CN1306573A - 一种新型人类血小板生成素突变蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型的人类血小板生成素(hTPO)的衍生物及其制备方法,特别是天然hTPO的特定位点的氨基酸被其它某些氨基酸,如天冬氨酸所取代,而在天然hTPO中引入了糖链,制备出在体内高活性地增加血小板生成的新型hTPO衍生物。因此,本发明的新型hTPO衍生物可用于与抗癌治疗或骨髓移植有关的血小板减少症的治疗。

Description

一种新型人类血小板生成素突变蛋白
本发明涉及一种新型的人类血小板生成素(hTPO)的衍生物，该衍生物在体内可高活性地增加血小板生成，本发明还涉及该衍生物的制备方法。
特别是，本发明还涉及通过天然hTPO的某些特定位点的氨基酸被其它某些氨基酸，如天冬氨酸所取代，而在天然hTPO中引入了糖链的新型hTPO衍生物；涉及编码该hTPO衍生物的核苷酸序列；涉及含有该核苷酸序列的表达载体；涉及其构建方法；涉及该载体转化的细胞系；以及涉及所述hTPO衍生物的制备方法。
血小板减少症是由抗癌治疗、骨髓移植等引起的一种血小板缺乏。在抗癌治疗或骨髓移植过程中，骨髓中的巨核细胞群形成细胞，即血小板的前体细胞受到破坏，导致血小板的缺乏。血小板减少症患者受到轻微的外伤后就会出血，严重的病人甚至未受伤也会出血。这种情况下，出血往往是致命的，因为这种出血完全不能止住。
目前对血小板减少症的治疗除了输入血小板，别无它法。然而，这种治疗有一些问题并产生一些副作用，如供血者不足，输血引起的感染，例如感染HIV(人类免疫缺损病毒)和肝炎病毒，引起免疫应答反应等。
血小板是血液中的一种组分，来源于巨核细胞前体细胞，在出血的抑制方面起作用。血小板生成素(以下称为TPO)是在肝或肾中合成和分泌的一种糖蛋白，在血液中调节血小板水平。TPO促进巨核细胞前体细胞的增殖和分化，然后产生血小板(Lok et al.,Nature,369:565-568,1994；De savage et al.,Nature,369:533-568,1994)。
由于在1994年首次从人类分离出一种编码TPO的基因(Lok et al.,Nature,369:565-568,1994；De savage et al.,Nature,533-568,1994；Miyazaki et al.,Experimental hematol.,22:838,1994；WO95/18858),临床上治疗血小板减少症的方向是基于改善人类TPO(以下称为hTPO)的功能，即用调节血小板水平的方法。
为了增进体内hTPO的活性，已研究了三种方法。
将糖蛋白表达在细胞中，作为一种包括有353个氨基酸的无活性的前体，信号肽(21个氨基酸)的分解导致有活性的hTPO蛋白(332个氨基酸)从这些细胞中分泌出。HTPO的氨基酸序列分为两个区。包括有151个氨基酸的N末端区有反应位点，与促红细胞生成素(EPO)的反应活性十分类似。另一个区，C末端区，被假定在细胞外的分泌中和体内hTPO的稳定性方面起着一个关键性的作用。
修饰天然hTPO的第一种方法涉及C末端区的缺失或者在缺失的hTPO增加新的氨基酸。
为了支持这一方法，Amgen公司开发了多种hTPO衍生物，例如hTPO151(由151个氨基酸组成)，hTPO174(由174个氨基酸组成)和在N末端增加蛋氨酸一赖氨酸的hTPO163。然而被证实，这些衍生物在体内的活性比起天然hTPO的活性低，尽管在体外试验中，它们能够保持活性。(WO95/26746,WO95/25498)。
此外，Genentech公司从大肠杆菌中制备了一种N末端增加蛋氨酸的重组体hTPO153衍生物(WO95/18858)。Kirin生产了缺失C末端的hTPO衍生物，和在一个特定的氨基酸残基有取代基，缺失或插入氨基酸的hTPO163衍生物(WO95/21920)。Zymogenetics公司还提供了其它C末端区缺失的hTPO衍生物(WO95/21920,WO95/17062)和G.D.Searl的(WO96/23888)。但是，这些衍生物在体内比起天然hTPO都未显示出较高的血小板产生活性。
第二种方法是与聚乙二醇(PEG)与hTPO片段结合有关的方法，实例是Amgen公司的hTPO163-PEG(WO95/26746)。
然而，根据这一方法制备的衍生物有着严重的缺陷，如稳定性和安全性低，由于它们不含有对hTPO的稳定性起重要作用的C末端区，还由于它们的空间结构的改变会引起免疫反应。而且，产品的质量不均，因为PEG并不以统一的比例被结合。
第三种方法开开发了hTPO的糖化，这种方法可以增加hTPO的活性。
Amgen公司进行了一项诱发突变的工作，在cDNA中编码hTPO的一个特定的核苷酸被取代，形成的氨基酸序列为“Asn-X-Ser/Thr”(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)。该突变的基因用于制备C末端区缺失的hTPO衍生物，其包括有174个氨基酸，该衍生物上产生了一个或多个N-连接的糖基化位点。
韩国生物学与生物技术研究所(KRIBB)制备了一种hTPO衍生物，在完整的天然hTPO上结合了一个糖链(Park et al.,J.Bio1.Chem.,273:256-261,1998)，该衍生物不同于Amgen公司的部分hTPO衍生物。
然而，所有这些衍生物都不能显示出显著的hTPO高活性。
如上所述，虽然开发具有增加的生物学活性的hTPO衍生物已经使用了多种方法，但这些方法都没能够获得在体内活性高于天然hTPO的hTPO衍生物。
通常，许多蛋白是以在特定位点被低聚糖链修饰的蛋白方式存在，例如，糖蛋白。已经发现了两类糖化方式。在O-连接的糖化中，糖链连接在糖蛋白的Ser/Thr残基的羟基上。在N-连接hTPO衍生物糖化中，糖链连接在糖蛋白的“Asn-X-Ser/Thr”(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)的酰胺基上。
糖蛋白中的糖链对蛋白的理化性质和生物学活性起到多种作用，如蛋白的稳定性和蛋白的分泌等，特别是对蛋白在体内产生的生物学活性以及药物动力学性质起到作用。(Jenkins et al.,Nature Biotechnological.,14:975-981,1996；Liu et al,,Act.TIBTECH.,10:114-120,1992)。
这些作用可以用人干扰素γ和葡萄糖运输蛋白为例，在合适的糖基化位点氨基酸取代引起hTPO活性的显著降低，提示N-连接的糖链对糖蛋白的活性有重大影响(Sareneva et al.,Biochem.J.303:831-840,1994；Asano et al.,FEBS,324:258-261,1993)
然而，引入额外的糖链并不总是伴随着增加糖蛋白的催化活性，如前所述的Amgen公司和KRIBB的技术(WO96/25498；Park et al.,J.Biol.Chem.,273:256-261,1993)。虽然这些hTPO衍生物引入了额外的糖链，但当与天然hTPO相比时，这些糖蛋白的生物学活性要低得多。根据此观察，对于提高糖蛋白的催化活性，起决定性作用的并不是糖链的数量，而是糖基化反应的特定位点。
本发明的发明者制备了不同种类的hTPO衍生物，并且进行了活性试验。本发明公开了几种hTPO衍生物，例如Asn取代Arg164的衍生物；Asn取代Thr193的衍生物；Asn取代Pro157和Arg164的衍生物；Asn取代Leu108、Arg117和Arg164的衍生物，这些衍生物比起天然hTPO产生水平明显高的血小板，这在现有技术的hTPO衍生物中是从未观察到的。
本发明的目的是提供新型的hTPO衍生物，这些衍生物在体内对于增加血小板的产生比天然hTPO有着较高的活性。
按照本发明，上述目的和优点是可以迅速达到的。
本发明提供了新型的在体内促进血小板的产生的高活性的hTPO衍生物。通过将天然hTPO的某些特定位点的氨基酸被某些氨基酸，如天冬氨酸取代，额外的糖链被引入所述hTPO衍生物。
本发明还提供了编码所述hTPO衍生物的基因。
此外，本发明提供了制备所述hTPO衍生物的方法，包括将所述基因插入适当的载体；用所述载体转入宿主细胞；以及转入的细胞在适当的培养基中的培养。
本发明进一步的内容将在后文中论述。
附图说明
图1是PCR-based诱变，其中产生了编码hTPO衍生物的cDNA，图中
1：由SEQ ID NO:1所示的引物；
2：由SEQ ID NO:2所示的引物；
N：N-引物；
C：C-引物；
S：信号序列
图2是突变的基因连接到pBlueBac4载体的过程。
图3是构建动物表达载体的过程，该突变的cDNA被亚克隆在pCDT载体中。
图4是细胞扩增试验的结果，图中M-07e细胞扩增的活性在hTPO衍生物表达在动物细胞之前被测出。
图5是天然hTPO在体内的活性，通过对小鼠用不同剂量的天然hTPO给药后，测定小鼠血中血小板的数量而得到。
图6是不同hTPO衍生物在体内的活性，通过对小鼠用表达在动物细胞上的hTPO衍生物(36μg/kg)给药后，测定小鼠血中血小板的数量而得到。
图7a和7b是不同种类的hTPO衍生物在体内的活性，通过对小鼠用表达在动物细胞上的hTPO衍生物(10μg/kg)给药后，测定小鼠血中血小板的数量而得到。
图8是构建dhfr表达载体的过程，该载体含有一个编码天然hTPO或hTPO衍生物的基因。
图9是在一种hTPO衍生物的纯化过程中所获的不同部分SDS-PAGE和银染色的结果，图中
带M：大小标记；
带1：培养上清液；
带2：CM-离子交换亲和柱洗脱；
带3：苯基琼脂糖凝胶柱洗脱；
带4：羟基磷灰石柱洗脱；
带5：Q筒柱洗脱。
图10是天然hTPO和不同种类的hTPO衍生物在体内的活性，通过对小鼠用天然hTPO或纯化的hTPO衍生物(10μg/kg)给药后，测定小鼠血中血小板的数量而得到。
图11是纯化的天然hTPO或hTPO衍生物经SDS-PAGE和westernblot分析的结果，图中
带M：大小标记；
带1：天然hTPO；
带2：hTPO衍生物40433；
带3：hTPO衍生物40434；
带4：hTPO衍生物40449；
带5：hTPO衍生物40458。
图12a和12b是western blot分析的结果，其中天然hTPO(图12a)或其衍生物40433(图12b)的凝血酶-消化模式根据消化后的时间被显示，图中
带M：大小标记；
