WO2008000881A1 - Muteínas del interferón alfa humano glicosiladas, su procedimiento de obtención y utilización. - Google Patents

Muteínas del interferón alfa humano glicosiladas, su procedimiento de obtención y utilización. Download PDF

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Marcos Rafael Oggero Eberhardt
Natalia Analía CEAGLIO
Marina Etcheverrigaray
Ricardo Kratje
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Definitions

  • the present invention belongs to the field of molecular biology related to the development of recombinant proteins.
  • it is related to recombinant human interferon alpha muteins with improved pharmacological, chemical and physical properties; procedures for obtaining said isoforms and pharmaceutical formulations for use in mammals, especially for humans requiring therapeutic treatment with interferon.
  • this invention is related to human alpha interferon muteins, which contain at least one modified amino acid in a position belonging to a secondary helix-like structure. Said modification generates at least one sequence of the Asn-Xaa-Ser / Thr type, introducing a site susceptible to N-glycosylation by glycosylation of the asparagine residue in said sequence.
  • interferons The group of cytokines known as interferons was first characterized in 1957, they were called interferons (IFNs) for their ability to interfere with viral replication, conferring resistance to infection from infected cells to non-cells. infected. The first to demonstrate this characteristic of these cytokines were Isaacs and Lindermann in 1957 (Proc R Soc Lond Biol Sci, Sep 1957; 147 (927): 258-67).
  • IFNs are divided into two groups according to their structural and functional properties: type I interferons (IFN-alpha, IFN-beta, IFN-omega) and type I interferons (IFN-gamma). Each of these is expressed in a wide variety of cell types in low concentration. IFN-alpha is expressed primarily in B lymphocytes and macrophages; IFN-beta in fibroblasts and IFN-gamma in T lymphocytes.
  • IFN-alpha is expressed primarily in B lymphocytes and macrophages; IFN-beta in fibroblasts and IFN-gamma in T lymphocytes.
  • interferon type III is comprised of lambda interferons 1, 2 and 3 (corresponding to lnterleukin-29 (IL-29), IL -28a and IL-28b, respectively) (Kotenko, SV 2003. IFN-lambdas mediated antiviral protection through a distinct class Il cytokine receptor complex. Nat. Immunol. 4: 69-77; Sheppard, P. 2003. IL-28, IL-29 and their class Il cytokine receptor IL-28R. Nat. Immunol. 4: 63-68).
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • EMVC encephalomyocarditis virus
  • Interferon type I alpha belongs to a multigenic family composed of genes and pseudogenes, more than 20 variants have been identified.
  • the interferon alfa 2b contains 2 disulfide bonds in its structure and an O-type linked glycosidic chain, in the Thr 106 position.
  • the post-translational modifications necessary to transfer a glycan to the protein occur in the endoplasmic reticulum of the cell immediately After the newly synthesized polypeptide is translocated from the cell cytoplasm, in order for glycosylation of type N to occur, the presence of sequences of the type is necessary Asn-Xaa-Ser / Thr in the amino acid chain, where an N-glycosidic bond is formed between the amino group of the asparagine residue and an OH group of the sugar.
  • interferon type I in living organisms, at high levels, is induced by the presence of a viral infection, it can also be induced by a wide variety of other non-viral agents, such as bacteria, mycoplasmas and various polymers such as lipopolysaccharides of the membrane of gram-negative bacteria and the presence of synthetic polymers (Merigan T: Induction of circulating interferon by synthetic anionic plymers of known composition. Nature 1967, 214: 416-417).
  • Type I interferon also has anti-proliferative and immunomodulatory activity.
  • the signaling pathway of type I IFNs is initiated by the binding of said molecule to the receptor on the target cell surface and mediates the activation of white genes in the nucleus through the Jak / STAT signaling pathway, there are other activation pathways of IFN-receptor binding dependent genes that do not depend on the aforementioned signal transduction pathway (A Lick: Interferon signal transduction. Biotherapy, January 1, 1996; 8 (3-4): 175-81).
  • Type-1 alpha interferon is clinically used in the treatment of chronic hepatitis B and C, acute viral encephalitis, cancers such as nasopharyngeal carcinoma, lymphoma, leukemia and melanomas, among others.
  • Interferon alfa One of the main disadvantages of the use of interferon in the treatment of diseases is its low stability when supplied to a living organism, so it is necessary to supply excessive amounts of interferon to achieve adequate therapeutic levels. On the one hand this determines that the therapies in which interferon is used, particularly Interferon alfa, have high costs and on the other hand they cause in certain patients the appearance of side effects such as influenza-like conditions, with fever, fatigue, irritability, chills, headaches and aches muscle upset stomach, loss of appetite, diarrhea, dizziness, etc. (Richard Grieve: Cost-effectiveness of interferon or peginterferon with ribavirin for histologically mild chronic hepatitis C. Gut, Jun 2005; 10.1 136 / gut. 2005.064774; Gary L. Davis: Interferon alfa-2b alone or with ribavirin for the treatment of relapse of chronic hepatitis C. 1998. Volume 339 Number 21-1493).
  • the present invention solves the problems described in the prior art and provides a preparation of a recombinant human interferon alpha mutein, which has a different N-glycosylation profile than those known in the state of the art, said mutein has a release profile in Improved time and stability, a biological activity comparable to that presented by interferon-pegylated with a 12000 Dalton Polyethylene Glycol (PEG 12000), in addition the obtaining of said mutein implies few steps in its process of obtaining and its purification is simple, with the quality of obtaining a final product of high purity.
  • said recombinant human interferon alpha 2b mutein also has at least one N-glycosylation site in a position outside an alpha helix structure.
  • N-glycosylation sites preferably formed by a consensus sequence of the Asn-Xaa-Ser / Thr type, at a position of their amino acid sequence that is part of a secondary alpha helix type structure, occupy selected positions from the set comprising: Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Met 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156.
  • N-glycosylation sites outside secondary helix-type secondary structures occupy the positions selected from the set comprised of the positions of natural human interferon alpha 2b Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, GIyI 04, ThM 06 , Lys134, GInI 58, Leu161.
  • said directed site mutation is performed on the amino acids selected from the set comprised of amino acids Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Met ⁇ 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156 .
  • said gene also has at least one site-directed mutation that generates an Asn-Xaa-Ser / Thr type consensus sequence, where Asn is susceptible to suffer an N-glycosidic binding with an oligosaccharide and is outside a secondary structure type alpha helix.
  • said N-glycosylation site outside an alpha helix-like secondary structure is performed on the amino acids selected from the set comprised of Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161.
  • It is another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising at least the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention for the treatment of diseases such as melanomas, chronic hepatitis C, acute and chronic hepatitis B, non-A hepatitis no- Acute and chronic B, Kaposi's sarcoma, multiple sclerosis, genital warts, leukemia, viral infections, among others.
  • diseases such as melanomas, chronic hepatitis C, acute and chronic hepatitis B, non-A hepatitis no- Acute and chronic B, Kaposi's sarcoma, multiple sclerosis, genital warts, leukemia, viral infections, among others.
  • Figure 1 shows the nucleotide and amino acid sequence of natural interferon type I alpha 2b.
  • the thick arrow marks the signal peptide, the thin arrows correspond to the synthetic oligonucleotides used to obtain a cloning vector with the gene that codes for the natural interferon type I alpha 2b.
  • the amino acid residues and codons framed in a thick frame correspond to the amino acids and nucleotides that were subjected to site-directed mutagenesis to obtain the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention that includes the N-glycosylation sites in Pro4 positions, Arg23, Lys70 and Asp77.
  • Figure 2 Mutagenesis site directed by PCR technique in its extension variant by overlap.
  • Figure 3 Western blot test. Streets: 1 - Molecular mass marker; 2- rhlFN- ⁇ 2bM4; 3- rhlFN- ⁇ 2bM77; 4- rhlFN- ⁇ 2bM23; 5-rhlFN- ⁇ 2bM70; 6- rhlFN- ⁇ 2b O-glycosylated; 7- rhlFN- ⁇ 2b non-glycosylated; 8- rhlFN- ⁇ 2bM4 / 23/70/77
  • Figure 4 Enzymatic N-deglycosylation of the mutated variants of hlFN- ⁇ 2b (hlFN- ⁇ 2bM23, hlFN- ⁇ 2bM47, hlFN- ⁇ 2bM70, hlFN- ⁇ 2bM95)
  • Figure 5 percentage variation of the N-glycosylation as a function of the time expressed as a percentage thereof with respect to the amount present at the beginning of the enzymatic deglycosylation procedure
  • Figure 6 SDS-PAGE in reducing conditions with argumentative staining (A) and Western blot (B) corresponding to the purification of rhlFN- ⁇ 2bM77 and rhlFN- ⁇ 2bM4 / 23/70/77 by immunoaffinity chromatography. Streets: 1 - Raw sample of a culture supernatant containing rhlFN- ⁇ 2bM77 before purification; 2- Sample purified from rhlFN- ⁇ 2bM77; 3 Crude sample of a culture supernatant containing rhlFN- ⁇ 2bM4 / 23/70/77 before purification; 4 Purified sample of rhlFN- ⁇ 2bM4 / 23/70/77.
  • Figure 7 Time profile of the variation of the biological activity of IFN present in each sample after the subcutaneous inoculation of the rhIFN ⁇ 2b wild type, rhIFN ⁇ 2bM23 and rhIFN ⁇ 2bM70 variants.
  • Figure 8 Time profile of the percentage variation of the remaining biological activity in each sample with respect to the units of IFN biological activity supplied to each rat intravenously for the rhlFN- ⁇ 2b non-glycosylated, rhlFN- ⁇ 2bM77, rhlFN- ⁇ 2b variants -PEG (12kDa) and rhlFN- ⁇ 2bM4 / 23/70/77.
  • Figure 9 Temporal profile of the variation of the biological activity of IFN present in each sample after the subcutaneous inoculation of the rhlFN- ⁇ 2b non-glycosylated, rhlFN- ⁇ 2b-PEG (12kDa) and rhlFN- ⁇ 2bM4 / 23/70/77 variants .
  • Natural human interferon alpha 2b (hlFN- ⁇ 2b), refers to the cytokine present in nature, without having undergone any type of artificial modification.
  • substitution of an amino acid refers to the exchange of an amino acid present in the primary sequence of hlFN- ⁇ 2b with another amino acid.
  • Recombinant mutein of human alpha interferon of the invention refers to those recombinant molecules of human alpha interferon, preferably alpha 2b, with at least one glycosylation site, preferably N-glycosylation, at a position of its amino acid sequence that is part of a secondary alpha helix-like structure.
  • Human alpha interferon includes those analogs, mutants, isoforms and fragments of natural alpha interferon.
  • N-glycosylation site refers to the tripeptide Asn-Xaa-Ser / Thr, where X can be any residue except a Proline residue.
  • the "position" of the "N-glycosylation site” is indicated by the position occupied by the amino acid residue in the amino acid sequence of the natural human interferon alpha 2b that is to be replaced by an Asn or is the asparagine of said consensus sequence .
  • Said Asn residue, in said consensus sequence is susceptible to enzymatic glycosylation of the N-type.
  • glycosylation of certain eukaryotic proteins takes place in certain positions of the polypeptide skeleton, there are commonly two types of glycosylation.
  • Type-0 glycosylation involving the binding of an oligosaccharide to an -OH group of a Serine or Threonine residue
  • N-type glycosylation which involves the binding of an oligosaccharide to an -NH group of an Asparagine residue
  • the N-type glycosylation takes place in the Asn-X-Ser / Thr consensus sequence, where X can be any amino acid except a proline.
  • oligosaccharides bound to the protein by N-type binding have in common a pentasaccharide nucleus consisting of three trickle residues and two N-acetylglucosamine residues.
  • the sugars attached to this pentasaccharide nucleus can acquire a wide variety of oligosaccharide patterns.
  • the presence or absence of said oligosaccharides affects the physical properties of the proteins and can be critical in their function, stability, secretion and location in the cell.
  • the present invention is related to the production of a human interferon alpha mutein that has at least one substitution of an amino acid in Ia Natural human interferon alpha sequence in a position that forms a secondary helix alpha structure, in order to obtain the Asn-Xaa-Ser / Thr consensus sequence, where the Asn residue is susceptible to N-glycosylation.
  • the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention with at least one N-glycosylation site in a position that is part of a secondary alpha helix structure is that obtained from the substitution of an amino acid in the Lys70 position with a residue Asn (Lys70Asn), in this way the Asn-Xaa-Ser / Thr consensus sequence is generated, where the asparagine residue is part of a secondary alpha helix structure and is susceptible to N-glycosylation.
  • Another example would be the substitution of the amino acid residue Leu95 with a Serine or Threonine residue, in this way an Asn-Xaa-Ser / Thr consensus sequence is generated, where the asparagine residue in the Asn93 position is susceptible to N-glycosylation . It has been shown that the presence of at least one N-glycosylation site in alpha helix-like structures gives interferon greater stability and therefore a longer half-life in blood.
  • Said N-glycosylation sites generated by substitution of an amino acid that is part of a secondary structure type alpha helix are selected from the set comprising positions Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Asn93, GIu1 13, Arg125, Met ⁇ 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156.
  • One of the preferred embodiments of the present invention is a recombinant human interferon alpha mutein that has at least one substitution of an amino acid in a position that is part of a secondary alpha helix structure and also at least one substitution in an amino acid in a position outside an alpha helix structure in order to obtain Asn-Xaa-Ser / Thr consensus sequences, where the Asn residue is susceptible to N-glycosylation.
  • Such sites of N- glycosylation in positions outside alpha helix structures are selected from the set comprised of positions Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161.
  • the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention has in its amino acid sequence an N-glycosylation site in a position that is part of alpha helix structures, where the position of the glycosylation site is selected from the set comprising Positions Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Met 48, Ser150, Ser152, Leu153, Asn156. More preferably even in the selected position of the set comprised by the positions Lys70, Asn93, GIu113. More preferably even in the Lys70 position.
  • the recombinant human interferon alpha mutein of the invention has two N-glycosylation sites, where said sites are selected from the set comprised by the positions Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Met ⁇ 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161. More preferably, said mutein has a glycosylation site in the Lys70 position and also an N-glycosylation site in a position selected from the set comprised by the positions Pro4, Arg23 and Asp77.
  • the recombinant human interferon alpha mutein of the invention has three N-glycosylation sites selected from the set comprised of the positions Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Asn93, GIu1 13, Arg125, Met ⁇ 48, Ser150, Ser152, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Asn45, Leu26, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161.
  • the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention with three N-glycosylation sites It presents an N-glycosylation site in the Lys70 position and two N-glycosylation sites selected from the set comprised of the Pro4, Arg23 and Asp77 positions.
  • the recombinant human interferon alpha mutein of the invention is a mutein with four N-glycosylation sites selected from the set comprising positions Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Asn93, Glu1 13 , Arg125, Met ⁇ 48, Ser150, Ser152, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161. More preferably, said sites are Pro4, Arg23, Lys70 and Asp77.
  • the recombinant human interferon alpha mutein of the invention has 5 N-glycosylation sites selected from the set of positions Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Asn93, GIu1 13, Arg125, Met 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161. More preferably, said sites are selected from the set comprised of positions Pro4, Arg23, Lys70, Asp77, Asn93, Glu113.
  • Another strategy is to locate all the asparagine present in the hlFN- ⁇ 2b sequence and replace the amino acid in the third position with a serine or threonine.
  • the modifications made in the amino acid sequence of the natural human interferon alpha to obtain the recombinant mutein of the invention are the result of the genetic modification of the gene encoding the natural human interferon alpha 2b. Where said genetic modifications are introduced in such a way that it generates the Asn-Xaa-Ser / Thr consensus sequence in the amino acid sequence of the human alpha interferon, where the Asn residue is susceptible to N-glycosylation.
  • the gene coding for the recombinant human interferon alpha interferon mutein of the invention comprises at least one genetic modification in a codon of the gene coding for natural human interferon alpha, such that said modification generates The Asn-Xaa-Ser / Thr consensus sequence in a position that is part of a secondary alpha helix structure, thus generating an N-glycosylation site in a position that is part of a secondary alpha helix type structure.
  • said modification in the nucleotide sequence is carried out in at least one position selected from the set comprised of the positions Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Leu95, Glu1 13, Arg125, Met ⁇ 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158.
  • said gene coding for the recombinant human interferon alpha mutein of the invention also has at least one genetic modification in a codon of the gene coding for the natural human interferon alpha, so that said modification generates the Asn-Xaa-Ser / Thr consensus sequence in a position outside a secondary alpha helix structure, thus generating an N-glycosylation site in a position outside a secondary alpha helix type structure.
  • Such modifications in positions outside of secondary alpha helix type structures are made in positions that are selected from the set comprised of positions Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, ThM 06, Lys134, Gln158, Leu161.
  • said gene has a unique modification in its nucleotide sequence and is performed in the codon that codes for amino acids selected from the set comprised of Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Leu95, Glu1 13, Arg125, Met 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158. More preferably in the codon that codes for the amino acid of the Lys70 position.
  • the gene encoding the recombinant human interferon alpha mutein of the present invention has two modifications in its nucleotide sequence in such a way that two N-glycosylation sites are generated, said modifications involve the codons coding for the amino acids selected from the set comprising Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Leu95, Glu1 13, Arg125, Met ⁇ 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Leu161. More preferably the modifications in its nucleotide sequence are presented in the codon coding for Lys70 and in the codon coding for one of the amino acids selected from the set comprised of Pro4, Arg23 and Asp77.
