DE69821930T2

DE69821930T2 - Hgf polypeptide und deren therapeutische verwendungen

Info

Publication number: DE69821930T2
Application number: DE69821930T
Authority: DE
Inventors: Ermanno Gherardi; Walter Birchmeier; Guido Hartmann
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1997-05-10
Filing date: 1998-05-07
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2018-05-08
Also published as: DE69821930D1; CA2289720A1; EP0981620A1; WO1998051798A1; ES2219888T3; EP0981620B1; GB9709453D0; AU7343898A; DK0981620T3; ATE260341T1; JP2001526540A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polypeptide und deren Verwendung in der Therapie und insbesondere auf die Verwendung von mutante Leberzellenwachstumsfaktoren in der Therapie.
Leberzellenwachstumsfaktur (Hepatocyte Growth Factor = HGF), auch bekannt als Streufaktor (Scatter Factor = SF), ist ein Polypeptidwachstumsfaktor, der Wachstum, Bewegung und Differenzierung in den Zielzellen induziert. HGF wird als eine Einkettenvorform synthetisiert, die proteolytisch in eine aktive Zweikettenform gespalten wird. Von der aktiven HGF-Form wird angenommen, dass sie ihre Wirkung vermittelt, indem sie an einen Tyrosinkinaserezeptor (MET) anbindet, der durch das c-met-Onkogen codiert wird.
HGF vom Wildtyp hat eine Anzahl von möglichen therapeutischen Verwendungen. Jedoch wird HGF vom Wildtyp von Plasma schnell beseitigt (Halbwertzeit ungefähr 4,5 min.). Die Klärungsrate kann etwas reduziert werden, indem HGF vor der Verabreichung mit Heparin oder anderen Polyanionen zu Komplexen geformt wird.
Matsumoto et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 181, 691–699 beschreibt, dass die Auslöschung von Kringeldomänen oder der N-terminalen Haarnadelstruktur bei HGF in einen merklichen Abbau bei den verknüpften biologischen Aktivitäten resultiert.
Miau et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 223, 487–491 gibt an, die Identifikation einer neuen HGF-Variante zu beschreiben, die von aus der Milz erhaltenen Stromalzellen sekretiert wird.
Lokker et al. (1994) Prot. Eng. 7, 895–903 beschreibt die Mutationsanalyse und das Molekularmodell der N-terminalen, den Kringel enthaltenden HGF-Domäne und identifiziert Aminosäureseitenketten, die für die Interaktion mit dem c-Met-Rezeptor wichtig sind.
Mizuno et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1131–1136 beschreibt Mutanten, bei denen die Haarnadelschleife oder eine Kringel Domäne ausgelöscht worden sind.
Schwall et al. (1996) J. Cell Biol. 133, 709–718 berichtet, dass Heparin Dimerisierung induziert und proliferative Aktivität auf die HGF-Antagonisten NK1 und NK2 überträgt, die abgeschnittene HGF-Varianten sind.
Lokker et al. (1992) EMBO J. 11, 2503–2510 beschreibt verschiedene HGF-Mutanten.
Die WO 92/05184 und die WO 96/40914 beziehen sich auf eine abgeschnittene HGF-Form, die angeblich als Antagonist der HGF-Aktivität wirkt.
Die WO 93/23541, die US 5,547,856 , die US 5,316,921 und die US 5,580,963 beziehen sich auf HGF-Varianten, die gegenüber proteolytischer Spaltung resistent sind.
Die US 5,464,815 beschreibt ein Verfahren zum Verlängern der Plasmahalbwertzeit von Heparin-bindenden Proteinen.
Die WO 96/28475 beschreibt HGF, das mit einem Polyethylenglykol modifiziert ist.
Die vorliegende Erfindung beschreibt HGF-Varianten, die eine signifikant reduzierte Fähigkeit aufweisen, Heparin oder Heparansulfatproteoglykan (Heparan Sulphate Proteoglycan = HSPG) zu binden, die aber weiterhin in der Lage sind, an den HGF-Rezeptor (MET) anzubinden. Zumindest einige dieser Varianten haben eine längere Kreislaufhalbwertzeit in vivo und eine größere mitogene Aktivität als HGF vom Wildtyp, wenn sie an Ratten verabreicht werden. So ist es ein Ziel dieser Erfindung, die Notwendigkeit zu überwinden, Komplexe aus HGF und heparinartigen Komponenten oder anderen Polyanionen zu bilden, um die pharmazeutische Kinetik und die in vivo-Aktivität zu verbessern. Die HGF-Molekülvarianten der Erfindung können den HGF-Rezeptor in im Wesentlichen derselben Weise aktivieren wie HGF vom Wildtyp, oder sie können als Antagonisten von HGF vom Wildtyp agieren, oder sie können auf irgendeine andere Weise agieren. In jedem Fall sind die HGF-Molekülvarianten in der Medizin verwendbar.
Ein erster Aspekt der Erfindung stellt eine Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) bereit, die im Wesentlichen nicht in der Lage ist, ein Heparansulfatproteoglykan zu binden, die aber in der Lage ist, an den HGF-Rezeptor anzubinden, zur Verwendung in der Medizin.
Mit "Variante des Leberzellenwachstumsfaktors" meinen wir einen Leberzellenwachstumsfaktor (HGF) der bezüglich der primären Aminosäurestruktur vom Wildtyp abweicht. Zum Beispiel ist die Aminosäuresequenz eines Wildtyps von humanem HGF in 7 angegeben. Es ist gut bekannt, dass bestimmte Polypeptide, insbesondere solche von Menschen, polymorph sind, und es wird vorausgesetzt, dass einige natürliche Variationen der humanen HGF-Sequenz auftreten können und dass solche humanen HGF-Moleküle als Wildtyp angesehen werden, vorausgesetzt, dass der HGF Heparansulfatproteoglykan (HSPG) bindet und in der Lage ist, an den HGF-Rezeptor anzubinden, und die bekannten biologischen Effekte auslöst.
Mit "im Wesentlichen nicht in der Lage, HSPG zu binden" schließen wir die Bedeutung ein, dass die HGF-Variante HSPG signifikant weniger gut als HGF vom Wildtyp bindet. Es ist bevorzugt, wenn die HGF-Variante HSPG mindestens zehnmal weniger gut als HGF vom Wildtyp bindet, vorzugsweise mindestens zwanzigmal weniger gut, noch mehr bevorzugt fünzigmal weniger gut und am meisten bevorzugt mindestens hundertmal weniger gut. Die HSPG-Bindungfähigkeit von HGF vom Wildtyp und HGF-Varianten wird praktischerweise in Bezug auf die HSPGs gemessen, die von den Zellen im Beispiel 1 produziert werden, wie in Beispiel 1 beschrieben ist.
Vorzugsweise weist die HGF-Variante eine reduzierte Affinität zu Heparin auf.
Typischerweise, wenn auch nicht immer, wird die HGF-Variante der Erfindung eine reduzierte Fähigkeit aufweisen, sowohl Heparin als auch HSPG zu binden.
Praktischerweise kann die hier offenbarte HGF-Variante eine solche sein, die Heparin signifikant weniger gut bindet als HGF vom Wildtyp. Es ist bevorzugt, wenn die HGF-Variante Heparin mindestens zehnmal weniger gut als HGF vom Wildtyp bindet, bevorzugt mindestens zwanzigmal weniger gut, noch mehr bevorzugt mindestens fünfzigmal weniger gut und am meisten bevorzugt mindestens einhundertmal weniger gut. Praktischerweise wird die Heparinbindungsfähigkeit von HGF vom Wildtyp und der HGF-Variante unter Verwendung der Verfahren gemessen, die in Beispiel 1 beschrieben sind.
In jedem Fall ist es sinnvoll, wenn die HGF-Variante (zumindest solche Varianten, die keine Antagonisten von HGF sind) im Wesentlichen dieselben mitogenen und motogenen Aktivitäten in Bezug auf Zielzellen aufweist wie HGF vom Wildtyp.
Vorzugsweise werden NK2-Fragmente von HGF vom Wildtyp oder der HGF-Variante verwendet, um die Bindungsaffinität zu Heparin zu bestimmen. Unter Verwendung des Verfahrens des Beispiels 1 weist humane HGF von Wildtyp eine molare Dissoziationskonstante (K_c) von ~1 × 10^–9 M (1 nM) auf, und das NK2-Fragment von HGF vom Wildtyp weist eine molare Dissoziationskonstante (K_d) von ungefähr 2,3 nM bezüglich Heparin auf.
Die natürlich vorkommende Form von NK2 ist ein Produkt des alternativen Spleißen des primären HGF-Transkripts und codiert die Führersequenz (Reste 1 bis 31), die N-Domäne, die die Haarnadelschleife enthält (Reste 70 bis 96), den Kringel 1 (Reste 128 bis 206), den Kringel 2 (Reste 211 bis 288) und drei zusätzliche Reste nach Kringel 2 (Reste 289 bis 291).
Mit "in der Lage, an den HGF-Rezeptor anzubinden" schließen wir die Bedeutung ein, dass die HGF-Variante mit im Wesentlichen derselben Affinität an eine lösliche Form des HGF-Rezeptors (MET) binden kann, wie HGF vom Wildtyp, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Zur Vermeidung von Zweifel umfassen die HGF-Varianten der Erfindung HGF-Varianten, die in der Lage sind, an den HGF-Rezeptor anzubinden, was entweder zu (a) einer Aktivierung des Rezeptors oder (b) einer Verhinderung der Rezeptorsignalübertragung durch endogene HGF oder HGF vom Wildtyp führt.
Vorzugsweise bindet die HGF-Variante an den HGF-Rezeptor mit einer Affinität zwischen dem 0,1- und zehnfachen derjenigen von HGF vom Wildtyp an.
Vorzugsweise sind in einigen Fällen die HGF-Varianten keine HGF-Antagonisten, und für einige Varianten ist der Effekt des Bindens der HGF-Variante an MET in einer Zelle, die MET enthält und auf die Bindung von HGF an MET antworten kann, im Wesentlichen derselbe wie der Effekt des Anbindens von HGF vom Wildtyp an MET. So ist in diesen Fällen die Aktivität der HGF-Variante, die kein HGF-Antagonist ist, und die Aktivität von HGF vom Wildtyp in Bezug auf Zielzellen in vitro im Wesentlichen dieselbe.
Weiterhin bevorzugt sind, wie oben beschrieben ist, einige HGF-Variantenmoleküle HGF-Antagonisten, diese fallen aber nichts desto trotz in den Umfang der Erfindung.
Wie unten detaillierter diskutiert ist, wird von allen diesen Typen von Molekülen angenommen, dass sie in der Medizin einsetzbar sind, und werden so in eine Form gepackt, zubereitet und zur Verwendung in der Medizin präsentiert.
Vor der vorliegenden Arbeit ist nicht gezeigt worden, dass HGF-Varianten, die im Wesentlichen nicht in der Lage sind, Heparin oder HSPG zu binden, die aber in der Lage sind, an den HGF-Rezeptor anzubinden, verbesserte in vivo-Aktivität verglichen mit dem Wildtyp und anderen Formen von HGF-Varianten aufweisen. Insbesondere zeigen zumindest einige Varianten der Erfindung eine unerwartet langsamere Klärung von Serum als HGF vom Wildtyp, und zumindest einige der HGF-Molekülvarianten der Erfindung induzieren in unerwarteter Weise DNA-Synthese in ausgewachsener Leber auf einem höheren Niveau als HGF vom Wildtyp.
Mit "HGF" schließen wir Einkettenformen sowie Formen ein, die in die Zweikettenform proteolysiert worden sind.
Vorzugsweise ist die HGF-Variante eine HGF-Variante, bei der ein positiv geladener Aminosäurerest in der Haarnadelschleifenstruktur von HGF vom Wildtyp durch einen Aminosäurerest ohne Ladung oder mit einer negativen Ladung ersetzt worden ist.
Die Haarnadelschleifenstruktur überspannt die Aminosäurereste 70 bis 96 von HGF vom Wildtyp.
Mit einem "positiv geladenen Aminosäurerest" meinen wir Arg (R), Lys (K) oder His (H). Histidin hat eine teilweise positive Ladung bei physiologischem pH-Wert.
Arg und Lys werden oft als basische Aminosäurereste bezeichnet.
Mit einem "negativ geladenen Aminosäurerest" meinen wir Glu (E) oder Asp (D). Neben den angegebenen positiv oder negativ geladenen Aminosäureresten haben alle natürlich auftretenden Aminosäurereste, die direkt durch den genetischen Code codiert werden, keine Ladung.
Glu und Asp werden oft als saure Aminosäurereste bezeichnet.
Es ist besonders bevorzugt, wenn die Variante eine solche ist, bei der ein positiv geladener Rest in der Haarnadelschleifenstruktur durch einen negativ geladenen Rest ersetzt ist. Es ist deshalb bevorzugt, wenn ein Lys- oder Arg- oder His-Rest durch einen Glu- oder Asp-Rest ersetzt ist. Es ist besonders bevorzugt, wenn ein Lys- oder Arg-Rest durch einen Glu-Rest ersetzt ist.
Es wird vorausgesetzt, dass der Austausch von positiv geladenen Resten durch nicht geladene oder negativ geladene Reste durch gut bekannte Verfahren des Proteinengineerings, wie sie unten beschrieben werden, einfach erreicht wird. HGF-Molekülvarianten, die im Wesentlichen nicht in der Lage sind, Heparin oder HSPG zu binden, die aber in der Lage sind, an den HGF-Rezeptor anzubinden, können jedoch z. B. auch erhalten werden, indem positiv geladene Aminosäurereste, die in der Haarnadelschleifenstruktur vorliegen, durch Proteinengineeringverfahren unterdrückt werden, oder z. B. durch chemisches Modifizieren positiv geladener Reste in der Haarnadelschleifenstruktur. Proteinengineeringverfahren werden für das Austauschen von Aminosäureresten bevorzugt; es mag jedoch beispielsweise auch möglich sein, unter Verwendung von Zyklohexan-1,2-Dion ausgewählte Modifikationen von Argininresten zu bewirken.