带1：消化前；
带2：消化后30分钟；
带3：1小时；
带4：2小时；
带5：3小时；
带6：4小时；
带7：6小时。
本发明详述如下：
本发明提供了新型的活性增强的在体内促进血小板的产生的hTPO衍生物。通过用某些氨基酸，如天冬氨酸，取代在天然hTPO的某些特定位点的氨基酸，额外的糖链被引入所述hTPO衍生物。
为了开发新型的在体内促进血小板的产生的活性增强的hTPO衍生物，制备了几种hTPO衍生物，通过取代hTPO衍生物的特定位点上一个或多个氨基酸，一种或多种糖链被引入到这些衍生物上。结果，在特定的位置建立了N-连接的糖化位点“Asn-X-Ser/Thr”(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)。
在一个优选的实例中，用重迭的PCR方法进行位点特异性诱变(Cheng et al.,Proc.Natl.Acad.Soc.USA,91:5695,1994)，产生在特定位点上有特定的氨基酸取代的编码hTPO衍生物的基因。(见图1)。
首先，化学合成出了含有突变序列的下列引物对。这些寡核苷酸引物对含有与该突变氨基酸残基相应的核苷酸序列，在hTPO的cDNA突变区扩展到该5′或3′相邻的序列。
表1用于特定位点突变的引物对
衍生物 引物    SEQ IDNO: 核苷酸序列
  40429     29-N     3  5’-GCTGT GGTGT TGCCC TGTGG-3’
    29-C     4  5’-ACAGG GCAAC ACCAC AGCTC-3’
  40430     30-N     5  5’-GGGTT CCGTT TAAAC TCTGC AG-3’
    30-C     6  5’-CTGCA GAGTT TAAAC GGAAC CCAG-3’
  40431     31-N     7  5’-AGAGG GTGGA ATTCC CTACA AGCA-3’
    31-C     8  5’-TGCTT GTAGG GAATT CCACC CTCT-3’
  40432     32-N     9  5’-GGGCC CGGTT GACGC AGA-3’
    32-C     10  5’-TCTGC GTCAA CCGGG CCC-3’
  40433     33-N     11  5’-GGACT AGAGA CGTGT TGCTG GGGAC-3’
    33-C     12  5’-GTCCC CAGCA ACACG TCTCT AGTCC-3’
  40434     34-N     13  5’-GAAGC CCAGA TCCGT TAGTT CTGGC-3’
    34-C     14  5’-GCCAG AACTA ACGGA TCTGG GCTTC-3’
  40458     58-N     15  5’-AGCTG TGGTG TTTGG GGCCC GC-3’
    58-C     16  5’-GCGGG CCCCA AACAC CACAG CT-3’
    33-N     11  5’-GGACT AGAGA CGTGT TGCTG GGGAC-3’
    33-C     12  5’-GTCCC CAGCA ACACG TCTCTAGTCC-3’
  40459     59-N     17  5’-CTAGA GAGGT GCTGT TGACA GCTGT G-3’
    59-C     18  5’-CACAG CTGTC AACAG CAGCA CCTCT CTAG-3’
  40460     60-N     19  5’-GGTGG GTGGG GTCCG GTTGA CGCAG AGG-3’
    60-C     20  5’-CCTCT GCGTC AACCG GACCC CACCC ACC-3’
    33-N     11  5’-GGACT AGAGA CGTGT TGCTG GGGAC-3’
    33-C     12  5’-GTTCCC CAGCA ACACG TCTCT AGTCC-3’
  40461     61-N     21  5’-TCTGC TGGGG GAAGC GTTGG TGGGT GG-3’
    61-C     22  5’-CCACC CACCA ACGCT TCCCC CAGCA GA-3’
    33-N     11  5’-GGACT AGAGA CGTGT TGCTG GGGAC-3’
    33-C     12  5’-GTCCC CAGCA ACACG TCTCT AGTCC-3’
  40462     62-N     23  5’-CAGTG TGAGG GTTAG ATTGG TTCTG CTG-3’
    62-C     24  5’-CAGCA GAACC AATCT AACCC TCACA CTG-3’
  40463     63-N     25  5’-CAGTG TGAGG TTTAG AGAGG TT-3’
    63-C     26  5’-AACCT CTCTA AACCT CACAC TG-3’
    33-N     11  5’-GGACT AGAGA CGTGT TGCTG GGGAC-3’
    33-C     12  5’-GTCCC CAGCA ACACG TCTCT AGTCC-3’
完成了重叠PCR，其中所建立的含有hTPO cDNA的载体pBlue404(KOREA APPLICATION NO.97-7512)用作模板。一方面，编码hTPO信号肽的寡核苷酸(SEQ ID NO:1)和编码突变序列的一种寡核苷酸(表1中的N-引物系列)被用作PCR引物。另一方面，含有hTPO C-端ORF和停止密码子的寡核苷酸(SEQ ID NO:2)和编码突变序列的一种寡核苷酸(表1中的C-引物系列)被用作PCR引物。
该重叠PCR产物分别含有从N-端信号序列到突变区的DNA序列，和从突变区到C-端区的DNA序列。
为获得全长的含有氨基酸取代目的位点的hTPO cDNA序列，用PCR方法，使用两个重叠PCR产物作为模板，两个寡核苷酸(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)被用作PCR引物。
通过上述方法，制备了编码hTPO衍生物的1078-bp全长cDNA序列(见图1)。
在另一个实施方案中，构建了含有hTPO衍生物的cDNA的载体，以得到含有该cDNA的表达载体并最终产生被该表达载体转染的细胞系。
具体地说，所建立的载体pBlueBac4和每个编码hTPO衍生物的cDNA分别被BglⅡ和EcoRⅠ限制酶消化。然后两种DNA片段用T4DNA连接酶连接，构建含该hTPO衍生物cDNA的载体。
表2列出了所产生的载体，表中给出了这些载体的名称、编码hTPO衍生物的突变序列，以及根据该突变修饰的氨基酸残基。
本发明的hTPO衍生物的氨基酸序列通过下述方法被描述：该氨基酸序列用替代的氨基酸残基和在天然hTPO氨基酸序列的特定位点(SEQID NO:30)进行描述。例如，本发明的一种hTPO衍生物40430也可以指作与SEQ ID NO:30所述的氨基酸序列相对应的“[Asn108]hTPO”,表示只有天冬氨酸替代了氨基酸残基108。
表2在含有hTPO衍生物cDNAs载体中取代的氨基酸和核苷酸序列
    载体     替代的氨基酸     突变的核苷酸
    PBlue29     R117→N117     AGG→AAC
    PBlue30     L108→N108     CTT→AAT
    PBlue31     G146G147→G146N147     GGAGGG→GGGAAT
    PBlue32     R153→N153     AGG→AAC
    PBlue33     R164T165→N164T165     AGAACC→AACACG
    PBlue34     T193G194→N193G194     ACTGGT→AACGGA
    PBlue58     P157→N157R164T165→N164T165     CCC→AACAGAACC→AACACG
    PBlue59     R162,R164→N162,S164     CCC,AGA→AAC,AGC
    PBlue60     R153,A155→N153,T155R164T165→N164T165     AGG,GCC→AAC,ACCAGAACC→AACACG
    PBlue61     T159,V161→N159,S161R164T165→N164T165     ACA,GTC→AAC,TCCAGAACC→AACACG
    pBlue62     S166,V168→N166,T168     TCT,GTC→AAT,ACC
    pBlue63     R164T165→N164T165V168→N168     AGAACC→AACACGGTC→AAC
在另一个优选的实施例中，为了被引入一种动物细胞，构建了该含有hTPO衍生物cDNAs序列的表达载体。
尤其是，通过将天然hTPO cDNA插入所建立的载体pCDNA3.1，制备了pCDT载体。该pCDT和含有hTPO衍生物基因的载体，如pBlue29、pBlue30、pBlue31、pBlue32、pBlue33、pBlue34、pBlue58、pBlue59、pBlue60、pBlue61、pBlue62、pBlue63被NheⅠ和EcoRⅠ酶所消化。然后这些片段用T4 DNA连接酶所连接，获得含有每种hTPO衍生物基因的动物表达载体(见图3与表3)。
表3在含有hTPO衍生物cDNAs的动物表达载体中取代的氨基酸和核苷酸序列
表达载体         突变的氨基酸     突变的碱基
 p40429     R117→N117     AGG→AAC
 p40430     L108→N108     CTT→AAT
 p40431     G146G147→G146N147     GGAGGG→GGGAAT
 p40432     R153→N153     AGG→AAC
 p40433     R164T165→N164T165     AGAACC→AACACG
