ES2219888T3 - Polipeptidos del factor de crecimiento de hepatocitos y su uso en terapia. - Google Patents

Abstract

Se describe un factor mutante del crecimiento de los hepatocitos (HGF) que es básicamente incapaz de fijarse a una heparina-sulfato proteolican pero que es capaz de fijarse al receptor del HGF para su uso en la medicina.

Description

Polipéptidos del factor de crecimiento de hepatocitos y su uso en terapia.

La presente invención se refiere a polipéptidos y su uso en terapia y en particular al uso de los factores de crecimiento mutantes de hepatocitos en terapia.

El factor de crecimiento mutante de hepatocitos (HGF, por las siglas de su expresión inglesa, Hepatocyte Growth Factor), también conocido como factor de dispersión (SF, por las siglas de su expresión inglesa, Scatter Factor) es un factor de crecimiento de polipéptidos que induce el crecimiento, movimiento y diferenciación en células objetivo. El HGF es sintetizado como un precursor de una sola cadena que se escinde proteolíticamente a una forma activa de dos cadenas. La forma activa de HGF se cree que media su efecto por su enlace a un receptor cinasa de tirosina (MET) codificado por el oncogen c-met.

El HGF de tipo natural tiene varios usos terapéuticos potenciales. Sin embargo, el HGF de tipo natural es rápidamente eliminado del plasma (t_{1/2} de aproximadamente 4,5 min.). La velocidad del balance puede ser reducida algo al acomplejar el HGF en heparina o a otros polianiones antes de su administración.

Matsumoto et al (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 181, 691-699 describe que la supresión de dominios kringle o la estructura capilar de terminal N en HGF resulta en un decrecimiento notable de las actividades biológicas relacionadas.

Miau et al, (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 223, 487-491, pretende describir la identificación de una nueva variante de HGF secretada por células stromales derivadas del bazo.

Lokker et al (1994) Prot. Eng. 7, 895-903 describe el análisis mutacional y modelado molecular para el HGF del dominio terminal N, que contiene al kringle, e identifica las cadenas laterales importantes de aminoácidos para la interacción con el receptor c-MET.

Mizuno et al (1994) J Biol. Chem. 269, 1131-1136 describe mutantes en los que han sido eliminados el bucle capilar o un dominio kringle.

Schwall et al (1996) J. Cell Biol. 133, 709-718 informa que la heparina induce dimerización y confiere actividad proliferativa en los antagonistas NK1 y NK2 de HGF que son variables truncadas de HGF.

Lokker et al (1992) EMBO J. 11, 2503-2510 describe varios mutantes de HGF.

Los documentos WO 92/05184 y WO 96/40914 se refieren a una forma truncada de HGF que supuestamente antagoniza la actividad de HGF.

El documento WO 93/23541, la patente de los EE.UU. Nº 5.547.856, 5.316.921 y 5.580.963 se relacionan con variantes de HGF que son resistentes a la escisión proteolítica.

La patente de los EE.UU. Nº 5.464.815 describe un método para extender el período de semidesintegración en plasma de las proteínas enlazantes de la heparina.

El documento WO 96/28475 describe un HGF modificado con polietilenglicol.

La presente invención describe variantes de HGF que han reducido significativamente su habilidad de enlazar heparina o proteoglicano de sulfato de heparano (HSPG, por las siglas de su expresión inglesa, Heparan Sulphate Proteoglycan) pero que todavía pueden enlazarse al receptor de HGF (MET). Por lo menos algunas de estas variantes tienen in vivo un período circulatorio de semidesintegración más largo y una actividad mitogénica mayor que el HGF de tipo natural, cuando se administran a ratas. Por lo tanto, un objeto de la invención es superar la necesidad de acomplejar el HGF con compuestos semejantes a heparina, o a otros polianiones, a fin de mejorar su actividad farmacocinética e in vivo. Las moléculas variantes de HGF de la invención pueden activar al receptor de HGF sustancialmente del mismo modo que el HGF de tipo natural, o ellas pueden actuar como antagonistas al HGF de tipo natural, o pueden actuar de alguna otra manera. En todo caso, las moléculas variantes de HGF son útiles en medicina.

Un primer aspecto de la invención proporciona un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) que es sustancialmente incapaz de enlazar un proteoglicano de sulfato de heparano, pero que es capaz de enlazarse al receptor de HGF para uso en medicina.

Por la expresión "Factor variable de crecimiento de hepatocitos" significamos un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que varía en la estructura de aminoácidos a partir de una forma del tipo natural. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una forma HGF del tipo natural humano está dada en la Figura 7. Es conocido que ciertos polipéptidos, especialmente los de seres humanos, son polimórficos y se considera que podría ocurrir alguna variación natural de la secuencia de HGF humana, y que tales moléculas de HGF humanas serían consideradas pertenecientes al tipo natural, siempre que el HGF enlace al proteoglicano de sulfato de heparano (HSPG, por las siglas de su expresión inglesa, Heparan Sulphate Proteoglycan) y pueda enlazar el receptor de HGF y dar posibilidad al conocido efecto biológico.

Por la expresión "sustancialmente incapaz de enlazar al HSPG" incluimos el significado de que el HGF variable enlaza al HSPG significativamente menos adecuadamente que el HGF de tipo natural. Se prefiere que el HGF variable enlace al HSPG por lo menos 10 veces menos adecuadamente que el HGF de tipo natural, preferentemente menos adecuadamente por lo menos 20 veces, aún más preferentemente menos adecuadamente 50 veces, y lo más preferente aún menos adecuadamente por lo menos 100 veces. Convenientemente, la habilidad de enlazar al HSPG que tienen el HGF de tipo natural y el HGF variable es medida con referencia, como está descrito en el Ejemplo 1, al HSPG producido por las células del Ejemplo 1.

Preferentemente, el HGF variable tiene una afinidad reducida a la heparina.

Típicamente, aunque no siempre, el HGF variable de la invención tendrá una habilidad reducida de enlazar tanto la heparina, como el HSPG.

Convenientemente, el HGF variable revelado en la presente solicitud podría ser uno que enlace la heparina significativamente menos adecuadamente que el HGF de tipo natural. Se prefiere que el HGF variable enlace la heparina por lo menos 10 veces menos adecuadamente que el HGF de tipo natural, preferentemente menos adecuadamente por lo menos 20 veces, aún más preferentemente menos adecuadamente 50 veces y lo más preferente aún menos adecuadamente por lo menos 100 veces. Convenientemente, la habilidad de enlazar heparina que tienen el HGF de tipo natural y el HGF variable es medida, usando los métodos descritos en el Ejemplo 1.

En todo caso, adecuadamente, el HGF variable tiene sustancialmente las mismas actividades mitogénica y motogénica en células objetivo como tiene el HGF de tipo natural (por lo menos aquellas variantes que no sean antagonistas del HGF).

Preferentemente, los fragmentos NK2 de HGF de tipo natural o HGF variable son usados para determinar la afinidad enlazante de la heparina. Usando el método del Ejemplo 1, el HGF humano de tipo natural tiene una constante de disociación molar (Kd) de \sim 10^{-9} M (1 nM) y el fragmento NK2 del tipo natural de HGF tiene una constante de disociación de molar (Kd) de alrededor de 2,3 nM con respecto a la heparina.

La forma NK2 de ocurrencia natural es un producto del empalme alternativo de la transcripción primaria de HGF y codifica la secuencia del líder (residuos 1-31), el dominio N que contiene el bucle capilar (residuos 70-96), kringle 1 (residuos 128-206), kringle 2 (residuos 211-288) y tres residuos adicionales después de kringle 2 (residuos 289-291).

Por "capaz de enlazarse al receptor de HGF" incluimos el significado que el HGF variable puede enlazarse con sustancialmente la misma afinidad a una forma soluble del receptor de HGF (MET) que el HGF de tipo natural tal, como se describe en el Ejemplo 1. En evitación de duda, los HGF variables de la invención incluyen variables de HGF que sean capaces de enlazar al receptor de HGF, dando como resultado (a) la activación del receptor o (b) la inhibición de la señalización del receptor por el HGF endógeno (o del tipo natural).

Preferentemente, el HGF variable se une al receptor HGF con una afinidad entre 0,1 - y 10 - veces la del HGF del tipo natural.

Preferentemente, en algunos casos, las variantes de HGF no son antagonistas del HGF y para algunas variantes el efecto de enlazar el HGF variable a MET, en una célula que contiene MET y puede responder al enlace de HGF a MET, es sustancialmente la misma como el efecto del HGF de tipo natural enlazando a MET. Por lo tanto, en estos casos, la actividad de HGF variable que no sea antagonista de HGF y la actividad del HGF de tipo natural sobre células objetivo in vitro es sustancialmente la misma.

Aún preferentemente, como se describe más adelante, algunas moléculas variables de HGF son antagonistas de HGF pero éstas, sin embargo, caen también dentro del alcance de la invención.

Como se discute en más detalle más adelante, todos estos tipos de moléculas se creen son útiles en la medicina, y por eso están preparadas en forma envasada y presentada para su uso en medicina.

Antes del presente trabajo, no había sido mostrado que variantes de HGF que sean sustancialmente incapaces de enlazar heparina o HSPG, pero que son capaces de enlazarse al receptor de HGF, tienen in vivo actividades mejoradas en comparación con la forma de tipo natural u otras formas variables de HGF. En particular, por lo menos algunas de las variantes de la invención inesperadamente indican un balance más lento del suero que el del HGF de tipo natural, y por lo menos algunas de las moléculas variables de HPG de la invención inesperadamente inducen la síntesis de ADN en hígado adulto a un grado mayor que el HGF de tipo natural.

Por "HGF" incluimos tanto las formas de cadena simple, como también formas que han sido proteolizadas a la forma de dos cadenas.

Preferentemente, el HGF variable es un HGF variable en el que un residuo de aminoácidos positivamente cargado en la estructura de bucle capilar del HGF de tipo natural ha sido sustituido con un residuo de aminoácidos sin carga o una carga negativa.

La estructura de bucle capilar abarca residuos de aminoácidos 70 a 96 del HGF de tipo natural.

Por "residuo de aminoácidos positivamente cargado" significamos Arg (R), Lys (K) o His (H). Histidina tiene una carga positiva parcial a pH fisiológico.

Arg y Lys a menudo son llamados residuos básicos de aminoácidos.

Por "residuo de aminoácidos negativamente cargado" significamos Glu (E) o Asp (D). Aparte de los residuos de aminoácidos positiva o negativamente cargados, todos los otros residuos de aminoácidos que ocurren naturalmente, los cuales son directamente codificados por el código genético, no tienen carga.

Glu y Asp son a menudo llamados residuos acídicos de aminoácidos.

Es particularmente preferente si la variante es una, en la que un residuo positivamente cargado en la estructura de bucle capilar es sustituido por un residuo negativamente cargado. Es por consiguiente preferente si un residuo Lys o Arg o His es sustituido por un residuo Glu o Asp. Es particularmente preferente si un residuo Lys o Arg es sustituido por un residuo Glu.

Será apreciado que la sustitución de residuos cargados positivamente por residuos no cargados o negativamente cargados sea fácilmente conseguida por los métodos conocidos de ingeniería de proteínas tal, como se describe más adelante. Sin embargo, pueden ser obtenidas moléculas de HGF variables, las cuales son incapaces de enlazar heparina o HSPG, pero son capaces de enlazarse al receptor de HGF, por ejemplo, eliminando los residuos de aminoácidos cargados positivamente presentes en la estructura de bucle capilar por métodos de ingeniería de proteínas o, por ejemplo, modificando químicamente los residuos positivamente cargados presentes en la estructura de bucle capilar. Los métodos de ingeniería de proteínas son preferentes para la sustitución de residuos de aminoácidos; sin embargo, podría ser posible hacerlo, por ejemplo, realizando la modificación selectiva de residuos de arginina usando ciclohexan-1,2-diona.