Vorzugsweise ist der HGF humaner HGF. Die Aminosäuresequenz eines HGF vom Wildtyp ist in 7 angegeben. Es wird insbesondere bevorzugt, wenn die HGF-Variante eine humane HGF-Variante ist, bei der positiv geladene Aminosäurereste der Haarnadelschleifenstruktur durch negativ geladene Aminosäurereste oder Aminosäurereste ohne Ladung ausgetauscht sind. Es wird jedoch vorausgesetzt, dass HGF von anderen Säugetierarten eine analoge Haarnadelschleifenstruktur aufweist, die positiv geladene Reste enthält, und Varianten dieser nicht-humanen HGF-Moleküle, bei denen positiv geladene Aminosäurereste durch negativ geladene Aminosäurereste oder durch nicht geladene Aminosäurereste ausgetauscht sind, sind in den Umfang der Erfindung eingeschlossen, vorausgesetzt, dass solche Moleküle im Wesentlichen nicht in der Lage sind, Heparin oder HSPG zu binden, aber in der Lage sind, an den HGF-Rezeptor anzubinden.
Bei humanem HGF vom Wildtyp umfassen die positiv geladenen Aminosäurereste in der Haarnadelschleifenstruktur R73, R76, K78, K85, K91, R93 und K94.
Es ist insbesondere bevorzugt, wenn die humane HGF-Variante eine solche ist, bei der mindestens Arg73 (R73) durch einen Aminosäurerest ohne Ladung oder mit einer negativen Ladung ausgetauscht worden ist. Vorzugsweise umfasst die humane HGF-Variante die Mutation Arg73 Glu (R73E) oder Arg73 Asp (R73D); am meisten bevorzugt Arg73 Glu (R73E).
Es ist auch insbesondere bevorzugt, wenn die humane HGF-Variante eine solche ist, bei der zumindest Arg76 (R76) durch einen Aminosäurerest ohne Ladung oder mit einer negativen Ladung ausgetauscht worden ist. Vorzugsweise umfasst die humane HGF-Variante die Mutation Arg76 Glu (R76E) oder Arg76 Asp (R76D); am meisten bevorzugt Arg76Glu (R76E).
Eine speziell bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine humane HGF-Variante, bei der beide Aminosäurereste Arg73 und Arg76 (R73 und R76) unabhängig voneinander mit einem Aminosäurerest ohne Ladung oder mit einer negativen Ladung ausgetauscht worden sind. Es ist bevorzugt, dass sowohl Arg73 als auch Arg76 mit einem negativ geladenen Aminosäurerest, wie beispielsweise Glu (E) oder Asp (D) ausgetauscht worden sind; es ist insbesondere bevorzugt, wenn die humane HGF-Variante Aminosäureaustauschungen Arg73 Glu und Arg76 Glu (R73E und R76E) aufweist.
Praktischerweise werden zusätzlich zum Ersetzen von Arg73 und Arg76 andere positiv geladene Aminosäurereste in der Haarnadelschleifenstruktur mit einem negativ geladenen Aminosäurerest oder einem Aminosäurerest ohne Ladung ausgetauscht. Geeigneter Weise werden zusätzlich zur Austauschung von Arg73 und Arg76 von humanem HGF Arg93 (R93) und/oder Lys78 (K78) mit einem negativ geladenen Aminosäurerest oder einem ungeladenen Aminosäurerest ausgetauscht. Vorzugsweise werden Arg 93 (R93) und/oder Lys78 (K78) mit Glu (E) oder Asp (B) ausgetauscht, am meisten bevorzugt mit Glu (E).
So sind eine humane HGF-Variante, die Aminosäureaustauschungen R73E, R76E und R93E aufweist, und eine humane HGF-Variante, die Aminosäureaustauschungen R73E, R76E und K78E aufweist, bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
Die HGF-Molekülvarianten der Erfindung umfassen HGF-Moleküle, die zusätzlich dazu, dass sie die oben angegebenen Mutationen enthalten, auch weiter modifiziert sein können, um die biologische Aktivität des Moleküls zu modulieren (um z. B. einen HGF-Antagonisten auszubilden), oder sie können weiter modifiziert sein, um die Synthese und/oder Reinigung der HGF-Molekülvarianten zu erleichtern. Diese weiteren Modifikationen erhalten jedoch die gegebenen Eigenschaften der HGF-Molekülvariante, nämlich, dass die Variante im Wesentlichen nicht in der Lage ist, HSPG oder Heparin, wie es im Einzelfall sein mag, zu binden, aber in der Lage ist, an den HGF-Rezeptor anzubinden.
Geeigneter Weise kann die HGF-Variante eine Kennzeichenpeptidsequenz aufweisen, die ihre Reinigung erleichtern kann. Typischerweise weist das Kennzeichen einen Bindungsplatz für eine Komponente auf, die immobilisiert werden kann, um eine Festphasenreinigung der HGF-Variante nach dem Anbinden der HGF-Variante an die Komponente zu ermöglichen. Das Kennzeichen kann z. B. die His_n-Sequenz (n > 4) sein, die an Ni²⁺-Ionen anbindet, oder es kann ein Epitop für einen monoklonalen Antikörper sein, wie z. B. das gut bekannte Myc-Kennzeichenepitop. Andere Möglichkeiten sind im Stand der Technik gut bekannt.
Es wird jedoch bevorzugt, wenn die humane HGF-Variante aus einem HGF vom Wildtyp mit Aminiosäureaustauschungen Arg73 Glu und Arg76 Glu (R73E, R76E) oder einem HGF vom Wildtyp mit Aminosäureaustauschungen Arg73 Glu, Arg76 Glu und Arg93 Glu (R73E, R76E, R93E) oder einem HGF vom Wildtyp mit Aminosäureaustauschungen Arg73 Glu, Arg76 Elu und Lys78 Glu R73E, R76E, K78E) besteht.
Die humane HGF-Variante mit Aminosäureaustauschungen R73E, R76E und R93E wird im Beispiel 1 als HP1 bezeichnet, und die humane HGF-Variante mit Aminosäureaustauschungen R73E, R76E und K78E ist in Beispiel 1 als HP2 bezeichnet (s. Legende zu 1).
Es wird auch bevorzugt, wenn die humane HGF-Variante Mutationen von L80 und/oder F82 aufweist. Insbesondere weist eine bevorzugte humane HGF-Variante die Mutationen L80S und F82Q auf. Die humane HGF-Variante mit Aminosäureaustauschungen L80S und F82Q ist im Beispiel 1 als HP4 bezeichnet und ist eine HGF-Variante zur Verwendung in der Medizin gemäß der Erfindung. Es wird vorausgesetzt, dass es nützlich sein kann, eine oder mehrere dieser Mutationen in eine HGF-Variante einzuführen, die auch eine oder mehrere der Mutationen bei der Haarnadelschleife enthält, die die positive Ladung entfernen, wie hier beschrieben ist.
Zusätzlich zu den vorgenannten Mutationen kann es vorteilhaft sein, andere positiv geladene Aminosäurereste bei dem humanen HGF-Molekül mit nicht geladenen oder negativ geladenen Aminosäureresten auszutauschen. Zum Beispiel kann es vorteilhaft sein, eine oder mehrere Austauschungen von K91 und K94 (in der Haarnadelstruktur) und H241, R242, K244 und R249 (in der Kringel 2-Domäne) einzuführen.
Eine humane HGF-Variante, die aus HGF vom Wildtyp besteht, bei dem Lys85 durch Glu ausgetauscht ist (K85E; HP5 – s. Legende zur 1) ist keine Variante gemäß der Erfindung, da sie sich im Wesentlichen wie HGF vom Wildtyp verhält. Diese Mutation kann jedoch nützlicher Weise zusammen mit den anderen hier offenbarten Mutationen vorgesehen werden.
Die HGF-Variante ist vorzugsweise eine solche, die in Bezug auf ihre MET-Bindungsfähigkeit und ihre Fähigkeit, Signale in die Zelle zu übermitteln, im Wesentlichen dieselbe Aktivität aufweist wie HGF vom Wildtyp.
Es ist jedoch auch zu bevorzugen, wenn die HGF-Variante eine solche ist, die als Antagonist zur Wirkung von HGF vom Wildtyp wirkt. HGF-Molekülvarianten, die als Antagonisten zu der Wirkung von HGF vom Wildtyp wirken, sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel beziehen sich die WO 92/05184 und die WO 96/40914 auf verkürzte Formen von HGF, die als spezifische oder teilweise Antagonisten zur Aktivität von HGF vom Wildtyp wirken. Die WO 93/23541, die US 5,547,856 , die US 5,316,921 und die US 5,580,693 beziehen sich auf HGF-Molekülvarianten, die resistent gegenüber proteolytischer Spaltung durch Enzyme sind, welche zur in vivo-Umwandlung von HGF in seine zweikettige Form in der Lage sind. Alle diese Patentanmeldungen und Patente werden hier durch Bezugnahme eingeführt.
Es ist somit bevorzugt, wenn die in diesen Patentanmeldungen und Patenten beschriebenen Varianten weiter in der Weise modifiziert werden, wie sie hier beschrieben ist, indem z. B. zusätzliche Mutationen herbeigeführt werden, die die HGF-Variante im Wesentlichen unfähig machen, Heparin oder HSPG zu binden, wobei aber die HGF-Variante in der Lage ist, an den HGF-Rezeptor anzubinden.
Vorzugsweise werden die hier offenbarten Mutationen mit den Mutationen kombiniert, die Beständigkeit gegenüber proteolytischer Spaltung durch Enzyme vermitteln, die zur in vivo-Umwandlung von HGF in seine zweikettige Form in der Lage sind, wie beispielsweise jene, die in der US 5,316,921 beschrieben sind. Mehr bevorzugt sind diese Mutationen, die mit den Mutationen, die hier in Bezug auf die Haarnadelschleifenstruktur offenbart sind, kombiniert werden können, solche, bei denen eine Aminosäureänderung an oder benachbart irgendeiner der Aminosäureposition 493, 494, 495 und 496 der humanen HGF-Wildtypsequenz vorliegt.
So sind bevorzugte HGF-Molekülevarianten der Erfindung, von denen geglaubt wird, dass sie Antagonisten von HGF vom Wildtyp sind, beispielsweise jene, die die Aminosäureaustauschungen R73E, R76E und R93E oder R73E, R76E und K78E und irgendeine oder mehrere der Austauschungen der Aminosäurepositionen 493, 494, 495 und 496 von humanem HGF vom Wildtyp aufweisen.
Wie oben diskutiert wurde, sind die zuvor erwähnten HGF-Molekülvarianten in der Medizin verwendbar.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine HGF-Variante, so wie sie in dem ersten Aspekt definiert ist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Die vorgenannten erfindungsgemäßen Verbindungen oder eine Formulierung daraus können durch jedes konventionelle Verfahren verabreicht werden, einschließlich oral und parenterale Injektion (z. B. subkutan oder intramuskulär). Die Behandlung kann aus einer einzelnen Dosis oder einer Mehrzahl von Dosen über einen Zeitraum bestehen.
Während es für eine Verbindung der Erfindung möglich ist, allein verabreicht zu werden, ist es bevorzugt, wenn sie zusammen mit einem oder mehreren akzeptablen Trägern in einer pharmazeutischen Formulierung vorliegt. Die Träger müssen in dem Sinne "akzeptabel" sein, dass sie mit der erfindungsgemäßen Verbindung kompatibel sind und sich nicht vernichtend auf ihre Rezipienten auswirkt. Typischerweise werden die Träger Wasser oder Salzlösung sein, die steril und keimfrei sein werden.
Die Formulierungen können praktischerweise in der Form von Dosierungseinheiten vorliegen, und sie können durch jedes Verfahren, das im Stand der Technik gut bekannt ist, zubereitet werden. Solche Verfahren umfassen den Schritt des in Verbindung Bringens des aktiven Bestandteils (erfindungsgemäße Verbindung) mit dem Träger, der einen oder mehrere Zusatzstoffe ausbildet. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und intensives in Verbindung Bringen des aktiven Inhaltsstoffs mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder beidem und, falls notwendig, anschließendes Formen des Produkts zubereitet.
Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können als separate Einheiten, wie beispielsweise Kapseln, Cachets oder Tabletten, von denen jede bzw. jedes eine vorgegebene Menge des aktiven Inhaltsstoffs enthält, als Pulver oder Granulat, als Lösung oder Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit oder in einer nicht wässrigen Flüssigkeit oder einer nicht wässrigen Flüssigkeit oder als Öl-in-Wasser-Flüssigemulsion oder als Wasser-in-Öl-Flüssigemulsion vorliegen. Der aktive Inhaltsstoff kann auch als Bolus, Electuarium oder Paste vorliegen.
Eine Tablette kann durch Pressen oder Gießformen hergestellt sein, optional mit einem oder mehreren Zusatzstoffen. Gepresste Tabletten können durch Pressen des aktiven Inhaltsstoffs in einer frei fließenden Form, wie beispielsweise als Pulver oder Granulat, optional gemischt mit einem Bindemittel (z. B. Povidon, Gelatine, Hydroxypropylmethylcellulose), einem Schmiermittel, einem inertem Verdünner, einem Konservierungsmittel, einem Zersetzungmittel (z. B. Natriumstärke Glykolat, vernetztes Povidon, vernetzte Natriumcarboxylmethylcellulose), einem oberflächenaktivem Mittel oder einem Dispergiermittel, in einer geeigneten Maschine zubereitet werden. Gegossene Tabletten können durch Gießen einer Mischung der zerpulverten Verbindung angefeuchtet mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Die Tabletten können optional beschichtet oder eingekerbt werden, und sie können so formuliert werden, dass sie eine langsame bzw. gesteuerte Freigabe des aktiven Inhaltsstoffs bereitstellen, wobei z. B. Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen verwendet wird, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen.
Formulierungen, die zur äußerlichen Anwendung im Mund geeignet sind, umfassen Tabletten, die den aktiven Inhaltsstoff in einer aromatisierten Basis, üblicherweise Sukrose und Gummi-Arabicum oder Gummi-Tragacanth aufweisen, Pastillen, die den aktiven Inhaltsstoff in einer inerten Basis, wie beispielsweise Gelatine und Glycerin oder Sukrose und Gummi-Arabicum aufweisen, und Mundspülungen, die den aktiven Inhaltsstoff in einem geeigneten flüssigen Träger aufweisen.
Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen wässrige und nicht wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxydationsmittel, Puffer, Bakteriostatika und Lösungsbestandteile aufweisen, die die Formulierung isotonisch mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers machen, und wässrige und nicht wässrige sterile Suspensionen, die suspendierende Mittel und Verdickungsmittel aufweisen können. Die Formulierungen können in Einzeldosis- und Mehrfachdosisbehältern vorliegen, z. B. in abgedichteten Ampullen und Phiolen, und sie können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der direkt vor der Verwendung nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers erfordert, z. B. Wasser für Injektionen. Extemporane Injektionslösungen und -suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art zubereitet werden.
Bevorzugte Einzeldosisformulierungen sind jene, die eine tägliche Dosis oder Einheit, eine tägliche Unterdosis oder einen geeigneten Anteil hiervon des aktiven Inhaltsstoffs umfassen.
Es sollte verstanden werden, dass die Formulierungen dieser Erfindung zusätzlich zu den oben speziell erwähnten Inhaltsstoffen auch andere Mittel enthalten können, die im Stand der Technik bezüglich der Art der fraglichen Formulierung konventionell sind, z. B. können jene, die für die orale Verabreichung geeignet sind, Geschmacksstoffe umfassen.
Ein lokalisierter Austrag mag wünschenswert sein, wo er möglich ist; z. B., wenn der Austrag an die Leber erwünscht ist, mag er über eine Leberarterie erfolgen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren des Behandelns eines Patienten bereit, der einer Behandlung mit einem Leberzellenwachstumsfaktor oder eines Antagonisten davon bedarf oder der hiervon profitieren würde, wobei das Verfahren das Verabreichen einer effektiven Menge einer HGF-Variante, wie sie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert ist, aufweist.
Es wird erkannt werden, dass es mit den Fortschritten in der Gentherapie möglich sein kann, die HGF-Variante durch Verabreichung eines genetischen Konstrukts zu verabreichen, das die HGF-Variante codiert. Dies wird in das Behandlungsverfahren der Erfindung speziell eingeschlossen.
Die therapeutische Verwendung von HGF vom Wildtyp und bestimmten HGF-Molekülvarianten, die sich von jenen unterscheiden, welche hier offenbart sind, ist zuvor beschrieben worden. Zum Beispiel deuten Studien bei Mäusen an, dass HGF als ein tumorunterdrückendes Mittel in frühen Stadien von Leberkrebs wirken kann (Santoni et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9577–9582), und von HGF wird berichtet, dass er das Wachstum von Hep G2, HCC, B6/F1-Melanom- und schuppigen KB-Karzinomzellen in vitro verhindert (Tajima et al.(1991) FEBS Lett. 291, 229–232). HGF verhindert das Einsetzen und Fortschreiten von Leberfibrose/-zirrhose bei Ratten und wendet den Tod, der durch schwere Leberzirrhose und -fehlfunktion verursacht wird, vollständig ab ( EP 0 456 188 und Matsuda et al. (1995) J. Biochem. 118, 643–649). HGF fördert die Wirksamkeit der retroviralen Transduktion von primären Hepatozyten (Pages et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 222, 726–731).
HGF simmuliert Leberregeneration bei Ratten mit zu 70% zerstörter Leber (Ishii et al. (1995) J. Biochem. 117, 1105–1112). HGF ist als Therapie gegen Gefäßglattzellenproliferation vorgeschlagen worden (Nakamura et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 215, 483–488, und ein Abfall von lokalen HGF-Konzentrationen aufgrund von hoher D-Glukose kann eine endotheliale Verletzung bei Diabetes auslösen, die potentiell in das Fortschreiten von Atheriosklerose resultiert (Nakamura et al. (1997) Diabetes 46, 138–142).
HGF ist ein potenter Angionesefaktor in vivo (Rosen et al. (1993) Symp. Soc. Exp. Biol. 47, 227 bis 234) und kann so Verwendung bei der Wundheilung finden.
Von HGF wird berichtet, dass er die Heilung epithelialer Darmerosionen/-geschwüren fördert (Nusrat et al. (1994) J. Clin. Invest. 93, 2056–2065). HGF ist vorgeschlagen worden, um Nebenwirkungen von Strahlen-/Chemotherapie zu blockieren (WO 93/08821; WO 95/25537), als Heilmittel für kraniale Nervenstörungen (WO 95/07709), als Heilmittel für Knorpelerkrankung (WO 96/05855), um die Nebenwirkungen zu mildern, die von Immununterdrückungsmitteln verursacht werden, (WIO 95/25537) und als Therapeutikum gegen Nierenerkrankung ( EP 0 462 549 ). Siehe auch Matsumoto & Nakamura, Hepatocyte Growth Factor, Seiten 450–474, in: Acute Renal Failure, New Concepts and therapeutic Strategies, Hrgs. M. S. Goligorsky & J. H. Stein, Churchill Livingstone, New York. Alle diese Dokumente wurden hier durch Bezugnahme eingeführt.
HGF oder Varianten davon werden als in der Behandlung von vielen anderen Störungen verwendbar berichtet. Die WO 97/0997 deutet an, dass HGF bei der Behandlung von zystischer Fibrose verwendet werden kann. Die WO 97/12628 deutet an, dass HGF die Neubildung von Blutgefäßen fördern kann, die beispielsweise durch Gefäßchirurgie oder Gefäßplastik beschädigt oder traumatisiert worden sind, und die WO 97/12629 deutet an, dass HGF zur Förderung der Gefäßbildung verwendbar ist. Das α-Fragment von HGF kann als Antagonist wirken, der spezifisch die Fähigkeit von Krebszellen verhindert, mittels HGF zu streuen bzw. zu metastasieren (s. WO 97/16205), während in der WO 96/329560 HGF als der aktive Bestandteil verwendet wird, der den Effekt des Unterdrückens von Zytotoxizität bei einem ischaemischen Modell verhindert und deshalb als Prophylaxe- und/oder Heilungsmittel für ischaemische Erkrankungen wirksam ist.
Die WO 95/29694 weist darauf hin, dass HGF die Collagenhydrolyse beschleunigen kann, um Fibrose und andere Erkrankungen zu behandeln, die durch eine herabgesetzte Collagenaseaktivität verursacht werden, und die EP 0 661 995 deutet an, dass HGF bei der Verhinderung des Festsetzens oder des Fortschreitens von Leberschäden bei Patienten mit einem Risiko von Leberschäden verhindert werden kann. HGF-Varianten, die HGF daran hindern, an MET anzubinden, werden auch zur Verwendung in einem Verfahren zum Behandeln von Tumorzellenmetastasen vorgeschlagen (s. z. B. EP 0 805 203 ).
Zusätzlich beschreibt die WO 98/00543 verschiedene HGF-Rezeptoragonisten, und die WO 97/07824 weist darauf hin, dass das HGF-Gen bei Verwendung von Liposomen in der Gentherapie eingesetzt werden kann.
Die HGF-Molekülvarianten, die an MET binden und die zelluläre Signale in im Wesentlichen derselben Weise wie HGF vom Wildtyp vermitteln, werden in derselben Weise wie HGF vom Wildtyp als therapeutisch nützlich angesehen, aber da HGF-Molekülvarianten im Wesentlichen nicht in der Lage sind, HSPG oder Heparin zu binden, wird von den Molekülvarianten angenommen, dass sie einen überlegenen Effekt in vivo haben, weil z. B. von den HGF-Molekülvarianten angenommen wird, dass sie eine größere Gewebedurchdringung erbringen und somit die Fähigkeit haben, Zell- bzw. Gewebebereiche zu erreichen, die exogener HGF vom Wildtyp nicht wirksam erreichen kann (bzw. für deren Erreichen er eine viel höhere Dosis erfordern würde). Entsprechend wird angenommen, dass die therapeutische Wirksamkeit von mindestens einigen der HGF-Molekülvarianten der Erfindung höher ist als von HGF vom Wildtyp und dass eine niedrigere therapeutische Dosierung verwendet werden kann, welche in geringeren Nebenwirkungen resultieren kann. So wird von dieser Klasse von HGF-Molekülvarianten angenommen, dass sie als Krebstherapeutikum, bei der Behandlung von Leberfibrose/-zerrhose beim Menschen, als therapeutisches Mittel bei der Leberzerstörung und Leberverletzung, als Adjuvants für die Gentherapie der Leber, bei der Therapie von Gefäßglattmuskelzellenpoliferation, zur Förderung der Heilung von epithelialen Darmerosionen/-geschwüren, als Gefäßwachstumsfaktor, zum Blockieren von Nebenwirkungen von Strahlen- oder Chemotherapie, als Heilmittel für kraniale Nervenstörungen, als Heilmittel für Knorpelerkrankung, zur Linderung von Nebenwirkungen, die durch Immununterdrückungsmittel verursacht werden, und als therapeutisches Mittel gegen Nierenerkrankungen verwendbar sind. Diese HGF-Molekülvarianten können auch bei der Behandlung von chronischen Hautwunden nützlich sein.
Von den HGF-Molekülvarianten der Erfindung wird angenommen, dass sie nützlich bei der Behandlung von Krebs sind, um das Streuen und die Metastasenbildung zu verhindern bzw. zu verzögern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung einer HGF-Variante, wie sie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten bereit, der der Behandlung mit einem HGF oder einem Antagonisten bedarf oder hiervon profitieren würde.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Leberzellenwachstumsfaktor-(HGF)-Variante bereit, die im Wesentlichen nicht in der Lage ist, Heparin oder HSPG zu binden, die aber in der Lage ist, an den HGF-Rezeptor anzubinden, vorausgesetzt, dass die HGF-Variante keine Variante von humanem HGF ist, bei dem die Austauschungen (a) R73E, R76E und R93E oder (b) R73E und R76E oder (c) K91E, R93E und K94E vorgenommen worden sind.
Die bevorzugten Ausführungsformen bei den HGF-Molekülvarianten dieses Aspekts der Erfindung sind dieselben wie jene bei dem ersten Aspekt der Erfindung.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Polynukleotid bereit, das eine Leberzellenwachstumsfaktor-(HGF)-Variante codiert, die im Wesentlichen nicht in der Lage ist, Heparin oder HSPG zu binden, die aber in der Lage ist, an den HGF-Rezeptor anzubinden, vorausgesetzt, dass die HGF-Variante keine Variante von humanem HGF ist, bei dem die Austauschungen (a) R73E, R76E und R93E oder (b) R73E und R76E oder (c) K91E, R93E und K94E vorgenommen worden sind.
Das Polynukleotid dieses Aspekts der Erfindung kann beispielsweise durch platzgerichtete Mutationserzeugung unter Verwendung von fehlgepassten Oligonukleotiden oder durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion oder durch de novo Polynukleotidsynthese oder jegliche andere Verfahren einfach hergestellt werden. Solche Verfahren sind im Stand der Technik der Molekularbiologie gut bekannt, und zumindest einige der Verfahren sind detailliert in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt einen Vektor bereit, der ein Polynukleotid gemäß der Erfindung aufweist, und noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Wirtszelle bereit, die ein Polynukleotid oder einen Vektor gemäß der Erfindung aufweist.
Das Polynukleotid oder der Vektor kann DNA oder RNA sein; vorzugsweise ist er bzw. es DNA.
Eine Vielzahl von Verfahren ist entwickelt worden, um DNA funktional über komplementär anhaftende Termini an Vektoren anzuhängen. Zum Beispiel kann ein komplementärer Homopolymerabschnitt dem in die Vektor-DNA einzusetzenden DNA-Segment hinzugefügt werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbindung zwischen den komplementären homopolymeren Enden verbunden, um rekombinante DNA-Moleküle zu bilden.
Synthetische Verbinder, die einen oder mehrere Restriktionsplätze enthalten, stellen ein alternatives Verfahren des Verbindens des DNA-Segments mit Vektoren bereit. Das DNA-Segment, das, wie früher beschrieben wurde, durch Endonukleasenrestriktionsaufschluss erzeugt wird, wird mit Bakteriophage-T4-DNA-Polymerase oder E. coli-DNA-Polymerase I, Enzymen, die die vorstehenden 3'-Einzelstrangtermini mit ihren 3'-5' exonukleolytischen Aktivitäten entfernen und die zurückgesetzten 3'-Enden mit ihren polymerisierenden Aktivitäten auffüllen, behandelt.
Die Kombination dieser Aktivitäten erzeugt somit stumpf endende DNA-Segmente. Die stumpf endenden Segmente werden dann mit einem großen molekularen Überschuss an Verbindermolekülen in der Gegenwart eines Enzyms inkubiert, das in der Lage ist, die Ligation von stumpf endenden DNA-Molekülen zu katalysieren, wie beispielsweise Bacteriophage-T4-DNA-Ligase. So sind die Produkte der Reaktion DNA-Segmente, die polymere Verbindersequenzen an ihren Enden tragen. Dieses DNA-Segmente werden dann mit den geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und an einen Expressionsvektor ligatiert, der mit einem Enzym gespalten worden ist, das Termini erzeugt, welche mit jenen des DNA-Segments kompatibel sind.
Synthetische Verbinder, die eine Vielzahl von Endonukleaserestriktionsplätzen umfassen, sind kommerziell aus einer Anzahl von Quellen erhältlich, einschl. International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA.
Ein wünschenswerter Weg, die DNA zu modifizieren, die das Polypeptid der Erfindung codiert, ist es, die Polymerasekettenreaktion zu verwenden, wie sie von Saiki et al. (1988) Science 239, 487–491 offenbart ist.
Bei diesem Verfahren wird die enzymatisch zu verstärkende DNA von zwei spezifischen Oligonukleotidprimern flankiert, die ihrerseits in die verstärkte DNA eingebaut werden. Diese spezifischen Primer können Endonukleaseerkennungsrestriktionsplätze enthalten, die zum Klonen in Expressionsvektoren unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren verwendet werden können.
