente posible. La forma de Fc:FasL, que corresponde al pico de 440 kDa, se examinó por microscopia electrónica, utilizándose para fines comparativos FasL (3 ch), ACRP30:FasL oligomérico (6+ ch) y una mutante de deleción de ACRP30:FasL, es decir, ACRP\Delta-FasL (3 ch). FasL (3 ch) presenta una forma similar a una pelota (ver la Figura 4a), ACRP\Delta-FasL presenta una forma similar a una pelota con un "mango" (ver la Figura 4b) y ACRP30:FasL parece una "cereza gemela", lo cual coincide como resultado con una estructura de FasL dimérica (6 ch) (ver la Figura 4c).

Normalmente, Fc:FasL adopta una estructura anular con 5 "pelotas" o una estructura abierta con 5 "pelotas" (ver la Figura 4d). Esto corresponde otra vez a un FasL dimérico (6 ch), siendo las dos pelotas FasL y los tres pelotas restantes los componentes Fc de IgG (3 dímeros de polipéptido: 6 ch). Una representación en forma de modelo de un ligando de Fc se desarrolló utilizando la estructura cristalina conocida de linfotoxina a (un miembro de la familia de TNF) y del componente Fc de IgG2a (números de acceso PDB 1TNR y 1IGT), en la que la zona de ligador se ha trazado como línea continua (ver la Figura 4e). Esto demuestra claramente que los ligandos y las partes Fc son aproximadamente de tamaños similares, coincidiendo con la estructura de 5 pelotas observada de Fc:FasL. En total, estos resultados indican que el pico de 440 kDa de Fc:FasL es un FasL dimérico (6 ch).

En la presente memoria, "ch" representa "chain" y por tanto refleja el número de cadenas del ligando TNF (por ejemplo APRIL, FasL, BAFF, EDA o Tweak) en la molécula (independientemente del hecho de si se considera una proteína de fusión o no). Si un ligando TNF está presente en forma trimérica, presentará tres cadenas (3 ch), mientras que un dímero de un ligando (por ejemplo, a través de la construcción Fc según la invención) comprenderá 6 cadenas de ligando (6 ch).

La caracterización de las secuencias de proteínas de fusión según la invención restantes representadas en las Figuras 1b a 1j se realizó de forma análoga.

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3. Ejemplo de Forma de Realización 3

Actividad biológica de los constructos Fc:ligando in vitro

Según la invención, se desarrolló un ensayo basado en ELISA para investigar las propiedades biológicas de los constructos de Fc:ligando, es decir, su unión a sus receptores respectivos. En dicho ensayo, se captaron los constructos de Fc:ligando en primer lugar con un anticuerpo monoclonal murino antihumano de IgG. En una segunda etapa, se fusionaron los receptores solubles con el dominio de oligomerización del "cartilage oligomeric matrix proteína" (COMP) (ver los documentos DE 19963859 y DE 10122140, que cada uno con todo su contenido se incorporan en la presente memoria de patente por referencia), y se adicionó una secuencia "flag". Los receptores con sus ligandos unidos se identificaron a través de sus marcas "flag-tag" respectivas (ver la Figura 5). Este procedimiento modificado de un ensayo ELISA demostró que los constructos de Fc:ligando según la invención se unen efectivamente a sus receptores nativos respectivos, es decir, que no pierden su capacidad de unión como resultado de la estructura del constructo, realizándose la unión con una alta selectividad.

Además, fue demostrado según la invención que los constructos de Fc:ligando también son capaces de unirse a los receptores endógenos expresados en superficie. Experimentalmente, ha podido demostrarse que los constructos Fc:BAFF marcan las líneas celulares BJAB BAFF-R positivas en función de la dosificación, pero no lo hacen con la línea celular Jurkat BAFF-R negativa (ver la Figura 6a). Además, ha podido demostrarse que Fc:BAFF es capaz de inmunoprecipitar específicamente el receptor endógeno BAFF de las células BJAB (ver la Figura 6).