Preferentemente, el HGF es un HGF humano. La secuencia de aminoácidos de un HGF humano de tipo natural está dada en la Figura 7. Es particularmente preferente si el HGF variable es un HGF humano variable, en el que los residuos de aminoácidos positivamente cargados de la región del bucle capilar son sustituidos por residuos de aminoácidos negativamente cargados, o por residuos de aminoácidos sin carga. Sin embargo, será apreciado que el HGF de otras especies de mamíferos tiene un estructura de bucle capilar análoga que contiene residuos positivamente cargados y variables de estas moléculas de HGF no humano, en las que los residuos de aminoácidos positivamente cargados sean sustituidos por residuos de aminoácidos negativamente cargados, o por residuos aminoácidos no cargados, están incluidos dentro del alcance de la invención con tal de que tales moléculas sean sustancialmente incapaces de enlazar heparina o HSPG, pero que sean capaces de enlazar al receptor de HGF.

En el HGF de tipo natural humano, los residuos de aminoácidos positivamente cargados en la estructura de bucle capilar incluyen R73, R76, K78, K85, K91, R93 y K94.

Es particularmente preferente si el HGF humano variable es uno en el que por lo menos Arg 73 (R73) haya sido sustituido por un residuo de aminoácidos sin carga o con una carga negativa. Preferentemente, el HGF humano variable incluye la mutación de Arg73 Glu (R73E) o de Arg73 Asp (R73D); lo más preferente Arg73 Glu (R73E).

También es particularmente preferente si el HGF humano variable es uno en el que por lo menos Arg76 (R76) haya sido sustituido por un residuo de aminoácidos sin carga o con una carga negativa. Preferentemente, el HGF humano variable incluye la mutación Arg76 Glu (R76E) o Arg76 Asp (R76D); más preferentemente Arg76 Glu (R76E).

Una realización especialmente preferente de la presente invención es un HGF humano variable, en el que ambos residuos de aminoácidos Arg73 y Arg76 (R73 y R76) han sido sustituidos independientemente uno de otro con un residuo de aminoácidos sin carga o con una carga negativa. Es preferente que ambos Arg73 y Arg76 sean sustituidos con un residuo de aminoácidos negativamente cargado como Glu (E) o Asp (D); es particularmente preferente si el HGF humano variable comprenda las sustituciones de aminoácidos Arg73 Glu y Arg76 Glu (R73E y R76E).

Convenientemente, adicional a la sustitución de Arg73 y Arg76 otros residuos de aminoácidos positivamente cargados en la estructura de bucle capilar son sustituidos con un residuo de aminoácidos negativamente cargado, o un residuo de aminoácidos sin carga. Adecuadamente, además de la sustitución de Arg73 y Arg76 de HGF humano, Arg93 (R93) y/o Lys78 (K78) son sustituidos por un residuo de aminoácidos cargado negativo o un residuo de aminoácidos sin carga. Preferentemente Arg93 (R93) y/o Lys78 (K78) son sustituidos con Glu (E) o Asp (D), más preferentemente Glu (E).

Por lo tanto, una realización de la invención es un HGF humano variable que comprende sustituciones de aminoácidos R73E, R76E y R93E, y un HGF humano variable que comprende sustituciones de aminoácidos R73E, R76E y K78E.

Las moléculas de HGF variables de la invención incluyen moléculas de HGF, las que también, además de contener las mutaciones a las que se hace referencia más arriba, pueden ser modificadas adicionalmente para modular la actividad biológica de la molécula (por ejemplo, para hacer un antagonista de HGF) o pueden ser modificadas adicionalmente a fin de facilitar la síntesis y/o purificación de la molécula de HGF variable. Sin embargo, estas modificaciones adicionales conservan las propiedades dadas en particular de la molécula de HGF variable, concretamente que la variable es sustancialmente incapaz de enlazar HSPG o heparina como sea el caso, pero ser capaz de enlazarse al receptor de HGF.

Adecuadamente, el HGF variable podría comprender una secuencia "Etiqueta" de péptido que puede facilitar su purificación. Típicamente, la etiqueta comprende un sitio enlazante para un componente, que puede ser inmovilizado para admitir una purificación en fase sólida del HGF variable, posterior al enlace del HGF variable al componente. La etiqueta puede ser, por ejemplo, la secuencia His_{n} (n > 4) que enlaza un ión Ni^{2+}, o podría ser un epítope para un anticuerpo monoclonal, como el bien conocido epítope etiqueta Myc. Las otras posibilidades son conocidas en la técnica.

Se prefiere, sin embargo, si el HGF humano variable consiste en un HGF de tipo natural con sustituciones de aminoácidos Arg73 Glu y Arg76 Glu (R73E, R76E) o un HGF de tipo natural con sustituciones de aminoácidos Arg73 Glu, Arg76 Glu y Arg93 Glu (R73E, R76E, R93E) o un HGF de tipo natural con sustituciones de aminoácidos Arg73 Glu, Arg76 Glu y Lys78 Glu (R73E, R76E, K78E).

El HGF humano variable con sustituciones de aminoácidos R73E, R76E y R93E es llamado HP1 en el Ejemplo 1 y el HGF humano variable con sustituciones de aminoácidos R73E, R76E y K78E es llamado HP2 en el Ejemplo 1 (véase la leyenda de la Figura 1).

También es preferente si el HGF humano variable comprenda las mutaciones L80 y/o F82. En particular, un HGF humano variable preferente comprende las mutaciones L80S y F82Q. El HGF humano variable con sustituciones de aminoácidos L80S y F82Q se llama HP4 en el ejemplo 1 y es un HGF variable para uso en medicina de la presente invención. Será apreciado que podría ser beneficioso introducir una o más de estas mutaciones en una variante de HGF que también contenga una o más de las mutaciones en el bucle capilar que retire la carga positiva como se describe en la presente solicitud.

Además de las mutaciones mencionadas anteriormente podría ser ventajoso sustituir otros residuos de aminoácidos positivamente cargados en el HGF humano por residuos de aminoácidos no cargados o negativamente cargados. Por ejemplo, podría ser ventajoso introducir una o más sustituciones de K91 y K94 (en la estructura capilar) y a H241, R242, K244 y R249 (en el dominio kringle 2).

Un HGF humano variable que consta de HGF de tipo natural en el que Lys 85 es sustituido por Glu (K85E; HP5 - véase la leyenda de la Figura 1) no es una variable de la invención ya que actúa esencialmente de la misma manera que un HGF de tipo natural Sin embargo, podría ser beneficioso incluir esta mutación con las otras mutaciones aquí reveladas.

El HGF variable es preferentemente uno, que en relación a su habilidad enlazante de MET y su habilidad de transferir señales a la célula, tenga sustancialmente la misma actividad como el HGF de tipo natural.

Sin embargo, es también preferible que el HGF variable sea uno que antagonice la acción del HGF de tipo natural. Moléculas de HGF variables que antagonicen la acción de HGF de tipo natural son conocidas en la técnica. Por ejemplo, los documentos WO 92/05184 y WO 96/40914 que se relacionan con formas truncadas de HGF que antagonizan específicamente, o antagonizan parcialmente, la actividad del HGF de tipo natural. El documento WO 93/23541, las patentes de los EE.UU. Nº 5.547.856, Nº 5.316.921 y Nº 5.580.963 se refieren a moléculas de HGF variables que son resistentes a la escisión proteolítica por enzimas capaces de conversión in vivo de HGF a su forma de dos cadenas. Todas estas solicitudes y patentes son incluyen como referencia.

Por lo tanto, es preferente si las variables descritas en estas solicitudes de patentes y patentes se sometan a modificaciones adicionales en la manera descrita en la presente solicitud, por ejemplo, realizando mutaciones adicionales que hagan al HGF variable sustancialmente incapaz de enlazar heparina o HSPG, pero que sea capaz de enlazarse al receptor de HGF.

Preferentemente las mutaciones reveladas en la presente solicitud son combinadas con mutaciones que otorguen resistencia a la escisión proteolítica por enzimas capaces de la conversión in vivo del HGF a su forma de dos cadenas, como las descritas en la patente de los EE.UU. Nº 5.316.921. Más preferentemente, estas mutaciones, que pueden ser combinadas con las mutaciones que se revelan en la presente solicitud en relación con la estructura de bucle capilar, son aquellas en las cuales una alteración de aminoácidos en, o adyacente, a cualquiera de las posiciones de aminoácidos 493, 494, 495 y 496 de la secuencia del HGF de tipo natural humano.

Por lo tanto, las moléculas preferentes de HGF variables de la invención, las cuales se cree que son antagonistas del HGF de tipo natural, son, por ejemplo, aquellas que comprendan las sustituciones de aminoácidos R73E, R76E y R93E, o R73E, R76E y K78E y cualquiera, una o más, de las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 493, 494, 495 y 496 del HGF de tipo natural humano.

Como se discutió anteriormente, las moléculas de HGF variables mencionadas anteriormente son útiles en medicina.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un HGF variable como se define en el primer aspecto y un portador aceptable farmacéuticamente.

Los compuestos de la presente invención, mencionados anteriormente, o una formulación suya pueden ser administrados por cualquier método convencional incluyendo la vía oral e inyección parenteral (por ejemplo, subcutánea o intramuscular). El tratamiento podría constar de una sola dosis o una pluralidad de dosis durante un período de tiempo.

Aunque es posible que un compuesto de la presente invención sea administrado solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica con uno o más portadores aceptables. El(os) portador(es) debe(n) ser "aceptable(s)" en el sentido de ser compatible con el compuesto de la invención e inocuo a los receptores de éste. Típicamente, los portadores serán agua o solución salina que será estéril y libre de pirógenos.

Las formulaciones podrían ser presentadas en forma de dosis unitarias convenientes y pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica farmacéutica. Tales métodos incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo (compuesto de la invención) con el portador que constituye uno o más ingredientes adicionales. En general, las formulaciones son preparadas asociando de forma uniforme e íntima el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o con ambos, y luego, si fuera necesario, dándole forma al producto.

Las formulaciones apropiadas de conformidad con la presente invención para su administración oral podrían ser presentadas en unidades discretas como cápsulas, grageas o tabletas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como polvo o gránulos; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite - en - agua o una emulsión líquida de agua - en - aceite. El ingrediente activo también puede ser presentado como bolo, remedio o pasta

Una tableta puede ser formada por compresión o moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas pueden ser preparadas por compresión del ingrediente activo en una máquina apropiada en una forma con fluidez libre como polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante (por ejemplo povidona, gelatina, hidroxi-propil-metil-celulosa), un lubricante, diluyente inerte, conservante, desintegrante (por ejemplo glicolato de almidón sódico, povidona reticulada, carboxi-propil-metil-celulosa reticulada) agente tensioactivo o dispersante. Las tabletas moldeadas pueden ser confeccionadas por moldeado en una máquina apropiada de una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Las tabletas pueden opcionalmente ser recubiertas o estriadas, y pueden ser formuladas para proporcionar una liberación lento o sostenida del ingrediente, por ejemplo hidroxi-propil-metil- celulosa en proporciones diferentes para proporcionar el perfil de liberación deseado.

Las formulaciones apropiadas para administración tópica en la boca incluyen tabletas que comprenden el ingrediente activo sobre una base saborizada, generalmente con sacarosa y acacia o tragacanta; pastillas que comprenden el ingrediente activo sobre una base inerte como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un portador líquido apropiado.

Las formulaciones apropiadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección acuosas y no acuosas estériles que pueden contener anti oxidantes, búferes, bactericidas y solutos que convierten la formulación en isotónica con la sangre del futuro receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden ser presentadas en dosis unitarias o recipientes de dosis múltiples, por ejemplo, en ampollas cerradas y viales, y pueden ser guardadas en estado seco congeladas (liofilizadas) requiriendo solamente la adición de portadores líquidos estériles, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Soluciones y suspensiones extemporáneas de inyección podrían ser preparadas a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles de la clase antes descritas.

Las formulaciones de dosis unitarias preferente son aquellas que contengan una dosis diaria o unidad, una subdosis diaria o una fracción de apropiada de éstas, de un ingrediente activo.

Deberá ser comprendido que adicional a los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales de la técnica con respecto al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo aquellos apropiados para administración oral podrían incluir a agentes saborizantes.

La entrega localizada puede ser deseable, cuando sea posible; por ejemplo cuando la entrega deseada es al hígado la vía puede ser la arteria hepática.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método de tratamiento de un paciente en necesidad de, o que se beneficiaría del tratamiento, con un factor de crecimiento de hepatocitos o uno de sus antagonistas, método que comprendería administrar una cantidad eficaz de un HGF variable al paciente como se define en el primer aspecto de la invención.