Die DNA (oder RNA) wird dann in einem geeigneten Wirt expressiviert, um eine HGF-Variante der Erfindung (Polypeptid, das die Verbindung der Erfindung darstellt) zu produzieren. So kann die DNA, die das Polypeptid codiert, welches die Verbindung der Erfindung darstellt, gemäß bekannten Techniken verwendet werden, die in geeigneter Weise mit Blick auf die hier enthaltenen Lehren modifiziert sind, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle für die Expression und Produktion des Polypeptids der Erfindung zu transformieren. Solche Techniken umfasst jene, die in den US-Patenten 4,400,859, am 03. April 1984 erteilt für Rutter et al., 4,530,901, am 23. Juli 1985 erteilt für Weissmann, 4,582,800, am 15. April 1986 erteilt für Crowl, 4,677,063, am 30. Juni 1987 erteilt für Mark et al., 4,678,751 am 7. Juli 1987 erteilt für Goeddel, 4,704,362, am 03. November 1987 erteilt für Itakura et al., 4,710,463, am 01. Dezember 1987 erteilt für Murray, 4,757,006, am 12. Juli 1988 erteilt für Toole, Jr. et al., 4,766,075, am 23. August 1988 erteilt für Goeddel et al., und 4,810,648 am 07 März 1989 erteilt für Stalker, offenbart sind, von denen alle hier durch Bezugnahme eingeführt werden.
Die DNA, die das Polypeptid codiert, welches die Verbindung der Erfindung darstellt, kann mit einer großen Vielzahl von anderen DNA-Sequenzen für die Einführung in einen geeigneten Wirt verbunden werden. Die verbundene DNA wird von der Art des Wirts, der Weise der Einführung der DNA in den Wirt und davon abhängen, ob eine episomale Erhaltung oder Integration erwünscht ist.
Allgemein wird die DNA in einen Expressionsvektor, wie beispielsweise ein Plasmid, in richtiger Orientierung und in den geeigneten Leserahmen für die Expression eingesetzt. Falls notwendig kann die DNA mit den geeigneten transkriptionalen und translationalen regulatorischen Nukleotidsteuersequenzen verknüpft werden, die von dem gewünschten Wirt erkannt werden, obwohl solche Steuerungen allgemein in dem Expressionsvektor verfügbar sind. Der Vektor wird dann durch Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Allgemein werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert werden. Es ist deshalb notwendig, nach transformierten Wirtszellen zu selektieren. Eine Selektionstechnik umfasst das Einbauen einer DNA-Sequenz, die ein selektierbares Merkmal bei den transformierten Zellen codiert, wie beispielsweise Beständigkeit gegen Antibiotika, zusammen mit allen notwendigen Steuerelementen in den Expressionsvektor. Alternativ kann das auswählbare Merkmal auf einem anderen Vektor liegen, der zusammen für die Transformation der gewünschten Wirtszelle verwendet wird.
Wirtszellen, die durch die rekombinante DNA der Erfindung transformiert worden sind, werden dann für ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann im Hinblick auf die hier offenbarten Lehren bekannt sind, kultiviert, um die Expression des Polypeptids zu ermöglichen, das dann geborgen werden kann.
Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschl. Bakterien (z. B. E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (z. B. Saccharomyces cerevisiae) und filamentöse Pilze (z. B. Aspergillus), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen.
Die Vektoren umfassen ein prokaryotisches Replikon, wie beispielsweise ColE1 ori, zur Propagation in einem Prokaryot, selbst wenn der Vektor für die Expression in anderen, nicht prokaryotischen Zelltypen verwendet wird. Die Vektoren können auch einen geeigneten Promotor umfassen, wie beispielsweise einen prokaryotischen Promotor, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) der Gene in einer bakteriellen Wirtszelle, wie beispielsweise E. coli, die hiermit transformiert wurde, zu lenken.
Ein Promotor ist ein Expressionssteuerelement, das von einer DNA-Sequenz gebildet wird, die das Anbinden von RNA-Polymerase und die Transkription ermöglicht. Promotorsequenzen, die mit Beispielen für bakterielle Wirte kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmidvektoren bereitgestellt, die praktische Restriktionsplätze für das Einsetzen eines DNA-Segments der vorliegenden Erfindung enthalten.
Typische prokaryotische Vektorplasmide sind pUC18, pUC19, pBR322 und pBR329, die von Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA) erhältlich sind, und pTrc99A und pKK223-3, die von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA, erhältlich sind.
Ein typisches Säugetierzellenvektorplasmid ist pSVL, das von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA erhältlich ist. Dieser Vektor verwendet den SV40 Spätpromotor, um die Expression der geklonten Gene voranzutreiben, wobei das höchste Niveau der Expression bei T-Antigen erzeugenden Zellen gefunden wird, wie beispielsweise COS-1-Zellen.
Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetierexpressionsvektor ist pMSG, ebenfalls erhältlich von Pharmacia. Dieser Vektor verwendet den Glukokortikoid induzierbaren Promotor der langen Terminalwiederholung des Mausmammatumorvirus, um die Expression des geklonten Gens voranzutreiben. Verwendbare Hefeplasmidvektoren sind pRS403–406 und pRS413–416 und sind allgemein von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Hefe integrierende Plasmide (Yeast Integrating plasmids = Ylps) und umfassen die Hefe selektierbaren Marker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3. Das Plasmid pRS413–416 gehört zu den Hefecentromerplasmiden (Yeast Centromere plasmids = YCps).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Wirtszelle, die mit einem Polynukleotidvektorkonstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert ist. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bakterielle Zellen sind bevorzugte prokaryotische Wirtszellen und sind typischerweise ein Stamm von E. coli, wie beispielsweise die E. coli-Stämme DH5, erhältlich von Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, und RR1, erhältlich von der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, MD, USA (Nr. ATCC 31343). Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Hefe- und Säugetierzellen, vorzugsweise Wirbeltierzellen, wie jene einer Maus-, Ratten-, Affen oder humanen Bindegewebezelllinie. Hefewirtszellen umfassen YPH499, YPH500 und YPH501, die allgemein von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich sind. Bevorzugte Säugetierwirtszellen umfassen Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (Chinese Hamster Ovary = CHO), erhältlich von der ATCC als CCL61, NIH Schweizer Mausembryozellen NIH/3T3, erhältlich von der ATCC als CRL1653, und von Affenleber erhaltene COS-1-Zellen, erhältlich von der ATCC als CRL1650.
Die Transformation der geeigneten Wirtszellen mit einem DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung wird durch gut bekannte Verfahren bewirkt, die typischerweise von dem Typ des verwendeten Vektors abhängen. Bezüglich der Transformation von prokaryotischen Wirtszellen s. z. B. Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, und Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Die Transformation von Hefezellen ist bei Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., beschrieben. Bezüglich Wirbeltierzellen sind Reagenzien, die zum Transformieren solcher Zellen verwendbar sind, z. B. Kalziumphosphat- und DEAE-Dextran- oder Liposomformulierungen, von Stratagene Cloning Systems oder Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA, erhältlich.
Electroporation ist auch zum Transformieren von Zellen verwendbar und im Stand der Technik des Transformierens von Hefezellen, bakteriellen Zellen und Wirbeltierzellen gut bekannt.
Zum Beispiel können viele bakterielle Arten durch die Verfahren transformiert werden, die bei Luchansky et al. (1988) Mol. Microbiol. 2, 637–646 beschrieben ist, was hier durch Bezugnahme eingeführt wird. Die größte Anzahl von Transformanten wird regelmäßig nach Elektroporation unter Verwendung von 6.250 V pro Zentimeter bei 25 μFD von der DNA-Zellmischung erhalten, die in 2,5 × PEB suspendiert ist.
Verfahren zur Transformation von Hefe durch Elektroporation sind bei Becker & Guarente (1990) Methods Enzyymol. 194, 182, offenbart.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch gut bekannte Techniken identifiziert werden. Zum Beispiel können Zellen, die aus der Einführung eines Expressionskonstrukts der vorliegenden Erfindung resultieren, gezogen werden, um das Polypeptid der Erfindung zu produzieren. Zellen können geerntet und lysiert werden, und ihr DNA-Gehalt kann auf die Anwesenheit der DNA unter Verwendung eines Verfahrens wie desjenigen geprüft werden, das von Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 oder Berent et al (1985) Biotech. 3, 208 beschrieben wird. Alternativ kann die Anwesenheit des Proteins in dem Überstand unter Verwendung von Antikörpern detektiert werden, wie unten beschrieben wird. Zusätzlich zum direkten Prüfen auf die Anwesenheit von rekombinanter DNA kann eine erfolgreiche Transformation durch gut bekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rekombinante DNA in der Lage ist, die Expression des Proteins zu steuern. Zum Beispiel erzeugen Zellen, die erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformiert worden sind, Proteine, die eine geeignete antigene Wirkung aufweisen. Proben solcher Zellen, die möglicherweise transformiert worden sind, werden geerntet und auf das Protein unter Verwendung von geeigneten Antikörpern getestet.
So betrachtet die vorliegende Erfindung zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst auch eine Kultur solcher Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur oder eine Kultur, die von einer monoklonalen Kultur erhalten wurde, in einem Nahrungsmedium.
Es ist bevorzugt, wenn die Wirtszellen Insektenzellen sind und wenn die Expression eine Baculovirusexpression ist.
Es ist auch bevorzugt, wenn die Wirtszellen Pichia pastoris sind.
Es wird vorausgesetzt werden, dass, da es sinnvoll ist, die HGF-Molekülvarianten oder zumindest die sie codierenden Polyonukleotide in der Gentherapie einzusetzen, die Erfindung auch Verfahren des Einführens der Polynukleotide in die Zellen des Patienten umfasst.
Die Erfindung wird jetzt detailliert unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren beschrieben werden, bei denen 1 die Heparinbindung und die MDCK-Streuaktivität von HGF/SF vom Wildtyp und mutanten HGF/SF-Formen zeigt.
Die folgenden Mutanten wurden entweder bei der Haarnadelstruktur (Hairpin = HP) oder bei dem Kringel 2 (Kr2) von HGF/SF erzeugt: HP1: R73E, R76E, R93E; HP2: R73E, R76E, K78E; HP3: K91D, R93E, K94D; HP4: L80S, F82Q; HP5: K85E; HP6: D90K; Kr2-2: H241S, R242E, K244E, R249G und Kr2-2: R281G, W282G, Y284A.
a) Expression von HGF/SF vom Wildtyp und mutanten HGF/SF-Formen. Die Figur zeigt ein SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen von Proteinen, die in dem Überstand von Neuro-2a-Zellen vorliegen, die transient mit HGF/SF-cDNAs transfiziert und mit ³⁵S-Zystein markiert worden waren. Die Wanderung der 60 kDa A-Kette und der 32/34 kDa B-Kette ist angegeben. Die Kontrollspuren sind Überstände von Neuro-2a-Zellen, die nur mit dem Vektor transformiert wurden. Bei dem Mutant HPΔ ist die gesamte Haarnadelstruktur entfernt (Reste 68 bis 100), und deshalb ist die Mobilität der A-Kette verglichen mit HGF/SF vom Wildtyp leicht erhöht.
b) Binden von 20 ng/ml des HGF/SF-Proteins vom Wildtyp oder des Mutanten HGF/SF-Proteins in Löchern, die mit 200 μg/ml Heparin beschichtet sind. Die Daten sind als Prozentsatz der HGF/SF vom Wildtyp ausgedrückt. Die Entfernung der Haarnadelstruktur (HPΔ) reduzierte die Heparinbindung auf < 5%. Ähnlich zeigten alle Mutanten, bei denen die basischen Aminosäurereste ausgetauscht waren (HP1, HP2, HP3), eine stark reduzierte Heparinbindung. Mutationen außerhalb der positiv geladenen Oberfläche (HP4, HP5, HP6) hatten entweder einen weniger deutlichen Effekt (HP4) oder keinen Effekt (HP5 und HP6). Substitutionen der positiv geladenen Aminosäuren an der Oberfläche des Kringels 2 (KR2-1) reduzierten die Heparin-Bindung auf 18% der HGF/SF vom Wildtyp, während die Zerstörung der Lysin bindenden Tasche (KR2-2) keinen Effekt hatte.
c) Streuung von MDCK-Kolonien durch HGF/SF vom Wildtyp und mutantem HGF/SF expressiviert in Neuro-2a-Zellen. Die Daten sind als Prozentsatz des HGF/SF vom Wildtyp ausgedrückt. Die Auslöschung der Haarnadelstruktur (HPΔ) beseitigte die biologische Aktivität, aber Punktmutationen von positiv geladenen Aminosäuren in der Haarnadelstruktur hatten unterschiedlich Effekte auf die biologische Aktivität. So hatten die HP1- und HP2-Mutanten biologische Aktivitäten vergleichbar zu HGF/SF vom Wildtyp, während die Aktivität des HP 3-Mutanten nur 17% von HGF/SF vom Wildtyp betrug. Die Kringel 2-Mutanten zeigten entweder einen starken Verlust an biologischer Aktivität (KR2-1) oder keine Veränderung (KR2-2).
2 zeigt eine BIAcore-Analyse der Bindung von NK2 vom Wildtyp und HP1-NK2 an immobilisiertes Heparin.
Die Tafel a zeigt eine Sensorgrammüberlagerung der Bindung von NK2 vom Wildtyp (10–300 nM) an eine Heparinoberfläche (maximale Bindungskapazität 340 RU). Tafel b zeigt einen entsprechenden Satz von Sensorgrammen für HP1-NK2 (10–300 nM) (Oberflächenkapazität ca. 170 Lu). Eine geringere Oberflächenkapazität und längere Injektionszeit wurde für HP1-NK2 verwendet, um die größeren Unterschiede bei den Assoziierungsraten zuzulassen. Die Peaks zu Beginn und am Ende der Probenkurven sind Artefakte, die von der Subtraktion der Kurven der reinen Oberfläche (nicht gezeigt) resultieren und die auf kleinen, nicht auflösbaren Timingfehlern beruhen. Tafel c zeigt k_off über der Konzentration (C, nM), und Tafel d zeigt eine Auftragung der beobachteten Ratenkonstante k_S über der Konzentration (C, nM) für NK2 vom Wildtyp (gefüllte Quadrate) und HP1-NK2 (offene Quadrate).
3 zeigt die Gesamtbindung von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 an Minklungenzellen.