  • the gene encoding the recombinant mutein of the present invention has three modifications in its nucleotide sequence in such a way that three N-glycosylation sites are generated, said modifications involve the codons coding for amino acids. selected from the set comprised of Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Leu95, Glu1 13, Arg125, Met 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50 , Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Leu161. More preferably the modifications in its nucleotide sequence are presented in the codon coding for Lys70 and in two codons coding for the amino acids selected from the set comprised of Pro4, Arg23 and Asp77.
  • the gene encoding the recombinant mutein of the present invention has four modifications in its nucleotide sequence in such a way that they generate four N-glycosylation sites, said modifications involve the codons that code for the amino acids selected from the set comprised of Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Met 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Leu161. More preferably the modifications in its nucleotide sequence involve the codons coding for Pro4, Arg23, Lys70 and Asp77.
  • the gene encoding the recombinant human interferon alpha mutein of the invention has five modifications in its nucleotide sequence in the codons that code for the selected amino acids from the set comprised of Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Met ⁇ 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Leu161. More preferably, in the amino acids selected from the set comprised of Pro4, Arg23, Lys70, Asp77, Leu95 and Glu1 13.
  • the present invention provides a method for generating said sites susceptible to N-glycosylation.
  • Said method implies the generation of point mutations in the nucleotide sequence of the gene that codes for natural human interferon alpha, by means of the site directed mutagenesis technique in said gene.
  • Said method involves the following steps: a) - Clone the gene encoding natural human interferon alpha 2b in a suitable plasmid. b) - Generate the mutations necessary to produce the human alpha interferon mutein of the invention by means of the site directed mutagenesis technique and c) - Clone the gene, genetically modified from step b, into a suitable expression vector
  • the expression vector is that selected from the set of vectors that allow the insertion of the gene of the invention and also present the elements necessary for the expression of the gene of interest in eucahotas cells.
  • Said vector may be the pCI-neo expression vector.
  • the directed site mutagenesis technique of the invention involves the use of oligonucleotides specifically designed for this purpose. This technique is carried out in two stages. In the first stage two separate PCR reactions are performed using oligonucleotides that hybridize at the ends of the fragment cloned in the pCI-neo vector (oligonucleotides called IFNalfaF and IFNalfaR, Table I) and oligonucleotides carrying the point mutation Table Il (mut a and mut b) which hybridize in the internal region of the gene where the mutation is to be introduced.
  • oligonucleotides that hybridize at the ends of the fragment cloned in the pCI-neo vector
  • oligonucleotides carrying the point mutation Table Il mut a and mut b
  • a reaction mixture is carried out in tube a using the external reverse oligonucleotide (IFNalfa®) and the direct oligonucleotide mut a.
  • tube b another reaction mixture is carried out with the external oligonucleotide in the direct direction and the oligonucleotide mut b in the reverse direction.
  • the PCR products obtained in both reactions are purified from an agarose gel electrophoresis and used as a template for the second stage.
  • a second PCR reaction is carried out using the external oligonucleotides in a direct and reverse direction. The first three cycles are performed without the addition of primers to allow hybridization and elongation of the complete product (fill ir ⁇ ) and finally the latter are added to achieve amplification.
  • said muteins are sequentially constructed, in the following manner: first a mutein is generated with a N-glycosylation site, by means of the site directed mutagenesis technique, and then said mutein as a starting template to generate a new N-glycosylation site.
  • K1 transfected or transformed with an expression plasmid, pCI-neo, which has said gene coding for the recombinant mutein of human interferon alpha of the invention, involves the following steps:
  • Producer K1 comprises the steps of: a) - culturing the eucahota cell producing the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention and b) - isolating the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention expressed and excreted to the culture medium.
  • a method, also object of the present invention, of purification of the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention involves obtaining specific monoclonal antibodies for said mutein, adsorbing said monoclonal antibodies on a suitable chromatographic column and purifying the mutein of Ia invention by immunoaffinity chromatography.
  • Interferon alfa can be expressed in bacteria, yeasts or insect cells according to procedures well known in the art. In all these cases the recombinant interferon will not be glycosylated or will have a lower degree of glycosylation than the glycosylated interferon produced in animal cells. In these cases, the in vitro sugar chains can be glycosylated or remodeled.
  • a method for producing the human interferon mutein of the invention is provided by the steps of: a) - transforming or transfecting a prokaryotic cell with a suitable prokaryotic expression vector containing the gene that encodes for the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention; b) - select that clone that expresses the polypeptide of the recombinant mutein of the human interferon alpha of the invention; c) - culturing said clone in a suitable culture medium, d) -purifying, e) - glycosylate "in vitro" the human alpha interferon mutein polypeptide expressed by the clone of step c); and f) -purify the human alpha interferon mutein of the invention.
  • Glycosylation profiles of various recombinant muteins of hlFN- ⁇ 2b were analyzed: muteins with a glycosylation site outside the secondary helix alpha structure; The recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention; the natural hlFN- ⁇ 2b; and a non-glycosylated isoform; as seen in Figure 3. All mutants with a single site susceptible to N-glycosylation exhibited a mixture of IFN- ⁇ isoforms of different molecular mass corresponding to the following fractions: non-glycosylated; O-glycosylated; and N-, 0-glycosylated; the proportion of each one being variable of according to the mutant analyzed.
  • rhlFN- ⁇ 2bM70 In the particular case of the mutein whose gene has a point mutation in the codon that codes for the amino acid of the Lys70 position in order to generate an N-glycosylation site in alpha helix structure, rhlFN- ⁇ 2bM70, a greater molecular mass was observed with respect to the muteins in which a single site susceptible to N-glycosylation was incorporated outside alpha helix-like structures. Said mutein, rhlFN- ⁇ 2bM70, corresponds to a molecule that exhibits a higher content of glycosidic structures.
  • the recombinant human interferon alpha mutein of the invention in the preferred embodiment corresponding to four N-glycosylation sites in positions Pro4, Arg23, Lys70 and Asp77, rhlFN- ⁇ 2bM4 / M23 / M70 / M77, has a homogeneous glycosylation profile With a high degree of glycosylation, as seen in Figure 3. Furthermore, it can be seen in the same figure that this rhlFN- ⁇ 2bM4 / M23 / M70 / M77 mutein has a low content of the O-glycosylated isoform and those corresponding to a low degree of glycosylation. That is to say that a higher concentration of muteins with a high degree of occupation is observed in a range of molecular masses between 21 and 45 kDa, more particularly between 30 and 45 kDa.
  • results obtained from the measurement of the biological activity as a function of time show that the recombinant mutein of the human alpha interferon of the invention, in particular that corresponding to the mutein with a new N-glycosylation site in the Lys70 position, presents an increase of 1, 63 with respect to a mutein with a new N-glycosylation site at a site lacking alpha helix structure (rhlFN- ⁇ 2bM23). This indicates the importance of selecting N-glycosylation sites in alpha helix type structures.
  • the recombinant mutein of human interferon alfa of the invention has improved pharmacokinetic, physical and chemical properties with respect to the isoforms known in the state of the art obtained by cell cultures.
  • a pharmaceutical formulation of the recombinant mutein of human interferon alpha of the invention, another object of the present invention, for the administration and treatment of diseases such as melanomas, chronic hepatitis C, acute and chronic hepatitis B, non-A non-B hepatitis Acute and chronic, Kaposi's sarcoma, multiple sclerosis, genital warts, leukemia, viral infections, among others, consists in the preparation of a powder, gel, cream, lyophilisate, tablets or a solution to be administered by a route selected from the group included by subcutaneous, parenteral, oral, sublingual, intranasal or topical application.
  • Said formulation in a preferred solution preparation, has concentrations of 0.02mg / ml to 3mg / ml of protein mass in solution.
  • Said solution formulations comprising the interferon of the present invention, furthermore comprise a buffer, a stabilizer, a choprotector and a solvent
  • buffers those that maintain the pH between 4.5 and 7.5, preferably between 6.5 and 7.0, more preferably 6.8 are useful.
  • the buffers used are citrate / citric acid, acetate / acetic acid; dibasic / monobasic phosphate, preferably dibasic / monobasic phosphate in molar concentration between 0.005 to 0.1 molar.
  • Preferred stabilizers are those derived from poly (oxy-1, 2-ethanedyl), among these, more preferably mono-9-octadecenoate poly (oxy-1,2-ethanedyl), Polysorbate 80, which can be used in a range of concentrations of 0.01 to 1 mg / ml.
  • Carbohydrates such as sucrose or mannitol, surface active agents such as glycerol, dimethyl sulfoxide or Tween are useful as choprotectors.
  • the cryoprotectant is a carbohydrate, more preferably the sucrose in a range of concentrations ranging from 20 to 100 mg / ml.
  • the present invention has as another object the use of the recombinant human interferon alpha mutein of the invention for the preparation of a medicament to be used in a therapeutic protocol that allows reducing the therapeutic doses of IFN alpha 2b. It can be administered as monotherapy or as a combination therapy with ribavirin; as monotherapy subcutaneously in doses of 0.1 micrograms / kg to 2.0 micrograms / kg of the patient per week. More preferably in doses 0.5 micrograms / kg to 1.0 micrograms / kg of the patient per week. In the case of combined therapy, a dose of 0.5 to 3.0 micrograms / kg per week of the mutein of the invention is administered in combination with ribavirin in capsules. More preferably in doses of 1.0 to 2.0 micrograms / kg per week of the mutein of the invention in combination with ribavirin in capsules.
  • Example 1 Isolation of the human IFN- ⁇ 2b gene from leukocyte genomic DNA
  • the hlFN- ⁇ 2b gene was obtained by a PCR amplification reaction, using genomic DNA obtained from human peripheral blood leukocytes as a template (Sambrook et al., 1989).
  • genomic DNA obtained from human peripheral blood leukocytes as a template (Sambrook et al., 1989).
  • specific oligonucleotides were used that hybridize at both ends of the coding sequence of hlFN- ⁇ 2b, called IFNalfaF and IFNalfaR, which are indicated in Table I.
  • the 673 bp fragment obtained was cloned into the commercial plasmid pGEM ® T Easy Vector (Promega) following the protocol described by the manufacturer.
  • the sequencing of this construction called pGEM-rhlFN- ⁇ 2b ⁇ // f, confirmed the identity of the cloned fragment, observing 100% homology with the sequence published in the Gene Bank (Gen Bank) for hlFN- ⁇ 2b.
  • Fig. 1 the Ia nucleotide sequence corresponding to the hlFN- ⁇ 2b cDNA and the amino acid sequence corresponding to the protein encoded by it.
  • Example 2 Selection of amino acids to be modified in the rhlFN- ⁇ 2b gene to obtain new N-glycosylation sites
  • glycosylation sites resulting from the corresponding mutations were studied taking into account two basic aspects: high probability of glycosylation and conservation of the biological activity of the protein.
  • the first aspect was evaluated in order to generate, as far as possible, a high degree of occupancy of the chosen sites.
  • ASA Solvent accessible surface area
  • This study provided information regarding the degree of surface exposure of the amino acid present in the structure of the protein to which the oligosaccharide chain would bind.
  • This parameter was calculated using the ASAview software (Ahmed, S., Gromiha, M., Fawereh, H., Sorci, A., BMC Bioinformatics, 2004, 5:51; http://www.netasa.org/asaview /).
  • the mutations selected from the point of view of preventing a loss of the biological activity of the protein were analyzed.
  • This aspect was studied taking into account two characteristics: a- Proximity of the probable glycosylation site to the molecular region involved in receptor binding. If this parameter were not taken into account, there would be a high probability of generating glycoproteins whose hydrocarbon chains would interfere with receptor binding, obtaining biologically inactive forms of hlFN- ⁇ 2b.
  • the possible sites of being subjected to site-directed mutagenesis to obtain an Asn-Xaa-Ser / Thr consensus sequence are: Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71, Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Met ⁇ 48, SeM 50 , SeM 52, Leu153, Gln158 in secondary structures type alpha helix and Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, ThM 06, Lys134, GInI 58, Leu161 outside secondary structures type alpha helix.
  • Example 3 Targeted and cloned site mutagenesis of mutated genes in expression vectors for eukaryotic cells
  • the site-directed mutagenesis procedure for the introduction of N-glycosylation sites in the hlFN- ⁇ 2b gene was performed by PCR technique in its variant overlapping variant, which basically consisted of 2 consecutive PCR reactions.
  • the description of the technique used is summarized in Fig. 2. Both PCR stages were carried out in a thermal cycler, for 30 cycles composed of the following stages: denaturation at 94 Q C for 1 minute, hybridization at 60 Q C for 30 seconds and elongation at 72 Q C for 1 minute.
  • oligonucleotides used to carry out the selected point mutations are described in Table II.
  • the nucleotide sequence corresponding to four mutated variants of hlFN- ⁇ 2b was obtained where a single N-glycosylation site was incorporated, called rhlFN- ⁇ 2bM4, rhlFN- ⁇ 2bM23, rhlFN- ⁇ 2bM70 and rhlFN- ⁇ 2bM77, in which the codons corresponding to amino acids Pro4, Arg23, Lys70 and Asp77 were replaced by a codon coding for an Asn, respectively.
  • pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM4 a sequential N-glycosylation site was added using the technique of site directed mutagenesis previously described.
  • a mutant with two N-glycosylation sites was constructed, using as a template a molecule containing an N-glycosylation site.
  • a variant with three N-glycosylation sites was constructed using the molecule containing two N-glycosylation sites as tempering.
  • the mutant was obtained with the four N-glycosylation sites, carrying out the mutagenesis reaction on the molecule that contained three N-glycosylation sites.
  • the cloning of each variant was performed in the pCI-neo expression vector.
  • CHO cell transfection procedures were carried out. K1 by lipofection technique with plasmids pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM4, pCI neo-rhlFN- ⁇ 2bM23, pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM70, pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM77 and pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM4 / M23 / M23 / M23 / / M77.
  • the culture supernatant was removed and the cell layer was washed using the MC medium.
  • different mixtures were prepared containing 10 ⁇ g of cationic lipid (LipofectAMINE ® 2000, Invitrogen) and 6 ⁇ g of the corresponding plasmid DNA diluted in MC medium. These preparations were incubated for 30 minutes at room temperature before being added to the cell culture. Subsequently, the washing solution was removed from each cavity and the aggregate was added. The different solutions containing the liposomes which were incubated for 4 hours. After the incubation time, the culture supernatant was removed, adding culture medium supplemented with SFB at 5 % (V / V). After 72 hours of incubation, the culture supernatant was harvested in order to evaluate the expression of glycosylated rhlFN- ⁇ 2b variants.
  • 96-well flat bottom polystyrene plates were sensitized with 100 ⁇ l of a solution of 1 ⁇ g.ml "1 mAb (100 ng per cavity) diluted in 50 mM sodium carbonate / bicarbonate solution, pH 9.6 (solution Sensitization.) The plates were incubated for 1 hour at 37 Q C and overnight at 4 Q C. After washing 6 times with phosphate saline (PBS), Tween 20 0.05% (V / V) , the plates were blocked with 200 ⁇ l PBS with the addition of 1% bovine serum albumin (BSA) (P / V).
  • BSA bovine serum albumin
  • the polyacrylamide gel electrophoresis procedure was carried out in the presence of the partner dodecyl sulfate reagent (SDS-PAGE) and a disulfide bond reducing agent essentially following the method described by Laemmli (1970).
  • SDS-PAGE partner dodecyl sulfate reagent
  • a disulfide bond reducing agent essentially following the method described by Laemmli (1970).
  • the samples were treated with 0.05 M Tris-HCI solution, 2% SDS (P / V), 10% glycerol (V / V), 5% ⁇ -mercaptoethanol (V / V), bromophenol blue 0.05% (P / V), pH 6.8.
  • the samples were incubated at 100 ° C for 3 minutes and seeded directly on the stacking gel, whose concentration of monomer / branching agent (acrylamide / bisacrylamide) was 5% (P / V).
  • the separation gel was polymerized with an acrylamide / bisacrylamide concentration of 15% (P / V).
  • the run was carried out at constant voltage (200 mV) until the run front reached 0.5 cm from the bottom edge of the separation gel.
  • electrophoresis the transfer of the proteins to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad) was performed.
  • a standard protein transfer protocol was used using 25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol (V / V), pH 8.3 as the transfer solution.
  • the transfer was carried out at a constant current intensity of 180 mA for 1 hour. Once it was completed, the success of the transfer was evaluated by detecting the presence of proteins with 0.25% Red Ponceau solution (P / V) in 15% glacial acetic acid (V / V) and 40% methanol (V / V ). Subsequently, the dye was eluted by successive washes with Tris saline solution (TBS) and the membrane was blocked with TBS solution, 1% BSA (P / V).
  • TBS Tris saline solution
  • the membrane was incubated with a solution of rabbit polyclonal antibodies anti-rhlFN- ⁇ 2b diluted 1: 1000 with diluent solution (TBS, 0.1% BSA (P / V)). After the corresponding washes, the membrane was incubated with a solution of goat anti-rabbit immunoglobulin antibodies conjugated with the enzyme peroxidase diluted 1: 2,000 in diluent solution. All incubations were carried out under stirring for 1 hour at room temperature. Finally, the membrane was developed by chemiluminescence reaction using the ECL Plus Western Blotting Reagent commercial kit (GE Healthcare). The luminescence emission was detected by exposing the membrane to photographic films for a variable period of time. The development of the film was carried out manually using the conventional method of photographic fixation and development.