Será apreciado el hecho de que con los avances en la terapia genética podría ser posible administrar el HGF variable vía administración de un constructor genético que codifique el HGF variable. Esto está específicamente incluido en el método de tratamiento de la invención.

El uso terapéutico de moléculas de tipo natural y de HGF variables especiales, distintos de éstos revelados en la presente solicitud ha sido descrito con anterioridad. Por ejemplo, los estudios en ratones indican que el HGF podría funcionar como un supresor de tumores en etapas tempranas de la carcinogénisis del hígado (Santoni et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9577-9582), y se informa que el HGF in vitro impide el crecimiento de las células de melanomas Hep G2, HCC, B6 / F1 y el de las células KBs del carcinoma escamoso (Tajima et al (1991) FEBS Lett. 291, 229-232). El HGF previene el inicio y la evolución de fibrosis / cirrosis hepáticas en ratas y totalmente revoca la muerte causada por cirrosis y disfunción hepática grave (EP 0 456 188 y Matsuda et al (1995) J. Biochem. 118, 643-649). El HGF aumenta la eficiencia de la transducción retroviral de hepatocitos primarios (Pages et al (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 222, 726-731).

El HGF estimula la regeneración del hígado en ratas hepatectomizadas en un 70% (Ishii et al (1995) J. Biochem. 117, 1105-1112). El HGF ha sido propuesto como terapia contra la proliferación de células del músculo suave vascular (Nakamura et al (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 215, 483-488), y el decrecimiento de concentraciones locales altas de HGF atribuibles a la D - glucosa podría ser un detonador de la lesión endotelial en la diabetes, resultando potencialmente en la progresión de la aterosclerosis (Nakamura et al (1997) Diabetes 46, 138-142).

El HGF es in vivo un potente factor de angiogénesis (Rosen et al (1993) Symp. Soc. Exp. Biol. 47, 227-234) y, por lo tanto, puede tener utilidad en la curación de heridas.

Se ha informado que el HGF aumenta la reparación de erosiones / ulceraciones epiteliales intestinales (Nusrat et al (1994) J. Clin. Invest. 93, 2056-2065). El HGF ha sido propuesto para bloquear los efectos secundarios de la radio / quimioterapia (documentos WO 93/08821, WO 95/25537), como una solución para trastornos del nervio craneal (documento WO 95/07709), como una solución para la enfermedad de cartílagos (documento WO 96/05855), para aliviar los efectos secundarios causados por inmunosupresores (documento WO 95/25537) y como agente terapéutico para la enfermedad renal (patente europea Nº EP 0 462 549). Véase también Matsumoto & Nakamura, Hepatocyte Growth Factor, páginas 450-474 en: "Acute Renal Failure, New Concepts and therapeutic strategies", ed. M.S. Goligorsky & J.H. Stein, Churchill Livingstone, New York. Todos estos documentos han sido incluidos en las referencias de la presente solicitud.

Se ha informado que el HGF, o sus variantes, son útiles en el tratamiento de diversos otros trastornos. El documento WO 97/09997 indica que el HGF podría ser útil en el tratamiento de la fibrosis quística. El documento WO 97/12628 indica que el HGF puede aumentar la reconstrucción de una nueva superficie de vasos sanguíneos dañados o traumatizados, por ejemplo, por la cirugía vascular o angioplastia, y el documento WO 97/12629 indica que el HGF podría ser útil en aumentar la angiogénesis. El fragmento \alpha del HGF puede actuar como un antagonista que específicamente impida la habilidad de las células cancerígenas para invadir o hacer metástasis por medio del HGF (véase el documento WO 97/16205), mientras que en el documento WO 96/32960, el HGF es empleado como el ingrediente activo que ejerce el efecto de suprimir la citotoxicidad en un modelo isquémico y, por consiguiente, es eficaz como preventivo y/o remedio para enfermedades isquémicas.

El documento WO 95/29694 indica que el HGF puede acelerar la hidrólisis del colágeno al tratar la fibrosis y otras enfermedades causadas por una baja actividad de colagenasa, y el documento EP 0 661 995 indica que el HGF puede ser usado en la prevención del establecimiento de, o progresión de, el daño de hígado en pacientes en peligro de daños en el hígado. Variables de HGF que previenen que el HGF se enlace con el MET son propuestas para uso en un método de prevención de la metástasis de célula tumorales (véase, por ejemplo, el documento EP 0 805 203).

Además, el documento WO 98/00543 describe agonistas de varios receptores de HGF, y el documento WO 97/07824 indica que el gen de HGF podría ser empleado, con el uso de liposomas, en la terapia de genes.

Las moléculas de HGF variables que enlazan al MET y que transfieren señales celulares sustancialmente del mismo modo que el HGF de tipo natural, se considera que pueden ser terapéuticamente útiles de la misma manera, como lo es el HGF de tipo natural, pero ya que las moléculas de HGF variables son sustancialmente incapaces de enlazar HSPG o heparina, son cree que entonces las moléculas variables tendrían un efecto superior in vivo, por ejemplo, las moléculas de HGF variables se cree que proporcionan una penetración mayor del tejido, por lo tanto la habilidad de alcanzar compartimentos de células o tejidos, a los cuales el HGF exógeno de tipo natural no lograría llegar eficazmente (o que requeriría de una dosis mucho más alta). Por lo tanto, se cree que la eficacia terapéutica por lo menos de algunas de las moléculas de HGF variables de la invención es más alta que la del HGF de tipo natural y que se podría usar una dosis terapéutica inferior, que podría redundar en menores efectos secundarios. De este modo, este clase de moléculas alternativas de HGF se cree que es eficaz como terapéutica del cáncer, en tratar la fibrosis / cirrosis del hígado en humanos, como agente terapéutico en la hepatectomía y heridas del hígado, como un coadyuvante para la terapia génica del hígado, en la terapia en contra de la proliferación celular del músculo vascular liso, para aumentar la reparación de erosiones / ulceraciones intestinales epiteliales, como un factor de angiogénesis, para bloquear los efectos secundarios de la radio- o quimioterapia, como remedio para trastornos del nervio craneal, como remedio para la enfermedad de cartílagos, para disminuir el efecto secundario causado por inmunosupresores y como agente terapéutico para enfermedades renales. Estas moléculas de HGF variables también podrían ser útiles en el tratamiento de las heridas crónicas de la piel.

Las moléculas de HGF variables de la invención se cree son útiles en el tratamiento del cáncer para impedir o retrasar su extensión y metástasis.

Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de un HGF variable como se define en el primer aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente en necesidad de, o quien se beneficiaría, de tratamiento con un HGF o un antagonista.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un factor variable de crecimiento (HGF) de hepatocitos que es sustancialmente incapaz de enlazar heparina o HSPG, pero que es capaz de enlazarse al receptor de HGF siempre que el HGF variable no sea una variante de HGF humano, en la que se hayan hecho las sustituciones (a) R73E, R76E y R93E o (b) R73E y R76E o (c) K91 E, R93E y K94E.

Las preferencias de moléculas de HGF variables en este aspecto de la invención son las mismas que las del primer aspecto de la invención.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un polinucleótido que codifica un factor de crecimiento variable (HGF) de hepatocitos que es sustancialmente incapaz de enlazar heparina o HSPG, pero que es capaz de enlazarse al receptor de HGF siempre que el HGF variable no sea una variante de HGF humano, en la que se hayan hecho las sustituciones (a) R73E, R76E y R93E o (b) R73E y R76E o (c) K91E, R93E y K94E.

El polinucleótido de este aspecto de la presente invención se puede hacer fácilmente, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio usando oligonucleótidos disparejos o usando la reacción en cadena de la polimerasa o por síntesis de novo de polinucleótidos, o por cualesquiera otros métodos. Tales métodos son conocidos en la técnica de biología molecular y por lo menos algunos de los métodos son descritos en detalle por Sambrook et al (1989) "Molecular Cloning, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la invención y un aspecto todavía adicional de la invención proporciona una célula hospedador que comprende un polinucleótido o vector de la invención.

El polinucleótido o el vector podrían ser ADN o ARN; preferentemente es ADN.

Ha sido desarrollado una variedad de métodos para vincular operacionalmente el ADN con los vectores, vía terminales complementarias. Por ejemplo, pueden ser añadidos tractos homopolímeros complementarios al segmento de ADN para que sean insertados al vector de ADN. El vector y el segmento de ADN entonces son unidos por enlace de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas del ADN recombinante.

Enlazantes sintéticos que contengan uno o más sitios de restricción proporcionan un método alternativo de ligadura del segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado por la digestión de la restricción de endonucleasa como se describió anteriormente, es tratado con polimerasa bacteriófaga T4 ADN o con polimerasa de ADN E. coli I, enzimas que retiran protuberancias, terminales de hebra sencilla 3' con sus actividades exonucleolíticas 3 ' - 5 ', y rellenan en los extremos ranurados 3 ' con sus actividades polimerizantes.

La combinación de estas actividades por consiguiente genera segmentos de ADN con terminaciones embotadas. Los segmentos ADN con terminaciones embotadas son incubados luego con un exceso molar grande de moléculas enlazantes en presencia de una enzima que pueda catalizar la ligadura de moléculas de ADN con terminaciones embotadas, como la ligasa bacteriófaga ADN T4. Por tanto, los productos de reacción son segmentos de ADN que traen secuencias poliméricas enlazadoras en sus extremos. Estos segmentos de ADN entonces son escindidos con la enzima de restricción apropiada y ligados a un vector de expresión que ha sido escindido con una enzima que induce terminales compatibles con las del segmento de ADN.

Enlazantes sintéticos que contienen una variedad de sitios endonucleasa de restricción se encuentran comercialmente disponibles de varias fuentes incluyendo Internacional Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EE.UU.

Una manera deseable de modificar el ADN codificando el polipéptido de la invención es usar la reacción en cadena de la polimerasa, como se revela por Saiki et al en (1988) Science 239, 487-491.

En este método, el ADN, que debe ser amplificado enzimáticamente, está flanqueado por dos oligonucleótidos, plantillas específicas, que resultan incorporados ellos mismos en el ADN que debe ampliado. Dichas plantillas específicas podrían contener sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que pueden ser usados para clonar vectores que usarían métodos conocidos en la técnica.

El ADN (o ARN) son expresados entonces en un hospedador apropiado para producir un HGF variable de la invención (un polipéptido que constituye el compuesto de la invención). Por lo tanto, el DNA codificador del polipéptido, que constituye el compuesto de la invención, puede ser usado apropiadamente de acuerdo con las técnica conocidas, para modificarlo a la luz de las enseñanzas vertidas en la presente solicitud, para construir un vector de expresión, que luego es usado para transformar una célula hospedador apropiada para la expresión y producción del polipéptido de la invención. Tales técnica están reveladas en la patente de los EE.UU. Nº 4.440.859 emitida el 3 abril de 1984 a nombre de Rutter et al, en la Nº 4.530.901 emitida el 23 julio de 1985 a nombre de Weissman, en la Nº 4.582.800 emitida el 15 abril de 1986 a nombre de Crowl, en la Nº 4.677.063 emitida el 30 Junio de 1987 a nombre de Mark et al.; Nº 4.678.751 publicada el 7 julio de 1987 a nombre de Goeddel, Nº 4.704.362 publicada el 3 noviembre de 1987 a nombre de Itakura et al, Nº 4.710.463 emitida en 1 diciembre de 1987 a nombre de Murray, Nº 4.757.006 emitida el 12 julio de 1988 a nombre de Toole, Jr. et al, Nº 4.766.075 emitida el 23 Agosto de 1988 a nombre de Goeddel et al y Nº 4.810.648 emitida el 7 marzo de 1989 a nombre de Stalker, todas las cuales están incorporadas a la presente solicitud como referencias.

El polipéptido, que codifica ADN, que constituye el compuesto de la invención, puede ser unido a una gran variedad de otras secuencias de ADN para su introducción a un hospedador apropiado. El compañero ADN dependerá de la naturaleza del hospedador, la manera de introducción del ADN en el hospedador, y si se desea el mantenimiento o integración del episoma.