Die Gesamtbindung von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 an Minklungenzellen in einer 96 Lochplatte ist gezeigt. HGF/SF vom Wildtyp zeigte eine starke konzentrationsabhängige Bindung an die Zelloberfläche von Minklungenzellen (gefüllte Quadrate), um die durch Zugabe von löslichem Heparin im Umfang von 0,1 mg/ml konkurriert werden konnte (gefüllte Dreiecke). Im Gegensatz dazu war die Bindung von HP1 bei Konzentrationen bis zu 675 ng/ml (offene Quadrate) vernachlässigbar und wurde durch die Zugabe von Heparin (offene Dreiecke) nicht beeinflusst.
4 zeigt die Bindung von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 an eine lösliche Form des MET-Rezeptors (MET-Fc) und den Effekt von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 auf die DNA-Synthese in Minklungenzellen.
a) Bindung von HGF/SF vom Wildtyp (gefüllte Balken) und HP1 (offene Balken) an eine lösliche Form des MET-Rezeptors (MET-Fc). Immobilisierter HGF/SF vom Wildtyp oder HP1 wurden mit 200 ng/ml MET-Fc inkubiert, und gebundener MET-Fc wurde mit einem anti-Mensch-IgG-Antikörper detektiert. Die Bindung des HP1-Mutanten war nur wenig langsamer als bei HGF/SF vom Wildtyp.
b) Effekt von HGF/SF vom Wildtyp (gefüllte Quadrate) und HP1 (offene Quadrate) auf die DNA-Synthese in Minklungenzellen. Zehntausend Serum hungernde Minklungenzellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen an HGF/SF vom Wildtyp oder HP1 inkubiert. Nach 24 Stunden wurde ³H-Thymidin zugegeben, und die Menge der in die DNA eingebaute Radioaktivität wurde bei doppelten Proben gemessen. Die Figur zeigt DNA-Synthese eingeleitet durch HGF/SF vom Wildtyp oder HP1 nach Subtraktion der Hintergrundzählungen (³H-Thymidin von Kulturen, die in Kontrollmedium inkubiert wurden). Die durch HP1 induzierte Stimulation war nur wenig niedriger als bei HGF/SF vom Wildtyp.
5 zeigt den Effekt von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 auf die Morphologie von Minklungen- und NDCK-Zellen.
Die Fig. vergleicht Minklungenzellen (Tafeln a, b und c) und MDCK-Zellen (Tafeln d, e und f) kultiviert in der Abwesenheit von Faktoren (a und d) oder nach Inkubation mit 2 ng/ml von HGF/SF vom Wildtyp (b und e) oder HP1 (c und f) über Nacht. In den Kontrollkulturen (a und d) entwickeln die Zellen eine typische epitheliale Morphologie. Die Effekte des HGF/SF vom Wildtyp und von HP1 auf die Zelldissoziation und die Zellmorphologie waren ununterscheidbar.
6 zeigt die Klärung, Gewebeverteilung und Inaktivität in vivo von HGF/SF vom Wildtyp und HP1.

a) Klärungskurven von ¹²⁵I-markiertem HGF/SF vom Wildtyp und HP1 von Rattenserum. Sechs erwachsenen Ratten wurde entweder ¹²⁵I-markierter HGF/SF vom Wildtyp oder HP1 in die Jugularvene injiziert, und Blutproben wurden zu den angegebenen Zeiten genommen. Die Konzentration von HGF/SF vom Wildtyp (gefüllte Quadrate) und HP1 (offene Quadrate), die im Serum verbleibt (TCA-unlösliche Radioaktivität) ist als Anteil der insgesamt injizierten Radioaktivität gezeigt. Für jeden Zeitpunkt war das Niveau des HP1-Mutanten im Blut mindestens fünfmal höher als das von HGF/SF vom Wildtyp.
b) Verteilung von ¹²⁵I-markiertem HGF/SF vom Wildtyp und HP1 in Rattengeweben. Zwei Stunden nach der Injektion wurden zwei Tiere getötet und nach dem Perfundieren wurden mehrere Organe (Leber, Niere, Lunge, Herz, Hoden, Milz) homogenisiert, und die Menge der TCA-unlöslichen Radioaktivität wurde gemessen. Das Niveau der Geweberadioaktivität war bei HP1 zwei bis dreimal höher als bei HGF/SF vom Wildtyp, obwohl das Muster der Organverteilung bei beiden Proteinen dasselbe war.
c) Stimmulattion von DNA-Synthese in Mausleber durch HGF/SF vom Wildtyp und HP1. HGF/SF vom Wildtyp und HP1 wurden über einen Zeitrum von drei Tagen intravenös verabreicht (Gesamtdosis 277,5 μg/Tier verteilt über fünf Injektionen). Zu dem Zeitpunkt, zu dem die Tiere die letzte Dosis des Faktors erhielten, wurde BrdU intraperitoneal injiziert (75 μg/g Körpergewicht), und zwölf Stunden später wurden die Tiere getötet. BrdU-markierte Zellen wurden bei gefrorenen Leberschnitten gezählt (mindesten acht unterschiedliche Schnitte und eine Gesamtzahl von 120 Feldern pro Tier). Die Daten sind der Mittelwert +/– Standardabweichung für 4 (HGF/SF vom Wildtyp) bzw. 3 (HP1) Tiere.

7 zeigt die Aminosäuresequenz von humanem Leberzellenwachstumsfaktor von der Schweizer Proteindatenbank Zugangsnummer P14210 (Swiss Prot database accession no. P14210). Nukleotidsequenzen, die HGF codieren bzw. Informationen, die sich auf solche Sequenzen beziehen, werden angegeben bei Seki et al. (1991) Gene 102 213–219; Miyazawaka et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 967–973; Seki et al. (1990) Biochem. Biophs. Res. Comm. 172, 321–327; Nakamura et al. (1989) Natrue 342, 440–443; Weidner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7001–7005; Yushiyama et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 175, 660–667; und Lokker et al. (1992) EMBO J. 11, 2503–2510, von denen alle hier durch Bezugnahme eingeführt werden.
Abkürzungen: EGF (Epidermal Growth Factor): Eipdermalwachstumsfaktor; FGF (Fibroblast Growth Factor): Bindegewebszellenwachstumsfaktor; HB-EGF: Heparin bindender EGF; HGF/SF: Leberzellenwachstumsfaktor/Streufaktor; HSPGs: Heparansulfatproteoglykane; MES: 2-[N-Morpholin]Ethansulfonsäure; NK2: abgeschnittene HGF/SF-Variante, die der N-terminalen Domäne, dem Kringel 1 und dem Kringel 2 entspricht; SPR (Surface Plasmon Resonance): Oberflächenplasmonresonanz; VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor): endothelialer Gefäßwachstumsfaktor.
Beispiel 1: Konstruktion von HGF/SF-Mutanten mit reduzierter Bindung an Heparansulfatproteoglykane und verbesserter in vivo-Aktivität
Zusammenfassung
HGF/SF ist ein hochmulekulargewichtiger, Heparin bindender Polypeptidwachstumsfaktor, der wichtige Rollen bei der Säugetierentwicklung und Geweberegeneration spielt. Um die Aminosäuren zu identifizieren, die bei der Rezeptor- bzw. Heparinbindung betroffen sind, haben wir eine Anzahl von HGF/SF-Mutanten konstruiert, bei denen mehrere Cluster der Lösungsmittel zugänglichen Reste in der Haarnadelstruktur der N-terminalen Domäne oder im Kringel 2 ausgetauscht worden sind. Zwei der Mutanten (HP1: R73E, R76E, R93E und HP2: R73E, R76E, K78E) waren von besonderem Interesse, da sie eine stark herabgesetzte Affinität für Heparin, aber volle mitogene und motogene Aktivität in Bezug auf Zielzellen in Kultur entwickelten. Die Affinität von HP1 zu Heparin war mehr als 50-fach niedriger verglichen mit HGF/SF vom Wildtyp, wie durch die Bindungskinetik des NK2-Fragments der beiden Proteine etabliert wurde. Die Änderung in der Affinität bei HP1 war das Resultat einer reduzierten Bindungsrate (~5 × 10⁴ M^–1 s^–1 gegenüber 1.75 × 10⁶ M^–1 s^–1) und wurde von einer reduzierten Bindung an Heparansulfatproteoglykan an der Zelloberfläche und in der Matrix begleitet. Wichtige Unterschiede wurden bei dem Verhalten von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 in vivo beobachtet: Der Proteinmutant zeigte eine verzögerte Klärung von Blut, höhere Gewebeniveaus und eine 2,7-fach höhere Aktivität beim Induzieren von DNA-Synthese in normaler, erwachsener Mausleber. So haben wir mutante HGF/SF-Formen konstruiert, die aufgrund ihrer reduzierten Affinität zu Heparansulfat (Schwefelleber) eine größere in vivo-Aktivität entwickelten. Diese Resultate haben Auswirkungen auf das Verständnis der Rolle von Heparansulfatproteoglykanen bei der HGF/SF-Aktivität und der therapeutischen Anwendungen des Wachstumsfaktors.
Um die Rezeptor- und Heparinbindungsplätze bei HGF/SF zu sezieren, haben wir dreidimensionale Modelle der einzelnen Domänen (29) erzeugt, um eine Anzahl von platzspezifischen HGF/SF-Mutanten zu konstruieren. Die verfügbaren Röntgenstrukturen von Antithrombin (30) und FGF-Heparinkomplexen (31) weisen darauf hin, dass die Heparinbindungsplätze vornehmlich aus Clustern von positiv geladenen Resten bestehen, die einen elektrostatischen Kontakt mit negativ geladenen Gruppen an dem Glykosaminglykan eingehen. Wir haben deshalb die Oberfläche der Haarnadelstruktur und des Kringels 2 von HGF-/SF nach Clustern von positiv geladenen Aminosäuren abgesucht, drei solcher Cluster identifiziert (zwei in der Haarnadelstruktur und einen beim Kringel 2), und spezifische Mutationen an diesen Plätzen eingeführt.
Materialien und Verfahren
Zelllinien
Zelllinien wurden entweder von der ATCC erworben oder so wie zuvor in (7) und (32) beschrieben. Die Zellen wurden routinegemäß in DMEM gezogen, dem 10% fötales Kalbsserum bei 37°C und 10% CO₂ zugesetzt waren.
In vitro-Mutationserzeugung bei der Haarnadelstruktur und beim Kringel 2
Ein Doppelstrangoligonukleotid (5'-CA CAG TCA GGA CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAA GGA TCC TCT AGA GGT AC-3'), das sechs Histidinreste und einen Stoppkodon codiert, wurde in den Kpn I-Restriktionsplatz des 2,2 kbBam HI/Kpn I-Fragments der HGF/SF-cDNA geklont. Bei anfänglichen Experimenten wurde eine cDNA verwendet, die HGF/SF vom Wildtyp verschmolzen mit einem C-terminalen Haemaglutininkennzeichen codiert (26). Für die Erzeugung der Punktmutanten der Haarnadelstruktur oder des Kringels 2 wurden Kodonsubstitutionen in die cDNA durch Anlassen fehlgepasster Primer bei den PCR-Reaktionen eingeführt. Die PCR-Fragmente wurden in die cDNA geklont, und Mutationen wurden durch Sequenzieren bestätigt. Die auf diese Weise erzeugten Punktmutanten sind in der Legende zu 1 aufgelistet. Zur Entfernung der Haarnadelstruktur wurde ein zusätzlicher Pst I-Restriktionsplatz bei nt300 erzeugt, und durch partiellen Aufschluss wurde ein Fragment, das die Aminosäuren 68–100 von HGF/SF codiert, zerstört.
Transiente Expression von HGF/SF vom Wildtyp und mutantem HGF/SF in Neuro-2a-Zellen
cDNAs, die HGF/SF-Mutanten codieren, (jeweils 10 μg) wurden transient in Neuro-2a-Zellen übertragen, so wie es beschrieben ist (26). Zur Immunpräzipitation wurden die Neuro-2a-Zellen einen Tag nach der Übertragung über Nacht mit 2 μCi/ml ³⁵S-Zystein (Amersham) über Nacht markiert, und HGF/SF wurde aus dem Überstand (1,5 ml) unter Verwendung von 2 μg anti-HGF/SF-Antikörper (Klon 34) und 10 ml Protein A-Sepharose 4B-Perlen immunpräzipitiert. Das Präzipitat wurde dreimal mit 50 nM TrisCl pH 8,5, 100 nM NaCl, 1 nM EDTA, 1 mg/ml Ovalbumin und 5 g/l Triton X-100 gewaschen und für SDS-Gelelektrophorese- und Phosphorabbildungsanalyse verwendet.
Expression von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 voller Länge in Insektenzellen
Für die Produktion von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 im großen Stil wurden die entsprechen cDNAs mit einer C-terminale Histidinmarkierung fusioniert und in den Baculovirusexpressionsvektor pVL1393 geklont. Rekombinanter Virus wurde durch gemeinsame Übertragung von 23 μg Expressionsplasmid und 0,5 μg Baculogold-DNA (Parmingen, La Jolla, USA), erzeugt, von Plaques gereinigt, propagiert und verwendet, um 5 l Mengen von SF9-Zellen zu infizieren. HGF/SF vom Wildtyp und HP1 wurden von dem Überstand nach umfangreicher Dialyse gegen PBS und Affinitätschromatographie auf 5 ml Ni²⁺-Chelatsäulen (Qiagen, Deutschland) unter Verwendung eines linearen Imidazolgradienten (0–0,4 M in 0,1 M NaCl, 50 mM MES pH 6,0) gefolgt von Kationenaustauschchromatographie gereinigt (8). Die Reinheit der Zubereitungen gemäß Coomassie-gefärbter SDS-Gele lag typischerweise bei 80–90%.