  • Example 7 Evaluation of the stability of the ⁇ / -glycosylated variants of hlFN- ⁇ 2b at positions Arg23, Asn45, Lys70 and Asn93, in the presence of the enzyme PNGase F ( ⁇ / -glycanase)
  • the different molecules of hlFN- ⁇ 2b individually mutated at the amino acid positions Arg23, Leu47, Lys70 and Leu95, so as to obtain glycosylation sites at positions Arg23, Asn45, Lys70 and Asn93, were analyzed from the point of view of their stability in the presence of the PNGase F enzyme responsible for the release of oligosaccharides linked by N-glycosidic bond.
  • 350 ⁇ l of culture supernatant corresponding to each of the aforementioned mutants were treated with 250 U of PGNase F (Biolabs) and incubated at 37 ° C.
  • the deglycosylation reaction was inhibited at different time intervals (30, 60, 90, 120, 150, 180 and 300 minutes) by taking a 45 ⁇ l aliquot of said mixture and incubating it with 15 ⁇ l of 0.05 Tris-HCI solution M, 2% SDS (P / V), 10% glycerol (V / V), 5% ⁇ -mercaptoethanol (V / V), bromophenol blue 0.05% (P / V), pH 6.8 for 5 minutes at 100 ° C.
  • All samples were analyzed by SDS-PAGE reducing technique and subsequent Western Blot assay following the steps essentially indicated in Example 6.
  • the percentage of N, 0-glycosylated, O-glycosylated and non-glycosylated isoforms present in the samples was estimated by densitometry and subsequent percentage evaluation thereof using the commercial software ImageMaster TotalLab V1.1 1 (GE Healthcare, Sweden).
  • Fig. 4 the results of enzymatic deglycosylation corresponding to the 4 mutated variants of hlFN- ⁇ 2b are summarized.
  • the IFN- ⁇ 2bM23 mutant demonstrated complete elimination of the N-glycosidic bond after 150 minutes of incubation with the enzyme, while the IFN- ⁇ 2bM47 mutant reduced its degree of N-glycosylation by 50% after 30 minutes of enzymatic treatment.
  • the IFN- ⁇ 2bM70 and IFN- ⁇ 2bM95 mutants conserved approximately 40% of the N, 0-glycosylated variants at the end of the experiment, with respect to the total forms of IFN present in each sample.
  • Fig. 5 the percentage variation of N-glycosylation is observed as a function of the time expressed as a percentage thereof with respect to the amount present at the beginning of the enzymatic deglycosylation procedure.
  • Example 8 Evaluation of the in vitro antiviral biological activity of the mutated variants of rhlFN- ⁇ 2b
  • the biological activity of the different variants of hlFN- ⁇ 2b was determined by measuring their antiviral effect on cultures of MDBK cells (Madin-Darby Bovine Kidney, ATCC CCL-22) infected with Vesicular Stomatitis virus (VSV), Indiana strain (ATCC VR-158). To do this, flat-bottom 96-well plates were seeded with 100 ⁇ l of a 250,000 cell.ml "1 cell suspension using MEM culture medium supplemented with 2 mM L-glutamine, sodium bicarbonate 2.2 mg.mr 1 , 50 ⁇ g.ml gentamicin "1 and 10% bovine fetal serum (V / V) (growth medium).
  • the biological activity of the different muteins was determined by measuring their antiviral effect on cultures of MDBK cells (Madin-Darby Bovine Kidney, ATCC CCL-22) infected with Vesicular Stomatitis virus (VSV), Indiana strain (ATCC VR-158). To do this, flat-bottom 96-well plates were seeded with 100 ⁇ l of a 250,000 cell.ml "1 cell suspension using MEM culture medium supplemented with 2 mM L-glutamine, sodium bicarbonate 2.2 mg.mr 1 , 50 ⁇ g.ml gentamicin "1 and 10% bovine fetal serum (V / V) (growth medium).
  • the plates were incubated place overnight in an oven at 37 Q C in CO 2 atmosphere saturated at 5% moisture. The next day, the culture supernatant was removed and 100 ⁇ l of successive dilutions were added to the non-glycosylated rhlFN- ⁇ 2b medium (standard) from 20 U. mi "1 to 0.156 U. mi " 1 and the corresponding samples to be evaluated in adequate dilutions All dilutions were made in a culture medium identical to the growth medium with a concentration of SFB at 2% (V / V) (test medium). The plates were incubated in an oven for 6 hours. After this time, the supernatant was removed and the plates were washed using test medium.
  • the specific biological activity (ABE) parameter of each molecule was determined (Table III).
  • the rhlFN- ⁇ 2bM4, rhlFN- ⁇ 2bM23 and rhlFN- ⁇ 2bM77 mutants exhibited variable levels of specific activity in a range between 160 and 290 U.ng "1.
  • the incorporation of mutations in the protein sequence and / or the presence N-type hydrocarbon chains did not significantly alter the activity of said variants when compared with the specific biological activity of non-glycosylated rhlFN- ⁇ 2b (between 150 and U.ng "1 ).
  • a decrease of said parameter was evidenced by 48%.
  • Example 9 Obtaining stable cell lines producing rhlFN- ⁇ 2b mutated
  • CHO cells. K1 were transiently transfected with the different constructs essentially following the steps described in example 4. Subsequently, the cultures were subjected to selection pressure with the antibiotic Neomycin (200 ⁇ g.ml "1 ) between 72 and 168 hours post -transfection After two weeks of culture in the presence of said antibiotic, the expression levels of the cytokine were quantified by sandwich ELISA technique and the production lines (CHO pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM4, CHO pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM23, CHO pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM70, CHO pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM77 and CHO pCI-neo-rhlFN- ⁇ 2bM4 / 23/70/77) were conserved in liquid nitrogen, subsequently, the cell lines that conserved
  • Example 10 Production of mutated rhlFN- ⁇ 2b by culturing the selected clones under adhesion conditions
  • the specific productivity of rhlFN- ⁇ 2b was determined during the different phases of the cell culture, showing the clones evaluated, a higher specific productivity of the cytokine during the stationary phase of the culture.
  • Example 11 Purification of the recombinant mutein of human interferon alpha of the invention from culture supernatants
  • the purification of the different mutated variants of rhlFN- ⁇ 2b was carried out using the immunoaffinity chromatography method, using as a ligand the selected mAb as capture antibody for the sandwich ELISA technique.
  • the in vivo production of the mAb in ascitic fluid was performed, using a batch of 10 female BALB / c mice of 2 months of age.
  • the intraperitonial inoculation of 0.5 ml of 2, 6, 10, 14-tetramethyldecanoic acid (Pristane®, Sigma) was performed on each mouse and after 10 days the inoculation of 2.10 6 hybridoma cells per animal was performed resuspended in 0.5 ml of PBS in the same way.
  • the ascites fluid was collected by puncturing the intraperitoneal region with a 1, 2 needle mm in diameter, from the first week after the inoculation of hybridomas.
  • the concentration of murine immunoglobulins in ascites fluid was determined by sandwich ELISA technique.
  • the purification of the mAb was performed by affinity chromatography using a 5 ml Sepharose High Trap protein column (GE Healthcare), following the technique described by Harlow and La ⁇ e (1998).
  • the concentration of pure immunoglobulin was calculated by spectrophotometric reading at 280 nm using a percentage extinction coefficient (E ° ) of 12.5. Multiplying 10 x (E ⁇ ⁇ ° ) "1 by the optical density reading gives the concentration of mAb expressed in mg.ml " 1 .
  • the affinity ligand was coupled to a Sepharose 4B matrix activated with cyanogen bromide following the standard protocol (GE Healthcare).
  • the percentage of coupling of the mAb to the resin was 98.3% and the theoretical capacity of the matrix was 186 ⁇ g of rhlFN- ⁇ 2b not glycosylated per ml of gel.
  • the purification protocol of rhlFN- ⁇ 2b muteins with an N-glycosylation site and with four N-glycosylation sites is described below.
  • the culture supernatant containing the cytokine was conditioned by the addition of Triton X-100 until reaching a concentration of 0.3% (V / V).
  • the conditioned sample was applied to the column previously equilibrated with 0.1 M Tris solution, 0.3% Triton X-100 (V / V) (pH 7.5) at a flow of 0.5 ml.min "1 Subsequently, it was washed with 5 column volumes using each of the following solutions:
  • rhlFN- ⁇ 2b was evaluated in all fractions by sandwich ELISA technique, obtaining a higher recovery percentage (in a range between 95% and 100%) by using the 0.1 M glycine solution ( pH 2.0).
  • Example 12- Evaluation of the pharmacokinetic parameters of the variants with a single N-glycosylation site called rhlFN- ⁇ 2bM23 and rhlFN- ⁇ 2bM70 in experimental animals using the subcutaneous inoculation pathway
  • the pharmacokinetic properties of the variants with a site susceptible to N-glycosylation outside the ⁇ -helix regions (rhlFN- ⁇ 2bM23) and forming part of an ⁇ -helix (rhlFN- ⁇ 2bM70) were evaluated, using the subcutaneous inoculation pathway.
  • two-month-old female Wistar rats with an average weight of 200 g were inoculated with the aforementioned variants of IFN using a single dose of 5 x 105 U. Kg "1 of the animal's body weight.
  • blood samples were collected by puncturing the retroorbital vein using heparinized capillaries and the presence of the cytokine was determined by quantifying its volumetric biological activity. With the data obtained, the biological activity of each sample is plotted as a function of time (Fig. 7).
  • the same experiment was carried out using the wild type IFN molecule (rhlFN- ⁇ 2bwt).
  • Example 13 Evaluation of pharmacokinetic parameters of the different variants of rhlFN- ⁇ 2b in experimental animals
  • the rhlFN- ⁇ 2bM77 variant (representative of the molecules with a single site susceptible to ⁇ / -glycosylation outside a structure) was selected alpha-helix) and rhlFN- ⁇ 2bM4 / 23/70/77 mutein.
  • C A. e "t / t1 + B. e " ⁇ 2 , where C is the fraction of the drug remaining in the circulation at time t, A and t1 are parameters of the initial phase that reflect the distribution of the protein to the extravascular fluids of the organism , while B and t2 are parameters that characterize the terminal phase of drug elimination.
  • the pharmacokinetic properties of the mutein with four sites susceptible to N-glycosylation were evaluated using the subcutaneous inoculation route.
  • female Wistar rats, two months old, with an average weight of 200 g were inoculated with the aforementioned variant of IFN using a single dose of 5 x 10 5 U. Kg "1 of body weight of the animal.
  • animals were inoculated with the same dose of non-glycosylated rhlFN- ⁇ 2b or 12kDa rhlFN- ⁇ 2b-PEG.
  • the glycosylated cytokine reached a maximum concentration of biological activity from the first hour post-injection keeping approximately constant for 10 hours. Said maximum concentration was higher than that reached by the non-glycosylated variant, which was evidenced as a concentration peak after 30 minutes after the inoculation of the same. Finally, the biological activity levels of this last variant became undetectable after 4 hours post-injection.

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Abstract

Una muteína recombinante del interferón alfa humano con al menos un sitio de glicosilación en una posición de su secuencia aminoacídica que forma parte de una estructura secundaria tipo alfa hélice, un gen que codifica para dicha muteína, un método de producción de dicho gen, un método para obtener una célula eucariota productora de dicha muteina, un método para producir dicha muteina, un procedimiento para purificar dicha muteina, una composición farmacéutica de dicha muteina, el uso de dicha muteina para elaborar un medicamento

Description

Muteínas del interferón alfa humano glicosiladas, su procedimiento de obtención y utilización
MEMORIA DESCRIPTIVA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de Ia biología molecular relacionada con el desarrollo de proteínas recombinantes. En particular está relacionada con muteínas recombinantes del interferón alfa humano con propiedades farmacológicas, químicas y físicas mejoradas; procedimientos para obtener dichas isoformas y formulaciones farmacéuticas para su uso en mamíferos, en especial para humanos que requieran de tratamiento terapéutico con interferón. Más particularmente esta invención está relacionada con muteínas del interferón alfa humano, que contienen al menos un aminoácido modificado en una posición que pertenece a una estructura secundaria tipo alfa hélice. Dicha modificación genera al menos una secuencia del tipo Asn-Xaa-Ser/Thr, introduciendo un sitio susceptible de N-glicosilación por glicosilación del residuo de asparagina en dicha secuencia.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El grupo de citoquinas conocidas como interferones fue caracterizado por primera vez en 1957, se los llamó interferones (IFNs) por su habilidad de interferir en Ia replicación viral, confiriendo una resistencia a Ia infección desde las células infectadas a células no infectadas. Los primeros en demostrar esta característica de dichas citoquinas fueron Isaacs y Lindermann en 1957 (Proc R Soc Lond Biol Sci, Sep 1957; 147(927): 258-67).
Los IFNs se dividen en dos grupos de acuerdo a sus propiedades estructurales y funcionales: los interferones del tipo I (IFN-alfa, IFN-beta, IFN-omega) y los interferones tipo Il (IFN-gamma). Cada uno de estos se expresa en una gran variedad de tipos celulares en baja concentración. El IFN-alfa se expresa principalmente en linfocitos B y macrófagos; el IFN-beta en fibroblastos y el IFN-gamma en linfocitos T.
Recientemente se ha propuesto incluir un nuevo miembro a Ia familia de interferones, este nuevo miembro se Io denomina interferón tipo III, está comprendido por los interferones lambda 1 , 2 y 3 (que corresponden a las lnterleuquina-29 (IL-29), IL-28a y IL-28b, respectivamente) (Kotenko, S. V. 2003. IFN-lambdas medíate antiviral protection through a distinct class Il cytokine receptor complex. Nat. Immunol. 4:69-77; Sheppard, P. 2003. IL-28, IL-29 and their class Il cytokine receptor IL-28R. Nat. Immunol. 4:63-68). Estos INFs tipo III muestran una baja homología de secuencia con Ia familia de IFNs α/β pero son activados por los mismos factores que inducen Ia expresión de los IFNs α/β e inhiben Ia replicación de diversos virus incluyendo virus de Ia estomatitis vesicular (VSV) y el virus de Ia encefalomiocarditis (EMVC); aparentemente también inhibirían Ia replicación del virus de Ia hepatitis tipo B y C.
El interferón tipo I alfa pertenece a una familia multigénica compuesta de genes y pseudogenes, se han identificado más de 20 variantes. EL interferón alfa 2b contiene 2 enlaces disulfuro en su estructura y una cadena glicosídica unida por enlace tipo-O, en Ia posición Thr 106. Las modificaciones post-traduccionales necesarias para transferir un glicano a Ia proteína ocurren en el retículo endoplasmático de Ia célula inmediatamente luego de ser traslocado el polipéptido recién sintetizado desde el citoplasma celular, para que ocurra una glicosilación del tipo N es necesaria Ia presencia de secuencias del tipo Asn-Xaa-Ser/Thr en Ia cadena aminoacídica, donde se forma una unión N-glicosídica entre el grupo amino del residuo de asparagina y un grupo OH del azúcar.
La expresión de interferón tipo I en organismos vivos, en altos niveles, es inducida por Ia presencia de una infección viral, también puede ser inducida por una gran variedad de otros agentes no-virales, tales como bacterias, micoplasmas y diversos polímeros como ser lipopolisacáridos de Ia membrana de bacterias gram-negativas y Ia presencia de polímeros sintéticos (Merigan T: Induction of circulating interferón by synthetic anionic plymers of known composition. Nature 1967, 214: 416-417).
El interferón tipo I posee, además, actividad anti-proliferativa e inmunomoduladora.
La vía de señalización de los IFNs tipo I se inicia por Ia unión de dicha molécula al receptor en Ia superficie celular diana y media Ia activación de genes blanco en el núcleo a través de Ia vía de señalización Jak/STAT, existen otras vía de activación de genes dependientes de Ia unión IFN-receptor que no dependen de Ia vía de transducción de señales antes mencionada (A Lamer: Interferón signal transduction. Biotherapy, January 1 , 1996; 8 (3-4): 175-81 ).
El interferón tipo-l alfa es clínicamente utilizado en el tratamiento de Ia hepatitis B y C crónica, encefalitis viral aguda, cánceres tales como carcinoma nasofaríngeo, linfoma, leucemia y melanomas, entre otros.
Una de las principales desventajas que posee el uso del interferón en el tratamiento de enfermedades es su baja estabilidad cuando se suministra a un organismo vivo, por Io que es necesario suministrar cantidades excesivas de interferón para alcanzar niveles terapéuticos adecuados. Por un lado esto determina que las terapias en las que se utiliza interferón, particularmente el Interferón alfa, tengan costos elevados y por otro lado que provoquen en ciertos pacientes Ia aparición de efectos secundarios tales como estados similares a Ia gripe, con fiebre, fatiga, irritabilidad, escalofríos, cefaleas y dolores musculares; malestar estomacal, pérdida del apetito, diarrea, mareos, etc. (Richard Grieve: Cost-effectiveness of interferon or peginterferon with ribavirin for histologically mild chronic hepatitis C. Gut, Jun 2005; 10.1 136/gut.2005.064774; Gary L. Davis: Interferon alfa-2b alone or with ribavirin for the treatment of relapse of chronic hepatitis C. 1998. Volume 339 Number 21 -1493).