 p40434     T193G194→N193G194     ACTGGT→AACGGA
 p40435     p40429+p40431
 p40436     p40429+p40433
 p40437     p40430+p40431
 p40438     p40430+p40433
 p40439     p40431+p40433
 p40446     p40429+p40431+p40433
 p40447     p40430+p40431+p40433
 p40449     p40429+p40430+p40433
p40458     P157→N157R164T165→N164T165     CCC→AACAGAACC→AACACG
 p40459     R162,R164→N162,S164     CCC,AGA→AAC,ACC
p40460     R153,A155→N153,T155R164T165→N164T165     AGG,GCC→AAC,ACCAGAACC→AACACG
p40461     T159,V161→N159,S161R164T165→N164T165     ACA,GTC→AAC,TCCAGAACC→AACACG
 p40462     S166,V168→N166,T168     TCT,GTC→AAT,ACC
p40463     R164T165→N164T165V168→N168     AGAACC→AACACGGTC→AAC
本发明的范围不仅包括表3中的DNA序列，而且也根据遗传密码的简并性包括与表3中氨基酸序列相应的其它DNA序列。换句话说，含有表3中修饰的氨基酸的所有编码hTPO衍生物的DNA序列均可用作一种突变种hTPO基因。
例如，一种可以从表达载体p40433制备的hTPO衍生物，包括一种多肽[Asn164]hTPO，不仅可以被SEQ ID NO:31 DNA序列编码，而且可以被简并DNA序列编码。
为确定突变的序列插入载体，可使用该PCR产物的DNA序列。可选择地，如果设计了重叠PCR引物，其含有一种新限制位点或缺失一个野生型限制位点，该载体的限制图可以用于检测诱变作用。如果一种表达载体p40433，例如，有一种突变的序列ACACGT代替野生型序列GAACCT,AflⅢ限制位点将在p40433建立。这样，带有AflⅢ的p40433的消化可以用于确定突变的序列是否引入。
在一个优选的实施例中，为了将额外的糖链连接到天然hTPO修饰的氨基酸中，用所述表达载体产生了两种或多种氨基酸修饰的hTPO衍生物。
特别是，两种所述表达载体被合适的限制酶消化，然后所得到的片段在所述pCDT载体中亚克隆，以构建含有带有两个或三个修饰区的hTPO衍生物基因的表达载体。例如，一个表达载体p40429被NheⅠ或BspMⅠ酶消化，获得一个包括有氨基酸取代Arg117→Asn117的DNA片段。此外，一种表达载体p40431被BspMI和Bsu36Ⅰ酶消化，获得一个包括有氨基酸取代Gly147→Asn147的DNA片段。所得到的两种DNA片段被插入pCDT载体的BspMⅠ-Bsu36Ⅰ位点，构建一个表达载体p40435，该载体含有编码带有两个氨基酸取代(Arg117→Asn177和Gly147→Asn147)的DNA序列。按照此步骤，构建了一些表达载体，如p40436,p40437,p40438,p40439,p40446,p40447,p40448,p40449(见表3)。
又一个优选实施例，制备了表达每种hTPO衍生物的动物细胞转化体。
尤其是，通过lipofectamin方法，所述表达载体被转染到动物细胞系CHO/K-1，制备表达每种hTPO衍生物的动物细胞系。
根据所引入的表达载体的名称表示转染的细胞系：CHO K-1/p40429,CHOK-1/p40430,CHOK-1/p40431,CHOK-1/p40432等，CHOK-1/p40433已于1998年6月17日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC0495BP)。
另一个优选实施例，通过培养带有本发明的表达载体转染的动物细胞系，制备了几种hTPO衍生物。
尤其是，该转染的细胞系在一种含血清的培养基中被大量的传代培养，然后转染到一种分泌培养基中。浓缩并透析培养基，获得hTPO衍生物。
一种从CHO K-1/p40433分离得到的hTPO衍生物，是天冬氨酸取代了天然hTPO序列中精氨酸164的多肽[Asn164]hTPO。
一种从CHO K-1/p40434分离得到的hTPO衍生物，是天冬氨酸取代了天然hTPO序列中苏氨酸193的多肽[Asn193]hTPO。
一种从CHO K-1/p40449分离得到的hTPO衍生物，是天冬氨酸取代了天然hTPO序列中亮氨酸108、精氨酸117、精氨酸164的多肽[Asn108、Asn117、Asn164]hTPO。
一种从CHO K-1/p40458分离得到的hTPO衍生物，是天冬氨酸取代了天然hTPO序列中脯氨酸157、精氨酸164的多肽[Asn157、Asn164]hTPO。
根据表达载体的名称，表达在动物细胞系中的hTPO衍生物分别被表示为40429～40439、40446、40447、40449、40458～40463。它们在体外的活性通过测定巨核细胞白血病细胞系的增生而被估计。
其结果，hTPO衍生物如40429、40430、40432、40433、40434、40437、40438、40439等等显示出比天然hTPO衍生物较高水平的生物学活性。未观察到所增加的糖链数量与体外生物学活性方面有明显关系，由于活性的增减与所引入的糖链数量无关(见图4)。
在一个优选的实施例中，为研究该hTPO衍生物的体内生物学活性，将hTPO衍生物对小鼠给药，然后测定血小板水平。
实验过程详述如下：将8周龄鼠根据体重不同分成4～5组，然后将预定浓度的hTPO衍生物在小鼠皮下给药。给药后，收集小鼠外周血管的血液并测定血液中血小板水平。发现比起天然hTPO，大多数hTPO衍生物显示出较低的血小板水平，而衍生物40433、40434、40449和40458血小板水平相当或较高(见图6、7a或7b)。
这些结果提示，hTPO衍生物的体内活性不依赖于所引入的糖链数量，而是依赖于糖链的特定位置。即，为了增加hTPO在体内的活性，应在hTPO的特定位置上引入糖链，如氨基酸164、氨基酸193等位置。
最值得注意的是，在用40433给药的组中血小板水平比天然hTPO给药的组高了2天，从给药后第3天到第4天，表明40433可用作血小板减少症的一种治疗剂。观察到的最高的血小板水平是用40433对小鼠给药后的第5天，这一天达到了天然hTPO活性的134％，总共高于180％。
本发明的另一方面，用纯化的hTPO衍生物研究了体内hTPO活性，产生了与天然hTPO同样或较高的血小板水平。为进行此研究，构建了含有hTPO衍生物基因的dhfr表达载体，产生的载体用于制备有效表达hTPO基因的细胞系。
尤其是，BamHI连接物被连接在含有dfhr基因的pSV2-dhfr载体的PvuⅡ-SphⅠ片段上。这种含有dfhr基因的1710-bpDNA片段被插入pCDT，制备含有天然hTPO基因的dfhr表达载体pCDT。然后，该hTPO衍生物基因被插入pCDT代替天然hTPO基因，构建dfhr表达载体pD40433、pD40434、pD40449和pD40458(见图8)。
含有hTPO基因的dfhr表达载体可在转染的真核细胞基因组中通过细胞的传代培养被迅速地扩增。在一个优选的实施例中，这些载体被转入动物细胞系CHO/dhfr(-)。该新型的转染细胞系被分别表示为CHOdhfr-/pD40433、CHO dhfr-/pD40434、CHO dhfr-/pD40449和CHOdhfr/pD40458。CHO dhfr-/pD40434、CHO dhfr-/pD40449和CHOdhfr/pD40458己分别于1999年6月8日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC0630BP,KCTC0631BP,KCTC0632BP)。其它的含有hTPO衍生物基因dfhr载体和其转染细胞系可根据所述步骤被获得。
该转染细胞系可以大量培养，hTPO衍生物可按照所建立的方法被纯化。可用各种不同的柱层析法纯化来自细胞系的hTPO衍生物(该细胞系与含所述hTPO衍生物基因的dfhr表达载体被转染)。在一个优选的实施例中，使用了CM-离子交换亲和柱、苯基琼脂糖凝胶柱、羟基磷灰石柱等柱层析法(见图9)。
为了评估纯化的hTPO衍生物的体内生物学活性，在对小鼠进行该衍生物的给药后，按照所述方法测定了血小板水平。在40433-、40434-、40449-和40458-用药组，给药10天后，血小板水平分别达到了天然hTPO用药组的177％、191％、126％和179％(见图10)。
为确定附加的糖链引入hTPO衍生物，对纯化的天然hTPO和hTPO衍生物进行了SDS-PAGE和随后进行的Western blot分析。结果，衍生物40433和40434的分子量大于天然hTPO分子量。带有两个附加糖链的40458和带有三个附加糖链的40449的分子量，根据糖链的数量成比例比例增长(见图11)。
为考察hTPO衍生物的稳定性，天然hTPO和衍生物40433与凝血酶一起处理，然后根据消化的时间，观察在Western blot分析中的蛋白带。结果表明，40433对抗凝血酶的消化作用比天然hTPO衍生物更稳定(见图12)。由此提示，由于糖基化而增加的稳定性对提高hTPO在体内的生物学活性起到了作用。
本发明的含有hTPO衍生物的药物组合物可以很方便地制备，可单独用药或与药物可接受的载体、赋形剂、稀释剂等组合。这种组合物可以是粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、注射剂等。
尤其是，可用于与水、磷酸缓冲液、extroso溶液、白蛋白溶液、抗氧化剂、糊精等的组合物中。优选地，可在静脉内或皮下给药。
hTPO衍生物可以用比天然hTPO更少的量给药，例如，剂量范围在约0.01～1000μg/kg/日。
本发明的hTPO衍生物可用作治疗各种情况引起的血小板减少症。
例如，可用在服用了抗癌药、放疗、骨髓移植、肝炎、肝硬变等引起的血小板减少症。为治疗这些病，hTPO衍生物可与抗癌剂，如阿霉素、顺铂和造血细胞因子类生物制品如白介素-3、MCSF、SCF、促红细胞生成素，组合给药。