Expression von NK2 vom Wildtyp und HP1-NK2 in P. pastoris
cDNAs, die NK2 vom Wildtyp oder HP1-NK2 codierten, wurden durch PCR-Verstärkung von humaner HGF/SF-cDNA erzeugt und in den P.pastoris-Expressionsvektor pPIC 9K (Invitrogen, Inc.) geklont, wodurch eine im Rahmen liegende Fusion mit einem α-Matingsignalpeptid von S. cerevisiae erzeugt wurde. Linearisierte, rekombinante pPIC 9K-Plasmide, die NK2-vom Wildtyp codierten, und HP1-NK2-Plasmide wurden zur Transformation des GS115, his^–-Stamm von P. pastoris durch Spheroplasting verwendet. Die transformierten Klone wurden anfänglich auf his^–-Platten selektiert und anschließend für die Mehrfachkopieintegration auf G418-Platten (33). Ausgewählte Klone wurden für die Expression des rekombinanten Proteins im großen Stil in Schüttelkolben verwendet. Die Kulturüberstände wurden 72 Stunden nach der Induktion geerntet, und der Überstand wurde durch Zentrifugation gefolgt von Filtration geklärt. NK2 vom Wildtyp wurde anfänglich auf Heparin-Sepharose4B (Pharmacia) gefolgt von Ionenaustauschchromatographie auf S-Sepharose (Pharmacia) unter Verwendung eines NaCl-Gradienten (0,25–1,00 M) in 0,05 M MES, pH 6,0, gereinigt. HP1-NK2 wurde direkt durch Ionenaustauschchromatographie auf S-Sepharose gereinigt. Die monomeren und dimeren Spezies von NK2 vom Wildtyp und HP1-NK2 wurden durch Größenausschlusschromatographie auf einer Superdex 75-Säule (Pharmacia) in 0,05 MES, 0,25 M NaCl, Puffer, pH 6,0, getrennt. Die Ausbeute des biologisch aktiven Proteins lag zwischen 5 und 10 mg/l.
Heparin- und MET ELISAs
Für einen Heparin- ELISA wurden 96 Loch-Platten (Nunc, Multisop) mit 200 μg/Loch Heparin mit hohem Molekulargewicht (200 μg/ml, Sigma H3393) inkubiert. Nach dem Blocken, wurden gereinigter HGF/SF und Überstände von Neuro-2a-Zellen, die HGF-SF Proteine vom Wildtyp und HGF/SF Proteinmutanten expressivierten für 2 Stunden inkubiert und entweder mit dem anti-Markierungskaninchenantikörper HA11 (Hiss diagnosics) oder mit einem monoclonalen anti-HGF/SF-Mausantikörper (Klon 34) gefolgt von Inkubation mit einem HRP-konjugierten zweiten Antikörper detektiert. Für den MET-ELISA wurde ein lösliches Fusionsprotein, das aus der extrazellulären Domäne bzw. den extrazellulären Domänen von MET und der Verbindung sowie der CH2- und CH3-Domäne von Immungluboin γ1 erzeugt (GH, unpublizierte Ergebnisse) und durch A-Sepharoseproteinaffinitätchromatographie auf ~80% Homogenität gereinigt. Löcher wurden mit HGF/SF vom Wildtyp oder HP1 in voller Länge über Nacht bei 4°C beschichtet, geblockt, und das MET-Ig-Fusionsprotein (200 ng/ml wurde für zwei Stunden zugegeben, gefolgt von Inkubation mit anti-Mensch-IgG-Ziegenantikörper und HRP-konjugiertem anti-Ziege-IgG-Kaninchenantikörper. Zur Farbentwicklung wurden 0,66 mg/ml Orthophenyldiamin in 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,0, als HRP-Substrat (100 μl/Loch) verwendet.
Heparinbindungskinetik von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 voller Länge und von deren NK2-Fragmenten
Die Kinetikanalyse der Bindung von Proteinen vom Wildtyp und Proteinmutanten wurde durch Oberflächenplasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance = SPR) unter Verwendung eines BIAcore 2000 Instruments (BIAcore Ltd., St. Albans, Herts., UK) durchgeführt. 10 mg/ml Heparin mit hohem Molekulargewicht (Sigma H3393) wurden mit einem dreifachen Überschuss an NHS-LC-Biotin (Pierce 21336) in 1 ml 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, für eine Stunde bei Raumtemperatur biotinylisiert. Biotynilisiertes Heparin wurde von den freien Biotinderivaten durch sequentielle Passage durch zwei 2 ml Excellulosesäulen (Pierce) getrennt und zum Einfangen an der Oberfläche von Streptavidinbeschichteten SA-Sensorchips verwendet. Alle Experimente wurden bei einer Betriebstemperatur von 25°C durchgeführt. Der Elutionspufter (EB) bei allen Durchläufen war PBS, das 0,2 mM EDTA, 0,5 g/l NaN₃, 0,05 g/l p20-Detergenz (BIAcore Ltd.) enthielt.
Um ein mögliches Auslecken von Heparin von der Testoberfläche (Flowcells 2–4) zu der Kontrolle (Flowcell 1) zu verhindern, wurde die Oberfläche 1 mit zwei 20 μl Injektionen von 250 ng/ml Biotin in EB bei einer Strömungsrate von 5 μl/min. blockiert. Die Oberfläche 2 wurde dann bei 50 μl/min. mit 10 ml 2 nM Heparin-Biotin in EB beschichtet. Ungefähr 25 RU wurden in diesem Beispiel gebunden; da eine kleinen Erhöhung bei dem Signal aufgrund des Vernetzens des Dextrans durch die langen Heparinmoleküle auftreten kann, ist eine exakte Abschätzung der Heparinbindung bei niedrigen Niveaus nicht möglich. Die Oberfläche wurde dann wie bei der Oberfläche 1 mit Biotin blockiert. Um die Absorption oder Denaturierung der Proteinproben für die SPR-Analyse zu verhindern, wurden diese routinemäßig in 0,2 mg/ml BSA in 0,2 nM EDTA verdünnt, das vorab auf Heparin-Sepharose4B (Pharmacia Biotech, St. Albans) für 30 min. bei Raumtemperatur sorbiert worden war. Zur Analyse der verschiedenen Proteine wurden die Proben mit 15 μl/min. gepumpt. Die Regenerierung der Oberfläche erfolgte durch sequentielles "QUICKINJECT/EXTRACLEAN" von 10 μl 0,1 g/l SDS in Wasser gefolgt von 2 × 10 μl 1 M NaCl. Zum Schluss wurden 15 ml 0,2 mg/ml BSA in EB injiziert, um jegliche nicht spezifischen Bindungsplätze zu blockieren. Die Dateien der automatisierten Analysedurchläufe wurden durch nicht-lineares Kurvenanpassen (34) unter Verwendung der BIAcore BIAevaluation Software (BIAcore Ldt.) analysiert. Proteinkonzentrationen wurden durch das BCA-Reagenz (Pierce) gemessen, und die biologische Aktivität jedes Schlags von Proteinen wurde bei dem MDCK-Assay (7) bestätigt, um konsistente spezifische Aktivität sicherzustellen.
Biologische Zellassays
Koloniestreuassays wurden an MDCK- und Minklungenzellen ausgeführt, wie zuvor beschrieben wurde (4). Für die Messung der DNA-Synthese wurden Minklungenzellen in einer Dichte von 5.000 bis 10.000 Zellen/Loch in eine 24 Loch-Platte plattiert und durch Inkubation in DMEM für 48 Stunden Serum-gehungert. Unterschiedliche Konzentrationen von HGF/SF und HP1 wurden dann zugegeben, und die Inkubation dauerte für 24 Stunden in DMEM fort, das 100 μg/ml BSA enthielt, bevor ³H-Thymidin (1 μCi/Loch) zugegeben wurden und eine abschließende Inkubation für 16 Stunden erfolgte. Die in 5% TCA unlösliche Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung nach Auflösung in 0,2 M NaOH gemessen.
Gesamtbindung von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 an Minklungenzellen
Minklungenzellen wurden bis zum Zusammenfließen in 24 Lochplatten gezogen. Nach zwei Waschungen mit Medium, wurden die Zellen bei 4°C für 30 min. inkubiert. Dann wurden serielle Verdünnungen von HGF/SF und HP1 in PBS zu den Zellen hinzu gegeben und für weitere 15 min. bei 4°C inkubiert. Ungebundener Faktor wurde durch drei Waschungen mit PBS entfernt, und die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert. Nach zwei weiteren Waschungen wurden die Zellen mit einem monoklonalen anti-HGF/SF-Mausantikörper (Klon 34) inkubiert, der in einer identischen Weise mit HGF/SF vom Wildtyp und HP1 reagierte, gefolgt von Inkubation mit FITC-konjugiertem anti-Maus-IgG.
Klärung und Gewebeverteilung von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 bei Ratten
10 μg reiner HGF/SF und HP1 wurden durch ein Festphasenverfahren unter Verwendung von Iodogen (Pierce) von Biotez, Berlin, Deutschland, jodiert. Nach der Reaktion wurde 1 mg/ml BSA zugegeben, und freies Jod wurde durch mehrfache Filtration auf einem Centrisat Filtrationsapparat (Sartorius) mit einem Trennwert von 30 kDa entfernt. Die spezifischen Aktivitäten wurden zu 1,85 MBq/mg für HGF/SF und 1,95 MBq/mg für HP1 berechnet. Die biologischen Aktivitäten der Proteine vor und nach der Jodierung wurden in einem Beweglichkeitstest unter Verwendung von MDCK-Zellen verglichen und zu 80% nach der Jodierung bestimmt. Erwachsene Ratten (3 pro Gruppe) wurden anästhesiert, ein Katheter wurde in die Jugularvene implantiert, und eine einmalige intravenöse Bolusinjektion von 0,2 ml¹²⁵I-HGF/SF wurde verabreicht (0,45 MBq bei HGF/SF vom Wildtyp und 0,38 MBq bei HP1 pro Tier). Nach 1, 3, 5, 7, 10 und 60 min., 2 Stunden und 20 Stunden wurden 200 μl Blutproben über den Katheter genommen. Dem Blut wurde es erlaubt, zu gerinnen, und es wurde bei 10.000 g für 5 min. bei 4°C zentrifugiert. Für jede Probe wurden 100 μl mit einem gleichen Volumen von PBS verdünnt und 2 ml eiskalte 10% TCA wurden zugegeben. Nach 30 min. auf Eis wurden die Proben zentrifugiert und das Präzipitat wurde vor dem Zählen mit 5% TCA gewaschen. Zum Messen der Geweberadioaktivität wurden die Tiere 2 Stunden nach der Injektion von ¹²⁵I-markiertem HGF/SF vom Wildtyp oder HP1 getötet und mit PBS perfundiert. Die Organe wurden entnommen, gewogen, homogenisiert, und das Maß der mit TCA präzipitierbaren Radioaktivität wurde bestimmt.
Effekt von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 auf DNA-Synthese in ausgewachsener Leber
Die Fähigkeit von HGF/SF vom Wildtyp und HP1, DNA-Synthese bei Leberzellen zu induzieren, wurde nach der intravenösen Verabreichung von rekombinanten Proteinen und der Zellmarkierung mit BrdU gemessen. Kurz gesagt wurde weiblichen Tiere (6 bis 8 Wochen alt, 19,5 bis 26,0 g Körpergewicht) zweimal täglich für 3 Tage entweder PBS, HGF/SF vom Wildtyp oder HP1 in die Schwanzvene (55,5 μg/Dosis) injiziert. Zum Zeitpunkt der letzten Injektion des Faktors erhielt jedes Tier BrdU (75 μg/g Körpergewicht), das intraperitoneal injiziert wurde, und 12 Stunden später wurden die Tiere getötet, die Leber wurde entnommen, und Gefrierschnitte wurden präpariert. Die Schnitte wurden in 70% Ethanol/5 min.) fixiert, mit 2,4 M HCl für 10 min. bei 37°C behandelt, und Kerne, in die BrdU eingebaut war, wurden mit Anti-BrdU-Antikörpern gefärbt (Sigma, 1 : 400), gefolgt von Peroxidase-konjugiertem anti-Maus-IgG (Jackson Laboratories, 1 : 500).
Resultate
HGF/SF-Haarnadelstruktur und -Kringel 2-Mutanten
Die N-terminale Domäne von HGF/SF enthält 4 Zysteinreste, die bei HGF/SF-homologem HGF1/MSP und Plaminogen konserviert sind. Studien an Plasminogen (35) zeigen an, dass diese Domäne eine Haarnadelstruktur ausbildet, die durch zwei Disulfidbindungen stabilisiert ist. Ein dreidimensionales Modell der Haarnadelstruktur von HGF/SF deutet auf die Anwesenheit von verschiedenen positiv geladenen Resten hin, die in den entsprechenden Modellen von HGF1/MSP und Plasminogen abwesend waren (29). Sechs verschiedene Punktmutationen der Haarnadelstruktur von HGF/SF wurden konstruiert (HP1 bis HP6), bei denen eine Gesamtzahl von 10 Aminosäurerest substituiert wurde. Die Strategie umfasste die Mutation vom Positiven zum Negativen, vom Negativen zum Positiven und vom Hydrophoben zum Polaren (s. Legende zu 1 für die Sequenz der Mutanten). Die Aktivität dieser Punktmutanten wurde mit jener von HGF/SF vom Wildtyp und HPΔ verglichen, einem Mutant, bei dem die gesamte Haarnadelstruktur (Aminosäuren 68 bis 100) entfernt war. Zusätzlich wurden zwei Mehrfachmutanten des Kringels 2 konstruiert: Beim Mutant Kr2-1 wurde ein Cluster von 4 positiven Resten an der Oberfläche des Kringels (H241, R242, K244 und R249) mutiert; beim Mutant Kr2-2 wurden drei Reste mutiert (R281, W282 und Y284), von denen vorhergesagt worden war, dass sie eine hydrophobe Tasche an der Oberfläche des Kringels 2 bilden, die derjenigen ähnlich ist, die beim Plasminogenkringel 4 vorliegt (29).
Für anfängliche Studien wurden Mutanten durch transiente Transfektion in der Neuro2A-Zelllinie (1a) expressiviert und bezüglich der Heparinbindung (1b) und der biologischen Aktivität (1c) charakterisiert. Wie erwartet entwickelte HPΔ, der Mutant, dem die Haarnadelstruktur fehlt, weder Heparinbindung noch biologische Aktivität. Die Punktmutanten fallen in drei unterschiedliche Gruppen: Gruppe 1 (HP1, HP2 und HP4) entwickelten normale Signalisieraktivität aber stark reduzierte (HP1 und HP2) oder reduzierte (HP4) Heparinbindung; Gruppe 2 (HP3) zeigt einen ernsten Verlust sowohl bei der Signalisierung als auch der Heparinbindung, und Gruppe 3 (HP5 und HP6) verhielt sich im Wesentlichen wie HGF/SF vom Wildtyp (1b und c). Der erste Kringel 2-Mutant, Kr2-1, zeigte stark reduzierte Heparinbindung und biologische Aktivität, während der zweite, Kr2-2, von HGF/SF vom Wildtyp (1b und c) nicht unterscheidbar war. Aus diesen Ergebnissen können wir schließen, dass ein erster Cluster von positiv geladenen Resten in der Haarnadelstruktur (R73, R76) in die Heparinbindung aber nicht in die MET-Bindung einbezogen ist, und dass die Reste R281, W282 und Y284 in keine dieser Bindungen einbezogen sind. Es erscheint auch so, dass zwei zusätzliche Cluster von positiv geladenen Resten, einer in der Haarnadelstruktur (K91 und K94) und einer beim Kringel 2 (H241, R242, K24 und R249) sowohl an der MET- als auch der Heparinbindung teilhaben können.