En general, el ADN es insertado en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación correcta y en el marco correcto de lectura para la expresión. Si es necesario, el ADN puede ser ligado a las secuencias transcripcionales apropiadas y traslacionales de control de nucleótidos de regulación, reconocidas por el hospedador deseado, aunque tales controles en general están disponibles en el vector de expresión. El vector entonces es introducido en el hospedador a través de la técnica usual. En general, no todos los hospedadores serán transformados por el vector. Por lo tanto, será necesario seleccionarlos para las células del hospedador transformado. Una técnica de selección supone incluir una secuencia de ADN, con cualquier elemento necesario de control, que codifica un rasgo seleccionable en el vector de expresión de la célula transformada, como la resistencia a los antibióticos. Por otra parte, el gen para tal rasgo seleccionable puede estar sobre otro vector, que es usa como cotransformador de la célula del hospedador deseado.

Células del hospedador, que han sido transformado por el ADN recombinante de la invención, son entonces cultivadas durante un tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas, conocidas por los expertos en la técnica, a la luz de las enseñanzas reveladas en la presente solicitud, para permitir la expresión del polipéptido, que puede entonces ser recuperado.

Son conocidos muchos sistemas de expresión, incluyendo bacterias (por ejemplo E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), hongos filamentosos (por ejemplo Aspergillus), células de plantas, células de animales y células de insectos.

Los vectores incluyen un réplica procariótica, como el ColE1 Ori, para propagación en un procariota, incluso si el vector debe ser usado para la expresión en otros tipos de célula no procarióticas. Los vectores también pueden incluir un promotor apropiado como un promotor procariótica capaz de ordenar la expresión (transcripción y traslación) de los genes en una célula del hospedador bacteriano, como E. coli, transformada de esa manera.

Un promotor es un elemento de control de expresión, constituido por una secuencia de ADN, que permite que ocurra el vínculo de la polimerasa ARN, y la transcripción. Secuencias promotoras compatibles con los hospedadores bacterianos ejemplares son proporcionadas en vectores de plásmidos que contengan típicamente sitios de restricción de convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención.

Típicos plásmidos de vector procariótico son pUC18, pUC19, pBR322 y pBR329 disponible de Biorad Laboratories, (Richmond, CA, EE.UU.) y pTrc99A y pKK223 - 3 disponible de Pharmacia, Piscataway, NJ, EE.UU.

Un plásmido típico de vector de célula de mamífero es pSVL disponible de Pharmacia, Piscataway, NJ, EE.UU. Este vector usa el SV40 último promotor de expresión directriz de genes clonados, el nivel más alto de expresión encontrado en células productoras de antígeno T, como las células COS - 1.

Un ejemplo de un vector inducible de expresión de mamíferos es pMSG, también disponible de Pharmacia. Este vector usa el promotor inducible por glucocorticoide del virus de tumor mamario del ratón de terminal largo para repetir y dirigir la expresión del gen clonado.

Los vectores de plásmido de levadura útiles son pRS403 - 406 y pRS413 - 416 y en general se encuentran disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son de Yeast Integrating plasmids (Yips) e incorporan los marcadores de levadura para selección HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son de Yeast Centromere plasmids (YCps).

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora transformada con un constructor de vector de polinucleótidos de la presente invención. La célula hospedadora puede ser procariótica o eucariótica. Las células bacterianas son células hospedadoras procarióticas preferentes y son una cepa de E. coli como, por ejemplo, la cepa DH5 E coli disponible de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE.UU., y RR1 disponible de American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, EE.UU. (Nº ATCC 31343). Las células hospedadoras eucarióticas preferentes incluyen levadura y células de mamíferos, preferentemente células de vertebrados como las de ratón, rata, mono o línea de células fibroblásticas de humanos. Las células hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501 que están en general disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Las células hospedadoras de mamíferos preferentes incluyen células de ovarios (CHO) de hámster chino disponibles del ATCC como CCL61, células embrionarias de NIH (NIH, por las siglas de su expresión inglesa, National Institut of Health) de ratón suizo NIH / 3T3 disponibles del ATCC como CRL 1658, y células COS - 1 derivadas de riñón de mono disponibles del ATCC como 1650 de CRL.

La transformación de apropiados hospedadores de células con un constructor de ADN de la presente invención es lograda típicamente por métodos conocidos que dependen del tipo de vector usado. Con respecto a la transformación de células hospedadoras procarióticas, por ejemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 y Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.. La transformación de células de levadura está descrita en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. El método de Beggs (1978) Nature 275, 104-109 también es útil. Con respecto a Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, los reactivos útiles en transfectar tales células, por ejemplo, formulaciones de fosfato de calcio y dextrana DEAE, o liposomas, están disponibles de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA.

La electroporación es también útil para transformar células y es conocida en la técnica para transformar células de levadura, células bacterianas y células de vertebrados.

Por ejemplo, muchas especies bacterianas pueden ser transformadas por los métodos descritos en Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol 2, 637-646, incluidos en la presente invención como referencias. La cantidad mayor de transformantes es recuperada constantemente, luego de la electroporación de la mezcla de ADN - células suspendidas en 2,5X PEB usando 6250V por cm en 25 \mu FD.

Los métodos para la transformación de levadura por electroporación son revelados en Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182.

Células transformadas con éxito, i.e., células que contengan un constructor de ADN de la presente invención, pueden ser identificadas por técnicas conocidas. Por ejemplo, células que resultan de la introducción de un constructor de expresión de la presente invención pueden ser cultivadas para producir el polipéptido de la invención. Las células pueden ser colectadas y lisadas, y su contenido de ADN revisado para determinar la presencia de ADN usando un método como el que está descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 o por Berent et al (1985) Biotech. 3, 208. Por otra parte, la presencia de proteína en el sobrenadante puede ser detectada usando anticuerpos, como se describe más adelante.

Además de ensayar directamente el ADN, exitoso para la presencia de recombinante directamente, la transformación puede ser confirmada por métodos inmunológicos, conocidos cuando el ADN recombinante es capaz de dirigir la expresión de proteína. Por ejemplo, células transformadas con un vector de expresión producen proteínas con éxito exhibiendo antigenicidad apropiada. Las muestras de células sospechosas de estar transformadas son colectadas y ensayadas para determinar la presencia de proteínas usando anticuerpos apropiados.

Por lo tanto, además de las mismas células hospedadoras transformadas, la presente invención también considera un cultivo de esas células, preferentemente un cultivo monoclonal (clonación homogénea), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente.

Se prefiere si las células del hospedador son células de insectos y la expresión es una expresión de baculovirus.

También se prefiere si las células hospedadoras son Pichia pastoris.

Será apreciado que, al ser útil usar las moléculas de HGF variables, o por lo menos polinucleótidos que las codifican en la terapia genética, la invención también incluye métodos para introducir dichos polinucleótidos en las células del paciente.

La invención será ahora descrita en detalle con referencia a los siguientes ejemplos y dibujos en los cuales:

La Fig. 1 muestra la actividad enlazante de heparina y dispersión de MDCK de las siguientes formas t.n.- (tipo natural) y mutante HGF / SF.

Los siguientes mutantes fueron generados sea en la estructura capilar (HP, por las siglas de su expresión inglesa, Hairpin) o kringle 2 (Kr2) de HGF / SF: HP1: R73E, R76E, R93E; HP2: R73E, R76E, K78E; HP3: K91D, R93E, K94D; HP4: L80S, F82Q; HP5: K85E; HP6: D90K Kr2 – 1: H241S, R242E, K244E, R249G y Kr2 – 2: R281G, W282G, Y284A).

a) La expresión de formas de t.n.- y mutante de dHGF/SF: la figura muestra un gel de SDS en condiciones de reducción de proteínas presentes en el sobrenadante de células Neuro 2a transfectadas temporalmente con cDNAs de HGF / SF y marcadas con ^{35}S - cisteína. La emigración de la cadena de 60 kDa A y la cadena 32/34 kDa B está demostrada. Las líneas de control son sobrenadantes de células Neuro 2a transfectadas solamente con el vector. El HPA mutante tiene la estructura capilar completa eliminada (residuos 68-100) y por lo tanto la movilidad de la cadena A está ligeramente aumentada en comparación con t.n.-HGF / SF.

b) Enlace de 20 ng / ml de proteínas dHGF/ISF, t.n. - o mutante; para viales recubiertos con 200 \mug / ml de heparina. Los datos son expresados como porcentajes de t.n. - HGF / SF. La supresión de la estructura capilar (HPA) redujo el enlace de heparina a < 5%. Similarmente, todos los mutantes en los que los residuos de aminoácidos básicos fueron cambiados (HP1, HP2, HP3) indicaban un enlace de heparina enérgicamente reducido. Mutaciones fuera de la superficie positivamente cargada (HP4, HP5, HP6) tenían un efecto menos pronunciado (HP4), o tampoco ningún efecto (HP5 y HP6). La sustitución de aminoácidos positivamente cargados en la superficie de kringle 2 (Kr2 - 1) redujeron el enlace de heparina a un 18% de t.n. - HGF / SF ((tipo natural), mientras que la supresión del bolsillo enlazante de lisina (Kr2 - 2) no tenía absolutamente ningún efecto

c) Dispersión de colonias de MDCK por HGF / SF t.n. - y mutante expresada en células Neuro 2a. Los datos son expresados como porcentajes de t.n.-HGF / SF. La supresión de la estructura capilar (HPA) suprime la actividad biológica pero indica que las mutaciones de aminoácidos positivamente cargados en la estructura capilar tenían efectos variables sobre la actividad biológica. Por lo tanto, el HP1 y los mutantes de HP2 tenían actividades biológicas comparables a t.n.-HGF / SF mientras que la actividad de HP3 mutante era solamente 17 % de la de t.n.-HGF / SF. Los mutantes de kringle 2 indicaban una pérdida grave de la actividad biológica (Kr2 - 1), o ningún cambio (Kr2 - 2).

La Fig. 2. muestra un análisis en BlAcore del enlace t.n.- NK2 y HP1 - NK2 a la heparina inmovilizada.

El panel muestra una capa superpuesta del sensograma de t.n.- NK2 (10-300 nM) enlazantes a una superficie de heparina (340 de capacidad enlazante máximo RU). El panel b muestra un juego correspondiente al sensograma para HP1 - NK2 (10-300 nm) (capacidad de superficie, ca 170 RU). Una capacidad de superficie inferior y un tiempo de inyección más largo fueron usadas para HP1 - NK2 para permitir grandes diferencias en las velocidades de asociación. Los picos al principio y el final de los ritmos de muestra son artefactos que resultan de la resta de las curvas de la superficie en blanco (no indicada) y son atribuibles a errores de cronometraje pequeños sin resolución. El panel C muestra una k_{off} respecto a la concentración (C, nM) y el panel d muestra la dependencia de la constante observada ks respecto a la concentración (C, nM) para t.n.- NK2 (cuadrados rellenos) y HP1 - NK2 (cuadrados en blanco).

La Fig. 3 indica el enlace total de t.n.-HGF / SF y HP1 a células de pulmón de visón.

Está mostrado el enlace total de t.n.-HGF / SF y HP1 para células de pulmón de visón en una placa de 96 viales. La t.n.-HGF / SF muestra una fuerte dependencia de la concentración del enlace con la superficie de células de pulmón de visón (cuadrados rellenos) que pudiera ser comparada junto a la adición de heparina soluble en 0,1 mg / ml (triángulos rellenos). Por contraste, el enlace de HP1 era insignificante a concentraciones hasta 675 ng / ml (cuadrados en blanco) y no estar afectado por la adición de heparina (triángulos en blanco).

La Fig. 4 muestra el enlace de t.n.-HGF / SF y HP1 para una forma soluble del receptor de MET (MET-Fc) y el efecto de t.n.-HGF / SF y HP1 sobre la síntesis de ADN en células de pulmón de visón.

a) Enlace de t.n.-HGF/ISF (barras sólidas) y HP1 (barras abiertas) con una forma soluble del receptor de MET (MET-Fc). El t.n.-HGF / SF o HP1 inmovilizados fueron incubados con 200 ng / ml de MET - Fc y la unión MET- Fc fue detectada con un anticuerpo de IgG anti- humano. El enlace del HP1 mutante fue solamente ligeramente inferior que el de t.n.-HGF / SF.

b) Efecto de t.n.-HGF / SF (barras rellenas) y HP1 (barras en blanco) sobre la síntesis de ADN en células de pulmón de visón. 10,000 células de pulmón de visón con carencia de suero fueron incubadas a las concentraciones mostradas de t.n.-HGF / SF o HP1. Después de 24 horas, fue añadida ^{3}H- timidina y fue medida la cantidad de radiactividad incluida en el ADN en muestras por duplicado. La figura muestra la síntesis de ADN producido por t.n.-HGF / SF o HP1 después de la resta del fondo (^{3}H- timidina incorporada por cultivos incubados en el medio de control). El estímulo inducido por HP1 era solamente ligeramente inferior al inducido por t.n.-HGF / SF.