Además, se investigó la citotoxicidad de Fc:FasL sobre una línea celular Jurkat sensible a FasL. Fc:Fasl resultó ser altamente citotóxico para las células Jurkat con un IC_{50} de 1 ng/ml (ver la Figura 7). Se halló también que no existen diferencias significativas con relación a la actividad específica entre la preparación total de Fc:FasL y de la forma dimérica de Fc:FasL (6 ch) aislada en el pico de 440 kDa o la forma oligomérica de Fc:FasL (12 ch) identificada en el pico de 850 kDa. Estos resultados demuestran que el FasL dimérico (6 ch) ya es una molécula completamente activa y que los complejos más grandes ya no aumentan dicha actividad.

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4. Ejemplo de Forma de Realización 4

Actividad biológica de los constructos Fc:ligando in vivo

Se ensayaron las proteínas de fusión Fc:FasL y Fc:EDA in vivo.

La inyección de Fc:FasL en ratones dio el resultado de que dicha proteína de fusión es citotóxica in vivo.

Constructo de fusión Fc:EDA: EDA es un miembro de la familia de ligandos TNF, que es fisiológicamente responsable del desarrollo y de la función, en particular también de la morfogénesis, de las estructures ectodérmicas, especialmente de las glándulas sudoríparas, del pelo y de los dientes como estructuras endoteliales del ectodermo. Viceversa, es conocido que las disfunciones de EAD provocan en el ser humano el cuadro clínico de (XL)HED, mientras que en los ratones la disfunción da lugar al denominado fenotipo tabby, caracterizado sustancialmente por (i) una estructura anormal de la piel, (ii) ausencia de los distintos tipos nativos de pelo, (iii) pérdidas de pelo en la cola y en la zona de la piel detrás de las orejas, (iv) ausencia de glándulas sudoríparas en las garras, (v) formación de dientes y denticiones anormales, (vi) torsiones características en la punta de la cola, (vii) falta de las glándulas Moebius en el párpado, que secretan una película delgada para proteger la cornea de quedarse seca, por tanto queratinización de la cornea)
y otras glándulas, (viii) tamaño reducido de la abertura de los ojos y (ix) poco aumento de peso en los ratones jóvenes.

Según la invención, a ratones tabby hembra se les inyectaron en útero 400 \mug de Fc:EDA1 los días 11, 13 y 15 de su preñez. La tolerancia con relación a esta proteína de fusión era excelente, no observándose efectos de contraindicación en los ratones tratados. Mientras que el tratamiento con Fc:EDA1 no provocó efecto alguno detectable en los mismos ratones adultos hembra tratados, se observó una reversión clara y fuerte del fenotipo tabby en la descendencia de los animales madre preñados tratados. Dicha reversión era obvia el día 10 tras su nacimiento. El tamaño de la descendencia de los ratones tabby tratados durante su preñez era mucho mayor que el de los ratones de control, y su piel era lisa, negra y brillante (ver las Figuras 8/9). Al contrario de los ratones tabby, también la zona retroauricular de los ratones tabby tratados resultó ser pilosa, y sus colas eran normales, sin doblar y pilosas con muchos folículos pilosos y las glándulas sebáceas correspondientes, que podían observarse en la piel de la región de la cola (ver la Figura 8b).

Además de esto, podían detectarse en los cortes de tejido glándulas sudoríparas ecrinas, que no podían distinguirse de las glándulas sudoríparas de tipo salvaje correspondientes, en las garras de ratones tabby tratados, pero en los sin tratar (ver la Figura 8b). También en los ratones tabby tratados en útero en el estadio embrionario, dichas glándulas sudoríparas eran todavía funcionales a su edad adulta. Para determinar la funcionalidad de las glándulas, se realizó una prueba del sudor: A tal fin, a las garras de los animales investigados se aplicó una solución de I_{2} al 3,5% (p/v) en etanol y se sometieron las mismas a un secado. A continuación, se aplicó una solución de almidón al 50% (p/v) en aceite mineral. Después de aplicar un calor moderado con un secador de pelo (5 s), se tomó una foto, los animales se sacrificaron, y se prepararon cortes de tejido colorados con hemotoxilina y eosina del párpado y de la cornea.