Bindungskinetik von HGF/SF vom Wildtyp, HP1 und deren NK2-Fragmente an Heparin
HGF/SF vom Wildtyp und HP1 (einer der zwei Mutanten, die eine stark reduzierte Heparinbindung aber normale biologische Aktivität zeigen) voller Länge wurden in Insektenzellen expressiviert, um ihre Kinetik bei der Bindung an Heparin durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR) zu analysieren. Diese Ergebnisse erbrachten wichtige Unterschiede bei der Bindungskinetik von HP1.
Die Bindung an Heparin von HGF/SF vom Wildtyp (4–30 nM) ergab eine einzige Dissoziationsratenkonstante (k_off) erster Ordnung von ca. 2 × 10^–3 s^–1. Das Gros der Bindung während der Assoziation könnte an ein Einzelplatzmodell mit einer Assoziierungsratenkonstante (k_on) von ca. 1 × 10⁶ M^–1 s^–1 angepasst werden, was eine molare Dissoziierungs konstante (K_d) von ca. 1 × 10^–9 M ergibt. HP1 (4 bis 80 nM) zeigte stark reduzierte Heparinbindung (Daten nicht gezeigt). Dennoch haben wir erwogen, dass der Unterschied, der zwischen HGF/SF vom Wildtyp und HP1 beobachtet wird, durch die Anwesenheit von dimeren oder oligomeren Formen der beiden Proteine beeinflusst sein mag; ein Punkt, der aufgrund der geringen Ausbeute von den Größenausschlusssäulen nicht geklärt werden konnte. Wir haben deshalb die NK2-Fragmente von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 (d. h. alle Domänen, von denen gezeigt wurde, dass sie in die Heparinbindung einbezogen sind, Mizuno et al., 1994) in der methylotropen Hefe P. pastoris expressiviert und für diese weitere kinetische Analyse verwendet. NK2 vom Wildtyp und HP1-NK2, die von dem Überstand von P. pastoris-Kulturen aufgereinigt worden waren, bestanden aus einer Mischung von NK2-Monomeren und -Dimeren, die auf Superdex-75 Säulen schnell getrennt werden konnten, was es erlaubte, die Bindungskinetik zu Heparin im guten Glauben in Bezug auf monomere Arten festzustellen.
Sensorgrammüberlagerungen der Bindung an Heparin von NK2 vom Wildtyp (2a) und HP1-NK2 (2b) bestätigten wesentliche Unterschiede bei der Heparinbindung. Bei NK2 vom Wildtyp waren die Dissoziierungskurven bei den hohen Konzentrationen langsamer und die scheinbaren k_off-Werte variierten zwischen 1 und 4 × 10^–3 s^–1 (2c, gefüllte Quadrate). Im Gegensatz dazu stieg die Dissoziierung von HP1-NK2 (2b) mit der Konzentration auf einen scheinbaren k_off-Wert von 6 bis 7 × 10^–3 s^–1 an (2c, offene Quadrate). Eine Analyse der Assoziierungsphase von NK2 vom Wildtyp (2a) zeigt eine komplexe Kinetik. Unter Annahme einer einzigen Klasse von Bindungsplätzen und unter Berücksichtigung von Daten der frühesten (schnellsten Phase) ergaben Auftragungen der beobachteten Assoziierungsratenkonstante ("K_S") über C für Konzentrationen bis zu 300 nM eine gerade Linie (r² = 0,997) von der wir k_on zu 1,75 × 10⁶ M^–1 s^–1 berechneten (2d, gefüllte Quadrate). In den späteren Stufen der Bindung war eine zweite Phase mit viel langsamerer Assoziierung unterscheidbar, aber Versuche, Modelle basierend auf zwei Klassen von Bindungsplätzen anzupassen, erwiesen sich als unpassend. Unter Berücksichtigung des schnellsten Werts für k_off von 4 × 10^–3 s^–1 und eines Werts für k_on von 1,75 × 10^–6 M^–6 s^–1 wurde ein K_d-Wert von 2,3 nM für NK2 vom Wildtyp berechnet.
Für HP1-NK2 ergab die Analyse der frühen Phase der Bindung (unter der Annahme, dass eine einzige Klasse von Bindungsplätzen vorliegt) einen k_on-Wert von ca. 5 × 10⁴ M^–1 s^–1 aus der K_S über C-Auftragung (2d, offene Quadrate). Dieser Wert war ungefähr 35-mal niedriger als für NK2 vom Wildtyp. Aus einem Wert von 6 × 10^–3 s^–1 für k_off (2c, offene Quadrate) wurde ein K_d von 120 nM für HP1-NK2 berechnet. Die Bindungsaffinität von HP1-NK2 ist deshalb über 50-mal niedriger als für NK2 vom Wildtyp.
Bindung von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 an HSPGs und MET und KAtivität der beiden Proteine in Bezug auf Zielzellen in vitro
Die Bindung von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 an Heparansulfate an der Zelloberfläche und in der Matrix wurde bei verschiedenen Zelltypen untersucht, einschl. der Karzinomlinien HepG2 und Hep3B und Minklungenzellen. Von den letzteren ist kürzlich gezeigt worden, dass sie große Mengen an HGF/SF und seinen abgeschnitten Formen NK1 und NK2 HSPGs binden (36). Durch Immunfluoreszenz wurde bestimmt, dass die totale Bindung von HP1 an HepG2, Hep3B und Minklungenzellen viel niedriger war als bei HGF/SF vom Wildtyp (Daten nicht gezeigt). Diese Resultate wurden bestätigt und durch einen quantitativen Festphasenassay ausgeweitet, und ein repräsentatives Experiment, das die Bindung von HGF/SF vom Wildtyp und HP1 voller Länge an Minklungenzellen illustriert, ist in 3 gezeigt. Die totale Bindung von HGF/SF vom Wildtyp an Minklungenzellen steigt stetig von 10 auf 675 ng/ml, während die Bindung von HP1 über denselben Konzentrationsbereich kaum messbar war. Exogenes Heparin (0,1 mg/ml) konkurrierte wirksam in Bezug auf die Bindung von HGF/SF vom Wildtyp an die Zellen und reduziert sie auf Niveaus nur wenig höher als jene von HP1. Dies bestätigt, dass das Gros des zellengebundenen HGF/SF vom Wildtyp mit HSPGs assoziiert war, und dass HP1 scheiterte, solche Moleküle zu binden.
In deutlichem Kontrast zu der reduzierten Bindung von HP1 an Heparin und zellassoziierte HSPGs, war die Bindung von HP1 an eine lösliche Form des MET-Rezeptors und seine Fähigkeit, die Stimulation von DNA-Synthese in Minklungenzellen zu induzieren, nur marginal kleiner als bei HGF/SF vom Wildtyp (4a bzw. 4b). Ähnliche Resultate wurden mit der Mauskeratinozytlinie MK erhalten (Daten nicht gezeigt). In gleichem Maße war die Fähigkeit von HP1, Dissoziation und Streuung von Minklungenzellen und MDCK-Zellen zu induzieren, von HGF/SF vom Wildtyp ununterscheidbar (vgl. Tafeln b und c sowie e und f in 5). So war trotz einer deutlichen Herabsetzung der Bindungsaffinität in Bezug auf Heparin und HSPGs die Fähigkeit des HP1-Mutanten, DNA-Synthese und Zellbewegung bei Zielzellen zu induzieren, von HGF/SF vom Wildtyp nicht unterscheidbar.
In vivo-Aktivität von HGF/SF vom Wildtyp und HP1
Wir untersuchten den Effekt der HP1-Mutation auf das Verhalten des Faktors in vivo. Zu diesem Zweck wurden HGF/SF vom Wildtyp und HP1 mit ¹²⁵I markiert und in die Jugularvene von erwachsenen Ratten injiziert. Die Konzentration der zwei Proteine im Serum und in verschiedenen Organen wurde dann in Form der TCA-unlöslichen Radioaktivität gemessen. 6a zeigt die Klärungskurve für HGF/SF vom Wildtyp und HP1 von Serum. In Übereinstimmung mit früheren Studien (23, 37, 38), beobachteten wir eine schnelle Klärung des HGF/SF vom Wildtyp vom Kreislauf (> 98% binnen der ersten 15 min.). Die Klärung von HP1 war viel langsamer, und zu jedem getesteten Zeitpunkt bis zu 20 Stunden nach der Injektion war die Konzentration von HP1 im Plasma 5- bis 10-mal höher als von HGF/SF vom Wildtyp (6a).
Die langsamere Klärung von HP1 vom Serum war mit einer vergrößerten Menge des mutanten Faktors in verschiedenen Organen einschl. Leber, Niere, Lunge, Herz, Hoden und Milz verbunden (6b). Die relative Verteilung des HP1-Mutanten und von HGF/SF vom Wildtyp über die unterschiedlichen Organe war gleich, aber die Konzentration von HP1 war zwei bis dreimal höher als von HGF/SF vom Wildtyp (6b). Die Fähigkeit von HGF/SF vom Wildtyp, DNA-Synthese in ausgewachsener Leber zu induzieren, wurde direkt nach der intravenösen Injektion der beiden Proteine untersucht. Wie erwartet, war die DNA-Synthese in der Abwesenheit der Faktoren sehr langsam, sie stieg aber nach der Verabreichung von entweder HGF/SF oder HP1 deutlich an (6c). Jedoch war die Stimulation durch HP1 2,7-fach höher als bei HGF/SF vom Wildtyp (6c) was auf einer Linie mit den erhöhten Niveaus des Faktors im Serum und der Leber liegt (6a und 6b).
Diskussion
Die Heparin- und Rezeptorbindungsplätre von HGF/SF
Früher Studien haben gezeigt, dass die Haarnadelstruktur der N-terminalen Domäne von HGF/SF wichtig sowohl für die Heparinbindung (24) als auch die Rezeptorbindung (25–28) ist. In dieser Studie zeigen wir, dass die Heparin- und Rezeptorbindungsplätze von HGF/SF durch Proteinengineering getrennt werden können, und dass mutante Formen von HGF/SF mit stark reduzierter Heparinbindung überlegene biologische Aktivität in vivo haben. Vor dem Hintergrund, dass sowohl der HP1 als auch der HP2-Mutant eine stark reduzierte Affinität zu Heparin aber biologische Aktivität vergleichbar mit HGF/SF vom Wildtyp auf Zielzellen in Kultur aufweist, denken wir, dass die gemeinsamen Mutationen (R73E und R76E) wichtig für die Heparinbindung sind, eine Schlussfolgerung, die durch eine vorläufige Charakterisierung des R73E, R76E Doppelmutanten gestützt wird. Im Gegensatz dazu führt die Substitution eines zweiten Clusters von positiv geladenen Resten in der Haarnadelstruktur (K91, R93 und K94) oder eines separaten Clusters von positiv geladenen Resten im Kringel 2 (H241, R242, K244 und R249) zu einem Auslöschen sowohl der Heparinbindung als auch der HGF/SF-Signalisierung in Zielzellen. Wir merken an, dass die Allaninscanmutationserzeugung der N-terminalen Domäne von HGF/SF (39) scheiterte, um Reste in der Haarnadelstruktur zu identifizieren, die für die MET-Bindung und -Signalisierung essentiell sind. Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass mehrfache Substitutionen von benachbarten Resten in der Haarnadelstruktur, sowie jene, die wir eingeführt haben, erforderlich sind, um messbare Änderungen hervorzurufen. Das Maß der Heparinbindungsaktivität wurde durch Lokker et al. (39) nicht berichtet.
Kinetik der Bindung von HGF/SF vom Wildtyp und seines NK2-Fragments an Heparin
Unsere Daten zeigen an, dass HGF/SF vom Wildtyp voller Länge Heparin mit hoher Affinität bindet (K_d = ca. 1 nM). Dieser Wert ist mit einem Wert von 0,6 nM aus einer separaten Studie vergleichbar, in der die Bindung von HGF/SF vom Wildtyp voller Länge an ³⁵S-Heparin nach der Trennung von gebundenem und freiem ³⁵S-Heparin durch Ultrafiltration gemessen wurde (23). Um sicherzustellen, dass die gemessene Kinetik aus der Wechselwirkung von monomeren Proteinarten mit Heparin resultiert (und somit eine genaue Kinetik für den HP1-Mutanten darstellt) bauten wir auf monomere NK2-Fragmente, die in P. pastoris expressiviert wurden. Die Dissoziationskinetik von NK2 vom Wildtyp ergab bei den höchsten Konzentrationen des Proteins einen signifikanten Effekt bei den scheinbaren k_off-Werten, was auf eine kooperative Bindung von NK2 an Heparin hinweist (Daten nicht gezeigt). Die Analyse der Stöchiometrie der Bindung bei der oder nahe der Sättigung weist auf ungefähr vier NK2-Moleküle vom Wildtyp pro 16 kDa-Heparin hin. Weniger sichere Abschätzungen für HGF/SF vom Wildtyp an Oberflächen mit weniger Heparin ergaben einen Wert von 3,5 Molekülen HGF/SF pro Heparinmolekül. Diese Werte weisen darauf hin, dass der Heparinbindungsplatz von NK2 und HGF/SF ungefähr 14 Monosaccharideinheiten umfasst, was mit den Ergebnissen von Lyon et al. (40) konsistent ist, der berichtet, dass Heparansulfatfragmente von 12 bis 14 Einheiten für eine Bindung an HGF/SF mit hoher Affinität erforderlich waren.