下列实施例中列出了本发明的优选实施例。
然而，根据本发明公开的内容，本领域的技术人员可以在本发明的思路和范围内做出一些修改。
实施例1编码hTPO衍生物的cDNA的PCR扩增
为在编码hTPO衍生物的基因的特定位点引起突变，制备了表1中12对寡核苷酸，这些寡核苷酸含有与突变氨基酸残基相应的特定的核苷酸序列。
用已建立的含hTPO cDNA的载体pBlue404(KOREA PATENTAPPLICATION NO.97-7512)作为hTPO基因扩增的模板。
详述如下：用50ng pBlue404作为模板进行PCR。用含hTPO信号序列的寡核苷酸(SEQ ID NO:1)和一种含突变序列(表1中的N-引物)抗敏寡核苷酸作为引物。在总体积100μl含4μl引物溶液(40pmol/μl)和1μl Pfu(Pyrococcus furiosus)聚合酶(2.5u/μl；Stratagene,Cat.No.600153)的溶液中完成PCR反应。PCR中的热循环过程如下：在94℃预变性90秒；包括在94℃变性40秒的35个扩增循环，在55℃退火60秒，在72℃延伸120秒，在72℃后延伸5分钟。
按上述反应进行了另一个PCR。用含hTPO C-端ORF的寡核苷酸(SEQ ID NO:2)和一种含突变序列(表1中的C-引物)有意义寡核苷酸的停止密码子作为引物。
在PCR中得到的是从N-端hTPO信号序列到突变序列DNA片段和从突变序列到hTPO C-端DNA片段。
该PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用刀切下有关的DNA带，用50μl经三次蒸馏的蒸馏水与QIAEXⅡ kit(Qiagen,Cat No.20021)洗脱。
为获得编码突变hTPO的全长hTPO cDNA，在100μl终体积中完成PCR，其中用两种系列的PCR产物(分别为10ng)作为模板，两种寡核苷酸(SEQ ID NO:1和2)作为引物。PCR中的热循环过程如下：在94℃预变性90秒，包括在94℃变性40秒的35次扩增循环，在58℃退火60秒，在72℃延伸120秒，在72℃后延伸5分钟。
对该PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后按上述步骤用经三次蒸馏的蒸馏水30μl洗脱1078-bpDNA带。
为制备含有两个或多个突变DNA序列区的hTPO基因，PCR中使用了4对引物(引物58-N,58-C,60-N,60-C,61-N和61-C,63-N和63-C)。按上述步骤制备了含有突变序列的全长cDNA，然后用一个引物对33-N和33-C再次进行特定位点的诱变步骤。
在结果得到的cDNA修饰的氨基酸和核苷酸序列见表2。
实施例2含hTPO衍生物cDNA的哺乳动物表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达
(2-1)转移载体的构建
实施例1中制备的编码hTPO衍生物的基因在一种市售的载体pBlueBac4中被亚克隆(Invitrogen,Cat.No.V1995-20)，过程如下：
与每种hTPO衍生物相应的PCR产物用BglⅡ和EcoRⅠ酶在37℃消化3小时，然后用1％琼脂糖凝胶电泳从反应混合物中分离出1068-bpDNA片段。从用BglⅡ和EcoRⅠ酶消化的载体pBlueBac4中也获得了4771-bpDNA片段。
为亚克隆在载体pBlueBac4中编码hTPO衍生物的cDNA，通过与T4 DNA连接酶(NEB,Cat.No.202S)在16℃共同温育16小时，两种DNA片段以cDNA比载体DNA片段为4比1的摩尔比例被连接。然后该连接混合物与产生的转移载体被用于转化E.coli TOP10F′菌株(Invitrogen,Cat.No.C3030-03)。所建立的电泳方法已用于获得E.coli转化体。这些转化体在50ml LB培养基(1升水中10g胰胨，5g酵母提取物，10g氯化钠)中在37℃培养18小时后，从带有Wizard idiprep kit(Promega,Cat.No.A7640)的培养物中获得转移载体。
这些含hTPO衍生物基因的转移载体分别被表示为pBlue29、pBlue30、pBlue31、pBlue32、pBlue33、pBlue34、pBlue58、pBlue59、pBlue60、pBlue61、pBlue62、pBlue63(见图2)。
(2-2)动物表达载体的构建
为构建含hTPO衍生物基因的重组动物表达载体，使用了通过在一种市售载体pCDNA3.1(Invitrogen,Cat.No.790-20)中插入野生型hTPO基因制备的pCDT。
尤其是，5μgpCDT载体用EcoRⅠ和NheⅠ酶在37℃消化3小时，然后通过1％琼脂糖凝胶电泳从反应混合物中分离出4958-bpDNA片段。实施例2-1中的转移载体被EcoRⅠ和NheⅠ酶消化，然后1087-bpDNA片段也从每种限制混合物中被分离出。
为亚克隆在pCDT载体中编码不同hTPO衍生物的CDNA片段，两种DNA片段以3比1的摩尔比例被混合，并用T4DNA连接酶(NEB Cat.No.202S)在16℃共同温育18小时。然后该连接混合物与产生的表达载体被用于转化E.coli TOP10F′菌株(Invitrogen,Cat.No.C3030-03)。所建立的电泳方法已用于获得E.coli转化体(见图3)。这些转化体在50mlLB培养基中在37℃培养18小时后，从带有Wizardidiprep kit(Promega,Cat.No.A7640)的培养物中获得表达载体。含有hTPO衍生物基因的动物表达载体分别被命名为p40429,p40430,p40431,p40432,p40433,p40434,p40458,p40459,p40460,p40461,p40462(见图3)。分离的质粒DNA用NheⅠ,EcoRⅠ,BamHⅠ,Bsu36Ⅰ酶消化，以检验cDNA是否插入。通过限制制图和序列测定，确定表达载体中的突变。用Sambrook等的DNA电泳方法(Sambrook et al.,Molecular cloning-A laboratory manual,2nd ED.,Cold spring harbor laboratory press,1987)对表达载体进行定量测定和用于转染CHO/K-1细胞系。
(2-3)hTPO衍生物基因在CHO细胞的表达
根据lipofectamin方法(Gibco-BRL,Cat.No.18324012)进行转染步骤，在转染前一天将CHO/K-1细胞(ATCC CCL-61)装入6孔的微测定板，每孔的细胞密度为2×105。24小时以后用CHO-S-SFMⅡ培养基(Gibco-BRL,Cat.No.12052-098)冲洗一次,并在细胞中加入0.8ml新鲜培养基。同时，将每种表达载体12μg加至600μl CHO-S-SFMⅡ培养基中，然后与含36μl lipofectamin的600μl CHO-S-SFMⅡ培养基混合。该混合物室温下温育30分钟后，每孔中200μl混合物加入6孔板中的细胞内。然后细胞在5％二氧化碳气体中于37℃温育5小时。加入1ml含10％FBS(Gibco-BRL,Cat.No.16000-036)培养基到细胞中后，再于37℃在5％二氧化碳气体中培养24小时。测定板中的培养基用含10％FBS的HamF-12(Gibco-BRL,Cat.No.11059)替换，然后再在5％二氧化碳气体中于37℃培养72小时以制备一种瞬时表达的培养物。
此外，当细胞在HamF-12培养基中培养48小时以后，将6孔板中的一个孔的细胞转移至含500μg/ml zeocin(Gibco-BRL,Cat.No.R25001)100mm盘的培养基中。细胞培养7～10天后，用显微镜鉴别抗zeocin菌落。用克隆筒(Cloning cylinder)(Bellco,Cat.No.2090-01010)分离每种hTPO衍生物多于12个菌落。用测定hTPO的ELISA kit(R＆DCat.No.DTP00)测定基因表达水平，从而可选择出显示出最高表达水平的细胞系。
实施例3含带有两个或两个以上修饰区的hTPO衍生物cDNAs的哺乳动物表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达
为产生含带有两个或两个以上氨基酸修饰区的hTPO衍生物，利用实施例2中的哺乳动物表达载体。
为构建p40435，表达载体p40429用NheⅠ和BspMⅠ酶消化，以分离编码一种取代的氨基酸(Arg117→Asn117)的494-bpDNA片段。另一个表达载体p40431用BspMⅠ和Bsu36Ⅰ酶切断，以分离编码一种取代的氨基酸(Gly147→Asn147)的355-bpDNA片段。此外，含hTPO cDNA的动物表达载体pCDT用NheⅠ和Bsu36Ⅰ酶消化。p40429和p40431片段被插入pCDT片段，以构建动物表达载体p40435，其含有编码带有两个修饰区(Arg117→Asn117和Gly147→Asn147)的hTPO衍生物的cDNA。
另一个表达载体p40436与两种氨基酸取代有关(Arg117→Asn117和Arg164→Asn164)，通过在pCDT中插入p40429的494-bp片段和p40433的593-bp BspMⅠ-EcoRⅠ片段而制备。
根据上述步骤，表达载体如p40437、p40438和p40439被制备。其中编码取代氨基酸的DNA片段从相应的载体中被分离出并插入至表达载体pCDT(见图3)。
其它表达载体如p40446、p40447和p40449被制备，在制备步骤中编码取代氨基酸的三个DNA片段从相应的载体中被分离出并插入至pCDT(见图3)。
此处所获的8个载体被转染至6孔板上的CHO/K-1细胞中。按照实施例2的步骤，制备了瞬时表达的培养物，并分别分离出抗zeocin菌落。
实施例4 hTPO衍生物体外活性的估计：M-07e增殖试验
