ES2452640T3 - Complejo de interferón beta - Google Patents
Complejo de interferón beta Download PDFInfo
- Publication number
- ES2452640T3 ES2452640T3 ES04772408.3T ES04772408T ES2452640T3 ES 2452640 T3 ES2452640 T3 ES 2452640T3 ES 04772408 T ES04772408 T ES 04772408T ES 2452640 T3 ES2452640 T3 ES 2452640T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- interferon
- complex
- polyethylene glycol
- peg
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 title claims description 204
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 title claims description 190
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 title claims description 150
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 149
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 149
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 71
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 40
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 29
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 24
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 12
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 5
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract 3
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 claims abstract 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- -1 hydroxysuccinimide ester Chemical class 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 claims 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 abstract description 23
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 abstract description 23
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 abstract description 22
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 16
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 8
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 8
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 7
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 102000007445 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Human genes 0.000 description 4
- 108010086241 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SFPRJVVDZNLUTG-OWLDWWDNSA-N Ala-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SFPRJVVDZNLUTG-OWLDWWDNSA-N 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HBUJSDCLZCXXCW-YDHLFZDLSA-N Asn-Val-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HBUJSDCLZCXXCW-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000009043 Chemical Burns Diseases 0.000 description 1
- 208000018380 Chemical injury Diseases 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- VKAWJBQTFCBHQY-GUBZILKMSA-N Cys-Gln-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)N VKAWJBQTFCBHQY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- JESJDAAGXULQOP-CIUDSAMLSA-N Gln-Arg-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)CN=C(N)N JESJDAAGXULQOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VZRAXPGTUNDIDK-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N VZRAXPGTUNDIDK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HHRAEXBUNGTOGZ-IHRRRGAJSA-N Gln-Phe-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HHRAEXBUNGTOGZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N Glu-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- QOOFKCCZZWTCEP-AVGNSLFASA-N Glu-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O QOOFKCCZZWTCEP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HMDDEJADNKQTBR-BZSNNMDCSA-N Leu-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O HMDDEJADNKQTBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N Leu-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HDHQQEDVWQGBEE-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HDHQQEDVWQGBEE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N Lys-Asp-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RZHLIPMZXOEJTL-AVGNSLFASA-N Lys-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N RZHLIPMZXOEJTL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 1
- UAPZLLPGGOOCRO-IHRRRGAJSA-N Met-Asn-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N UAPZLLPGGOOCRO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N Met-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 1
- 101100068676 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gln-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- XWBJLKDCHJVKAK-KKUMJFAQSA-N Phe-Arg-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N XWBJLKDCHJVKAK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N Pro-Glu-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- KAAPNMOKUUPKOE-SRVKXCTJSA-N Ser-Asn-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KAAPNMOKUUPKOE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)CC1=CN=CN1 LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N Thr-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- FMOSEWZYZPMJAL-KKUMJFAQSA-N Tyr-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N FMOSEWZYZPMJAL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WYOBRXPIZVKNMF-IRXDYDNUSA-N Tyr-Tyr-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WYOBRXPIZVKNMF-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- UBTBGUDNDFZLGP-SRVKXCTJSA-N Val-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N UBTBGUDNDFZLGP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- 229940124532 absorption promoter Drugs 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012052 hydrophilic carrier Substances 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012051 hydrophobic carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 229960002900 methylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 210000000538 tail Anatomy 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/215—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Procedimiento para producir un complejo de interferón b que tiene un polietilenglicol unido de manera específica ycovalente a un residuo de lisina en las posiciones 19 ó 134 en la secuencia de aminoácidos del interferón b o en lacorrespondiente posición a las mismas en una secuencia de aminoácidos de un mutante del interferón b, quecomprende: unir de manera específica y covalente polietilenglicol, que tiene un peso molecular de 10.000 o superiory está activado con un grupo funcional reactivo con un grupo amino, a un residuo de lisina del interferón b según laSEQ ID NO: 1 o un mutante del interferón b según la SEQ ID NO: 1 que presenta una deleción, sustitución o adiciónde uno o varios aminoácidos, en presencia, como mínimo, de un aditivo a una concentración del 1-50% en pesoseleccionado del grupo que comprende oligosacáridos que tienen 5 o menos unidades de azúcar, monosacáridos,sus correspondientes alcoholes de azúcares y alcoholes polihídricos C2-6, a pH 5,0-8,5; y extraer, después de lareacción de unión, el interferón b no reaccionado, el polietilnglicol y los subproductos mediante la utilización de unportador de intercambio iónico para purificar y concentrar el complejo de interferón b que tiene polietilenglicol unidode manera específica y covalente a un residuo de lisina en las posiciones 19 ó 134 en la secuencia de aminoácidosdel interferón b o en la correspondiente posición a las mismas en una secuencia de aminoácidos de un mutante delinterferón b, en el que el complejo interferón b mantiene una actividad del 10% o superior de la actividad antiviral delinterferón b que no se ha unido a un polietilenglicol, cuando la actividad antiviral del interferón b se determinamediante un bioensayo utilizando células FL de amniocitos humanos y el virus sindbis o el virus de la estomatitisvesicular combinados.
Description
Complejo de interferón beta
Sector técnico
La presente invención se refiere a un complejo de interferón β que tiene polietilenglicol unido de manera específica a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 en la secuencia de aminoácidos del interferón β y a un procedimiento de producción del mismo.