El fenotipo revertido era estable, como ha podido comprobarse por análisis de los ratones tabby tratados en su estado adulto (ver la Fig. 9). Eran significativamente más grandes que los ratones tabby, y su piel presentó en particular el tipo de pelo monótrico más largo de los animales WT, que falta por completo en los ratones tabby. No presentaban sitios calvos en la región retroauricular, y las garras presentaban glándulas sudoríparas ecrinas no distinguibles de las de los animales WT. Además, dichas glándulas sudoríparas eran funcionales (Figura 9a), como fue comprobado en la prueba del sudor descrita anteriormente. Tras el tratamiento, las glándulas Moebius, que siempre faltan en los ratones tabby, estaban presentes otra vez y permitieron la formación de cornea normal, no queratinizada, lo cual es una prueba de la funcionalidad de las glándulas Moebius (Fig. 9c). Los dientes de los ratones tabby tratados presentaban un tamaño normal y el patrón de cúspides de los animales WT. En los ratones WT, el tercer molar es pequeño y ausente en los ratones tabby. Dicho tercer molar también faltaba en los ratones tabby tratados. Los resultados demuestran que Fc:EDA1 según la invención, al ser administrado a ratones preñados según la Fig. 1d, puede llegar al embrión en desarrollo a través de los receptores Fc de la placenta y puede iniciar en los receptores EDA la inducción de la formación estructuras epiteliales nativas. Con relación a esto, es muy probable que la dimerización de EDA1 (6 ch) es de importancia central, puesto que las investigaciones genéticas y bioquímicas han indicado que, tras la inducción y establecimiento de las estructuras epiteliales en el embrión en desarrollo, ya no es necesario para el mantenimiento del fenotipo nativo revertido administrar al animal adulto EDA funcional.

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5. Ejemplo de Forma de Realización 5

En este ejemplo, se investigó hasta qué punto los síntomas del fenotipo tabby del ratón pueden eliminarse por medio de una administración tardía, postnatal de Fc:EDA1 según la invención. Por tanto, a ratones jóvenes se administró por vía intraperitoneal Fc:EDA1 los días 2 (40 \mug), 4 (40 \mug), 6 (60 \mug), 8 (100 \mug) y 10 (100 \mug) (o en una serie de experimentos alternativa: los días 5 (40 \mug), 7 (60 \mug), 9 (60 \mug), 11 y 13 (100 \mug cada uno) tras el nacimiento o se realizó ningún tratamiento en un grupo de control de ratones tabby.

Los ratones tratados de este modo y los ratones del grupo de control se investigaron con relación a la presencia de las siguientes características fenotípicas: (i) cola "doblada", (ii) pilosidad en la cola o detrás de la zona auricular, (iii) forma de ojos. Además, en los ratones adultos, se realizó una prueba del sudor y, en los ratones con una edad de 25 días, se investigaron cortes de tejido de la garra y de las zonas de piel de la cola.

También en dicha administración postnatal de Fc:EDA1, ha sido posible inducir un gran número de los síntomas del fenotipo tabby, en particular la restauración del pelo de la cola y de las glándulas sudoríparas. En los ratones tabby tratados (ya el día 2 tras el nacimiento) con Fc:EDA1, ha podido observarse el pelo de la cola el día 15 (en lugar de los días 7 a 9 tras el nacimiento en los ratones WT). En los ratones no tratados hasta el día 5 tras el nacimiento, se observó la formación del pelo el día 18. En los ratones tabby tratados, la formación del pelo ocurrió primero en el lado ventral de la cola. En todos los ratones tabby tratados, independientemente del día de inicio del tratamiento, la estructura y densidad del pelo de la cola no se diferenció de las del pelo de la cola de los animales WT. Dicha formación del pelo retardada en los ratones tabby tratados puede explicarse perfectamente con la inducción más tarde de la formación de los folículos pilosos, disparada por la administración de Fc:EDA1 según la invención. La alopecia detrás de las orejas no ha podido eliminarse en la serie de experimentos descrita en este ejemplo de forma de realización.

Aunque la forma de cola doblada no ha podido revertirse por completo, la misma se revertió sustancialmente por medio de la terapia postnatal. La abertura de los ojos de los ratones tabby tratados quedó aumentada significativamente en comparación con los ratones no tratados, pero no tan pronunciada como en los animales WT (Figura 10a). En las garras de los ratones tabby tratados, se desarrollaron glándulas sudoríparas funcionales, como ha podido comprobarse en los cortes de tejido de ratones tratados con una edad de 25 días (Fig. 10b). La funcionalidad de las glándulas sudoríparas desarrolladas en los animales adultos como consecuencia del tratamiento ha podido demostrarse en las pruebas del sudor con animales tabby tratados.