为制备hTPO衍生物，在细胞工厂(Cell Factory)(Nunc Cat.No.170009)以10升的量培养实施例2和3的转染细胞系。将每种转染细胞(5×104 cells/ml)转移到含补充了10％FBS的Ham F-12培养基的细胞工厂。培养72小时后，将这些细胞用PBS冲洗一次，然后在ExCell细胞培养基(JRH,Cat.No.14311-10L)中培养。细胞再于5％二氧化碳气体中在37℃培养96小时后，从培养物中获得上清液。上清液第一次浓缩用pelicon膜(Millipore,Cat.No.42PEL60)，第二次浓缩用minitan膜(Millipore,Cat.No.80EL004)。浓缩后，每种样品在1×TNT缓冲剂(10mM Tris(三羟甲氨基甲烷)，0.15M氯化钠，0.01％吐温20,pH7.4)中在4℃透析30小时，接着进行第三次浓缩，用Ultrafree进行(Millipore,Cat.No.UFV2BGC10)。样品用ELISA kit定量分析三次。
巨核细胞白血病细胞系M-07e被保持在补充了GM-CSF(100u/ml)和10％FBS的PRMⅠ1640培养基中(Gibco-BRL,Cat.No.22400-089)。
为估算活性,制备试验培养基(补充了5％FBS的RPM1640)，离心处理收集M-07e细胞，然后用RPM1640冲洗三次。细胞被重新悬浮在试验培养基上，在T-75瓶中调节到8×104cells/ml，在5％二氧化碳气体中培养24小时。再次收集细胞，并调节到1×105cells/ml。将100μl细胞悬浮液加至96孔板上。通过用RPMⅠ1640培养基系列稀释制备标准材料(rhTPO,25μg)的8步浓缩液(100.0～0.78125ng/ml)，用CHO衍生细胞(cell-derived)天然hTPO作为对照。总共11种hTPO衍生物(从40429至40439)以1.5625,6.25,25ng/ml的浓度被制备。每孔中加入每个样品100μl，调节至每孔200μl。于5％二氧化碳气体中温育20小时后，供给细胞1μCi(37kBq)3H-胸苷，然后再温育4小时。用装有玻璃纤维滤器的细胞收集器收集细胞，用PBS冲洗7次。
将收集有细胞的滤器一个接一个地放入计数瓶中，用液闪计数器测定每个样品发出的3H-放射性。Riasmart软件用于计算标准品、对照品和样品的半数最大浓度。
所有衍生物都显示出类似的促进M-07e细胞增生活性的模式。在浓度为25ng/ml时，8种衍生物40429、40430、40432、40433、404334、40437、40438、40439都显示出比天然hTPO类似或更高的活性，活性达到了天然hTPO活性的117％、135％、120％、131％、97％、121％、166％和133％(见图4)。
实施例5从CHO细胞分离出的hTPO衍生物的体内活性
hTPO在体内的试验是小鼠用本发明的各种hTPO衍生物给药，测定小鼠血中血小板水平，图6和图7a、7b给出了试验结果。在条件调节室内用7周龄的Balb/c鼠(Charles River,Japan)试验一个星期，实验室条件为24±1℃,55％R.H.，照明12小时，从早7时至晚7时。试验期间，该8周龄的小鼠一直在饲养间进行试验。
根据体重该鼠被随机分组，每组5只。用药分别情况为：有仅用培养基的组、用天然hTPO的组、用本发明每种hTPO衍生物的组或不用药的空白对照组。
各种hTPO衍生物(36μg/kg或10μg/kg)对小鼠皮下进行一次注射，从第0天(开始注射的当天)至第10天，每天收集小鼠血样。在给药后24小时内从腹部腔静脉收集样品。将经EDTA处理过的试管中的全血样置于自动血细胞计数计中(Cell dyn 3500,Abbott)进行血小板水平测定。所提供的结果是平均值±标准差。
第3天时，天然hTPO刺激血小板水平增加。在第5天时，血小板水平达到最大值，在第10天趋于正常。发现所有衍生物都刺激血小板水平增加，其中衍生物40433、40434、40449和40458与天然hTPO的作用相比，产生相同或更高的血小板水平。特别是40433，在第5天时，其体内产生血小板的活性最大值比天然hTPO约高出34％，总体上高出80％或更多。
比较实施例1天然hTPO的体内活性
图5示出用从动物细胞得出的天然hTPO给药的一只小鼠的血小板水平。7周龄雌性Balb/c小鼠(Charles River,Japan)试验一个星期，实验室条件为24±1℃,55％R.H.，照明12小时，从早7时至晚7时。试验期间，该8周龄的小鼠一直在饲养间进行试验。
根据体重该鼠被随机分组，每组5只。用药分别情况为：有仅用培养基的组、用天然hTPO的组或不用药的空白对照组。
不同浓度的天然hTPO衍生物(1、5或10μg/kg)对小鼠皮下进行一次注射，在第4、8和10天(开始注射的当天为第1天)收集小鼠血样。在给药后24小时内从腹部腔静脉收集样品。将经EDTA处理过的试管中的全血样置于自动血细胞计数计中(Cell dyn 3500,Abbott)进行血小板水平测定。所提供的结果是平均值±标准差。从第4天开始，天然hTPO刺激血小板水平增加。在第8天时，血小板水平达到最大值，在第10天降到最大值的80％。
实施例6含天然hTPO衍生物cDNA的dhfr表达载体的构建及表达它们的哺乳动物细胞系的选择
(6-1)含天然hTPO衍生物cDNA的dhfr表达载体的构建
根据实施例5的结果构建了dhfr表达载体，其与衍生物40433、40434、43449和40458相对应。
首先，BamHⅠ连接物被插入含有dhfr基因的pSV-dhfr(ATCC37146)。为制备BamHⅠ连接物，两种寡核苷酸(SEQ ID NO:27和28)被磷酸化，然后被退火，以互相杂交。尤其是，在37℃用T4多核苷酸激酶(NEBL,Cat.No.201S)进行磷酸化反应3小时。在退火反应中，等分子的寡核苷酸被混合并在94℃放置2分钟，然后将该混合随温度的下降逐步冷却，从65℃到37℃，每秒下降0.2℃。载体pSV2-dhfr与限制酶PvuⅡ和SphⅠ作用，然后BamHⅠ连接物与pSV2-dhfr片段连接。为制备含dhfr基因的1710-bp片段，所得的载体被BamHⅠ酶消化。
含有野生型hTPO基因的表达载体pCDT被BglⅡ酶消化后，该1710-bp片段被插入pCDT。所得到的表达天然hTPO的dhfr的表达载体被pCDT消化。(见图8)。
对于相应于5种衍生物的dhfr表达载体，两种核苷酸(SEQ ID NO:29和NO:2)被用作PCR引物。除了引物，该PCR的条件与实施例1中相同。被扩增的编码hTPO衍生物的序列用KpnⅠ和EcoRⅠ酶进行酶切，然后插入该pCDT载体的KpnⅠ-EcoRⅠ位点。所得到的载体分别标示为pD40433、pD40434、pD40449、pD40458。
(6-2)转染入CHO/dhfr(-)细胞系和基因扩增
按实施例2的转染步骤，实施例6-1中的dhfr表达载体被转染入动物细胞系CHO/dhfr(-)(ATCC CRL-9096)。用补充了10％透析的FBS(Gibco-BRL,Cat.No.26300-061)IMDM培养基FBS(Gibco-BRL,Cat.No.12200-036)进行随后的培养。
为选择转化系，转染后48小时内将细胞加入96孔的微测定板上(每孔的细胞密度为1×103)，在含有500μl/mlzeocin的培养基中培养10～14天。分离抗zeocin菌落，用ELISA定量法选择产生高表达的10～20个细胞系。
所选择的细胞系在含有20nM MTX(氨甲蝶呤，Sigma,Cat.No.M8407)的培养基中传代培养，以扩增hTPO基因。详述如下：将细胞在T-25瓶中培养直到瓶中细胞饱和。将1/5的饱和细胞进行传代培养，接着进行1/10和1/15传代培养。当1/15的细胞传代培养3～天后，T-25瓶被饱和时，扩增完成。用ELISA定量法从在20nM MTX中扩增的细胞系选择出产生最高表达水平的细胞系。该细胞系被用于制备进行体内hTPO活性测定的样品。
实施例7天然hTPO及其衍生物在CHO/dhfr(-)细胞中的表达以及纯化
为制备天然hTPO和及其衍生物，在细胞工厂(Cell Factory)(NuncCat.No.170069)以4升的量培养实施例6的细胞系。将每个细胞系(5×104cells/ml)转移到含补充了10％FBS的IMDM培养基的细胞工厂。培养72小时后，将这些细胞用PBS冲洗一次，然后在DMEM/HamF-12培养基中培养。细胞于5％二氧化碳气体中在37℃再培养96小时后，从培养物中获得上清液用于纯化步骤。
将XK26/20柱(Amersham-pharmacia,Cat.No.18-1000-72)用50mlCM Affi-Gel兰色树脂(Bio-Rad,Cat.No.153-7304)填充后，用缓冲液A(10mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.4)冲洗柱子过夜。装入4升培养物上清液并以5ml/分钟的流速通过柱子。在波长为280nm的紫外光下通过分光光度法进行监控。待全部培养上清液都通过柱子后，用缓冲液B(10mM磷酸钠，2M尿素，pH7.4)冲洗，直到紫外吸收降到基础水平为止。包括hTPO的结合蛋白用缓冲液C(10mM磷酸钠，2M尿素，1M氯化钠，pH7.4)洗脱，这部分用于随后进行的苯基琼脂糖凝胶柱层析。将XK26/20柱用50ml苯基琼脂糖凝胶柱CL4B树脂(Sigma,Cat.No,P7892)填充后，用缓冲液C冲洗柱子过夜。从CM Affi-Gel兰色柱洗脱的部分进行苯基琼脂糖凝胶柱层析，以3ml/分钟的流速通过柱子并在波长为280nm的紫外光下通过分光光度法进行监控。待全部培养上清液都通过柱子后，用缓冲液C冲洗，直到紫外吸收降到基础水平为止。结合到树脂上的蛋白用缓冲液B洗脱，这部分用于随后进行的羟基磷灰石柱层析。将XK16/20柱(Amersham-pharmacia,Cat.No.18-8773-01)用10ml羟基磷灰石树脂(Bio-Rad,Cat.No.130-0420)填充后，用缓冲液D(10mM磷酸钠，2M尿素，pH6.8)冲洗柱子过夜。从苯基琼脂糖凝胶柱洗脱的部分用5N盐酸调pH至6.8，然后进行羟基磷灰石柱层析，流速为3ml/分钟。由于hTPO未结合到羟基磷灰石树脂上这部分被保留了下来。用缓冲液D冲洗柱子，直到紫外吸收降到基础水平为止。然后将结合到树脂上的不纯的蛋白用缓冲液E(0.5M磷酸钠，2M尿素，pH6.8)洗脱。用Econo-Pac Q筒(Bio-Rad,Cat.No.732-0021)将所获得的hTPO部分浓缩至10ml的体积，然后在10mM磷酸钠中透析24小时，以去除盐和尿素。在纯化步骤中每一部分通过SDS-PAGE和银染色而观察到(见图9)，其中，银染色试剂盒(Siver-Stain Plus kit,Bio-Rad,Cat.No.161-0449)的使用方法是按盒的制造者的说明书要求进行的。