Die molare Dissoziationskonstante von HGF/SF voller Länge für Heparin (K_d = 1 nM) ist mit einem Wert von 50 nM vergleichbar, der für die Wechselwirkung von saurem FGF und Heparin unter ähnlichen experimentellen Bedingungen erhalten wird (41). Die Anbindungsraten von HGF/SF und FGF sind ähnlich (1,75 gegenüber 1,0 × 10⁶ M^–1 s^–1) und die Differenz bei der Affinität ist der Ablösungsrate (1 × 10^–3 s^–1 gegenüber 6 × 10^–2 s^–1 für HGF/SF und FGF) zuzurechnen. Die reduzierte Affinität von HP1 zu Heparin ist durch Reduzieren der Anbindungsrate (2d) erreicht worden, ein Resultat, das auf einer Linie mit der hervortretenden Rolle der elektrostatischen Einflüsse auf die Assoziierungsraten ist. (42).
Unterschiedliche Rollen der Heparansulfate in den HGF/SF- und FGF-Systemen
Der HP1-Mutant hat eine Anzahl von Einblicken in die Rolle der Heparinbindung bei der HGF/SF-Aktivität gewährt. HGF/SF ist einer einer Anzahl von Wachstumsfaktoren, die HSPGs binden, aber die Rolle des Heparansulfats (Schwefelleber) bei der Wachstumsfaktoraktivität ist allgemein nicht klar, außer in dem Fall von FGF. Bei FGF gibt es Hinweise, dass drei Komponenten (Ligand, Rezeptor und Heparansulfat) für die Signalisierung erforderlich sind. Dieser Schluss wird durch Transfektionsexperimente (2, 3) und biochemische Studien mit gereinigten Komponenten (43) gestützt. HSPGs wirken möglicherweise durch Dimerisieren von FGF wodurch sie die Rezeptordimerisierung und – signalisierung fördern (44), eine Interpretation die konsistent mit den jüngsten Strukturen von FGF-Heparinkomplexen ist (31).
Unsere Resultate weisen auf eine unterschiedliche Rolle von HSPGs in dem HGF/SF-System hin. Obwohl eine andere Studie annimmt, dass Heparin die Aktivität von HGF/SF und der NK1- und NK2-Fragmente auf Zellen in Kultur fördert (36) finden wir, dass die Rezeptorbindung und biologische Aktivität des HP1-Mutanten im Wesentlichen von HGF/SF vom Wildtyp ununterscheidbar sind, trotz einer > 50-fach reduzierten Heparinbindung.
Unsere Ergebnisse werten jedoch die Frage der physiologischen Funktion der HGF/SF-Bindung an HSPGs auf. Die in vivo-Daten, die hier vorgelegt werden, deuten eine Rolle der HSPGs beim Fördern der Internalisierung und des Abbaus von HGF/SF in Geweben an ( 6a und 6b). So mögen HSPGs ein Mittel zum Klären von HGF/SF in vivo darstellen. Tatsächlich gibt es eine überraschende Parallele zwischen der erhöhten DNA-Syntheseaktivität von HP1 bei Leber (6c) und dem erhöhten Niveau des Faktors in dem Gewebe (6b). Es ist möglich, auf andere mögliche Rollen von HSPGs zu spekulieren. Zum Beispiel mögen HSPGs helfen, HGF/SF auf ausgewählte Zellen oder Gewebebereiche zu lokalisieren, wie es für den Aufbau eines "morphogenen Gradienden" während des Embryonenwachstums erforderlich ist (45, 46). Ein Beispiel dieses Prozess kann das Entwicklungsglied sein, bei dem die Wanderung von myogenen Vorläuferzellen im Keim dafür bekannt ist, dass sie kritisch von HGF/SF und MET abhängt (47).
Anwendungen von Heparin-defizienten HGF/SF-Mutanten in vivo
Es hat kürzlich erhebliches Interesse an potentiellen therapeutischen Anwendungen von HGF/SF gegeben, und verschiedene Studien haben sich der Frage der pharmazeutischen Kinetik des Wachstumsfaktors in vivo gewidmet. Die Resultate dieser Studien zeigen, dass HGF/SF sehr schnell vom Kreislauf geklärt wird (23, 37, 38), und dass die Halbwertzeit des Wachstumsfaktors im Plasma verlängert werden könnte, indem er mit entweder Heparin (23) oder anderen Polyanionen, wie beispielsweise Dextransulfaten (48), zu Komplexen zusammengefasst wird. HGF/SF, das als Komplex mit Dextransulfat als Infusion verabreicht wird, weist auch eine signifikant höhere Aktivität beim Induzieren der Leberzellenproliferation bei erwachsenen Tieren auf (48). Unsere Arbeit zeigt, dass gleiche oder noch bessere Resultate mit konstruierten Formen von HGF/SF, wie beispielsweise dem HP1-Mutant erreicht werden können. Dieser Mutant hat eine längere Verweilzeit im Kreislauf (6a), höhere Gewebeniveaus (6b) und ist aktiver als HGF/SF vom Wildtyp beim Induzieren von DNA-Synthese in ausgewachsener Leber (6c). Er überwindet deshalb die Notwendigkeit, HGF/SF in Komplexe mit Heparin-ähnlichen Verbindungen zu bringen, um die pharmazeutische Kinetik und Aktivität zu verbessern.
Obwohl es gut etabliert ist, dass Polypeptidwachstumsfaktoren ihre Effekte auf Zielzellen über spezifische Membranrezeptoren entwickeln (1) ist es in den letzten Jahren klar geworden, dass eine Anzahl dieser Proteine auch Zelloberflächen- und Matrixproteoglykane bindet, insbesondere solche vom Heparansulfattyp (HSPGs). Die biologische Signifikanz dieser doppelten Wechselwirkung wird im Fall des Bindegewebewachstumsfaktors (Fibroblast Growth Factor = FGF) gut verstanden. Zellen, die den FGF-Rezeptor expressivieren, denen es aber an membrangebundenem Heparansulfat fehlt, scheitern daran, auf basischen FGF zu antworten (2, 3), was impliziert, dass Heparansulfat ein wesentlicher Co-Rezeptor für die FGF-Signalisierung ist. Andere Wachstumsfaktoren, so wie epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) – verwandte Polypeptide Amphiregulin (4) und Heparinbindung – EGF (HB-EGF) (5) sowie verschiedene Spleißvarianten von endothelialem Gefäßwachstumsfaktor (Vascular Endothelial Growth Factor = VEGF) (6) erfordern auch zellgebundenes Heparansulfat für die Aktivität, obwohl die Rolle von HSPGs in diesen Systemen weniger definiert ist.
Leberzellenwachstumsfaktor/Streufaktor (HGF/SF) (7–12) ist ein Wachstumsfaktor in Form eines Polypeptids mit hohem Molekulargewicht, der sich von den anderen unterscheidet und der eine Domänenstruktur aufweist, die mit derjenigen des Blutproteinasevorstufenplasminogens verwandt ist. Wie Plasminogen wird HGF/SF als ein inaktives Einkettenpolypeptid produziert, das proteolytisch in eine zweikettige Art umgewandelt wird (13–15). Zweikettiger HGF/SF induziert Wachstum, Bewegung und Differenzierung bei Zielzellen über einen spezifischen Tyrosinkinasemembranrezeptor, der durch das c-MET-Protoonkogen codiert wird (16, 17). HGF/SF bindet fest an den MET-Rezeptor mit einer K_d im subnanomolaren Bereich an (18, 19). HGF/SF bindet auch Heparin (20, 21). Dies scheint die Bindungsaffinität zu einer löslichen Form des MET-Rezeptors nicht zu beeinträchtigen, obwohl sie die Rezeptorphosphorylierung und Mitogenizität auf Zielzellen (22) erhöht. HGF/SF-Heparinkomplexe zudem entwickeln anhaltende Plasmaniveaus und reduzierte Leberklärung in vivo (23).
Die modulare Struktur von HGF/SF hat die Identifikation der Domänen erleichtert, die für die Rezeptor- und Heparinbindung verantwortlich sind. Die Entfernung der Haarnadelstruktur der N-terminalen Domäne (eine Domäne, die homolog zu dem Aktivierungspeptid von Plasminogen ist) oder des Kringels 2 resultiert in Mutanten mit reduzierter scheinbarer Affinität zu Heparin (24). Im Gegensatz dazu haben Auslöschungen entweder des Kringels 1, 3 oder 4 oder der Proteinasedomäne wenig oder keinen Effekt (24). So scheint der Heparinbindungsplatz bzw. so scheinen die Heparinbindungsplätze von HGF/SF in der Haarnadelstruktur der N-terminalen Domäne und dem Kringel 2 enthalten zu sein. Dieselben Domänen sind jedoch kritisch für die MET-Bindung und -Signalisierung (25–28).
Beispiel 2: Behandlung mit HGF-Variante
Patienten mit akuter Lebererkrankung entweder aufgrund einer viralen Infektion oder chemischer Verletzung bzw. Verletzung durch Drogen werden mit der HGF-Variante durch tägliche intravenöse Injektionen einer Dosis von 1 bis 100 μg/kg in Salzlösung durch die akute Phase der Erkrankung hindurch behandelt. Die Entwicklung der Erkrankung wird durch Messen der Plasmaniveaus von α-Fötoprotein, γ-Globulin, SGOT, SGPT und γ-GT überwacht.
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Claims

Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (Hepatocyte Growth Factor = HGF), die im Wesentlichen nicht in der Lage ist, ein Heparansulfatproteoglykan zu binden, die aber in der Lage ist, an den HGF-Rezeptor anzubinden, wobei ein positiv geladener Aminosäurerest in der Haarnadelschleifenstruktur des HGF vom Wildtyp durch einen Aminosäurerest mit einer negativen Ladung ersetzt worden ist, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach Anspruch 1, wobei mindestens der Aminosäurerest R73 durch einen Aminosäurerest mit einer negativen Ladung ersetzt worden ist, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens der Aminosäurerest R76 durch einen Aminosäurerest mit einer negativen Ladung ersetzt worden ist, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei beide Aminosäurereste R73 und R76 unabhängig voneinander durch einen Aminosäurerest mit einer negativen Ladung ersetzt worden sind, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF), die Aminosäurerestersetzungen R73E und R76E aufweist, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF), die Aminosäurerestersetzungen R73E, R76E und R93E aufweist, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) die Aminosäurerestersetzungen R73E, R76E und K78E aufweist, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) bestehend aus humanem HGF mit Aminosäureersetzungen R73E und R76E, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) bestehend aus humanem HGF mit Aminosäureersetzungen R73E, R76E und R93E, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) bestehend aus humanem HGF mit Aminosäureersetzungen R73E, R76E und K78E, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach einem der Ansprüche 1 bis 10, die der Wirkung von HGF vom Wildtyp entgegenwirkt, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) gemäß Anspruch 11, wobei die Variante des HGF weiterhin eine Mutation aufweist, die bei der Variante des HGF zur Beständigkeit gegenüber proteolytischer Spaltung mit Enzymen führt, die zur in vivo-Umwandlung von HGF in seine zweikettige Form in der Lage sind, zur Verwendung in der Medizin.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach Anspruch 12, die eine Aminosäureänderung bei oder benachbart irgendeiner der Aminosäuren 493, 494, 495 und 496 des humanen HGF vom Wildtyp aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF), wie er in einem der vorangehenden Ansprüche oder der Ansprüche 17 bis 24 beschrieben ist, und mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung einer Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF), wie er in einem der Ansprüche 1 bis 13 beschrieben ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der der Behandlung mit einem HGF oder einem Antagonisten davon bedarf.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Patient Krebs hat.
Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF), wobei ein positiv geladener Aminosäurerest in der Haarnadelschleifenstruktur des HGF vom Wildtyp durch einen Aminosäurerest mit negativer Ladung ersetzt worden ist, unter der Voraussetzung, dass die Variante des HGF keine Variante des humanen HGF ist, bei der die Ersetzungen (a) R73E, R76E und R93E oder (b) R73E und R76E oder (c) K91E, R93E und K94E vorgenommen worden sind.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach Anspruch 17, wobei mindestens der Aminosäurerest R73 durch einen Aminosäurerest mit einer negativen Ladung ersetzt worden ist.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach Anspruch 17, wobei mindestens der Aminosäurerest R76 durch einen Aminosäurerest mit einer negativen Ladung ersetzt worden ist.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei beide Aminosäurereste R73 und R76 unabhängig voneinander durch einen Aminosäurerest mit einer negativen Ladung ersetzt worden sind.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) mit Aminosäurerestersetzungen R73E, R76E und K78E
Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach Anspruch 17, die der Wirkung des HGF vom Wildtyp entgegenwirkt.
Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach Anspruch 22, wobei die Variante des HGF weiterhin eine Mutation aufweist, die bei Variante des HGF zu Beständigkeit gegenüber proteolytischer Spaltung durch Enzyme führt, die zu einer in vivo-Umwandlung von HGF in seine zweikettige Form in der Lage sind.
Variante des humanen Leberzellenwachstumsfaktors (HGF) nach Anspruch 23, die eine Aminosäureänderung an oder benachbart irgendeiner der Aminosäuren 493, 494, 495 und 496 des humanen HGF von Wildtyp aufweist.
Polynukleotid, das eine Variante des Leberzellenwachstumsfaktors nach einem der Ansprüche 17 bis 22 kodiert.
Vektor, der ein Polynukleotid nach Anspruch 25 aufweist.
Wirtszelle, die ein Polynukleotid oder einen Vector nach Anspruch 25 bzw. 26 aufweist.
Verfahren zum Herstellen einer Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF), wobei das Verfahren das Kultivieren einer Zelle, wie sie im Anspruch 27 definiert ist, und das Isolieren der Variante des HGF davon aufweist.
Verfahren des Einleitens der DNA-Synthese in einer Zelle in vitro, das das Bereitstellen einer Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF), wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert ist, für die Zelle aufweist.
Verfahren des Einleitens der Aufspaltung und des Ausstreuens von Zellen bei einer Zellpopulation in vitro, wobei das Verfahren das Bereitstellen einer Variante des Leberzellenwachstumsfaktors (HGF), wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert ist, für die Zellpopulation aufweist.