En resumen, puede constatarse que los experimentos según la invención pueden provocar una reversión casi completa de un fenotipo causado genéticamente por la ausencia del ligando TNF EDA. Las curaciones de más éxito han podido observarse en las ratones tabby tratados ya en útero con la proteína de fusión recombinante según la invención. Sin embargo, una administración postnatal de las proteínas de fusión según la invención, por ejemplo Fc:EDA1, también dio lugar a una curación de éxito notable en los animales que presentaban este genotipo, es decir, a una reversión (parcial) del fenotipo, en particular al desarrollo de glándulas sudoríparas (especialmente en las garras), a la formación de pelo en la cola y a un aumento de la abertura de los ojos.

Claims (18)

1. Proteína de fusión recombinante, que contiene una secuencia de aminoácidos, que comprende: (a) en la sección de la proteína de fusión situada por el extremo N-terminal, la sección Fc de una inmunoglobulina o una parte de una sección Fc de una inmunoglobulina que mantiene su capacidad de dimerización como componente (A), (b) en la sección de la proteína de fusión más C-terminal la parte extracelular de un ligando TNF o una secuencia parcial de la parte extracelular de un ligando TNF como componente (B) y, si se desea, una zona de transición entre el componente (A) y el componente (B), que contiene un ligador,

caracterizada porque, el componente (B) es la parte extracelular del ligando TNF EDA1 o una secuencia parcial de la parte extracelular del ligando TNF EDA1 que presenta por lo menos la secuencia de aminoácidos 246 a 391 de la secuencia nativa de EDA1.

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2. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 1, caracterizada porque el componente (B) contiene la secuencia de aminoácidos 140-391, 157-391, 160-391, 181-391, 182-391, 200-391 ó 245-391 de la secuencia nativa de EDA1.

3. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el componente (A) presenta la región "hinge", el dominio CH2 y el dominio CH3 de la sección de Fc de una inmunoglobulina de la clase de IgG, en particular de IgG humana.

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4. Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el componente (A) presenta la secuencia de aminoácidos

100

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5. Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la zona de transición entre el componente (A) y el componente (B) contiene la secuencia PQPQPKPQPKPEPE.

6. Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la zona de transición presenta un punto de corte de proteasa.

7. Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el extremo N-terminal de la proteína de fusión recombinante presenta una secuencia señal, por ejemplo una secuencia señal de secreción, y/o un marcador del tipo "tag", por ejemplo "flag-tag" o "his-tag".

8. Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el extremo N-terminal presenta la secuencia MAIIYLILLFTAVRG.

9. Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la secuencia de la proteína de fusión recombinante une seis componentes (B) funcionalmente entre sí.

10. Complejo de constructos de fusión según una de la reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el complejo presenta 6 cadenas del componente (A).

11. Secuencia de ADN, caracterizada porque la secuencia de ADN codifica para una proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Vector de expresión, caracterizado porque el vector de expresión contiene una secuencia de ADN según la reivindicación 11.

13. Célula hospededora, caracterizada porque la célula hospededora se ha transfectado con un vector de expresión según la reivindicación 12.

14. Medicamento que contiene una proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 9, un complejo según la reivindicación 10, una secuencia de ADN según la reivindicación 11, un vector de expresión según la reivindicación 12 o una célula hospededora según la reivindicación 13.

15. Utilización de una proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 9, de un complejo según la reivindicación 10, una secuencia de ADN según la reivindicación 11, de un vector de expresión según la reivindicación 12 o de una célula hospededora según la reivindicación 13 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades genéticas, en particular de una displasia ectodérmica, o enfermedades, defectos o anomalías de las estructuras ectodérmicas, tales como por ejemplo, anomalías del pelo, de los dientes o de las glándulas, en particular para el tratamiento de la alopecia o para la curación de heridas.

16. Utilización según la reivindicación 15 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la displasia ectodérmica, en particular la displasia ectodérmica hipohidrótica ligada a X.

17. Utilización según la reivindicación 15 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la alopecia, el hirsutismo, para el tratamiento de heridas o de disfunciones de las glándulas sudoríparas o sebáceas, o de una deficiencia de las glándulas sudoríparas o sebáceas.

18. Utilización según una de la reivindicaciones 15 a 17 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la madre/del animal madre durante el embarazo/preñez, administrándose el medicamento proporcionado de forma parenteral en una dosificación adecuada.