En Ia actualidad se están desarrollado nuevas estrategias para aumentar Ia estabilidad in vivo de estas proteínas bioactivas mediante reacciones enzimáticas (WO 98/13381 , US 6,620,916, US 5,643,564, US 4,184,917), reacciones químicas (WO 96/21468, US 2004/0180054, US 6,524,570, US 4,179,337, US 5,981 ,709, US 20060029573, US 5,738,846), encapsulación de Ia proteína (WO2005074892), mutagénesis dirigida (US2004/0002474, WO92/01055, US 2005/0019871 ), etc., con el objeto de lograr dosis terapéuticas efectivas evitando Ia administración de cantidades excesivas de Ia proteína. Ejemplos de estas nuevas estrategias se detallan en documentos tales como Ia patente WO98/13381 (Ajinomoto Kk (Jp); Takahara Y., et al.), en Ia que se divulga un método de modificar proteínas biológicamente activas, mejorando su actividad in vivo, mediante Ia adición de ligandos ramificados a residuos de glutamina presentes en Ia secuencia primaria de Ia proteína. Los documentos de patente US 6,620,916 (Ajinomoto Co. Inc.; Takahara, et al.); US 5,643,564 (Takeda Chemical Industries, Ltd; Hamaguchi , et al.) yUS 4,184,917 (Sandoz Ltd.; Dorner, et al.) describen Ia obtención de homólogos de interferon con estabilidad mejorada, mediante modificaciones enzimáticas para alterar el perfil de glicosilación, estos nuevos homólogos actúan esencialmente a nivel del hígado y podrían mejorar Ia acción en ese órgano, pero desmejorar Ia acción de interferon sobre otras localizaciones. En el documento de patente WO 96/21468 (Amgen Inc; Collins David, et al.) se divulga Ia obtención de análogos del inteferón alfa recombinante mediante Ia adición de ligandos glicosídicos con múltiples lactosas conjugados a residuos de Arginina o al residuo amino terminal de Ia secuencia primaria del interferón alfa natural, el producto reivindicado en este documento es dirigido al hígado con Io cual estaría actuando a nivel hepático y podría presentar deficiencias a nivel de otros órganos como por ejemplo en tumores de riñon. En Ia solicitud de patente US 2004/0180054 (Kim, Young-Min, et al.) se divulga Ia obtención de un conjugado formado por una proteína (IFN-alfa), un polímero no peptídico y una inmunoglobulina, de esta manera se aumenta Ia estabilidad in vivo de Ia proteína. En los documentos de patente US 4,179,337, US 5,981 ,709, US 20060029573, US 5,738,846, US 6,524,570; los inventores divulgan procesos, composiciones y usos de interferón alfa conjugado con polietilenglicol para aumentar Ia estabilidad del mismo. Estos métodos implican pasos de purificación necesarios para eliminar los productos de reacción antes de realizar los pasos de purificación, mínimos, necesarios para obtener un producto de alta pureza. Además estos procedimientos propuestos presentan Ia dificultad de dirigir una reacción química a un sitio específico de Ia proteína Io que lleva a obtener productos heterogéneos, con Ia posibilidad de obtener productos inactivos.
En Ia solicitud de patente WO 2005074892 (Shenzhen Neptunus lnterlong Bl; Wang et al.) los inventores describen una crema conteniendo liposomas de interferón utilizada para el tratamiento de enfermedades dérmicas causadas por infecciones virales (por ejemplo herpes zoster), verrugas, úlceras genitales, etc. Este modo de preparación presenta Ia desventaja de tener una aplicación limitada al tratamiento tópico de enfermedades.
La solicitud de patente US 2004/0002474 (Maxygen, Inc.; Heinrichs, Volker, et al.) donde se reivindica Ia obtención de homólogos de interferón alfa, mediante modificaciones en Ia secuencia génica o aminoacídica. En el documento de patente WO 92/01055 (Boehringer Ingelheim Int; Adolf Guenther, et al.) los inventores divulgan Ia obtención de homólogos de interferón alfa los cuales presentan nuevos sitios de O- glicosilación. El producto obtenido mediante estas estrategias no muestra mejoras en las propiedades farmacocinéticas respecto al interferón-pegilado.
En Ia solicitud de patente US 2005/0019871 (Lee, Eun Jung, et al.) se divulga Ia obtención de isoformas del interferón alfa, en las cuales se ha modificado Ia secuencia de nucleótidos con el fin de introducir motivos Asn-Xaa-Ser/Thr en sitios que no están involucrados en Ia formación de estructuras secundarias, se proponen exclusivamente sitios fuera de las estructuras alfa-hélices. A pesar de obtener isoformas del interferón recombinante humano tipo I α2b con nuevos sitios de N-glicosilación, no demuestran una mejora en Ia estabilidad y/o perfil de liberación en el tiempo, comparable con las isoformas disponibles comercialmente en Ia actualidad tales como el interferón-pegilado con un Polietilenglicol de 12000 Dalton (PEG 12000). En esta solicitud se presentan isoformas con sólo dos nuevos sitios de N-glicosilación en regiones moleculares carentes de estructuras alfa hélice las cuales constituirían áreas de mayor susceptibilidad a Ia acción de N-glicanasas.
La presente invención resuelve los problemas descritos en el arte previo y provee una preparación de una muteína recombinante de interferón alfa humano, que presenta un perfil de N-glicosilación diferente a los conocidos en el estado del arte, dicha muteína presenta un perfil de liberación en el tiempo y una estabilidad mejoradas, una actividad biológica comparable con Ia que presenta el interferón-pegilado con un Polietilenglicol de 12000 Dalton (PEG 12000), además Ia obtención de dicha muteína implica pocos pasos en su proceso de obtención y su purificación es simple, con Ia cualidad de obtener un producto final de alta pureza.
OBJETOS DE LA INVENCIÓN Es un objeto principal de Ia presente invención proveer una muteína recombinante del interferón alfa humano, preferentemente del tipo 2b, que presenta al menos un sitio de glicosilación, preferentemente N-glicosilación, en una posición de su secuencia aminoacídica que forma parte de una estructura secundaria tipo alfa hélice. En una de las realizaciones preferidas de Ia presente invención dicha muteína recombinante del interferón alfa humano 2b presenta además al menos un sitio de N-glicosilación en una posición fuera de una estructura alfa hélice. Donde dichos sitios de N-glicosilación, preferentemente conformados por una secuencia consenso del tipo Asn-Xaa-Ser/Thr, en una posición de su secuencia aminoacídica que forma parte de una estructura secundaria tipo alfa hélice, ocupan posiciones seleccionadas del conjunto comprendido por: Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156. Mientras que dichos sitios de N-glicosilación fuera de estructuras secundarias tipo alfa hélice ocupan las posiciones seleccionadas del conjunto comprendido por las posiciones del interferón alfa humano 2b natural Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, GIyI 04, ThM 06, Lys134, GInI 58, Leu161.
Es otro objeto de Ia presente invención proveer un gen que codifica para una muteína recombinante del interferón alfa humano, preferentemente tipo 2b, que comprende al menos una mutación sitio dirigida que genera un sitio de N-glicosilación, preferentemente una secuencia consenso tipo Asn-Xaa-Ser/Thr, involucrado en una estructura alfa hélice. Donde dicha mutación sitio dirigida se realiza en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por los aminoácidos Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156. Donde en una realización preferida dicho gen presenta además al menos una mutación sitio dirigida que genera una secuencia consenso tipo Asn-Xaa-Ser/Thr, donde Ia Asn es susceptible de sufrir una unión N-glicosídica con un oligosacárido y está fuera de una estructura secundaria tipo alfa hélice. Donde dicho sitio de N-glicosilación fuera de una estructura secundaria tipo alfa hélice, se realiza en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161.
Es otro objeto de Ia presente invención proveer un método para generar nuevos sitios susceptibles de N-glicosilación mediante Ia técnica de mutagénesis sitio dirigida en el gen que codifica para dicha muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención.
Es otro objeto de Ia presente invención proveer un método para obtener una línea celular eucariota derivada, productora de dicha muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, mediante transformación ó transfección de una línea celular con dicho gen que codifica para dicha muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, inserto en un vector de expresión adecuando, donde, preferentemente Ia línea celular eucariota es Ia línea celular CHO. K1.
Es otro objeto de Ia presente invención proveer un método para producir Ia muteína recombinante del interferón humano de Ia invención mediante los pasos de: a)- cultivar dicha línea celular eucariota transformada ó transfectada con el vector de expresión que contiene el gen que codifica para Ia muteína del interferón humano de Ia invención y b)- aislar Ia muteína recombinante del interferón alfa humano, expresada y excretada, del medio de cultivo.
Es otro objeto de Ia presente invención proveer un procedimiento para purificar dicha muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención mediante cromatografía de inmunoafinidad. Es otro objeto de Ia presente invención proveer un método para producir Ia muteína del interferón humano de Ia invención a partir de células procariotas mediante los pasos de: a)- transformar ó transfectar una célula procariota con un vector de expresión adecuando que contiene el gen que codifica para Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención; b)-seleccionar aquel clon que exprese el polipéptido de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención; c)-cultivar dicho clon, d)-purificar, e)- glicosilar "in vitro" el polipéptido de Ia muteína del interferón alfa humano expresado por el clon del paso c); y f)-purificar Ia muteína del interferón alfa humano de Ia invención.
Es otro objeto de Ia presente invención proveer una composición farmacéutica que comprende al menos Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención para el tratamiento de enfermedades tales como melanomas, hepatitis C crónica, hepatitis B aguda y crónica, hepatitis no-A no-B aguda y crónica, Sarcoma de Kaposi, esclerosis múltiple, verrugas genitales, leucemia, infecciones virales, entre otras.
Es otro objeto de Ia presente invención proveer un método para el tratamiento de melanomas, hepatitis C crónica, hepatitis B aguda y crónica, hepatitis no-A no-B aguda y crónica, Sarcoma de Kaposi, esclerosis múltiple, verrugas genitales, leucemia, infecciones virales, el cual implica Ia administración a un mamífero, preferentemente humano, que Io necesite, una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención y en donde dicha composición comprende además excipientes farmacológicamente aceptables.
Es otro objeto de Ia presente invención proveer un uso de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención para elaborar un medicamento para el tratamiento de Ia hepatitis C crónica, mediante un protocolo terapéutico en el cual se reducen las dosis terapéuticas habituales en Ia terapia con interferón. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : muestra Ia secuencia nucleotídica y aminoacídica del interferón tipo I alfa 2b natural. La flecha gruesa marca el péptido señal, las flechas delgadas corresponden a los oligonucleótidos sintéticos utilizados para Ia obtención de un vector de clonado con el gen que codifica para el interferón tipo I alfa 2b natural. Los residuos de aminoácidos y codones encuadrados en marco grueso corresponden a los aminoácidos y nucleótidos que fueron sometidos a mutagénesis sitio dirigida para Ia obtención de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención que incluye los sitios de N-glicosilación en las posiciones Pro4, Arg23, Lys70 y Asp77.
Figura 2: Mutagénesis sitio dirigida mediante técnica de PCR en su variante extensión por solapamiento.
Figura 3: Ensayo de Western blot. Calles: 1 - Marcador de masa molecular; 2- rhlFN-α2bM4; 3- rhlFN-α2bM77; 4- rhlFN-α2bM23; 5-rhlFN-α2bM70; 6- rhlFN-α2b O- glicosilado; 7- rhlFN-α2b no glicosilado; 8- rhlFN-α2bM4/23/70/77
Figura 4: N-desglicosilación enzimática de las variantes mutadas de hlFN-α2b (hlFN-α2bM23, hlFN-α2bM47, hlFN-α2bM70, hlFN-α2bM95)
Figura 5: variación porcentual de Ia N-glicosilación en función del tiempo expresada como porcentaje de Ia misma con respecto a Ia cantidad presente al inicio del procedimiento de desglicosilación enzimática
Figura 6 (A y B): SDS-PAGE en condiciones reductoras con tinción argéntica (A) y Western blot (B) correspondientes a Ia purificación del rhlFN-α2bM77 y rhlFN- α2bM4/23/70/77 por cromatografía de inmunoafinidad. Calles: 1 - Muestra cruda de un sobrenadante de cultivo conteniendo rhlFN-α2bM77 antes de Ia purificación; 2- Muestra purificada de rhlFN-α2bM77; 3 Muestra cruda de un sobrenadante de cultivo conteniendo rhlFN-α2bM4/23/70/77 antes de Ia purificación; 4 Muestra purificada de rhlFN- α2bM4/23/70/77.
Figura 7: Perfil temporal de Ia variación de Ia actividad biológica de IFN presente en cada muestra luego de Ia inoculación subcutánea de las variantes rhIFN α2b wild type, rhIFN α2bM23 y rhIFN α2bM70.
Figura 8: Perfil temporal de Ia variación porcentual de Ia actividad biológica remanente en cada muestra con respecto a las unidades de actividad biológica de IFN suministrada a cada rata por vía endovenosa para las variantes rhlFN-α2b no glicosilado, rhlFN-α2bM77, rhlFN-α2b-PEG (12kDa) y rhlFN-α2bM4/23/70/77.
Figura 9: Perfil temporal de Ia variación de Ia actividad biológica de IFN presente en cada muestra luego de Ia inoculación subcutánea de las variantes rhlFN-α2b no glicosilado, rhlFN-α2b-PEG (12kDa) y rhlFN-α2bM4/23/70/77.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se definen a continuación algunos términos utilizados en esta descripción con el objeto de facilitar Ia cabal comprensión de Ia invención:
"Interferón alfa humano 2b natural" (hlFN-α2b), se refiere a Ia citoquina presente en Ia naturaleza, sin haber sido sometida a ningún tipo de modificación artificial.
"Sustitución de un aminoácido", se refiere al cambio de un aminoácido presente en Ia secuencia primaria del hlFN-α2b por otro aminoácido.
"Muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención", se refiere a aquellas moléculas recombinantes del interferón alfa humano, preferentemente alfa 2b, con al menos un sitio de glicosilación, preferentemente N-glicosilación, en una posición de su secuencia aminoacídica que forma parte de una estructura secundaria tipo alfa hélice.
"Interferón alfa humano" incluye aquellos análogos, mutantes, isoformas y fragmentos del interferón alfa natural.
"Sitio de N-glicosilación", hace referencia al tripéptido Asn-Xaa-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier residuo excepto un residuo de Prolina. La "posición" del "sitio de N- glicosilación" esta indicada por Ia posición que ocupa el residuo de aminoácido en Ia secuencia aminoacídica del interferón alfa humano 2b natural que va a ser reemplazado por una Asn o bien es Ia asparagina de dicha secuencia consenso. Dicho residuo de Asn, en dicha secuencia consenso, es susceptible de sufrir glicosilación enzimática del tipo-N.
La glicosilación de ciertas proteínas eucariotas tiene lugar en determinadas posiciones del esqueleto polipeptídico, comúnmente existen dos tipos de glicosilación. La glicosilación tipo-0 que involucra Ia unión de un oligosacárido a un grupo -OH de un residuo de Serina o Treonina, y Ia glicosilación del tipo-N, que involucra Ia unión de un oligosacárido a un grupo -NH de un residuo de Asparagina. Particularmente, Ia glicosilación tipo-N tiene lugar en Ia secuencia consenso Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto una Prolina. Todos los oligosacáridos unidos a Ia proteína mediante unión del tipo-N tienen en común un núcleo pentasacárido constituido por tres residuos de mañosa y dos residuos de N-acetilglucosamina. Los azúcares unidos a este núcleo pentasacárido pueden adquirir una gran variedad de patrones de oligosacáridos. La presencia o ausencia de dichos oligosacáridos afecta las propiedades físicas de las proteínas y puede ser crítico en Ia función, estabilidad, secreción y localización de las mismas en Ia célula.
La presente invención está relacionada con Ia producción de una muteína del interferón alfa humano que presenta al menos una sustitución de un aminoácido en Ia secuencia del interferón alfa humano natural en una posición que forma parte una estructura secundaria alfa hélice, de manera de obtener Ia secuencia consenso Asn-Xaa- Ser/Thr, donde el residuo de Asn es susceptible de sufrir N-glicosilación. Por ejemplo, Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención con al menos un sitio de N-glicosilación en una posición que forma parte de una estructura secundaria alfa hélice es aquella obtenida de Ia sustitución de un aminoácido en Ia posición Lys70 por un residuo de Asn (Lys70Asn), de esta manera se genera Ia secuencia consenso Asn-Xaa- Ser/Thr, donde el residuo de asparagina está formando parte de una estructura secundaria alfa hélice y es susceptible de sufrir N-glicosilación. Otro ejemplo sería Ia sustitución del residuo de aminoácido Leu95 por un residuo de Serina o Treonina, de esta manera se genera una secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, donde el residuo de asparagina en Ia posición Asn93 es susceptible de sufrir N-glicosilación. Se ha demostrado que Ia presencia de al menos un sitio de N-glicosilación en estructuras tipo alfa hélice confieren al interferón una mayor estabilidad y por Io tanto una mayor vida media en sangre.
Dichos sitios de N-glicosilación, generados mediante sustitución de un aminoácido que forma parte de una estructura secundaria tipo alfa hélice son seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156.
Una de las realizaciones preferidas de Ia presente invención es una muteína recombinante del interferón alfa humano que presenta al menos una sustitución de un aminoácido en una posición que forma parte de una estructura secundaria alfa hélice y además al menos una sustitución en un aminoácido en una posición fuera de una estructura alfa hélice de manera de obtener secuencias consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, donde el residuo de Asn es susceptible de sufrir N-glicosilación. Dichos sitios de N- glicosilación en posiciones fuera de estructuras alfa hélice son seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161.
En una realización preferida, Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención presenta en su secuencia aminoacídica un sitio de N-glicosilación en una posición que forma parte de estructuras alfa hélice, donde Ia posición del sitio de glicosilación es seleccionado del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Metí 48, Ser150, Ser152, Leu153, Asn156. Más preferentemente aún en Ia posición seleccionada del conjunto comprendido por las posiciones Lys70, Asn93, GIu113. Más preferentemente aún en Ia posición Lys70.