La Fig. 5 indica el efecto de t.n.-HGF / SF y HP1 sobre la morfología de pulmón de visón y células MDCK.

La figura compara células de pulmón de visón (paneles a, b y c) y de células MDCK (paneles d, e y f) de t en ausencia de los factores (a y d) o después de la incubación durante la noche con 20 ng / ml de t.n.-HGF / SF (b y e) o HP1 (c y f). En los cultivos de control (a y d) las células presentaban una morfología epitelial típica. Los efectos de t.n.-HGF / SF y HP1 sobre la disociación y morfología de las células eran indistinguibles.

La Fig. 6 indica el balance, la distribución de tejidos y actividad in vivo de t.n.-HGF / SF y HP1.

a) Curvas de balance de t.n.-HGF / SF y HPI marcados con ^{125}I de suero de rata. Fueron inyectadas seis ratas adultas, sea con t.n.-HGF / SF o HP1, marcadas con ^{125}I en la vena yugular y se tomaron muestras de sangre a las tiempos indicados. La concentración de t.n.-HGF / SF (cuadrados rellenos) y HP1 (cuadrados en blanco) remanentes en suero (radioactividad TCA insoluble) es mostrada como una fracción de la radiactividad total inyectada. Para cada punto de tiempo el nivel de HP1 mutante en sangre fue al menos 5 veces más alto que para t.n.-HGF / SF.

b) Distribución de t.n.-HGF/ISF y HPI marcados con ^{125}I en tejidos de rata. Dos horas después de la inyección, dos animales fueron sacrificados y, después de la perfusión, algunos órganos (hígado, riñón, pulmón, corazón, bazo, testículos) fueron homogeneizados y medida la cantidad de radiactividad TCA insoluble. El nivel de radiactividad en los tejidos fue 2-3 veces más alto para HP1 que para t.n.-HGF / SF, aunque el patrón de distribución por órganos fue el mismo con las dos proteínas.

c) Estimulación de la síntesis de ADN en hígado de ratón por t.n.-HGF/ISF y HPI. Fueron administrados t.n.-HGF / SF y HP1 por vía intravenosa durante un período de 3 días (dosis total 277,5 \mug / animal espaciados en 5 inyecciones). Al tiempo en cual los animales recibieron la última dosis del factor, fue inyectado BrdU intraperitoneal (75 \mug / g del peso corporal) y 12 horas después los animales fueron sacrificados. Las células marcadas con BrdU fueron contadas en secciones congeladas del hígado (al menos 8 secciones diferentes y un total de 120 campos por animal). Los datos son la \pm DS de la media para 4 (p.-HGF / SF) o 3 (HP1) animales.

La Figura 7 indica la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento de hepatocitos humanos del Nº de acceso P14210 de la base de datos Swiss Prot. Las secuencias de nucleótidos de codificación de HGF o información que se refiera a tales secuencias son dados en Seki et al (1991) Gene 102, 213-219; Miyazawaka et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 967-973; Seki et al (1990) Biochem. Biophys. Res. Comm. 172, 321-327; Nakamura et al (1989) Nature 342, 440-443; Weidner et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7001-7005; Yushiyama et al (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 175, 660-667; y Locker et al (1992) EMBO J. 11, 2503-2510 todas las cuales están incorporadas a la presente solicitud como referencias.

Abreviaturas (por las siglas de sus expresiones inglesas)

EGF (Epidermal Growth Factor): factor de crecimiento epidérmico.

FGF (Fibroblast Growth Factor): factor de crecimiento de fibroblastos.

HB – EGF (Heparin-Binding EGF): EGF enlazante a la heparina.

HGF / SF (Hepatocyte Growth Factor/ Scatter Factor: factor de crecimiento de hepatocitos / factor de dispersión

HSPG (Heparan Sulphate Proteoglycans): proteoglicanos de sulfato de heparano.

MES (2-[N-morfolino]ethane sulfónico acid): ácido (2 - [N - morfolino] etan sulfónico

NK2: una variable truncada de HGF / SF correspondiente a los dominio n terminales, kringle 1 y kringle 2.

SPR (surface plasmon resonance): resonancia plasmon de superficie;

VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor): factor de crecimiento endotelial vascular.

w.t.- (Wild Type) t.n.- tipo natural

Ejemplo 1 HGF / SF mutantes diseñados por ingeniería con un enlace reducido a los proteoglicanos de sulfato de heparano y una actividad mejorada in vivo Sumario

El HGF / SF es un factor de crecimiento, polipéptido de alto peso molecular, enlazante a la heparina, el cual tiene un papel importante en el desarrollo y regeneración de tejidos de los mamíferos. Para identificar los aminoácidos involucrados en el receptor o enlace de heparina, hemos creado por ingeniería un número de mutantes de HGF / SF, en los que han sido sustituidos algunos grupos de residuos accesibles a solventes en la estructura capilar del dominio terminal N o en kringle 2. Dos de los mutantes (HP1: R73E, R76E, R93E y HP2: R73E, R76E, K78E) eran de particular interés ya que presentaban una afinidad enormemente reducida por heparina, pero plenas actividades mitogénica y motogénica en células objetivo en cultivos. La afinidad de HP1 hacia la heparina era más de 50 veces inferior comparada con la del HGF / SF de tipo natural, cuando se estableció de la cinética enlazante de los fragmentos NK2 de las dos proteínas. El cambio en la afinidad en HP1 era el resultado de una disminución en velocidades reales (\sim 5 x 10^{4} M^{-1}s-^{1} respecto a 1,75 x 10^{6} M^{-1}s-^{1}) y en paralelo en enlace reducido a superficie de la células y proteoglicanos de sulfato de heparano de matriz. Diferencias importantes fueron observadas in vivo en el comportamiento de HGF / SF tipo natural y HP1: la proteína mutante presentaba un balance retrasado en sangre, niveles más altos en tejidos y una actividad más alta en 2,7 veces en producir la síntesis de ADN en hígado normal de roedor adulto. Por lo tanto, hemos creado por ingeniería formas mutantes de HGF / SF que en virtud de una afinidad reducida hacia el sulfato de heparano, presentan una actividad mayor in vivo. Estos resultados tienen implicaciones para comprender el papel de los proteoglicanos de sulfato de heparano en la actividad de HGF / SF y para aplicaciones terapéuticas del factor de crecimiento.

Para diseccionar el receptor y los sitios enlazante de la heparina en el HGF/ISF, generamos modelos en tres dimensiones de los dominios individuales (29) para ayudar a diseñar varios mutantes de HGF / SF específicos al sitio. Las estructuras disponibles por rayos X de la antitrombina (30) y complejos de FGF - heparina (31) demuestran que los sitios enlazantes de heparina están compuestos principalmente de clusters positivamente cargados de residuos que hacen contacto electrostático con grupos cargados negativamente en el glicosaminoglicano. Por consiguiente examinamos la superficie de la estructura capilar y kringle 2 de HGF / SF buscando grupos de aminoácidos cargados positivamente, identificamos tres de tales grupos (dos en la estructura capilar y uno en kringle 2) e introdujimos mutaciones específicas en estos sitios.

Materiales y métodos Líneas celulares

Las líneas celulares fueron compradas en ATCC o descritas anteriormente en (7) y (32). Las células fueron crecidas de forma regular en DMEM complementado con suero al 10% de ternero fetal a 37ºC y CO_{2} 10%.

Mutagénesis in vitro de la estructura capilar y de kringle 2

Un oligonucleótido de doble hebra (5'-CA CAG TCA GGA CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAA GGA TCC TCT AGA GGT AC-3') que codifica seis residuos de histidina y un stop codon fue clonado en el sitio de restricción del fragmento Kpn I de los 2,2 kb Bam HI / Kpn I cDNA de HGF / SF. En los experimentos iniciales, fue usado un cDNA de t.n.-HGF / SF de codificación fusionado a una etiqueta de hemaglutinina terminal C - (26). Para la generación de mutantes de punto de la estructura capilar o de la kringle 2, las sustituciones de codon fueron introducidas en el cDNA soldando bases disparejas en las reacciones de PCR. Los fragmentos de PCR fueron reproducidos en el cDNA y las mutaciones confirmadas por ordenación en serie. Los mutantes de punto generados de este modo son posiciones en una lista de la leyenda de la Fig. 1. Para la supresión de la estructura capilar, un sitio adicional de restricción Pst I fue creado en nt 300 y, por digestión parcial, fue eliminado un fragmento que codificaba los aminoácidos 68 a 100 de HGF / SF.

Expresión transiente de HGF / SF t.n. y mutante en células Neuro 2a

El cDNAs que codifica los HGF / SF mutantes (10 \mug cada) fueron temporalmente transfectados en células Neuro 2a como se describió en (26). Por precipitación inmunológica, un día después de la transfección las células Neuro 2a fueron marcadas toda la noche con 20 \mu Ci / ml de cisteína ^{35}S (Amersham) y HGF / SF fue sometido a precipitación inmunológica del sobrenadante (1,5 ml) usando 2 \mug de anti- HGF / anticuerpo de SF (clon 34) y 100 ml de cuentas de 4B Sepharose proteína A-. El precipitado fue lavado tres veces con 50 mM de Tris - CI pH 8,5, 100 mM de NaCl, 1 milímetros EDTA, 1 mg / ml ovalbúmina y 5 X g / l de Triton X-100 y usado para electroforesis por gel de SDS y análisis de fosfoimager.

Expresión de t.n.-HGF / SF y HP1 de longitud normal en células de insectos

Para la producción a gran escala de t.n.-HGF/ISF y HP1 los cDNAs correspondientes fueron unidos a una etiqueta de histidina con terminal C y reproducido en el pVL 1393 del vector del expresión Baculovirus. El virus recombinante fue generado por cotransfección de 2 \mug de la expresión de plásmido y 0,5 \mug de Baculogold - ADN (Pharmingen, La Jolla, USA), plaquetas purificadas, propagado y usado para contagiar lotes de 5 litro de células SF9. t.n.-HGF/ISF y HP1 fueron purificados del sobrenadante después de una diálisis extensiva en contra de PBS y cromatografía de afinidad en columnas de 5 ml de quelato de Ni^{2+} (Qiagen, Alemania) usando una pendiente lineal de imidazol (0 - 0,4 M en NaCl 0,1 M 50 mM de MES de pH 6,0) seguido por cromatografía de intercambio catiónico (8). La pureza de las preparaciones era típicamente 80-90% de Coomassie geles SDS impregnadas.

Expresión de t.n.- NK2 y HP1 - NK2 en P. Pastoris

cDNA codificando t.n.- NK2 o HP1 - NK2 fueron generados por amplificación de PCR de un cDNA de HGF / SF humano y clonados al vector en la expresión 9K pPIC de P pastoris (Invitrogen Inc.) creando una fusión en marco con el péptido á-apareado de señalización marcado por S cerevisiae. Los plásmidos 9K pPIC recombinantes linearizados, codificando los plásmidos t.n.- NK2 y HP1 - NK2, fueron usados para la transformación del GS115, cepa his de P. Pastoris por esferoplasting. Los clones transformados fueron seleccionados inicialmente sobre placas His y posteriormente sobre placas de G418 para integración por multicopias (33). Los clones seleccionados fueron usados para la expresión de las proteínas recombinantes a gran escala en matraces de agitación. El sobrenadante de los cultivos fue colectado 72 horas después de la inducción y el sobrenadante fue aclarado por centrifugación seguida por filtración. El t.n.- NK2 fue purificado inicialmente sobre heparina - Sepharose 4B (Pharmacia) seguido por cromatografía de intercambio iónico en Sepharose S (Pharmacia) usando una pendiente de NaCl (0,25 - 1,00 M) en MES 0,05 M, pH 6,0. El HP1 - NK2 fue purificado directamente por cromatografía de intercambio iónico en Sepharose S. Especies de monómeros y de dímeros de t.n.- NK2 y HP1 NK2 fueron evaluados por cromatografía de exclusión por tamaños en una columna de Superdex 75 (Pharmacia) en búfer, 0,05 MES NaCl 0,25 M, pH 6,0. El rendimiento de la proteína biológicamente activa estuvo entre 5-10 mg / litro.