HTPO的体内试验是用纯化的hTPO衍生物(剂量为10μg/kg)，按照实施例5的方法进行的。已发现，所有衍生物不仅能促进血小板水平的增加，而且能产生比天然hTPO更高的血小板水平。尤其是40433、40434、40449和40458在给药后10天内，总体上比天然hTPO分别高出77％、91％、26％和79％的血小板水平(见图10)。
实施例8 hTPO衍生物的特性：检测引入糖链和hTPO衍生物稳定性考察
为检验是否在hTPO衍生物中引入了糖链，用SDS-PAGE和Westernblot方法进行分析。如果引入了糖链，则hTPO衍生物的分子量将比天然hTPO分子量大。
将纯化的天然hTPO及其衍生物装入有10～20％梯度tricine聚丙烯酰胺凝胶(Novex,Cat.No.EC66252)的孔中，在10V/cm的电压下进行电泳。电泳之后，将凝胶上分离出的蛋白转至一种硝化纤维滤器上。将该滤器置于含5％脱脂奶粉的TBS液(pH7.5)中温育1小时，然后加入用TBS稀释(1∶1000)的山羊抗hTPO多克隆抗体(R＆D system,Cat.No.AB-288-NA)继续温育18小时。该滤器再与第二种抗体-用TBS稀释(1∶10000)的碱性磷酸酶结合抗山羊抗IgG抗体(Sigma,Cat.No.A4187)温育2小时。染色的底物BCIP/NBT(Sigma,Cat.No.B5655)用作检测hTPO带。结果为，根据引入糖链数量的不同，纯化的hTPO衍生物的分子量高于天然hTPO的分子量(图11)。
为评价hTPO衍生物的稳定性，将天然hTPO与hTPO衍生物40433分别用凝血酶消化，然后观察时间-消化曲线图。将该hTPO衍生物(50μg/ml)加入凝血酶(5units/ml,Sigma,Cat.No.T6759)在37℃消化0.5、1、2、3、4或6小时。然后用SDS-PAGE和Western blot方法进行分析，观察消化图。天然hTPO在用凝血酶处理后30分钟后明显降解，而衍生物40433在4小时后才降解。(见图12)。此结果证实衍生物40433比天然hTPO更稳定，这可从引入的糖链解释。
如上所述，本发明的hTPO衍生物可促使体内血小板前体细胞产生，因此可用于与抗癌治疗或骨髓移植有关的血小板减少症的治疗。特别是衍生物40433、40434、40449和40458在促使血小板生成方面的作用比天然hTPO有显著的提高，并提供了多种优点。由于低剂量的hTPO衍生物与天然hTPO有类似的效果，可对患有血小板减少症病人偶而进行小剂量用药。因此，由于不含有不纯的蛋白以及使用小剂量，使用本发明的hTPO衍生物将减少治疗该病的费用。并提高患者的福利及用药安全性。
本领域的技术人员应理解，上述概念和所公开的实施例很容易被用作修改或设计其它与本发明目的相同的实施例的基础。本领域的技术人员还应理解，这样同类的实施例并不能脱离本发明在权利要求书中所提出要求的精神实质和范围。
        序列表<110>株式会社大熊制药<120>一种新型人类血小板生成素突变蛋白<130>9fpo-04-08<150>KR98-25935<151>1998-06-30<150>KR99-25143<151>1999-06-29<160>34<170>KOPATIN1.0<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>相应于hTPO蛋白质N末端序列的BglⅡ-标记的引物<400>1gaagatctat ggagctgact gaa    23<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>相应于hTPO蛋白质的C末端序列的EcoRⅠ-标记的引物<400>2atgaattctc acccttcctg agac    24<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡脱氧核苷酸引物29-N<400>3gctgtggtgt tgccctgtgg    20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡脱氧核苷酸引物，29-C<400>4acagggcaac accacagctc    20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡脱氧核苷酸引物，30-N<400>5gggttccgtt taaactctgc ag    22<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡脱氧核苷酸引物30-C<400>6ctgcagagtt taaacggaac ccag    24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物31-N<400>7agagggtgga attccctaca agca    24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物31-C<400>8tgcttgtagg gaattccacc ctct    24<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物32-N<400>9gggcccggtt gacgcaga    18<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物32-C<400>10tctgcgtcaa ccgggccc    18<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物33-N<400>11ggactagaga cgtgttgctg gggac    25<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物33-C<400>12gtccccagca acacgtctct agtcc    25<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物34-N<400>13gaagcccaga tccgttagtt ctggc    25<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物34-C<400>14gccagaacta acggatctgg gcttc    25<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物58-N<400>15agctgtggtg tttggggccc gc    22<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物58-C<400>16gcgggcccca aacaccacag ct    22<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物59-N<400>17ctagagaggt gctgttgaca gctgtg    26<210>18<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物59-C<400>18cacagctgtc aacagcagca cctctctag    29<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物60-N<400>19ggtgggtggg gtccggttga cgcagagg    28<210>20<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物60-C<400>20cctctgcgtc aaccggaccc cacccacc    28<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物61-N<400>21tctgctgggg gaagcgttgg tgggtgg    27<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物61-C<400>22ccacccacca acgcttcccc cagcaga    27<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物62-N<400>23cagtgtgagg gttagattgg ttctgctg    28<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物62-C<400>24cagcagaacc aatctaaccc tcacactg    28<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物63-N<400>25cagtgtgagg tttagagagg tt    22<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物63-C<400>26aacctctcta aacctcacac tg    22<210>27<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>BamHⅠ连接子的合成的寡脱氧核苷酸1<400>27cgcggatccg catg    14<210>28<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>BamHⅠ连接子的合成的寡脱氧核苷酸2<400>28cggatccgcg    10<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>相应于hTPO蛋白质的N末端序列的KpnI-标记的引物<400>29ggggtaccgc caccatggag ctgactgaat tg    32<210>30<211>332<212>PRT<213>人类<400>30Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1              5                   10                  15Arg Asp Set His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val