En otra realización preferida de Ia presente invención Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención tiene dos sitios de N-glicosilación, donde dichos sitios son seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161. Más preferentemente aún, dicha muteína presenta un sitio de glicosilación en Ia posición Lys70 y además un sitio de N-glicosilación en una posición seleccionada del conjunto comprendido por las posiciones Pro4, Arg23 y Asp77.
Preferentemente, Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención tiene tres sitios de N-glicosilación seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, GIu1 13, Arg125, Metí 48, Ser150, Ser152, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Asn45, Leu26, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161. Preferentemente, Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención con tres sitios de N-glicosilación presenta un sitio de N-glicosilación en Ia posición Lys70 y dos sitios de N-glicosilación seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Pro4, Arg23 y Asp77.
Más preferentemente, Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención es una muteína con cuatro sitios de N-glicosilación seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Metí 48, Ser150, Ser152, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161. Más preferentemente aún dichos sitios son Pro4, Arg23, Lys70 y Asp77.
En otra realización preferida, Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención presenta 5 sitios de N-glicosilación seleccionados del conjunto de posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Gln158, Leu161. Más preferentemente aún dichos sitios son seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Pro4, Arg23, Lys70, Asp77, Asn93, Glu113.
Para obtener Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención con sitios susceptibles de N-glicosilación, se llevaron a cabo dos estrategias posibles:
1 )- localizar todas las serinas y/o treoninas en Ia secuencia aminoacídica del hlFN-α2b y cambiar el aminoácido que ocupa Ia primera posición de Ia secuencia consenso por una asparagina,
2)- otra estrategia es Ia de ubicar todas las asparaginas presentes en Ia secuencia del hlFN-α2b y sustituir el aminoácido en Ia tercera posición por una serina o treonina.
Las modificaciones realizadas en Ia secuencia aminoacídica del interferón alfa humano natural para obtener Ia muteína recombinante de Ia invención son el resultado de Ia modificación genética del gen que codifica para el interferón alfa humano 2b natural. Donde dichas modificaciones genéticas son introducidas de manera tal que genera Ia secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr en Ia secuencia aminoacídica del interferón alfa humano, donde el residuo de Asn es susceptible de sufrir N-glicosilación.
El gen que codifica para Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, objeto de esta solicitud de patente, comprende al menos una modificación genética en un codón del gen que codifica para el interferón alfa humano natural, de manera tal que dicha modificación genera Ia secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr en una posición que forma parte de una estructura secundaria alfa hélice, generándose así un sitio de N-glicosilación en una posición que forma parte de una estructura secundaria tipo alfa hélice. Preferentemente, dicha modificación en Ia secuencia nucleotídica se realiza en al menos una posición seleccionada del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, Glu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158.
En una de las realizaciones preferidas de Ia presente invención dicho gen que codifica para Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, además presenta al menos una modificación genética en un codón del gen que codifica para el interferón alfa humano natural, de manera tal que dicha modificación genera Ia secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr en una posición fuera de una estructura secundaria alfa hélice, generándose así un sitio de N-glicosilación en una posición fuera de una estructura secundaria tipo alfa hélice. Dichas modificaciones en posiciones fuera de estructuras secundarias tipo alfa hélice se efectúan en posiciones que se seleccionan del conjunto comprendido por las posiciones Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, ThM 06, Lys134, Gln158, Leu161.
En una realización preferida de Ia presente invención, dicho gen tiene una única modificación en su secuencia nucleotídica y se realiza en el codón que codifica para los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, Glu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158. Más preferentemente en el codón que codifica para el aminoácido de Ia posición Lys70.
En otra realización preferida, el gen que codifica para Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia presente invención presenta dos modificaciones en su secuencia nucleotídica de manera tal que se generan dos sitios de N-glicosilación, dichas modificaciones involucran los codones que codifican para los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, Glu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Leu161. Más preferentemente las modificaciones en su secuencia nucleotídica se presentan en el codón que codifica para Lys70 y en el codón que codifica para uno de los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Pro4, Arg23 y Asp77.
En otra realización preferida de esta invención, el gen que codifica a Ia muteína recombinante de Ia presente invención presenta tres modificaciones en su secuencia nucleotídica de manera tal que se generan tres sitios de N-glicosilación, dichas modificaciones involucran los codones que codifican para los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, Glu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Leu161. Más preferentemente las modificaciones en su secuencia nucleotídica se presentan en el codón que codifica para Lys70 y en dos codones que codifican para los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Pro4, Arg23 y Asp77.
En otra realización más preferida de esta invención, el gen que codifica a Ia muteína recombinante de Ia presente invención presenta cuatro modificaciones en su secuencia nucleotídica de manera tal que generan cuatro sitios de N-glicosilación, dichas modificaciones involucran los codones que codifican para los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Leu161. Más preferentemente las modificaciones en su secuencia nucleotídica involucran a los codones que codifican para Pro4, Arg23, Lys70 y Asp77.
En otra realización preferida, el gen que codifica Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención presenta cinco modificaciones en su secuencia nucleotídica en los codones que codifican para los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, Thr106, Lys134, Leu161. Mas preferentemente aún, en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Pro4, Arg23, Lys70, Asp77, Leu95 y Glu1 13.
Además, Ia presente invención provee un método para generar dichos sitios susceptibles de N-glicosilación. Dicho método implica Ia generación de mutaciones puntuales en Ia secuencia nucleotídica del gen que codifica para el interferón alfa humano natural, mediante Ia técnica de mutagénesis sitio dirigida en dicho gen. Dicho método implica los siguientes pasos: a)- Clonar el gen que codifica para el interferón alfa humano 2b natural en un plásmido adecuado. b)- Generar las mutaciones necesarias para producir Ia muteína del interferón alfa humano de Ia invención mediante Ia técnica de mutagénesis sitio dirigida y c)- Clonar el gen, modificado genéticamente del paso b, en un vector de expresión adecuado
El vector de expresión es aquel seleccionado del conjunto de vectores que permiten Ia inserción del gen de Ia invención y que además presentan los elementos necesarios para Ia expresión del gen de interés en células eucahotas. Dicho vector puede ser el vector de expresión pCI-neo.
La técnica de mutagénesis sitio dirigida de Ia invención implica Ia utilización de oligonucleótidos diseñados específicamente para tal fin. Dicha técnica, se lleva a cabo en dos etapas. En Ia primera etapa se realizan dos reacciones de PCR por separado utilizando oligonucleótidos que hibridan en los extremos del fragmento clonado en el vector pCI-neo (oligonucleótidos denominados IFNalfaF e IFNalfaR, Tabla I) y oligonucleótidos portando Ia mutación puntual Tabla Il (mut a y mut b) los cuales hibridan en Ia región interna del gen donde se quiere introducir Ia mutación. En el tubo a se realiza una mezcla de reacción utilizando el oligonucleótido externo en sentido reverso (IFNalfaR) y el oligonucleótido mut a en sentido directo. En el tubo b se realiza otra mezcla de reacción con el oligonucleótido externo en sentido directo y el oligonucleótido mut b en sentido reverso. Los productos de PCR obtenidos en ambas reacciones se purifican a partir de una electroforesis en gel de agarosa y se emplean como molde para Ia segunda etapa. En esta segunda etapa se realiza una segunda reacción de PCR empleando los oligonucleótidos externos en sentido directo y reverso. Los tres primeros ciclos se realizan sin agregado de cebadores para permitir Ia hibridización y elongación del producto completo (fill irí) y finalmente estos últimos son agregados para lograr su amplificación.
Para Ia obtención de una muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención con más de un sitio de N-glicosilación se procede de manera secuencial a construir dichas muteínas, de Ia siguiente manera: primero se genera una muteína con un sitio de N-glicosilación, mediante Ia técnica de mutagénesis sitio dirigida, y luego dicha muteína como molde de partida para generar un nuevo sitio de N-glicosilación.
El método para Ia obtención de una línea celular eucahota derivada productora de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, más particularmente una línea celular CHO. K1 , transfectada ó transformada con un plásmido de expresión, pCI-neo, el cual presenta dicho gen que codifica para Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, implica los siguientes pasos:
- Transformar ó transfectar una célula eucahota con el vector de expresión con el inserto de dicho gen que codifica para Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención y
- seleccionar aquel clon que exprese Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención.
Un procedimiento, también objeto de Ia presente invención, para producir Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención a partir de dicha línea celular CHO. K1 productora, comprende los pasos de: a)- cultivar Ia célula eucahota productora de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención y b)- aislar Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención expresada y excretada al medio de cultivo.
Un método, también objeto de Ia presente invención, de purificación de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, implica Ia obtención de anticuerpos monoclonales específicos para dicha muteína, adsorber dichos anticuerpos monoclonales en una columna cromatográfica adecuada y purificar Ia muteína de Ia invención por cromatografía de inmunoafinidad. El interferón alfa puede ser expresado en bacterias, levaduras ó células de insectos de acuerdo a procedimientos bien conocidos en el arte. En todos estos casos el interferón recombinante no estará glicosilado o poseerá un grado de glicosilación menor y distinto al interferón glicosilado producido en células animales. En estos casos se puede glicosilar ó remodelar las cadenas de azúcares "in vitro". Para ello existen numerosos protocolos descriptos con gran detalle en las siguientes patentes o solicitudes de patentes: WO03031464, WO9425615, WO9216640, US20030040037, US20030003529, US20020137134, US20020019342, US20030124645, US20020160460, US20020142370, US200201 19516.
En una de las realizaciones preferidas de Ia presente invención se provee un método para producir Ia muteína del interferón humano de Ia invención mediante los pasos de: a)- transformar ó transfectar una célula procariota con un vector de expresión procariota adecuando que contiene el gen que codifica para Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención; b)-seleccionar aquel clon que exprese el polipéptido de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención; c)- cultivar dicho clon en un medio de cultivo adecuado, d)-purificar, e)- glicosilar "in vitro" el polipéptido de Ia muteína del interferón alfa humano expresado por el clon del paso c); y f)-purificar Ia muteína del interferón alfa humano de Ia invención.
Se analizaron perfiles de glicosilación de diversas muteínas recombinantes del hlFN-α2b: muteínas con un sitio de glicosilación fuera de estructura secundaria alfa hélice; Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención; el hlFN-α2b natural; y una isoforma no glicosilada; tal como se observa en Ia Figura 3. Todas las mutantes con un único sitio susceptible de N-glicosilación exhibieron una mezcla de isoformas de IFN-α de diferente masa molecular correspondientes a las siguientes fracciones: no-glicosiladas; O-glicosiladas; y N-,0-glicosiladas; siendo la proporción de cada una de ellas variable de acuerdo con Ia mutante analizada. En el caso particular de Ia muteína cuyo gen presenta una mutación puntual en el codón que codifica para el aminoácido de Ia posición Lys70 de manera de generar un sitio de N-glicosilación en estructura alfa hélice, rhlFN-α2bM70, se observó una mayor masa molecular con respecto a las muteínas en las que se incorporó un único sitio susceptible de N-glicosilación fuera de estructuras tipo alfa hélice. Dicha muteína, rhlFN-α2bM70, corresponde a una molécula que exhibe un mayor contenido de estructuras glicosídicas. La glicosilación en Ia estructura alfa hélice confiere al oligosacárido ligado a Ia Asn70 mayor resistencia y como consecuencia superior estabilidad frente a Ia acción de N-glicanasas. Estos mismos resultados son obtenidos cuando se evalúa Ia estabilidad de una muteína con un sitio de glicosilación en Ia posición Asn93, también perteneciente a una estructura secundaria tipo alfa hélice (ver ejemplo 7).
La muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención en Ia forma de realización preferida correspondiente a cuatro sitios de N-glicosilación en posiciones Pro4, Arg23, Lys70 y Asp77, rhlFN-α2bM4/M23/M70/M77, presenta un perfil de glicosilación homogéneo con un alto grado de glicosilación, tal como se observa en Ia figura 3. Además se observa en Ia misma figura que esta muteína rhlFN-α2bM4/M23/M70/M77 presenta un bajo contenido de Ia isoforma O-glicosilada y de aquéllas correspondientes a un bajo grado de glicosilación. Es decir que se observa una mayor concentración de muteínas con elevado grado de ocupación en un rango de masas moleculares comprendido entre 21 y 45 kDa, más particularmente entre 30 y 45 kDa.
A partir de Ia creación de estos nuevos sitios de N-glicosilación se ha logrado mejorar Ia estabilidad de Ia citoquina in vivo comparada con cualquiera de las isoformas del rhlFN-α2b conocidas en el estado del arte. La creación de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, en una forma preferida, con cuatro sitios de N- glicosilación (rhlFN-α2bM4/M23/M70/M77) presenta un perfil de liberación en el tiempo equivalente a Ia molécula de interferón-PEG 12000 disponible comercialmente, resultando ser un producto con alto grado de N-glicosilación y con un elevado grado de homogeneidad en cuanto al perfil de glicosilación. Por otro lado es de destacar Ia relevancia de que el producto obtenido no involucra reacciones químicas o Ia adición de polímeros sintéticos.
Los resultados obtenidos de Ia medición de Ia actividad biológica en función del tiempo muestran que Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, en particular Ia correspondiente a Ia muteína con un nuevo sitio de N-glicosilación en Ia posición Lys70, presenta un incremento de 1 ,63 respecto de una muteína con un nuevo sitio de N-glicosilación en un sitio carente de estructura alfa hélice (rhlFN-α2bM23). Esto indica Ia importancia de seleccionar sitios de N-glicosilación en estructuras tipo alfa hélice.
La muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención presenta propiedades farmacocinéticas, físicas y químicas mejoradas respecto a las isoformas conocidas en el estado del arte obtenidas mediante cultivos celulares.
Una formulación farmacéutica de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención, otro objeto de Ia presente invención, para Ia administración y tratamiento de enfermedades tales como melanomas, hepatitis C crónica, hepatitis B aguda y crónica, hepatitis no-A no-B aguda y crónica, Sarcoma de Kaposi, esclerosis múltiple, verrugas genitales, leucemia, infecciones virales, entre otras, consiste en Ia preparación de un polvo, gel, crema, liofilizado, tabletas o una solución para ser administrada por una vía seleccionada del grupo comprendido por subcutánea, parenteral, oral, sublingual, intranasal o aplicación tópica. Dicha formulación, en una preparación preferida de solución, presenta concentraciones de 0,02mg/ml a 3mg/ml de masa de proteína en solución. Dichas formulaciones en solución que comprenden el interferón de Ia presente invención, además comprenden un buffer, un estabilizador, un choprotector y un solvente. Como buffers,son útiles aquellos que mantengan el pH entre 4,5 y 7,5, preferentemente entre 6,5 y 7,0, más preferentemente 6,8. Entre los buffers utilizados se mencionan citrato/ácido cítrico, acetato/ácido acético; fosfato dibásico/monobásico, preferentemente fosfato dibásico/monobásico en concentración molar entre 0,005 a 0,1 molar. Como estabilizadores preferidos son útiles los derivados del poli(oxi-1 ,2- etanedil), entre éstos, más preferentemente el mono-9-octadecenoato poli (oxi-1 ,2-etanedil), Polysorbato 80, que puede utilizarse en un rango de concentraciones de 0,01 a 1 mg/ml. Como choprotectores son útiles carbohidratos tales como sacarosa o manitol, agentes tensoactivos tales como glicerol, dimetilsulfoxido ó Tween. Preferentemente el crioprotector es un carbohidrato, más preferentemente Ia sacarosa en un rango de concentraciones que va desde 20 a 100 mg/ml.
La presente invención tiene como otro objeto el uso de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para ser usado en un protocolo terapéutico que permite reducir las dosis terapéuticas del IFN alfa 2b. Puede ser administrado como monoterapia o en forma de terapia combinada con ribavirina; como monoterapia por vía subcutánea en dosis de 0,1 microgramos/kg a 2,0 microgramos/kg del paciente por semana. Más preferentemente en dosis 0,5 microgramos/kg a 1 ,0 microgramos/kg del paciente por semana. En el caso de terapia combinada se administra una dosis de 0,5 a 3,0 microgramos/kg por semana de Ia muteína de Ia invención en combinación con ribavirina en cápsulas. Más preferentemente en dosis de 1 ,0 a 2,0 microgramos/kg por semana de Ia muteína de Ia invención en combinación con ribavirina en cápsulas.
Para una mejor comprensión de Ia presente invención se describen los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser interpretados como una limitación impuesta al alcance de Ia misma. Por el contrario, debe entenderse claramente que puede recurrirse a otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de Ia misma que luego de leerse Ia presente descripción, puede sugerir a aquellos entendidos en el tema sin apartarse del espíritu de Ia presente invención y/o alcance de las reivindicaciones anexas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Aislamiento del gen del IFN-α2b humano a partir de ADN genómico de leucocitos
El gen del hlFN-α2b se obtuvo mediante una reacción de amplificación por PCR, utilizando como molde ADN genómico obtenido a partir de leucocitos de sangre periférica humana (Sambrook y col., 1989). Para Ia reacción de PCR se emplearon oligonucleótidos específicos que hibridan en ambos extremos de Ia secuencia codificante del hlFN-α2b, denominados IFNalfaF e IFNalfaR, los cuales se indican en Ia Tabla I.