ELISA de Heparina y MET

Para ELISA de heparina, placas de 96 viales (Nunc, Multisorp) fueron incubadas con 200 \mul / vial de heparina de alto peso molecular (200 \mug / ml, Sigma H3393). Después del bloqueo, el HGF / SF purificado y los sobrenadantes de células Neuro 2a expresando proteínas HGF / SF t.n.- y mutante fueron incubados durante 2 horas y detectados sea con anticuerpo HA11 de anti etiqueta de conejo (diagnósticos Hiss) o con un anticuerpo monoclonal de ratón anti
- HGF / SF (clon 34), seguido por incubación con un segundo anticuerpo conjugado con HRP. Para ELISA de MET, una proteína soluble de fusión que consta de dominio(s) extracelular(es) MET y el vínculo, fueron producidos el dominio CH_{2} y CH_{3} de \gamma-inmunoglobulina (GH, resultados sin punbicar) y purificados usando cromatografía de afinidad
- 80% homogeneidad por Sepharose de proteína A. Los viales fueron cubiertos con t.n.-HGF / SF de longitud normal o HP1 durante una noche a 4ºC, bloqueados, y fue añadida la proteína de fusión MET-Ig (200 ng / ml) durante 2 horas, seguido por incubación con anticuerpo de cabra IgG anti- humano y anticuerpo de conejo IgG anti-cabra conjugado con HRP. Para el desarrollo de color se usó 0,66 mg / ml de orto – fenil diamina en 50 mM de búfer de fosfato de pH 6,0 como sustrato de HRP (100 \mul / vial).

Cinética enlazante de heparina t.n.-HGF/ISF de longitud normal y HP1, y sus fragmentos NK2

El análisis cinético del enlace proteínas de tipo natural y mutante fue llevado por resonancia de plasmon de superficie (SPR) usando un instrumento BlAcore 2000 (BIAcore Ltd., St. Albans, Herts., R.U.). 10 mg / ml de heparina de alto peso molecular (Sigma H3393) fue biotinilado con un exceso tres veces de LC – NHS biotin de la (Pierce 21336) en 1 ml de búfer de fosfato de 100 mM, pH 8,0, durante 1 hora a RT. Heparina biotinilada fue separada de derivados de biotin libre por pasaje secuencial a través de dos columnas de 2 ml de Excellulose (Pierce) y usada para capturar en la superficie preferentemente chips sensores recubiertos de estreptavidina SA. Todos los experimentos fueron llevados a cabo a una temperatura de operación de 25ºC. El búfer del experimento (EB) en todos los experimentos fue PBS que contenía 0,2 mM EDTA, 0,5 g / l de NaN3 0,05 de g / l (BlAcore Ltd). Para prevenir la fuga posible de heparina de las superficies de prueba (2-4 de celdas a flujo) a un control (1 celda a flujo), la superficie 1 fue bloqueada con dos inyecciones de 20 \mul de 250 ng / ml de biotina en EB a una velocidad de flujo de 5 \mul / min. La superficie 2 fue cubierta entonces a razón de 5 \mul / min. con 10 ml de 2 nM heparina - biotin en EB. Aproximadamente 25 RU fue unidos en este ejemplo; debido a que podía ocurrir un pequeño aumento en la señal debido a la reticulación de la dextrana por las moléculas de largas heparina, no fue posible un cálculo aproximado exacto del salto de heparina a niveles bajos. La superficie fue bloqueada entonces con biotin en cuanto a la superficie 1. Para prevenir la absorción o desnaturalización de las muestras de proteína para el análisis de SPR, éstas eran diluidas con regularidad en BSA con 0,2 mg/ml de EDTA que habían sido preabsorbidos en heparina - Sepharose 4B (Pharmacia Biotech, St. Albans) durante 30 min. A temperatura ambiente en 0,2 mg / ml. Para el análisis de diversas proteínas, las muestras fueron bombeadas a 15 \mu l / min. La regeneración de la superficie fue realizada con "QUICKINJECT / EXTRACLEAN" secuencial de 10 \mul de 0,1 SDS de g / l en agua seguido por 2 x 10 \mul de NaCl 1M. Finalmente 15 ml de 0,2 mg / ml de BSA en EB fue inyectado para bloquear cualquier sitios no específico enlazante. Los datos de los experimentos automáticos fueron analizados con ajuste por regresión no lineal de las curvas (34) usando el BlAcore BlAevaluation software (BlAcore Ltd). Las concentraciones de proteína eran determinadas con el reactivo BCA (Pierce) y la actividad biológica de cada grupo de proteína confirmada en el ensayo MDCK (7) para asegurar la actividad específica consiguiente.

Ensayos biológicos de células

Los ensayos de colonias en células MDCK y de pulmón de visón fueron llevados a cabo como anteriormente se describió (7). Para la medición de la síntesis de ADN, las células de pulmón de visón fueron colocadas en placas a una densidad de 5.000 - 10.000 células / vial en placas de 24 viales, se eliminó el suero y se incubaron en DMEM durante 48 horas. Entonces fueron añadidas concentraciones diferentes de HGF / SF y HP1, y la incubación continuó durante 24 horas en DMEM que contenía 100 \mug / ml BSA antes de la adición de ^{3}H- timidina (1 \muCi / vial), y posteriormente se sometió a una incubación final durante 16 horas. La radiactividad insoluble en 5% TCA fue medida por centelleo contando después de la solubilización en NaOH 0,2 m.

Enlace total de t.n.-HGF / SF y HP1 a células de pulmón de visón

Células de pulmón de visón fueron crecidas a confluencia en placas de 24 viales. Después de dos lavados con el medio, las células fueron incubadas a 4ºC durante 30 minutos. Las diluciones en series de HGF / SF y HP1 en PBS fueron entonces añadidas a las células e incubadas durante otros 15 minutos a 4ºC. El factor sin unir fue retirado con tres lavados de PBS y las células se fijaron con para-formaldehído al 4% en PBS. Después de dos lavados adicionales las células fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal anti HGF / SF de ratón (clon 34) que reaccionó de una manera idéntica con t.n.-HGF / SF y HP1, seguido por incubación con anti-ratón IgG conjugado con FITC.

Balance y distribución de tejidos de t.n.-HGF / SF y HP1 en ratas

10 \mug de HGF / SF y HP1 puros fueron yodinados por un método en fase sólido que usa lodogen (Pierce) por Bi otez, Berlín, Alemania. Después de la reacción, fue añadido 1 mg / ml BSA y el yodo libre fue retirado por filtración múltiple en un aparato de filtración Centrisat (Sartorius) con un corte a 30 kDa. Las actividades específicas fueron calculadas resultando 1,85 MBq / mg para HGF / SF y 1.95 MBq / mg para HP1. Las actividades biológicas de las proteínas antes y después de la yodinación fueron comparadas en un ensayo de motilidad usando células MDCK y determinadas resultando 80% después de la yodinación. Ratas adultas (3 por grupos) fueron anestesiadas, un catéter implantado en la vena yugular y fue administrada una sola inyección bolus iv de 0,2 ml de ^{125}I - HGF / SF (por animal 0,45 MBq para t.n.-HGF / SF y 0,38 MBq para HP1). Después de 1, 3, 5, 7, 10 y 60 mins, 2 horas y 20 horas, fueron tomadas muestras de 200 \mul de sangre vía el catéter. La sangre fue dada coagular y centrifugada a 10.000 g durante 5 minutos a 4ºC. Por cada muestra 100 \mul fueron diluidos con un volumen igual de PBS y fueron añadidos 2 ml helados al 10% de TCA. Después de 30 minutos sobre hielo, las muestras fueron centrifugadas y el precipitado lavado con TCA al 5% antes del conteo. Para la medición de la radiactividad en tejidos, los animales fueron sacrificados 2 horas después de la inyección de t.n.-HGF / SF o HP1, marcados con ^{125}I y fueron perfusados con PBS. Los órganos fueron sacados, pesados, homogeneizados y determinada la cantidad de radiactividad precipitatable de TCA.

Efecto de t.n.-HGF / SF y HP1 sobre la síntesis de ADN en hígado para adultos

Fue determinada la habilidad del HGF / SF tipo natural y HP1 para producir la síntesis de ADN en células de hígado, seguido a la administración intravenosa de proteínas recombinantes y células marcadas con BrdU. Brevemente, animales de sexo femenino (de 6-8 semanas; 19,5 a 26,9 g de peso corporal) fueron inyectados dos veces diariamente sea con PBS, HGF / SF tipo natural o HP1 en la vena de la cola (55,5 \mug / dosis) durante tres días. Al tiempo de la última inyección del factor, cada animal recibido BrdU (75 \mug / g de peso corporal) fue inyectado intraperitoneal y 12 horas después los animales fueron sacrificados, el hígado fue diseccionado y fueron preparadas secciones congeladas. Las secciones fueron arregladas en etanol al 70% (5 min.), tratadas con HCI 2,4 M durante 10 min a 37ºC y los núcleos que habían incluido BrdU fueron impregnados con el anticuerpo anti- BrdU (Sigma, 1: 400) seguido por IgG anti
- ratón conjugado con peroxidasa - (laboratorios Jackson, 1: 500).

Resultados Estructura capilar y mutantes de kringle 2 de HGF / SF

El dominio terminal N de HGF / SF contiene cuatro residuos de cisteína que son conservados en el HGF1 / MSP de homólogos de HGF / SF y plasminógeno. Estudios sobre plasminógeno (35) indicaron que este dominio constituía una estructura capilar estabilizada por dos enlaces disulfuro. Un modelo tridimensional de la estructura capilar de HGF / SF sugiere la presencia de varios residuos positivamente cargados que estaban ausentes en los modelos de HGF1 / M.S.P. y plasminógeno (29). Seis mutantes de punto diferentes de la estructura capilar de HGF / SF fueron construidos (HP1 a HP6) en los que un total de 10 residuos de aminoácidos fueron sustituidos. La estrategia involucró la mutación de respuesta positiva a negativa, negativa a positiva y de hidrófobo a polar (véase la leyenda a la Fig. 1 para la secuencia de los mutantes). La actividad de estos mutantes de punto fue comparada con los de HGF / SF de tipo natural y HPA, un mutante en el que el toda la estructura capilar (aminoácidos 68 a 100) había sido eliminada. Además, dos mutantes múltiples kringle 2 fueron formulados: en mutantes Kr 2-1 un grupo de cuatro residuos seguros preferentemente de kringle (H241, R242, K244 y R249) fueron mutados; en Kr 2-2 mutantes tres residuos fueron mutados (R281, W282 y Y284) que habían sido predicho para formar un bolsillo hidrófobo preferentemente de kringle 2, similar a uno presente en el plasminógeno de kringle 4 (29).

Para los estudios iniciales, los mutantes fueron expresados por transfección transiente en la línea de células Neuro 2a (Fig. 1 a) y caracterizados para el enlace de heparina (Fig. 1 b) y actividad biológica (Fig. Lc). Como cabía esperar HPD, el mutante privado de la estructura capilar, no presentaba el enlace de heparina ni la actividad biológica. Los mutantes de punto entraron en tres grupos diferentes: el grupo 1 (HP1, HP2 y HP4) exhibieron actividad normal de señalización pero muy reducida (HP1 y HP2) o reducida (HP4) heparina enlazante; el grupo 2 (HP3) indicaba una pérdida grave tanto en actividad de señalización y enlazante heparina - y el grupo 3 (HP5 y HP6) se comportó esencialmente como HGF / SF de tipo natural (Fig. 1 b y c). El primer mutante kringle 2, Kr 2-1 indicaba seriamente respecto a la actividad inducida enlazante de heparina y biológica mientras que el segundo, Kr 2-2, era indistinguible de t.n.-HGF / SF (Fig. 1b y c). De estos resultados podemos llegar a la conclusión de que un primer grupo de clusters de residuos positivamente cargados en la estructura capilar (R73, R76) está involucrado en la actividad enlazante de heparina pero no en MET y que los residuos R281, W282 y Y284 no están involucrados en ninguna. También parece que dos grupos adicionales de residuos positivamente cargados, uno en la estructura capilar (K91 y K94) y uno en kringle 2 (H241, R242, K24 y 249 de R) pueden participar tanto en el enlace MET como en el de la heparina.