         20                  25                  30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu
     35                  40                  45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu
 50                  55                  60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65                   70                  75                  80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln
            85                   90                  95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu
        100                 105                 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe
     115                120                 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu
130                 135                 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145                 150                 155                  160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro ASh
             165                170                 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr
        180                 185                 190Thr GIy Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile
    195                 200                 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly
210                 215                 220Tyr Leu Ash Arg Ile His Glu Leu Leu Ash Gly Thr Arg Gly Leu Phe225                 230                 235                 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly
            245                 250                 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser
        260                 265                 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu
    275                 280                 285Pro Pro Thr Leu Pro Leu Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro
290                 295                 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305                 310                 315                 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly
            325                 330<210>31<211>996<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码hTPO突变蛋白40433的cDNA序列<400>31agcccggctc ctcctgcttg tgacctccga gtcctcagta aactgcttcg tgactcccat       60gtccttcaca gcagactgag ccagtgccca gaggttcacc ctttgcctac acctgtcctg      120ctgcctgctg tggactttag cttgggagaa tggaaaaccc agatggagga gaccaaggca      180caggacattc tgggagcagt gacccttctg ctggagggag tgatggcagc acggggacaa      240ctgggaccca cttgcctctc atccctcctg gggcagcttt ctggacaggt ccgtctcctc      300cttggggccc tgcagagcct ccttggaacc cagcttcctc cacagggcag gaccacagct      360cacaaggatc ccaatgccat cttcctgagc ttccaacacc tgctccgagg aaaggtgcgt      420ttcctgatgc ttgtaggagg gtccaccctc tgcgtcaggc gggccccacc caccacagct      480gtccccagca acacgtctct agtcctcaca ctgaacgagc tcccaaacag gacttctgga      540ttgttggaga caaacttcac tgcctcagcc agaactactg gctctgggct tctgaagtgg      600cagcagggat tcagagccaa gattcctggt ctgctgaacc aaacctccag gtccctggac      660caaatccccg gatacctgaa caggatacac gaactcttga atggaactcg tggactcttt      720cctggaccct cacgcaggac cctaggagcc ccggacattt cctcaggaac atcagacaca      780ggctccctgc cacccaacct ccagcctgga tattctcctt ccccaaccca tcctcctact      840ggacagtata cgctcttccc tcttccaccc accttgccca cccctgtggt ccagctecac      900cccctgcttc ctgacccttc tgctccaacg cccaccccta ccagccctct tctaaacaca      960tcctacaccc actcccagaa tctgtctcag gaaggg                                996<210>32<211>996<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码hTPO突变蛋白40434的cDNA序列<400>32agcccggctc ctcctgcttg tgacctccga gtcctcagta aactgcttcg tgactcccat       60gtccttcaca gcagactgag ccagtgccca gaggttcacc ctttgcctac acctgtcctg      120ctgcctgctg tggactttag cttgggagaa tggaaaaccc agatggagga gaccaaggca      180caggacattc tgggagcagt gacccttctg ctggagggag tgatggcagc acggggacaa      240ctgggaccca cttgcctctc atccctcctg gggcagcttt ctggacaggt ccgtctcctc      300cttggggccc tgcagagcct ccttggaacc cagcttcctc cacagggcag gaccacagct      360cacaaggatc ccaatgccat cttcctgagc ttccaacacc tgctccgagg aaaggtgcgt      420ttcctgatgc ttgtaggagg gtccaccctc tgcgtcaggc gggccccacc caccacagct      480gtccccagca gaacctctct agtcctcaca ctgaacgagc tcccaaacag gacttctgga      540ttgttggaga caaacttcac tgcctcagcc agaactaacg gatctgggct tctgaagtgg      600cagcagggat tcagagccaa