TABLA I: Oligonucleótidos empleados para Ia construcción de plásmidos conteniendo el rhlFN-α2b wild type
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El fragmento de 673 pb obtenido fue clonado en el plásmido comercial pGEM®T Easy Vector (Promega) siguiendo el protocolo descripto por el fabricante. La secuenciación de esta construcción, denominada pGEM-rhlFN-α2bι//f, confirmó Ia identidad del fragmento clonado, observándose un 100% de homología con Ia secuencia publicada en el Banco de Genes (Gen Bank) para el hlFN-α2b. En Ia Fig. 1 se observa Ia secuencia nucleotídica correspondiente al ADNc del hlFN-α2b y Ia secuencia aminoacídica correspondiente a Ia proteína codificada por el mismo.
Ejemplo 2: Selección de los aminoácidos a modificar en el gen del rhlFN-α2b para obtener nuevos sitios de N-glicosilación
Con el objetivo de seleccionar los aminoácidos a mutar de manera de crear en forma artificial sitios de N-glicosilación, se decidió en primera instancia llevar a cabo el menor número posible de cambios en Ia secuencia de aminoácidos del hlFN-α2b natural. De esta forma y recordando Ia secuencia consenso buscada (Asn-Xaa-Ser/Thr), se analizaron dos estrategias:
1 - Localización de todas las serinas y/o treoninas en Ia secuencia aminoacídica del hlFN-α2b natural, tercera posición de Ia secuencia consenso, y cambio del aminoácido que ocupa Ia primera posición por asparagina.
2- Ubicación de todas las asparaginas presentes en Ia secuencia del hlFN-α2b natural (primera posición de Ia secuencia consenso) y mutación del aminoácido en Ia tercera posición por una serina o treonina.
Una vez identificados dichos aminoácidos, se procedió a estudiar los sitios de glicosilación resultantes de las correspondientes mutaciones teniendo en cuenta dos aspectos básicos: elevada probabilidad de glicosilación y conservación de Ia actividad biológica de Ia proteína.
El primer aspecto se evaluó con el objeto de generar, en Io posible, un alto grado de ocupación de los sitios elegidos. Para ello, se llevó a cabo el siguiente análisis: a- Área superficial accesible al solvente (ASA %) del aminoácido ubicado en Ia primera posición de Ia secuencia consenso (Asn u otro aminoácido mutado por Asn). Este estudio proporcionó información con respecto al grado de exposición superficial del aminoácido presente en Ia estructura de Ia proteína al cual se uniría Ia cadena de oligosacáridos. Este parámetro se calculó utilizando el programa informático ASAview (Ahmed, S., Gromiha, M., Fawereh, H., Sorci, A., BMC Bioinformatics, 2004, 5:51 ; http://www.netasa.org/asaview/). b- Probabilidad de glicosilación teniendo en cuenta Ia información presente en bases de datos de glicoproteínas conocidas. Este parámetro se determinó empleando el programa NetNGIyc 1.0 Server (www.cbs.dtu.dk/services/NetNGIyc/) creado por el Centro de Análisis de Secuencias Biológicas (CBS, Universidad Técnica de Dinamarca).
Por otro lado, se analizaron las mutaciones seleccionadas desde el punto de vista de evitar una pérdida de Ia actividad biológica de Ia proteína. Este aspecto se estudió teniendo en cuenta dos características: a- Cercanía del sitio probable de glicosilación a Ia región molecular involucrada en Ia unión al receptor. De no tenerse en cuenta este parámetro, existiría una elevada probabilidad de generar glicoproteínas cuyas cadenas hidrocarbonadas interferirían en Ia unión al receptor, obteniéndose formas biológicamente inactivas del hlFN-α2b. b- Área superficial accesible al solvente (ASA%): Ia unión de oligosacáridos a residuos ocultos o en el interior de Ia proteína podría generar una alteración de Ia estructura terciaria de Ia misma, disminuyendo así su actividad biológica.
Los sitios posibles de ser sometidos a mutagénesis sitio dirigida para obtener una secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr son: Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158 en estructuras secundarias tipo alfa hélice y Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, Gly104, ThM 06, Lys134, GInI 58, Leu161 fuera de estructuras secundarias tipo alfa hélice.
De los sitios posibles de ser sometidos a mutagénesis sitio dirigida para obtener una secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, fueron seleccionados los aminoácidos Pro4, Arg23, Lys70 y Asp77 (se muestran en Ia figura 1 ) para obtener construcciones de rhlFN- α2b mutadas por Asn en las posiciones aminoacídicas indicadas. Estos sitios seleccionados satisficieron las pruebas y análisis mencionados anteriormente.
Ejemplo 3: Mutagénesis sitio dirigida y clonado de los genes mutados en vectores de expresión para células eucariotas
El procedimiento de mutagénesis sitio-dirigida para Ia introducción de sitios de N- glicosilación en el gen del hlFN-α2b se realizó mediante técnica de PCR en su variante extensión por solapamiento, Ia cual consistió básicamente en 2 reacciones de PCR consecutivas. La descripción de Ia técnica empleada se resume en Ia Fig. 2. Ambas etapas de PCR se llevaron a cabo en termociclador, durante 30 ciclos compuestos por las siguientes etapas: desnaturalización a 94Q C durante 1 minuto, hibridización a 60Q C durante 30 segundos y elongación a 72Q C durante 1 minuto.
Los oligonucleótidos empleados para llevar a cabo las mutaciones puntuales seleccionadas se describen en Ia Tabla II. De esta manera, se obtuvo Ia secuencia nucleotídica correspondiente a cuatro variantes mutadas del hlFN-α2b donde se incorporó un único sitio de N-glicosilación, denominadas rhlFN-α2bM4, rhlFN-α2bM23, rhlFN- α2bM70 y rhlFN-α2bM77, en las cuales los codones correspondientes a los aminoácidos Pro4, Arg23, Lys70 y Asp77 fueron sustituidos por un codón que codifica para una Asn, respectivamente.
Los fragmentos de ADN obtenidos fueron digeridos con las enzimas de restricción EcoRI y Xbal y clonados en el vector de expresión pCI-neo, obteniéndose las construcciones denominadas pCI-neo-rhlFN-α2bM4, pCI-neo-rhlFN-α2bM23, pCI-neo- rhlFN-α2bM70 y pCI-neo-rhlFN-α2bM77. Tabla II: Oliαonucleótidos empleados para Ia construcción de plásmidos conteniendo las diferentes variantes qlicosiladas
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Para Ia obtención de Ia mutante de rhlFN-α2b con cuatro sitios de N-glicosilación, denominada pCI-neo-rhlFN-α2bM4/23/70/77, se procedió a adicionar un sitio de N- glicosilación en forma secuencial empleando Ia técnica de mutagénesis sitio dirigida previamente descripta. De esta manera, se construyó una mutante con dos sitios de N- glicosilación, utilizando como molde una molécula conteniendo un sitio de N-glicosilación. Posteriormente se construyó una variante con tres sitios de N-glicosilación empleando como templado Ia molécula que contenía dos sitios de N-glicosilación. Finalmente se obtuvo Ia mutante con los cuatro sitios de N-glicosilación, realizando Ia reacción de mutagénesis sobre Ia molécula que contenía tres sitios de N-glicosilación. En cada paso se realizó el clonado de cada variante en el vector de expresión pCI-neo.
Todas las construcciones de ADN conteniendo las diferentes variantes N- glicosiladas del rhlFN-α2b fueron secuenciadas, Io que permitió verificar el éxito de las mutaciones realizadas. Ejemplo 4: Expresión transitoria de las variantes N-glicosiladas del interferón alfa humano en células CHO.K1 (Chínese Hámster Ovary)
Con el objeto de evaluar Ia integridad del gen correspondiente a cada variante del interferón alfa humano, su expresión, el grado de glicosilación de Ia citoquina y Ia actividad específica de cada variante se llevaron a cabo procedimientos de transfección de células CHO. K1 mediante técnica de lipofección con los plásmidos pCI-neo-rhlFN- α2bM4, pCI neo-rhlFN-α2bM23, pCI-neo-rhlFN-α2bM70, pCI-neo-rhlFN-α2bM77 y pCI- neo-rhlFN-α2bM4/M23/M70/M77.
Para ello, se sembraron 3.105 células. mi"1 CHO. K1 por pozo de una placa de 6 cavidades utilizando medio de cultivo para células de mamífero (MC) preparado a partir de una mezcla 1 :1 (V:V) de los medios D-MEM y Ham's F12 suplementado con NaHCO3 2,441 g/l, D(+) glucosa anhidra 6,6 mM, piruvato de sodio 1 mM, glutamina 7,8 mM, triptofano 0,13 mM, ácido aspártico 0,3 mM, serina 0,76 mM y sulfato de gentamicina 50 μg/ml. Dicho medio fue adicionalmente suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 5 % (V/V). Al día siguiente, se retiró el sobrenadante de los cultivos y Ia capa celular fue lavada empleando el medio MC. Simultáneamente, se prepararon diferentes mezclas conteniendo 10 μg de lípido catiónico (LipofectAMINE® 2000, Invitrogen) y 6 μg del correspondiente ADN plasmídico diluido en medio MC. Estas preparaciones fueron incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de ser adicionadas al cultivo celular. Posteriormente, Ia solución de lavado fue retirada de cada cavidad procediéndose al agregado de las diferentes soluciones conteniendo los liposomas las cuales fueron incubadas durante 4 horas. Transcurrido el tiempo de incubación se eliminó el sobrenadante de cultivo, adicionándose medio de cultivo suplementado con SFB al 5 %(V/V). Luego de 72 horas de incubación, el sobrenadante de cultivo fue cosechado con el fin de evaluar Ia expresión de las variantes del rhlFN-α2b glicosilado.
La evaluación de Ia expresión y grado de glicosilación de las diferentes isoformas se llevó a cabo mediante técnica de ELISA sandwich y Western Blot, respectivamente.
Ejemplo 5: Cuantificación de rhIFN α2b mediante técnica de ELISA sandwich
Placas de poliestireno de fondo plano de 96 cavidades fueron sensibilizadas con 100 μl de una solución de 1 μg.ml"1 de mAb (100 ng por cavidad) diluido en solución de carbonato/bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9,6 (solución de sensibilización). Las placas fueron incubadas durante 1 hora a 37QC y durante toda Ia noche a 4QC. Luego de lavar 6 veces con solución salina de fosfatos (PBS), Tween 20 0,05 % (V/V), las placas fueron bloqueadas con 200 μl PBS con el agregado de albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % (P/V). Posteriormente, se adicionaron 100 μl de diluciones sucesivas al medio de rhlFN- α2b no glicosilado (proteína estándar) desde 25 ng.ml"1 hasta 0,39 ng.ml"1 empleando solución de PBS, BSA 0,1 %(P/V), Tween 20 0,05 % (V/V) (solución diluyente), incubándose durante 1 hora a 37QC. Luego de los lavados correspondientes, se adicionaron 100 μl de una solución de anticuerpos policlonales de conejo anti-rhlFN-α2b diluidos 1 :2.000 con solución diluyente. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37QC. Finalmente, se agregaron 100 μl de anticuerpos de cabra anti-inmunoglobulinas de conejo conjugados con Ia enzima peroxidasa diluidos 1 :1.000 con solución diluyente, incubándose durante 1 hora a 37QC. Luego de lavar las placas, el revelado de las mismas se llevó a cabo empleando como sustrato agua oxigenada 0,12 volúmenes diluida en solución de citrato fosfato 50 mM, pH 5,3 con el agregado de o-fenilendiamina en una concentración de 3 mg.ml"1. Se adicionaron 100 μl de Ia solución de revelado a cada cavidad y las placas se incubaron en oscuridad a temperatura ambiente. Luego de incubar las placas durante 15 minutos se determinó Ia absorbancia de Ia solución presente en cada cavidad mediante lectura del color generado a 450 nm en un lector de placas de microtitulación. Los resultados de las experiencias de transfecciones transitorias demostraron Ia expresión de rhlFN-α2b recombinante para todas las variantes analizadas luego de 72 horas post-transfección
Ejemplo 6: Identificación de las variantes de rhlFN-α2b mediante técnica de Western Blot
En primera instancia, se llevó a cabo el procedimiento de electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia del reactivo dodecilsulfato de socio (SDS-PAGE) y un agente reductor de enlaces disulfuro siguiendo esencialmente el método descripto por Laemmli (1970). Para ello, las muestras fueron tratadas con solución de Tris-HCI 0,05 M, SDS 2 % (P/V), glicerol 10 % (V/V), β-mercaptoetanol 5 % (V/V), azul de bromofenol 0,05 % (P/V), pH 6,8. Las muestras fueron incubadas a 100 °C durante 3 minutos y sembradas directamente sobre el gel de apilamiento, cuya concentración de monómero/ramificante (acrilamida/bisacrilamida) fue del 5 % (P/V). El gel de separación fue polimerizado con una concentración de acrilamida/bisacrilamida del 15 % (P/V). La corrida se llevó a cabo a voltaje constante (200 mV) hasta que el frente de corrida alcanzó 0,5 cm del borde inferior del gel de separación. Luego de Ia electroforesis, se realizó Ia transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad). Se utilizó un protocolo estándar de transferencia de proteínas empleando Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20 % (V/V), pH 8,3 como solución de transferencia. La transferencia se llevó a cabo a intensidad de corriente constante de 180 mA durante 1 hora. Finalizada Ia misma, el éxito de Ia transferencia se evaluó detectando Ia presencia de proteínas con solución de Rojo Ponceau al 0,25 % (P/V) en ácido acético glacial 15 % (V/V) y metanol 40 % (V/V). Posteriormente, el colorante se eluyó por lavados sucesivos con solución salina de Tris (TBS) y Ia membrana fue bloqueada con solución de TBS, BSA 1 %(P/V). Luego de tres lavados sucesivos con solución de TBS, Ia membrana fue incubada con una solución de anticuerpos policlonales de conejo anti-rhlFN-α2b diluidos 1 :1.000 con solución diluyente (TBS, BSA 0,1 %(P/V)). Luego de los correspondientes lavados, Ia membrana fue incubada con una solución de anticuerpos de cabra anti-inmunoglobulinas de conejo conjugados con Ia enzima peroxidasa diluidos 1 :2.000 en solución diluyente. Todas las incubaciones fueron llevadas a cabo en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se procedió al revelado de Ia membrana mediante reacción de quimioluminiscencia empleando el kit comercial ECL Plus Western Blotting Reagent (GE Healthcare). La emisión de luminiscencia fue detectada mediante exposición de Ia membrana a películas fotográficas durante un período de tiempo variable. El revelado de Ia película se efectuó en forma manual empleando el método convencional de fijación y revelado fotográfico.
Todas las variantes con un único sitio susceptible de N-glicosilación exhibieron una mezcla de muteínas de I FNa de diferente masa molecular, correspondientes a fracciones no glicosiladas, O-glicosiladas y N,0-glicosiladas, siendo la proporción de cada una de ellas variable de acuerdo con Ia mutante analizada. En el caso particular de Ia muteína rhlFN-α2bM70, se observó Ia expresión de muteínas de mayor masa molecular con respecto a las restantes muteínas que incorporaron un único sitio susceptible de N- glicosilación. Dichas isoformas corresponderían a moléculas que exhiben un mayor contenido de estructuras glicosídicas. Con respecto a Ia muteína rhlFN- α2bM4/M23/M70/M77, se observó un grado de glicosilación variable con desaparición de Ia isoforma O-glicosilada y disminución de Ia proporción de aquellas correspondientes a un bajo grado de ocupación. Por otro lado, se observó una mayor concentración de isoformas con elevado grado de ocupación en un rango de masas moleculares comprendido entre 21 y 45 kDa.
En todos los casos (mutantes portando un único sitio o 4 sitios susceptibles de N- glicosilación) se confirmó Ia presencia de oligosacáridos unidos por enlaces tipo N mediante tratamiento de N-desglicosilación específica empleando Ia enzima PNGasa F (Asparagina amidasa, Biolabs). De esta manera, todas las muteínas coincidieron con bandas proteicas correspondientes a Ia variante O-glicosilada, confirmando Ia presencia de cadenas hidrocarbonadas unidas a través de enlace N-glicosídico en los sitios incorporados. La figura 3 ilustra los resultados obtenidos.
Ejemplo 7: Evaluación de Ia estabilidad las variantes Λ/-glicosiladas del hlFN-α2b en las posiciones Arg23, Asn45, Lys70 y Asn93, en presencia de Ia enzima PNGasa F (Λ/-glicanasa)
Las diferentes moléculas de hlFN-α2b, individualmente mutadas en las posiciones aminoacídicas Arg23, Leu47, Lys70 y Leu95, de manera de obtener sitios de glicosilación en las posiciones Arg23, Asn45, Lys70 y Asn93, fueron analizadas desde el punto de vista de su estabilidad en presencia de Ia enzima PNGasa F responsable de Ia liberación de oligosacáridos unidos por enlace N-glicosídico. Para ello, 350 μl de sobrenadante de cultivo correspondiente a cada una de las mencionadas mutantes fueron tratados con 250 U de PGNasa F (Biolabs) e incubado a 37°C. La reacción de desglicosilación fue inhibida a diferentes intervalos de tiempo (30, 60, 90, 120, 150, 180 y 300 minutos) tomando una alícuota de 45 μl de dicha mezcla e incubándola con 15 μl de solución de Tris-HCI 0,05 M, SDS 2 % (P/V), glicerol 10 % (V/V), β-mercaptoetanol 5 % (V/V), azul de bromofenol 0,05 % (P/V), pH 6,8 durante 5 minutos a 100°C. Al finalizar Ia reacción de desglicosilación todas las muestras fueron analizadas mediante técnica de SDS-PAGE reductor y posterior ensayo de Western Blot siguiendo las etapas esencialmente indicadas en el ejemplo 6.