Cinética de enlace de t.n.-HGF / SF, HP1 y sus fragmentos NK2 a la heparina

p.-HGF / SF y HP1 de longitud normal (uno de los dos mutantes que mostraban una actividad considerablemente reducida de enlace a la heparina, aunque normal actividad biológica) fueron expresados en células de insectos a fin de analizar su cinética de enlace a la heparina por resonancia plasmon de superficie (SPR). Estos experimentos revelaron diferencias importantes en la cinética de enlace del HP1.

El enlace a la heparina de t.n.-HGF / SF (4 a 30 nm) reveló una constante de velocidad de disociación (k_{off}) de primer orden de \sim 1 x 10^{-3} s^{-1}. La mayor parte del enlace durante la asociación podía ser conveniente ajustada a un modelo de un solo sitio con una constante de velocidad de asociación (k_{on}) de \sim 1 x 10^{6} M-1s^{-1}, dando una constante de disociación molar (Kd) \sim 1 x 10^{-9} M-1s^{-1}. HP1 (4 a 80 nm) mostró un enlace muy reducido a la heparina (los datos no se muestran). Sin embargo, consideramos que la diferencia observada entre t.n.-HGF / SF y HP1 podría haber sido afectada por la presencia de formas diméricas u oligoméricas de las dos proteínas, un punto que no podía ser establecido debido a la baja recuperación de las columnas de exclusión por tamaños. Por consiguiente, expresamos los fragmentos NK2 de t.n.-HGF / SF y HP1 (esto es, que todos los dominios mostraron estar involucrados en el enlace de heparina, Mizuno et al., 1994) en la levadura metilotrópica P. pastoris y usados éstos para un análisis cinético adicional. t.n.- NK2 y HP1 - NK2 purificados del sobrenadante de los cultivos de P pastoris constaron de una mezcla de monómeros y dímeros de NK2 que podían ser separados fácilmente en columnas de Superdex - 75, permitiendo que la cinética enlazante para heparina fuera establecida con especies monoméricas bona fide.

Las capas superpuestas de los sensogramas de enlaces a la heparina de t.n.-NK2 (Fig. 2a) y HP1 - NK2 (Fig. 2b) confirman diferencias muy importantes en el enlace de heparina. Para t.n.-NK2, las curvas de disociación fueron más lentas a concentraciones más altas y los valores aparentes de k_{off} cambiaron entre 1 y 4 x 10^{-3} s^{-1} (Fig. 2c cuadrados rellenos). Por el contraste, la disociación de HP1 - NK2 (Fig. 2b) aumentaron con la concentración a un valor aparente de k_{off} de 6-7 x 10^{-3} s^{-1} (Fig. 2c cuadrados en blanco). El análisis de la fase de asociación de t.n.-NK2 (Fig. 2a) muestra una cinética compleja. Asumiendo una clase sola de sitios enlazantes y tomando los datos de la fase más temprana (más rápida), la dependencia de la constante de velocidad de asociación observada ("Ks") respecto a C para las concentraciones hasta 300 nm dio a una línea recta (r^{2}= 0,997) de la que calculamos k_{on} de 1,75 x 10^{5} M-1s^{-1} (Fig. 2d cuadrados llenos). En etapas posteriores del enlace, era discernible una segunda fase con una relación mucho más lenta, pero los intentos de ajustar los modelos sobre la base de dos clases de sitios enlazantes resultaron inadecuados. Tomando el valor más rápido para k_{off} de 4 x 10^{-3} s^{-1}y un valor para k_{on} de 1,75 x 10^{6} M-1s^{-1}, fue calculado un valor de K_{d} de 2,3 nm para t.n.-NK2.

Para HP1 - NK2, el análisis de la fase temprana de enlace (asumir la presencia de una clase sola de sitios enlazantes) dio un valor k_{on} de \sim 5 x 10^{4} M^{-1}s^{-1} de la dependencia de K_{S} respecto a C (Fig. 2d cuadrados en blanco). Esta figura lo fue \sim 35 veces inferior que para t.n.-NK2. Tomando un valor de 6 x 10^{-3} s^{-1} para k_{off} (Fig. 2c cuadrados en blanco), fue calculado un K_{d} de 120 nm para HP1 - NK2. La afinidad enlazante de HP1 - NK2 está por lo tanto sobre 50 veces menor que para t.n.-NK2.

Enlace de t.n.-HGF / SF y HP1 a HSPG y MET y actividad de las dos proteínas sobre células objetivo in vitro

El enlace de t.n.-HGF/SF y HP1 a la superficie de células y sulfatos de heparano de matriz fue investigada en algunos tipos de célula, incluyendo las líneas de carcinoma HepG2 y Hep3B y células de pulmón de visón. El último recientemente ha sido demostrado que enlaza grandes cantidades de HGF / SF y sus formas truncadas NK1 y NK2, vía HSPG (36). Por inmunofluorescencia, el enlace total de HP1 a HepG2, Hep3B y células de pulmón de visón era muy inferior al de para t.n.-HGF / SF (los datos no se muestran). Estos resultados fueron confirmados y extendidos por ensayo en fase sólida cuantitativa y a un experimento representativo, ilustrando el enlace de t.n.-HGF / SF y HP1 de longitud normal a células de pulmón de visón, está mostrado en la Fig. 3 que el enlace total de t .n.-HGF / SF para células de pulmón de visón aumentó regularmente de 10 a 675 ng / ml, mientras que el enlace de HP1 era apenas medible sobre el mismo intervalo de las concentraciones. Heparina exógena (0,1 mg / ml) compitió eficazmente por el enlace con t.n.-HGF / SF a las células y lo redujo a niveles solo ligeramente más alto que los de HP1. Este confirma que la mayor parte del enlace de t.n.-HGF / SF con células estaba relacionada con HSPG, y que HP1 falló en el enlace a tales moléculas.

En notable contraste con el enlace reducido de HP1 a la heparina y a HSPG asociado a células, el enlace de HP1 a una forma soluble del receptor MET y su habilidad para producir el estímulo de síntesis de ADN en células de pulmón de visón fueron solamente ligeramente inferiores que el de t.n.-HGF/SF (Fig. 4a y 4b respectivamente). Resultados similares fueron obtenidos con la línea MK de keratinocito de ratón (los datos no están mostrados). Igualmente, la habilidad de HP1 para inducir la disociación y la dispersión de células de pulmón de visón y células MDCK era indistinguible de la de t.n.-HGF / SF (compárense el panel b respecto a c, y e respecto a f en la Fig. 5). Por lo tanto, a pesar de un decrecimiento considerable en la afinidad enlazante a la heparina y HSPG, la habilidad del mutante HP1 para inducir la síntesis de ADN y el movimiento de células sobre células objetivo fue indistinguible de la de t.n.-HGF / SF.

Actividad in vivo de t.n.-HGF / SF y HP1

Investigamos el efecto de la mutación de HP1 sobre el comportamiento in vivo del factor. Para esto, t.n.-HGF/SF y HP1 fueron etiquetados con ^{125-}I e inyectados en la vena yugular de ratas adultas. La concentración de las dos proteínas en suero y en algunos órganos entonces fue determinada en forma de radiactividad TCA - insoluble. La Fig. 6a muestra la curva de balance HGF / SF y HP1 de suero. En concordancia con estudios previos (23, 37, 38), observamos un balance rápido de t.n.-HGF / SF del flujo (> 98% terminado en los primeros 15 minutos). El balance de HP1 fue mucho más lento y, en cada valor de tiempo evaluado, la concentración de HP1 en plasma fue en 5-10 veces más alta que la de t.n.-HGF / SF hasta 20 horas después de la inyección (Fig. 6a).

El balance más lento de HP1 en suero fue relacionado con una cantidad aumentada del factor mutante en algunos órganos incluyendo hígado, riñón, pulmón, corazón, testículo y bazo (Fig. 6b). La respectiva distribución del mutante HP1 y t.n.-HGF / SF entre órganos diferentes fue similar, pero la concentración de HP1 fue en 2-3 veces más alta que t.n.-HGF / SF (Fig. 6b). La habilidad de t.n.-HGF / SF de producir la síntesis de ADN en hígado para adultos fue investigada después de la inyección intravenosa de las dos proteínas. Como era de esperar, en ausencia de los factores, la síntesis de ADN fue muy baja, pero aumentó sustancialmente después de la administración de HGF/SF o HP1 (Fig. 6c). Sin embargo, el estímulo con HP1 fue en 2,7 veces más alto que con t.n.-HGF / SF (Fig. 6c) según el nivel aumentado del factor en suero y hígado (Fig. 6a y 6b).

Discusión Sitios enlazantes de heparina y del receptor de HGF / SF

Los estudios previos habían mostrado que la estructura capilar de los dominios de terminal N de HGF / SF es importante tanto para la heparina (24), como para el enlace del receptor (25-28). En este estudio, mostramos que los sitios enlazantes de heparina y receptor de HGF/ISF pueden ser separados por ingeniería de proteínas y que formas mutantes de HGF / SF con enlace de heparina muy reducido tienen in vivo una actividad biológica superior. Dado que los mutantes tanto el HP1, como de HP2 tenían muy reducida la afinidad hacia la heparina, pero con actividades biológicas comparables a la del t.n.-HGF / SF en células objetivo en cultivo, sugerimos que las mutaciones en común (R73E y R76E) sean importantes para el enlace de heparina, una conclusión respaldada por la caracterización preliminar del mutante doble R73E, R76E. Por contraste, la sustitución de un segundo grupo de residuos positivamente cargados en la estructura capilar (K91, R93 y K94) o de un grupo distinto de residuos positivamente cargados en kringle 2 (H241, R242, K244 y 249 R), abolió tanto el enlace de heparina como la señalización de HGF / SF en células objetivo. Notamos que la mutagénesis de escaneo de alanina del dominio terminal N de HGF / SF (39) falló en identificar residuos en la estructura capilar esencial para MET enlazantes y la señalización. Esto puede ser debido a que las sustituciones múltiples de residuos vecinos en la estructura capilar (como uno que hemos presentado) son requeridas para producir cambios mensurables. El grado de actividad enlazante de heparina no fue informado por Lokker et al (39).

Cinética enlazante de t.n.-HGF / SF y su fragmento NK2 a la heparina

Nuestros datos indican que t.n.-HGF/SF de longitud normal une la heparina con alta afinidad (K_{d} = - 1 nM). Esta figura se puede comparar con un valor de 0,6 nM de un estudio separado en el que enlace de t.n.-HGF / SF de longitud normal a heparina ^{35}S fue medida siguiente a la separación de la heparina ^{35}S unida y libre por ultrafiltración (23). Para asegurar que la cinética medida resultada de la interacción de las especies de proteína monoméricas con heparina (y por lo tanto, establecer la cinética exacta para el HP1 mutante) nosotros dependíamos de los fragmentos NK2 monoméricos expresados en P pastoris. La disociación cinética de t.n.-NK2 reveló un efecto importante sobre los valores aparentes de k_{off} a las concentraciones más altas de proteína, lo que sugerían el enlace cooperativo de NK2 a heparina (los datos no se muestran). El análisis de la estequiometría en o cerca de la saturación indica el enlace de aproximadamente 4 moléculas de t.n.-NK2 por heparina de 16 kDa. Ciertos cálculos menos aproximados para t.n.-HGF / SF sobre superficies bajas de heparina proporcionan un valor de 3,5 moléculas de HGF / SF por molécula de heparina. Éstos valores indican que el sitio enlazante de heparina de NK2 y HGF / SF abarca 14 unidades de monosacáridos, que es consistente con las conclusiones de Lyon et al. (40) quien informó que los fragmentos de sulfato de heparano de 12-14 unidades eran requeridos para el enlace de alta afinidad al HGF/ISF.