gattcctggt ctgctgaacc aaacctccag gtccctggac      660caaatccccg gatacctgaa caggatacac gaactcttga atggaactcg tggactcttt      720cctggaccct cacgcaggac cctaggagcc ccggacattt cctcaggaac atcagacaca      780ggctccctgc cacccaacct ccagcctgga tattctcctt ccccaaccca tcctcctact      840ggacagtata cgctcttccc tcttccaccc accttgccca cccctgtggt ccagctccac      900cccctgcttc ctgacccttc tgctccaacg cccaccccta ccagccctct tctaaacaca      960tcctacaccc actcccagaa tctgtctcag gaaggg                                996<210>33<211>996<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码hTPO突变蛋白40449的cDNA序列<400>33agcccggctc ctcctgcttg tgacctccga gtcctcagta aactgcttcg tgactcccat       60gtccttcaca gcagactgag ccagtgccca gaggttcacc ctttgcctac acctgtcctg      120ctgcctgctg tggactttag cttgggagaa tggaaaaccc agatggagga gaccaaggca      180caggacattc tgggagcagt gacccttctg ctggagggag tgatggcagc acggggacaa      240ctgggaccca cttgcctctc atccctcctg gggcagcttt ctggacaggt ccgtctcctc      300cttggggccc tgcagagttt aaacggaacc cagcttcctc cacagggcaa caccacagct      360cacaaggatc ccaatgccat cttcctgagc ttccaacacc tgctccgagg aaaggtgcgt      420ttcctgatgc ttgtaggagg gtccaccctc tgcgtcaggc gggccccacc caccacagct      480gtccccagca acacgtctct agtcctcaca ctgaacgagc tcccaaacag gacttctgga      540ttgttggaga caaacttcac tgcctcagcc agaactactg gctctgggct tctgaagtgg      600cagcagggat tcagagccaa gattcctggt ctgctgaacc aaacctccag gtccctggac      660caaatccccg gatacctgaa caggatacac gaactcttga atggaactcg tggactcttt      720cctggaccct cacgcaggac cctaggagcc ccggacattt cctcaggaac atcagacaca      780ggctccctgc cacccaacct ccagcctgga tattctcctt ccccaaccca tcctcctact      840ggacagtata cgctcttccc tcttccaccc accttgccca cccctgtggt ccagctccac      900cccctgcttc ctgacccttc tgctccaacg cccaccccta ccagccctct tctaaacaca      960tcctacaccc actcccagaa tctgtctcag gaaggg                                996<210>34<211>996<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码突变蛋白40458的cDNA序列<400>34agcccggctc ctcctgcttg tgacctccga gtcctcagta aactgcttcg tgactcccat       60gtccttcaca gcagactgag ccagtgccca gaggttcacc ctttgcctac acctgtcctg      120ctgcctgctg tggactttag cttgggagaa tggaaaaccc agatggagga gaccaaggca      180caggacattc tgggagcagt gacccttctg ctggagggag tgatggcagc acggggacaa      240ctgggaccca cttgcctctc atccctcctg gggcagcttt ctggacaggt ccgtctcctc      300cttggggccc tgcagagcct ccttggaacc cagcttcctc cacagggcag gaccacagct      360cacaaggatc ccaatgccat cttcctgagc ttccaacacc tgctccgagg aaaggtgcgt      420ttcctgatgc ttgtaggagg gtccaccctc tgcgtcaggc gggccccaaa caccacagct      480gtccccagca acacgtctct agtcctcaca ctgaacgagc tcccaaacag gacttctgga      540ttgttggaga caaacttcac tgcctcagcc agaactactg gctctgggct tctgaagtgg      600cagcagggat tcagagccaa gattcctggt ctgctgaacc aaacctccag gtccctggac      660caaatccccg gatacctgaa caggatacac gaactcttga atggaactcg tggactcttt      720cctggaccct cacgcaggac cctaggagcc ccggacattt cctcaggaac atcagacaca      780ggctccctgc cacccaacct ccagcctgga tattctcctt ccccaaccca tcctcctact      840ggacagtata cgctcttccc tcttccaccc accttgccca cccctgtggt ccagctccac      900cccctgcttc ctgacccttc tgctccaacg cccaccccta ccagccctct tctaaacaca      960tcctacaccc actcccagaa tctgtctcag gaaggg                                996

Claims (12)

1．由SEQ ID NO:30所示的人类血小板生成素(hTPO)衍生的人类血小板生成素衍生物；该衍生物至少有一个额外的N-连接糖基化位点；该衍生物选自下组：[Asn108]hTPO；[Asn117]hTPO；[Asn147]hTPO ；[Asn153]hTPO；[Asn164]hTPO；[Asn193]hTPO；[Asn117,Asn147]hTPO；[Asn117,Asn167]hTPO；[Asn108,Asn147]hTPO；[Asn108,Asn164]hTPO；[Asn147,Asn164]hTPO；[Asn117,Asn147,Asn164]hTPO；[Asn108,Asn147,Asn164]hTPO；[Asn108,Asn117,Asn164]hTPO；[Asn157,Asn164]hTPO；[Asn162,Ser164]hTPO；[Asn162,Thr164]hTPO；[Asn153,Ser155,Asn164]hTPO；[Asn153,Thr155,Asn164]hTPO；[Asn159,Ser161,Asn164]hTPO；[Asn159,Thr161,Asn164]hTPO；[Asn166,Ser168]hTPO；[Asn166,Thr168]hTPO；[Asn164,Asn168]hTPO。
2．权利要求1的人类血小板生成素衍生物，它是[Asn164]hTPO、[Asn193]hTPO、[Asn108,Asn117,Asn164]hTPO或[Asn157,Asn164]hTPO。
3．编码权利要求1的人类血小板生成素衍生物的重组基因。
4．编码权利要求2的人类血小板生成素衍生物的重组基因。
5．含有权利要求3的重组基因的真核表达载体。
6．权利要求5的真核表达载体，它是p40433、p40434、p40449、p40458、pD40433、pD40434、pD40449或pD40458。
7．被权利要求6的表达载体p40433转染的哺乳动物细胞系CHOK-1/p40433(保藏号：KCTC0495BP)。
8．被权利要求6的表达载体pD40434转染的哺乳动物细胞系CHOdhfr-/pD40434(保藏号：KCTC0630BP)。
9．被权利要求6的表达载体pD40449转染的哺乳动物细胞系CHOdhfr-/pD40449(保藏号：KCTC0631BP)。
10．被权利要求6的表达载体pD40458转染的哺乳动物细胞系CHOdhfr-/pD40458(保藏号：KCTC0632BP)。
11．制备权利要求1所述的人类血小板生成素衍生物的方法，其中含有权利要求3的重组基因的哺乳动物细胞系被用于获得权利要求1所述的人类血小板生成素衍生物。
12．用于治疗血小板减少症的含有权利要求1所述的人类血小板生成素衍生物的药物组合物。
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