Luego de revelar las membranas por reacción de quimioluminiscencia se estimó el porcentaje de isoformas N,0-glicosiladas, O-glicosiladas y no glicosiladas presentes en las muestras mediante densitometría y posterior valoración porcentual de las mismas empleando el software comercial ImageMaster TotalLab V1.1 1 (GE Healthcare, Suecia).
En Ia Fig. 4 se resumen los resultados de desglicosilación enzimática correspondientes a las 4 variantes mutadas de hlFN-α2b. La mutante IFN-α2bM23 demostró completa eliminación del enlace N-glicosídico luego de 150 minutos de incubación con Ia enzima, mientras que Ia mutante IFN-α2bM47 redujo su grado de N- glicosilación en un 50 % luego de los 30 minutos de tratamiento enzimático. Por otro lado, las mutantes IFN-α2bM70 y IFN-α2bM95 conservaron aproximadamente un 40 % de las variantes N,0-glicosilada al final del experimento, con respecto al total de formas de IFN presentes en cada muestra.
En Ia Fig. 5 se observa Ia variación porcentual de N-glicosilación en función del tiempo expresada como porcentaje de Ia misma con respecto a Ia cantidad presente al inicio del procedimiento de desglicosilación enzimática. Notoriamente, se visualiza Ia mayor estabilidad de las variantes IFN-α2bM70 y IFN-α2bM95 que conservaron una elevada proporción de dicha isoforma (90% y 70%, respectivamente) luego de 300 minutos de reacción.
Analizando Ia estructura molecular del hlFN-α2b, se observa que Ia posición aminoacídica Arg23 se halla en el inicio de un asa de conexión de dos estructuras α- hélices y Ia posición aminoacídica Phe47 se encuentra en Ia región central de otra asa de conexión, Io que Ie conferiría mayor susceptibilidad a Ia acción de Ia enzima desglicosilante. Las posiciones Arg70 y Leu95, en cambio, forman parte de una α-hélice. Este tipo de estructura conferiría a ambos sitios mayor resistencia y como consecuencia superior estabilidad a Ia acción de N-glicanasas.
Ejemplo 8: Evaluación de Ia actividad biológica antiviral in vitro de las variantes mutadas de rhlFN-α2b
La actividad biológica de las diferentes variantes del hlFN-α2b fue determinada mediante medición del efecto antiviral de las mismas sobre cultivos de células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney, ATCC CCL-22) infectados con el virus de Ia Estomatitis Vesicular (VSV), cepa Indiana (ATCC VR-158). Para ello, placas de fondo plano de 96 cavidades fueron sembrados con 100 μl de una suspensión celular de 250.000 cél.ml"1 empleando medio de cultivo MEM suplementado con L-glutamina 2 mM, bicarbonato de sodio 2,2 mg.mr1, gentamicina 50 μg.ml"1 y suero fetal bovino al 10 %(V/V) (medio de crecimiento).
La actividad biológica de las diferentes muteínas fue determinada mediante medición del efecto antiviral de las mismas sobre cultivos de células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney, ATCC CCL-22) infectados con el virus de Ia Estomatitis Vesicular (VSV), cepa Indiana (ATCC VR-158). Para ello, placas de fondo plano de 96 cavidades fueron sembrados con 100 μl de una suspensión celular de 250.000 cél.ml"1 empleando medio de cultivo MEM suplementado con L-glutamina 2 mM, bicarbonato de sodio 2,2 mg.mr1, gentamicina 50 μg.ml"1 y suero fetal bovino al 10 %(V/V) (medio de crecimiento). Las placas se incubaron durante toda Ia noche en estufa a 37QC en atmósfera de CO2 al 5% saturada de humedad. Al día siguiente, se eliminó el sobrenadante de cultivo y se agregaron 100 μl de sucesivas diluciones al medio de rhlFN-α2b no glicosilado (estándar) desde 20 U. mi"1 hasta 0,156 U. mi"1 y las correspondientes muestras a evaluar en diluciones adecuadas. Todas las diluciones se efectuaron en un medio de cultivo idéntico al de crecimiento con una concentración de SFB al 2% (V/V) (medio de ensayo). Las placas fueron incubadas en estufa durante 6 horas. Transcurrido este tiempo, se retiró el sobrenadante y las placas se lavaron mediante el empleo de medio de ensayo. Finalmente, se agregaron 100 μl de una suspensión del virus VSV preparado en medio de ensayo. Se trabajó con aquella dilución viral capaz de generar al cabo de 20-24 horas una acción citopática del 100 %. Las placas se incubaron toda Ia noche en estufa a 37QC en atmósfera de CO2 al 5% saturada de humedad. Al día siguiente, al observar una acción citopática aproximada del 100 % en aquellas cavidades controles en ausencia de IFN, se eliminó el sobrenadante de cultivo por inversión de las placas y se procedió al revelado de las mismas empleando 50 μl de solución de cristal violeta 0,75 %(P/V) en metanol 40 %(V/V). Las placas se incubaron a 37QC durante 15 minutos. Se eliminó el colorante y las placas fueron lavadas con agua destilada hasta verificar Ia ausencia de colorante en los lavados. Luego de escurrir las placas, se adicionaron 250 μl de solución de ácido acético al 20 %(V/V). Las placas fueron homogeneizadas hasta observar una coloración uniforme en cada cavidad, determinándose finalmente Ia absorbancia del colorante por mediciones espectrofotométricas a λ=540 nm.
Se determinó el parámetro actividad biológica específica (ABE) de cada molécula (Tabla III). Las mutantes rhlFN-α2bM4, rhlFN-α2bM23 y rhlFN-α2bM77 exhibieron niveles variables de actividad específica en un rango comprendido entre 160 y 290 U.ng"1. De esta manera, Ia incorporación de mutaciones en Ia secuencia proteica y/o Ia presencia de cadenas hidrocarbonadas de tipo N- no alteraron significativamente Ia actividad de dichas variantes al comparar con Ia actividad biológica específica del rhlFN-α2b no-glicosilada (entre 150 y U.ng"1). En el caso de Ia muteína rhlFN-α2bM70 se evidenció un descenso del mencionado parámetro en un 48%. Sin embargo, considerando Ia conservación de Ia actividad biológica específica de las variantes IFN-α2bM4, IFN-α2bM23 e IFN-α2bM77 y el superior grado de glicosilación de Ia muteína rhlFN-α2bM70, se obtuvo Ia correspondiente muteína portadora de los mencionados 4 sitios susceptibles de N- glicosilación. Al evaluar su actividad biológica específica (26 U.ng"1), se observó un descenso del 87% con respecto a Ia molécula no-glicosilada.
Tabla III: Evaluación de diferentes muteínas glicosiladas de rhlFN-α2b
Figure imgf000039_0001
Ejemplo 9: Obtención de líneas celulares estables productoras de rhlFN-α2b mutado
Para Ia obtención de líneas celulares estables productoras de rhlFN-α2b N- glicosilado, células CHO. K1 fueron transfectadas en forma transitoria con las diferentes construcciones siguiendo, esencialmente, las etapas descritas en el ejemplo 4. Posteriormente, los cultivos fueron sometidos a presión de selección con el antibiótico Neomicina (200 μg.ml"1) entre 72 y 168 horas post-transfección. Luego de dos semanas de cultivo en presencia del mencionado antibiótico, se cuantificaron los niveles de expresión de Ia citoquina mediante técnica de ELISA sandwich y las líneas productoras (CHO pCI-neo-rhlFN-α2bM4, CHO pCI-neo-rhlFN-α2bM23, CHO pCI-neo-rhlFN-α2bM70, CHO pCI-neo-rhlFN-α2bM77 y CHO pCI-neo-rhlFN-α2bM4/23/70/77) fueron conservadas en nitrógeno líquido. Posteriormente, las líneas celulares que conservaron Ia expresión de Ia citoquina fueron clonadas por el método de dilución límite. En Ia Tabla IV se detallan los clones seleccionados y su productividad específica en fase estacionaria. En Ia misma, se remarcan los clones de cada línea celular que demostraron mayor productividad, los cuales fueron empleados para Ia fase de producción de cada variante de rhlFN-α2b mutado.
Tabla IV: Clonado de las líneas productoras y evaluación de Ia productividad específica de los clones obtenidos
Figure imgf000040_0001
Ejemplo 10: Producción de rhlFN-α2b mutado mediante el cultivo de los clones seleccionados en condiciones de adherencia
En primera instancia, se determinó Ia productividad específica de rhlFN-α2b durante las diferentes fases del cultivo celular, exhibiendo los clones evaluados, una mayor productividad específica de Ia citoquina durante Ia fase estacionaria del cultivo.
En segundo lugar, se ensayaron diferentes concentraciones de SFB para suplementar el medio de cultivo, con el objeto de disminuir el contenido proteico de los sobrenadantes y facilitar Ia posterior purificación de Ia variante del rhlFN-α2b. Con este fin, los clones se cultivaron empleando medio de cultivo (MC) suplementado con SFB al 5% (V/V) y, cuando alcanzaron Ia fase estacionaria, el sobrenadante condicionado fue sustituido por medio de cultivo fresco conteniendo diferentes concentraciones de suero: 5%, 1 %, 0,5% y 0,1 % (V/V). Luego de 24 horas de cultivo, se observó una drástica caída de Ia productividad específica al pasar de una concentración de SFB del 5% al 1 % (V/V). Sin embargo, Ia productividad específica empleando concentraciones de SFB al 1 % y 0,5% (V/V) fue similar, seleccionándose esta última concentración de suero para llevar a cabo Ia producción. De esta manera, se logró disminuir diez veces el contenido proteico de las muestras a purificar.
Por último, se realizó una experiencia para determinar el número de recambios de medio de cultivo y el intervalo de tiempo óptimo entre los mismos con el objetivo de obtener Ia mayor masa posible de proteína recombinante. Se realizaron ocho cosechas y sus correspondientes recambios de medio de cultivo cada 24 horas y cuatro cosechas cada 48 horas en cultivos en fase estacionaria de crecimiento. Se encontró que Ia masa total acumulada del rhlFN-α2b era similar en ambas experiencias, obteniéndose una mayor concentración de Ia citoquina en los sobrenadantes cosechados cada 48 horas. En todas las experiencias anteriormente mencionadas, se evaluó Ia calidad de las proteínas producidas demostrándose que, independientemente de las condiciones ensayadas, se conservó Ia actividad biológica específica y el perfil de isoformas de masa molecular de las diferentes moléculas.
De esta manera, se procedió a Ia producción de las diferentes variantes del rhlFN- α2b empleando frascos de cultivos de 500 cm2 de superficie. Para ello, se sembraron aproximadamente 2.105 cél.ml"1 empleando medio de cultivo MC suplementado con SFB al 5% (V/V). Cuando el cultivo alcanzó Ia fase estacionaria de crecimiento se iniciaron los recambios secuenciales cada 48 y 72 horas empleando medio de cultivo MC suplementado con SFB al 0,5% (V/V). El sobrenadante de cultivo fue centrifugado a 3.000 r.p.m durante 10 minutos y conservado a -20°C para Ia posterior purificación de Ia variante correspondiente.
Ejemplo 11 : Purificación del muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia invención a partir de sobrenadantes de cultivo
La purificación de las diferentes variantes mutadas del rhlFN-α2b se realizó empleando el método de cromatografía de inmunoafinidad, utilizando como ligando el mAb seleccionado como anticuerpo de captura para Ia técnica de ELISA sandwich.
En primera instancia, se realizó Ia producción in vivo del mAb en líquido ascítico, empleando un lote de 10 ratones BALB/c hembras de 2 meses de edad. Para ello, se realizó Ia inoculación intraperitonial de 0,5 mi de ácido 2, 6, 10, 14-tetrametildecanoico (Pristane®, Sigma) a cada ratón y luego de 10 días se realizó Ia inoculación de 2.106 células de hibridoma por animal resuspendidas en 0,5 mi de PBS por Ia misma vía. El líquido ascítico fue recolectado por punción de Ia región intraperitoneal con aguja de 1 ,2 mm de diámetro, a partir de Ia primera semana posterior a Ia inoculación de hibridomas. La concentración de inmunoglobulinas murinas en el fluido ascítico se determinó mediante técnica de ELISA sandwich.
La purificación del mAb se realizó por cromatografía de afinidad empleando una columna de proteína A Sepharose High Trap de 5 mi (GE Healthcare), siguiendo Ia técnica descripta por Harlow y Lañe (1998). La concentración de inmunoglobulina pura fue calculada mediante lectura espectrofotométrica a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción porcentual (E¡^° ) de 12,5. Multiplicando 10 x (E¡^° )"1 por Ia lectura de densidad óptica se obtiene Ia concentración de mAb expresada en mg.ml"1.
El ligando de afinidad fue acoplado a una matriz de Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno siguiendo el protocolo estándar (GE Healthcare). El porcentaje de acoplamiento del mAb a Ia resina fue de un 98,3% y Ia capacidad teórica de Ia matriz fue de 186 μg de rhlFN-α2b no glicosilado por mi de gel.
El protocolo de purificación de las muteínas del rhlFN-α2b con un sitio de N- glicosilación y con cuatro sitios de N-glicosilación se describe a continuación. El sobrenadante de cultivo que contenía Ia citoquina fue acondicionado mediante el agregado de Tritón X-100 hasta alcanzar una concentración de 0,3% (V/V). La muestra acondicionada se aplicó a Ia columna previamente equilibrada con solución de Tris 0,1 M, Tritón X-100 0,3% (V/V) (pH 7,5) a un flujo de 0,5 ml.min"1. Posteriormente, se lavó con 5 volúmenes de columna empleando cada una de las siguientes soluciones:
1 -solución de NaCI 0,5 M, Tritón X-100 0,2% (V/V) en Tris 0,025 M (pH 7,5).
2-solución de NaCI 0,15 M en agua (pH 5,0). La elución del rhlFN-α2b fue evaluada empleando tres soluciones diferentes:
1 - solución de NaCI 0,15 M en ácido acético 0,2 M (pH 3,0)
2- solución de glicina 0,1 M (pH 2,5) 3- solución de glicina 0,1 M (pH 2,0).
Se recolectaron fracciones de 2 mi. Cada fracción fue neutralizada mediante el agregado de solución de Tris 1 M (pH 9,0). La matriz se conservó en solución de azida 0,02 % (P/V) en Tris 0,025 M (pH 7,5).
La presencia del rhlFN-α2b fue evaluada en todas las fracciones mediante técnica de ELISA sandwich, obteniendo un mayor porcentaje de recuperación (en un rango comprendido entre el 95% y 100 %) mediante el empleo de Ia solución de glicina 0,1 M (pH 2,0).
La eficiencia de purificación se estudió mediante Ia técnica de SDS-PAGE en condiciones reductoras con posterior tinción argéntica y ensayos de Western blot (Figura 6). El porcentaje de pureza, estimado por densitometría de bandas, fue del 85 %. Además, los ensayos de Western blot demostraron que, para ambas variantes del rhlFN-α2b, el perfil de isoformas de Ia molécula purificada fue muy similar al de Ia citoquina presente en los sobrenadantes de cultivo.
Ejemplo 12- Evaluación de los parámetros farmacocinéticos de las variantes con un único sitio de N-glicosilación denominadas rhlFN-α2bM23 y rhlFN-α2bM70 en animales de experimentación empleando Ia vía de inoculación subcutánea
Se evaluaron las propiedades farmacocinéticas de las variantes con un sitio susceptible de N-glicosilación fuera de regiones α-hélice (rhlFN-α2bM23) y formando parte de una α-hélice (rhlFN-α2bM70), empleando Ia vía de inoculación subcutánea. Para tal fin, ratas Wistar hembras, de dos meses de edad, con un peso promedio de 200 g fueron inoculadas con las mencionadas variantes de IFN empleando una dosis única de 5 x 105 U. Kg"1 de peso corporal del animal. Posteriormente, a diferentes tiempos post inyección se recolectaron muestras de sangre mediante punción de Ia vena retroorbital empleando capilares heparinizados y se determinó Ia presencia de Ia citoquina cuantificando su actividad biológica volumétrica. Con los datos obtenidos se gráfico actividad biológica de cada muestra en función del tiempo (Fig. 7). El mismo experimento se llevó a cabo empleando Ia molécula de IFN wild type (rhlFN-α2bwt).
El cálculo del área debajo de las curvas (AUC) de actividad biológica en función del tiempo correspondiente a Ia variante glicosilada rhlFN-α2bM70 demostró un incremento en una magnitud de 1 ,63 veces con respecto a Ia variante rhlFN-α2bM23.
Ejemplo 13: Evaluación de parámetros farmacocinéticos de las diferentes variantes de rhlFN-α2b en animales de experimentación
13-a)- Vía de inoculación endovenosa
Con el propósito de evaluar Ia influencia de Ia porción glicosídica sobre los parámetros farmacocinéticos de las variantes glicosiladas de rhlFN-α2b se seleccionó Ia variante rhlFN-α2bM77 (representante de las moléculas con un único de sitio susceptible de Λ/-glicosilación fuera de una estructura alfa-hélice) y Ia muteína rhlFN-α2bM4/23/70/77. Los estudios se realizaron en comparación con Ia molécula de rhlFN-α2b producida en bacterias (no-glicosilada) y Ia versión conjugada covalentemente con una molécula de polietilenglicol (PEG) de 12 kDa (rhlFN-α2b-PEG 12kDa; Schering Plough). Para tal fin, ratas Wistar hembras, de dos meses de edad, con un peso promedio de 200 g fueron inoculadas con una dosis única de 52,6 pmol de cada variante de IFN por animal empleando, en primera instancia, Ia vía de administración endovenosa (vena de Ia cola). En dicho ensayo, se utilizaron lotes de 4 animales por cada variante estudiada. Posteriormente, a diferentes tiempos post-inyección se recolectaron muestras de sangre mediante punción de Ia vena retroorbital empleando capilares heparinizados. A partir de las mismas, se determinó Ia presencia de Ia citoquina cuantificando su actividad biológica volumétrica (AB) mediante el ensayo de valoración de Ia actividad biológica in vitro anteriormente mencionado. Con los datos obtenidos se calculó el porcentaje de actividad biológica remanente en cada muestra con respecto a las unidades de actividad biológica de IFN suministrada a cada rata y se gráfico dicho porcentaje en función del tiempo transcurrido desde su inoculación (Fig.8).