La constante de disociación de molar de HGF / SF de longitud normal para heparina (Kd = 1 nm) se puede comparar con un valor de 50 nm obtenido para la interacción de FGF acídico y heparina bajo condiciones experimentales similares (41). Las velocidades de HGF/SF y FGF son similares (1,75 respecto a s - 1 de M-1 de 1,0 x 10^{6} M^{-1}s^{-1} 106 respectivamente) y la diferencia en la afinidad es atribuible a la velocidad k_{off} (1 x 10^{-3} s^{-1} respecto a 6 x 10^{-2} s^{-1} para HGF / SF y FGF). La afinidad reducida para heparina de HP1 ha sido conseguida reduciendo la velocidad k_{on} (Fig. 2d), un resultado de acuerdo con el papel emergente de las interacciones electrostáticas sobre las velocidades de asociación (42).

Papeles diferentes para sulfatos de heparano en sistemas HGF / SF y FGF

El mutante de HP1 ha proporcionado una cierta comprensión sobre el papel de del enlace de heparina en la actividad de HGF/SF. HGF/SF es uno de varios factores de crecimiento que enlazan a HSPG, pero el papel del sulfato de heparano en la actividad del factor de crecimiento en general no está claro, excepto en el caso de FGF. Con FGF hay pruebas de que tres componentes ( enlazante, receptor y sulfato de heparano) son requeridos para la señalización. Esta conclusión es respaldada por experimentos de transfección (2,3) y estudios bioquímicos con componentes purificados (43). HSPG actúan probablemente dimerizando FGF por lo tanto, promocionar la dimerización de receptor y señalización (44), una interpretación consistente con estructuras recientes de complejos FGF - heparina (31).

Nuestros resultados indican un papel diferente para el HSPG en el sistema HGF / SF. Aunque otras estudios sugirieren que la heparina aumenta la actividad de HGF / SF y el NK1 y los fragmentos NK2 sobre células en cultivo (36), descubrimos que el enlace de receptor y la actividad biológica del HP1 mutante son esencialmente indistinguibles de la de t.n.-HGF/SF a pesar de una pérdida > 50 veces en el enlace de heparina.

Nuestros resultados, sin embargo, plantean la cuestión acerca de la función fisiológica del enlace de HGF/SF a HSPG. Los datos in vivo presentados aquí indican un papel para HSPG en promocionar la interiorización y degradación de HGF / SF en tejidos (Fig. 6a y 6b). Por tanto, los HSPG podrían representar unos medios de balancear HGF / SF in vivo. Efectivamente, hay un paralelo sorprendente entre la actividad de HP1 incrementada para la síntesis de ADN en hígado (Fig. 6c) y el nivel incrementado del factor en el tejido (Fig. 6b). Es posible especular sobre los otros papeles posibles de HSPG. Por ejemplo, los HSPG pueden ayudar a localizar HGF/ISF a la célula seleccionada o a compartimentos de tejidos, como se requiere para el establecimiento de un "gradiente morfogénico" durante la embriogénesis (45,46). Un ejemplo de este proceso podría ser un miembro en desarrollo, donde la migración de células de precursor miogénico en el brote es conocido que depende de forma crítica y conocida de HGF/ SF (47).

Aplicaciones in vivo de HGF / SF mutantes deficientes en heparina

Recientemente ha habido un interés considerable en las aplicaciones terapéuticas potenciales de HGF / SF y diversos estudios se han dirigido a satisfacer la pregunta referente a la macrocinética del factor de crecimiento in vivo. Los resultados de estos estudios indican que el HGF / SF experimenta un balance por eliminación muy rápidamente de la circulación (23, 37, 38), y que el período de semidesintegración del factor de crecimiento en plasma podría ser extendido por acomplejamiento de éste con heparina (23) o con otros polianiones, como los sulfatos de dextrana (48). El HGF / SF infundido en forma de un complejo con sulfato de dextrana también tenía una actividad significativamente más alta en producir la proliferación de hepatocitos en animales adultos (48). Nuestro trabajo demuestra que resultados iguales o superiores pueden ser conseguidos con las formas de HGF / SF creadas por ingeniería, como el mutante de HP1. El mutante tiene un tiempo de residencia más largo en la circulación (la Fig. 6a), niveles mayores en tejidos (Fig. 6b) y es más activo de lo que es el t.n.-HGF / SF en inducir la síntesis de ADN en hígado para adultos (Fig. 6c). Por consiguiente vence la necesidad de acomplejar HGF / SF con compuestos semejante a la heparina a fin de mejorar su farmacocinética y actividad.

Aunque está bien establecido que los factores de crecimiento de polipéptidos ejercían sus efectos sobre células objetivo, vía receptores específicos de membrana (1), ha quedado claro en los últimos años que un número de estas proteínas también unen superficies de célula y proteoglicanos de matriz, especialmente del tipo de sulfato de heparano (HSPG). El significado biológico de esta interacción doble es comprendido bien en la caso del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Las células expresan el receptor de FGF, pero el sulfato de heparano falla en su unión a la membrana en responder al FGF básico (2,3) implicando al sulfato de heparano como un coreceptor esencial para la señalización del FGF. Otros factores de crecimiento, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) amfiregulina, relacionado con polipéptidos (4) y el EGF (HB - EGF) de enlace con la heparina (5), tan bien como varias variables de empalme del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (6) también requieren del sulfato de heparano unido a las células para su actividad, aunque el papel de los HSPG en estos sistemas está menos definido.

El factor de crecimiento de hepatocitos / factor de dispersión (HGF / SF) (7-12) es un polipéptido, factor de crecimiento, de alto peso molecular distinto de los otros y con una estructura de dominio relacionado con la del plasminógeno precursor de la proteinasa de la sangre. De la misma manera que el plasminógeno, el HGF / SF es producido como un polipéptido inactivo de una cadena y el que es convertido proteolíticamente a una especie dos cadenas (13-15). El HGF / SF de dos cadenas induce el crecimiento, movimiento y diferenciación en las células objetivo vía un receptor de cinasa de tirosina de membrana específico, codificado por el protooncogén c-MET (16,17). El HGF / SF se une fuerte al receptor de MET con una K_{d} en el intervalo subnanomolar (18,19). El HGF / SF también enlaza la heparina (20,21). Esto no parece afectar la afinidad enlazante hacia una forma soluble del receptor de MET, aunque incrementa la fosforilación del receptor y mitogenicidad en las células objetivo (22). Los complejos HGF / SF - heparina también presentan niveles sostenidos de plasma y un balance hepático reducido in vivo (23).

La estructura modular de HGF / SF ha facilitado la identificación de los dominios responsables del receptor y del enlace de heparina. La supresión de la estructura capilar del dominio terminal N (un dominio homólogo al del péptido de activación del plasminógeno) o kringle 2, da como resultado en mutantes con reducida afinidades aparentes hacia la heparina (24). Por contraste, las supresiones de cualquiera de los kringle 1, 3, 4 o dominio de proteinasa, tienen poco o ningún efecto (24). Por lo tanto, el(os) sitio(s) del HGF / SF, enlazante(s) de la heparina, parece ser que encuentran contenidos en la estructura capilar del dominio terminal N y kringle 2. Los mismos dominios, sin embargo, son críticos para enlace y señalización de MET (25-28).

Ejemplo 2 Tratamiento con HGF variable

Los pacientes con una enfermedad aguda del hígado, sea atribuible a infección viral o a lesión por agentes químicos / fármacos, son tratados con el HGF variable por inyecciones diarias de iv salino en dosis entre 1-100 \mug / kg durante toda la fase aguda de la enfermedad. El desarrollo de la enfermedad es observado midiendo el nivel en plasma de \alpha-fetoproteína, y-globulina, SGOT, SGPT e y-GT.

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Claims (30)

1. Un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF), el cual es sustancialmente incapaz de enlazar un proteoglicano de sulfato de heparano, pero el que es capaz de enlazarse al receptor de HGF, en el que un residuo de aminoácidos positivamente cargado en la estructura de bucle capilar del HGF de tipo natural ha sido sustituido por un residuo de aminoácidos con una carga negativa para uso en medicina.

2. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según la reivindicación 1, en el que por lo menos el residuo de aminoácidos R73 ha sido sustituido por un residuo de aminoácidos con una carga negativa para uso en medicina.

3. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según la Reivindicación 1 ó 2, en el que por lo menos el residuo de aminoácidos R76 ha sido sustituido por un residuo de aminoácidos con una carga negativa para uso en medicina.

4. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que ambos residuos de aminoácidos R73 y R76 han sido sustituidos independientemente por un residuo de aminoácidos con una carga negativa para uso en medicina.

5. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) que comprende las sustituciones de residuos de aminoácidos R73E y R76E para uso en medicina.

6. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) que comprende las sustituciones de residuos de aminoácidos R73E, R76E y R93E para uso en medicina.

7. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) que comprende las sustituciones de residuos de aminoácidos R73E, R76E y K78E para uso en medicina

8. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) que consiste en HGF humano con las sustituciones de residuos de aminoácidos R73E y R76E para uso en medicina.

9. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) que consiste en HGF humano con las sustituciones de residuos de aminoácidos R73E , R76E y R93E para uso en medicina.

10. Un factor humano variable (HGF) de crecimiento de hepatocitos que consiste en HGF humano con las sustituciones de residuos de aminoácidos R73E , R76E y K78E para uso en medicina.

11. Un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el cual antagoniza la acción del HGF de tipo natural para uso en medicina.

12. Un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según la Reivindicación 11, en el que el HGF variable adicionalmente comprende una mutación que confiere resistencia en el HGF variable frente a la escisión proteolítica por enzimas capaces de la conversión in vivo del HGF hacia su forma de dos cadenas para uso en medicina.

13. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según la Reivindicación 12 que tiene una alteración de aminoácidos en, o adyacente a, cualquiera de los aminoácidos 493, 494, 495 y 496 del HGF humano de tipo natural.

14. Una composición farmacéutica que comprende un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes o de las reivindicaciones 17 a 24, y un portador aceptable farmacéuticamente.

15. El uso de un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) como define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en la preparación de un medicamento para tratar a un paciente en necesidad de tratamiento con un HGF o un antagonista suyo.

16. Uso como define en la Reivindicación 15, en el que el paciente tiene cáncer.

17. Un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF), en el que un residuo de aminoácidos cargado positivamente en la estructura de bucle capilar del HGF de tipo natural haya sido sustituido por un residuo de aminoácidos con una carga negativa, siempre que el HGF variable no sea una variante de HGF humano en el que hayan sido hechas las sustituciones (a) R73E. R76E y R93E o (b) R73E y R76E o (c) K91E, R93E y K94E.

18. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según la Reivindicación 17, en el que por lo menos un residuo de aminoácidos R73 haya sido sustituido por un residuo de aminoácidos con una carga negativa.

19. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según la Reivindicación 17, en el que por lo menos un residuo de aminoácidos R76 haya sido sustituido por un residuo de aminoácidos con una carga negativa.

20. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 19, en el que ambos residuos de aminoácidos R73 y R76 hayan sido sustituido independientemente por un residuo de aminoácidos con una carga negativa.

21. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) que comprende las sustituciones de residuos de aminoácidos R73E, R76E y K78E.

22. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según la Reivindicación 17, el cual antagoniza la acción del HGF de tipo natural.

23. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según la Reivindicación 22, en el que el HGF variable adicionalmente comprende una mutación que confiere resistencia en el HGF variable frente a la escisión proteolítica por enzimas capaces de conversión in vivo del HGF hacia su forma de dos cadenas.

24. Un factor humano variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) según la Reivindicación 23, el cual tiene una alteración de aminoácidos en, o adyacente a, cualquiera de los aminoácidos 493, 494, 495 y 496 del HGF humano variable de tipo natural.

25. Un polinucleótido que codifica un factor variable de crecimiento de hepatocitos según cualquier de las Reivindicaciones 17 a 22.

26. Un vector que comprende un polinucleótido según la Reivindicación 25.

27. Una célula hospedador que comprende un polinucleótido o vector según la Reivindicación 25 ó 26.

28. Un método para producir un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF), comprendiendo el método el cultivar una célula como se define en la Reivindicación 17, y aislar el HGF variable a partir de ésta.

29. Un método para inducir in vitro la síntesis de ADN en una célula, que comprende proporcionar a la célula un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF), como define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

30. Un método para inducir in vitro la disociación y dispersión de células en una población de células, comprendiendo el método proporcionar un factor variable de crecimiento de hepatocitos (HGF) a la población de células, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.