El comportamiento de las diferentes moléculas se ajustó adecuadamente a un modelo bicompartimental, el cual se rige por Ia siguiente ecuación: C = A . e "t/t1 + B . e "^2, donde C es Ia fracción del fármaco remanente en Ia circulación al tiempo t, A y t1 son parámetros de Ia fase inicial que reflejan Ia distribución de Ia proteína a los fluidos extravasculares del organismo, mientras que B y t2 son parámetros que caracterizan Ia fase terminal de eliminación del fármaco.
De esta manera, se realizó un ajuste de regresión para todas las curvas obtenidas, determinándose los parámetros farmacocinéticos que se detallan en Ia Tabla V. Tabla V. Evaluación de parámetros farmacocinéticos de las diferentes variantes de rhlFN-α2b.
Figure imgf000046_0001
En dicha Tabla, se observa que el tiempo de vida media de Ia fase inicial (el cual es proporcional a t1 ) de las moléculas de rhlFN-α2b no-glicosilado e rhlFN-α2bM77 es similar entre sí resultando inferior con respecto al calculado para las variantes rhlFN- α2bM4/23/70/77 y rhlFN-α2b-PEG. Por otro lado, el tiempo de vida media correspondiente a Ia fase de eliminación fue superior para Ia variante de rhlFN-α2bM4/23/70/77.
Teniendo en cuenta las variantes no glicosiladas y glicosiladas de IFN, se observó un descenso del clearance plasmático a medida que se incrementó el contenido de hidratos de carbono. En el caso particular de Ia variante rhlFN-α2bM4/23/70/77, se visualizó una reducción en dicho parámetro en una magnitud de 9 veces con respecto a Ia molécula de rhlFN-α2b no modificada. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas en el cálculo del clearance plasmático correspondiente a las moléculas de rhlFN-α2bM4/23/70/77 y rhlFN-α2b-PEG.
12 b)-Vía de inoculación subcutánea
Adicionalmente, se evaluaron las propiedades farmacocinéticas de Ia muteína con cuatro sitios susceptibles de N-glicosilación (IFN-α2bM4/23/70/77) empleando Ia vía de inoculación subcutánea. Para tal fin, ratas Wistar hembras, de dos meses de edad, con un peso promedio de 200 g fueron inoculadas con Ia mencionada variante de IFN empleando una dosis única de 5 x 105 U. Kg"1 de peso corporal del animal. Simultáneamente, se inocularon animales con idéntica dosis de rhlFN-α2b no glicosilado ó rhlFN-α2b-PEG 12kDa. Posteriormente, a diferentes tiempos post inyección se recolectaron muestras de sangre mediante punción de Ia vena retroorbital empleando capilares heparinizados. A partir de las mismas, se determinó Ia presencia de Ia citoquina cuantificando su actividad biológica volumétrica mediante el ensayo de valoración de Ia actividad biológica in vitro anteriormente mencionado. Con los datos obtenidos se gráfico actividad biológica de cada muestra en función del tiempo (Fig. 9). El cálculo del área debajo de las curvas (AUC) de actividad biológica en función del tiempo correspondiente a Ia variante N-glicosilada rhlFN-α2bM4/23/70/77 demostró un incremento en una magnitud de 37 veces con respecto a Ia variante no glicosilada de Ia citoquina. Simultáneamente, Ia citoquina glicosilada alcanzó una concentración máxima de actividad biológica a partir de Ia primera hora post-inyección manteniéndose aproximadamente constante durante 10 horas. Dicha concentración máxima fue superior a Ia alcanzada por Ia variante no glicosilada, Ia cual se evidenció como un pico de concentración luego de 30 minutos posteriores a Ia inoculación de Ia misma. Finalmente, los niveles de actividad biológica de esta última variante se tornaron no detectables luego de 4 horas post-inyección.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiendo así especialmente descrito y determinado Ia naturaleza de Ia presente invención y Ia forma como Ia misma ha de ser llevada a Ia práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:
I . Una muteína recombinante del interferón alfa humano con al menos un sitio de glicosilación en una posición de su secuencia aminoacídica caracterizada porque dicha posición forma parte de una estructura secundaria tipo alfa hélice.
2. La muteína recombinante del interferón alfa humano de Ia reivindicación 1 caracterizada porque dicho sitio de glicosilación es un sitio de N-glicosilación.
3. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 2 caracterizada porque dicho sitio de N-glicosilación se encuentra en una secuencia consenso de glicosilación.
4. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 3 caracterizada porque dicha secuencia consenso es Ia secuencia Asn- Xaa-Ser/Thr.
5. La muteína recombinante del interferón alfa humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque dicho interferón alfa humano es del tipo 2b.
6. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 caracterizada porque dicha posición que forma parte de una estructura secundaria tipo alfa hélice es seleccionada del conjunto de posiciones comprendido por Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, GIu1 13, Arg125, Met148, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156.
7. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque además posee al menos un sitio de glicosilación en una posición fuera de una estructura tipo alfa hélice.
8. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 7 caracterizada porque dicho sitio de glicosilación en una posición fuera de una estructura secundaria tipo alfa hélice es seleccionada del conjunto comprendido por las posiciones Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, ThM 06, Lys134, Gln158, Leu161.
9. La muteína recombinante del interferón alfa humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque comprende un sitio de N-glicosilación.
10. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 9 caracterizada porque dicho sitio de N-glicosilación es seleccionado del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156.
1 1. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 9 caracterizada porque dicho sitio de N-glicosilación es seleccionado del conjunto comprendido por las posiciones Lys70, Asn93 y GIu1 13.
12. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 9 caracterizada porque dicho sitio de N-glicosilación es Ia posición Lys70.
13. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 caracterizada porque comprende dos sitios de N-glicosilación.
14. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 13 caracterizada porque dichos sitios de N-glicosilación son seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, GIyI 04, Thr106, Lys134, GInI 58, Leu161.
15. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 13 caracterizada porque posee un sitio de N-glicosilación en Ia posición Lys70 y un sitio de N-glicosilación en una posición fuera de una estructura secundaria tipo alfa hélice seleccionado del conjunto comprendido por las posiciones Pro4, Arg23 y Asp77.
16. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 caracterizada porque comprende tres sitios de N-glicosilación.
17. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 16 caracterizada porque dichos sitios de N-glicosilación son seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, GIyI 04, ThM 06, Lys134, GInI 58, Leu161.
18. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 17 caracterizada porque posee un sitio de N-glicosilación en Ia posición Lys70 y dos sitio de glicosilación seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Pro4, Arg23 y Asp77.
19. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 caracterizada porque comprende cuatro sitios de N-glicosilación.
20. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 19 caracterizada porque dichos sitios de N-glicosilación son seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, Gly104, ThM 06, Lys134, Gln158, Leu161
21. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 19 caracterizada porque dichos sitios de N-glicosilación involucran las posiciones Pro4, Arg23, Lys70 y Asp77.
22. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 caracterizada porque comprende cinco sitios de N-glicosilación.
23. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 22 caracterizada porque dichos sitios de N-glicosilación son seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Leu9, Arg12, Asn65, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Asn93, Glu1 13, Arg125, Metí 48, Ser150, SeM 52, Leu153, Asn156, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Asn45, Ala50, Asp77, GIyI 04, Thr106, Lys134, GInI 58, Leu161.
24. La muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 23 caracterizada porque los sitios de glicosilación son seleccionados del conjunto comprendido por las posiciones Pro4, Arg23, Lys70, Asp77, Asn93 y GIu113.
25. Un gen que codifica para una muteína recombinante del interferón alfa humano caracterizado porque dicho gen comprende al menos una mutación sitio dirigida que genera un sitio de N-glicosilación involucrado en una estructura alfa hélice.
26. El gen de Ia reivindicación 25 caracterizado porque dicho sitio de N- glicosilación es una secuencia consenso tipo Asn-Xaa-Ser/Thr.
27. El gen de las reivindicaciones 25 y 26 caracterizado porque dicho interferón alfa humano es del tipo 2b.
28. El gen de las reivindicaciones entre 25 y 27 caracterizado porque dicha mutación sitio dirigida se realiza en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por los aminoácidos Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, Ser152, Leu153, GInI 58.
29. El gen de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 caracterizado porque dicho gen presenta además al menos una mutación sitio dirigida que genera una secuencia consenso tipo Asn-Xaa-Ser/Thr, donde Ia Asn es susceptible de sufrir una unión N-glicosídica con un oligosacárido y está fuera de una estructura secundaria tipo alfa hélice.
30. El gen de Ia reivindicación 29 caracterizado porque dicha mutación sitio dirigida, que genera un sitio de N-glicosilación fuera de una estructura secundaria tipo alfa hélice, se realiza en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Ala50, Leu66, Phe67, Asp77, Gly104, ThM 06, Lys134, Gln158, Leu161.
31. El gen de acuerdo con las reivindicaciones 25 a 30 caracterizado porque tiene una mutación dirigida.
32. El gen de acuerdo con Ia reivindicación 31 caracterizado porque dicha mutación se realiza en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por los aminoácidos Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, Ser150, SeM 52, Leu153, Gln158.
33. El gen de las reivindicación 31 caracterizado porque dicha mutación se realiza en el aminoácido de Ia posición Lys70.
34. El gen de acuerdo con las reivindicaciones 25 a 30 caracterizado porque tiene dos mutaciones sitio dirigida.
35. El gen de acuerdo con Ia reivindicación 34 caracterizado porque dichas mutaciones se realizan en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por los aminoácidos Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, GIyI 04, Thr106, Lys134, Leu161.
36. El gen de acuerdo con Ia reivindicación 34 caracterizado porque dichas mutaciones se realizan en el aminoácido correspondiente a Ia posición Lys70 y en un aminoácido seleccionado del conjunto comprendido por los aminoácidos Pro4, Arg23 y Asp77.
37. El gen de acuerdo con las reivindicaciones 25 a 30 caracterizado porque tiene tres mutaciones sitio dirigida.
38. El gen de acuerdo con Ia reivindicación 37 caracterizado porque dichas mutaciones se realizan en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por los aminoácidos Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, GIyI 04, ThM 06, Lys134, Leu161.
39. El gen de acuerdo con Ia reivindicación 37 caracterizado porque dichas mutaciones puntuales se realizan en el aminoácido correspondiente a Ia posición Lys70 y a dos de los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por los aminoácidos Pro4, Arg23 y Asp77.
40. El gen de acuerdo con las reivindicaciones 25 a 30 caracterizado porque tiene cuatro mutaciones sitio dirigida.
41. El gen de acuerdo con Ia reivindicación 40 caracterizado porque dichas mutaciones se realizan en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por los aminoácidos Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, SeM 50, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, GIyI 04, ThM 06, Lys134, Leu161.
42. El gen de acuerdo con Ia reivindicación 40 caracterizado porque dichas mutaciones se realizan en los aminoácidos correspondientes a las posiciones Lys70, Pro4, Arg23 y Asp77.
43. El gen de acuerdo con las reivindicaciones 25 a 30 caracterizado porque tiene cinco mutaciones sitio dirigida.
44. El gen de acuerdo con Ia reivindicación 43 caracterizado porque dichas mutaciones se realizan en los aminoácidos seleccionados del conjunto comprendido por los aminoácidos Leu9, Arg12, Leu66, Phe67, Lys70, Asp71 , Phe84, Leu95, GIu1 13, Arg125, Metí 48, Ser150, SeM 52, Leu153, Gln158, Pro4, Thr6, Arg23, Leu26, Phe47, Ala50, Asp77, GIyI 04, Thr106, Lys134, Leu161.
45. El gen de acuerdo con Ia reivindicación 43 caracterizado porque dichas mutaciones se realizan en los aminoácido seleccionados del conjunto comprendido por los aminoácidos Lys70, Pro4, Arg23, Asp77, Leu95 y GIu1 13.
46. Un método para producir el gen de las reivindicaciones 25 a 45 que codifica a Ia muteína del interferón humano de Ia invención caracterizado porque comprende los pasos: a)- clonar el gen que codifica para el interferón alfa humano 2b en un vector adecuado para su amplificación, b)- producir el gen que codifica Ia muteína del interferón alfa humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 mediante Ia técnica de mutagénesis sitio dirigida, c)- clonar el gen modificado genéticamente obtenido en el paso b, en un vector de expresión eucariota adecuado.
47. Un método para producir una línea celular eucariota productora de Ia muteína recombinante de interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 24 caracterizado porque comprende los pasos de: a)- transformar o transfectar dicha célula eucariota con dicho vector de expresión eucariota. b)- seleccionar aquel clon que exprese Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 24.
48. El método de Ia reivindicación 47 caracterizado porque Ia línea celular eucahota comprende a una línea celular derivada de Ia línea CHO. K1.
49. Un procedimiento para producir Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 caracterizado porque comprende los pasos de: a)- cultivar dicha célula eucariota transformada o transfectada con un vector de expresión que contiene el gen que codifica para Ia muteína del interferón alfa humano de las reivindicaciones 1 a 24. b)- aislar Ia muteína recombinante del interferón alfa humano excretada al medio de cultivo.
50. Un procedimiento para purificar Ia muteína del interferón humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 presente en el medio de cultivo de Ia reivindicación 49 caracterizado porque Ia purificación de dicha muteína se realiza mediante cromatografía de inmunoafinidad.
51. Un método para producir el gen de las reivindicaciones 25 a 45 que codifica a Ia muteína del interferón humano de Ia invención caracterizado porque comprende los pasos: a)- clonar el gen que codifica para el interferón alfa humano 2b en un vector adecuado para su amplificación, b)- producir el gen que codifica Ia muteína del interferón alfa humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 mediante Ia técnica de mutagénesis sitio dirigida, c)- clonar el gen modificado genéticamente obtenido en el paso b, en un vector de expresión procariota adecuado.
52. Un método para producir Ia muteína recombinante del interferón humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 caracterizado porque comprende los pasos de: a)- transformar o transfectar una célula procariota con vector de expresión procariota adecuando. b)-seleccionar aquel clon que exprese el polipéptido de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 24. c)-cultivar dicho clon, transformado o transfectado, con dicho vector de expresión procariota adecuado que contiene el gen que codifica para Ia muteína del interferón alfa humano de las reivindicaciones 1 a 24. d)-purificar el polipéptido de Ia muteína del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 24. e)-glicosilar "in vitro"e\ polipéptido de Ia muteína del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 24. impurificar Ia muteína del interferón alfa humano de las reivindicaciones 1 a 24.
53. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos una muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
54. La composición de acuerdo con Ia reivindicación 53 caracterizada porque además contiene excipientes farmacológicamente aceptables.
55. La composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 53 ó 54 caracterizada porque dicha composición es administrada para el tratamiento de melanomas, hepatitis C crónica, hepatitis B aguda y crónica, hepatitis no-A no-B aguda y crónica, Sarcoma de Kaposi, esclerosis múltiple, verrugas genitales, leucemia, infecciones virales.
56. La composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 53 a 55 caracterizada porque dicha composición es administrada a un mamífero, preferentemente humano, en una dosis de entre 0,1 y 2,0 μg/Kg semanal.
57. La composición de acuerdo con las reivindicaciones 53 a 56 caracterizada porque es administrada en combinación con ribavirina.
58. Un método para el tratamiento de melanomas, hepatitis C crónica, hepatitis B aguda y crónica, hepatitis no-A no-B aguda y crónica, Sarcoma de Kaposi, esclerosis múltiple, verrugas genitales, leucemia, infecciones virales, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero, preferentemente humano, que Io necesite una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos una muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 24, y en donde dicha composición comprende además excipientes farmacológicamente aceptables.
59. El método de acuerdo con Ia reivindicación 8, caracterizado porque Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 es administrada por una vía seleccionada del grupo comprendido por subcutánea, parenteral, oral, sublingual, intranasal, tópica.
60. El método de acuerdo con las reivindicaciones 58 a 59, caracterizado porque Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 es administrada en una dosis de entre 0,1 y 2.0 μg/Kg semanal.
61. El uso de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para elaborar un medicamento para el tratamiento de melanomas, hepatitis C crónica, hepatitis B aguda y crónica, hepatitis no-A no-B aguda y crónica, Sarcoma de Kaposi, esclerosis múltiple, verrugas genitales, leucemia, infecciones virales.
62. El uso de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 61 caracterizado porque dicho medicamento es administrado en una dosis de entre 0,1 y 2.0 μg/Kg semanal.
63. El uso de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 61 caracterizado porque dicho medicamento es administrado en una dosis de entre 05 y 1.0 μg/Kg semanal en combinación con ribavirina.
64. El uso de Ia muteína recombinante del interferón alfa humano de acuerdo con Ia reivindicación 61 caracterizado porque dicho medicamento es administrado por una vía seleccionada del grupo comprendido por las vías subcutánea, parenteral, oral, sublingual e intranasal, tópica.
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