Técnica anterior
Es conocido que los polímeros solubles en agua, tales como el polietilenglicol, cuando se unen a biomoléculas tal como se tipifica para los fármacos de proteínas, confieren utilidad clínica de varias maneras que provocan efectos, tales como una estabilidad física y térmica mejorada, resistencia a proteasa y solubilidad, así como una volumen de distribución in vivo disminuida y una retención mejorada en la sangre (véase, Inada y otros, J. Bioact and Compatible Polymers 5, 343 (1990); Delgado y otros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, 249 (1992); y Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10, 91 (1993)).
Existe un conjunto de procedimientos para unir el interferón β natural o el interferón β que tiene una estructura primaria idéntica a la del interferón β natural a un polímero soluble en agua de polietilenglicol (PEG). Por ejemplo, Katre y otros han aplicado la modificación del grupo amino de la lisina o similar a la PEGilación del interferón β (véanse, las patentes de Estados Unidos Nos. 4766106 y 4917888 y la publicación internacional No. WO87/00056). De manera específica, han dado a conocer un conjugado obtenido mediante la unión de un polímero soluble en agua (PEG) con un peso molecular de 300 a 100.000 al interferón β recombinante o IL-2 a través de 1 a 10 residuos de lisina en la secuencia de aminoácidos del mismo. De manera alternativa, se ha dado conocer una técnica para unir PEG a un grupo amino en una linfoquina en "Chemically modified lymphokine and production thereof" (“Linfoquina modificada químicamente y producción de la misma”) (véase, publicación de la patente de Japón (Kokai) No. 60-226821A (1985)). Sin embargo, en realidad, el interferón β unido con PEG mediante estos procedimientos presenta una actividad de interferón β disminuida a menos del 10% y no puede ser de uso práctico.
Previamente no se ha descrito una técnica para unir selectivamente el PEG al grupo amino de una lisina particular en el interferón β. Si es posible seleccionar y modificar de manera específica una lisina que minimiza la tasa de reducción en la actividad biológica del interferón β causada por la unión a PEG, la reducción en la cantidad total de proteínas administradas como un fármaco conduce a menos efectos secundarios para los pacientes y, además, a un control de calidad más sencillo.
Por otro lado, también se conoce un procedimiento que utiliza una alquilación reductora sin implicar residuos de lisina para unir de manera selectiva un polímero soluble en agua al extremo amino terminal del interferón a través de una reacción a pH adecuado para la activación selectiva del grupo α-amino del extremo amino terminal del interferón (véase, la publicación de patente de Japón (Kokai) No. 9-25298A (1997)). Sin embargo, en realidad, la PEGilación del interferón β mediante este procedimiento no proporciona una monoPEGilación y provoca una PEGilación no selectiva en cualquier residuo de lisina o el extremo N terminal, dando lugar a la generación de una mezcla heterogénea sin una actividad antiviral y una actividad inhibidora del crecimiento celular suficientes.
De manera más destacada, también se conoce que el interferón β purificado unido por el extremo N terminal con PEG presenta una actividad restante (proporción con respecto a la actividad del interferón β antes de la unión) disminuida de manera drástica cuando el PEG tiene un peso molecular superior a 20.000 y carece completamente de actividad cuando el PEG tiene un peso molecular de 40.000, tal como se da a conocer por Pepinsky y otros (véase, Pepinsky y otros, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, volumen 297, págs. 1059-1066, (2001)).
En cuanto al interferón α, Bailon y otros han producido interferón α monoPEGilado de manera no selectiva en el residuo de lisina con un polímero de PEG ramificado con un peso molecular de 40.000 (Bailon y otros, Bioconjugate Chem. 12, 195 (2001)). Sin embargo, han dado a conocer que la actividad restante del interferón α unido con PEG con un peso molecular, como máximo, de 40.000, disminuye significativamente como en el caso con el interferón β unido por el extremo N terminal con PEG, y es del 7%.
A saber, es difícil aplicar de forma directa técnicas (el número y posición del PEG unido) que se han desarrollado para la modificación de un PEG de peso molecular bajo a PEG con un peso molecular elevado. De este modo, se requiere una técnica nueva para producir un complejo de interferón β muy activo unido con PEG con un peso molecular necesario para obtener de manera suficiente efectos, tales como una vida media circulatoria in vivo prolongada y unos valores disminuidos de depuración que conducen a la utilidad como fármaco.
Tal como se ha descrito anteriormente, hasta ahora no se ha dado a conocer una selección de un residuo de lisina
para modificarse para evitar la reducción en la actividad del interferón β unido con un polímero soluble en agua de peso molecular elevado ni una técnica para este objetivo. Además, no se ha dado a conocer que la unión selectiva de un polímero soluble en agua de peso molecular elevado, tal como PEG, a cualquiera de los 11 residuos de lisina presentes en el interferón β produzca un complejo de interferón β muy activo.
El documento WO 01/15736 A2 da a conocer un conjugado que muestra una actividad de interferón β y que comprende, como mínimo, un primer grupo no polipeptídico unido de forma covalente a un polipéptido interferón β.
El documento WO 01/48052 A1 da a conocer polialquilenglicoles ramificados que tienen un peso molecular que varía de 500 a 1.000.000, así como conjugados de polialquilenglicoles ramificados e interferones, tales como el interferón β.
Características de la invención
Un objetivo de la presente invención es encontrar una estructura de un complejo de interferón β que no tenga deficiencias en la actividad biológica, incluso mediante la modificación con una sustancia de peso molecular elevado, tal como polietilenglicol, y dar a conocer un procedimiento para producir dicho complejo con una eficacia elevada. De manera particular, un objetivo de la presente invención es obtener un complejo de interferón β en el que se mantenga el 10% o más de la actividad del interferón β incluso mediante la unión de PEG con un peso molecular, como máximo, de 40.000.
Los presentes inventores han llevado a cabo un conjunto de estudios para conseguir los objetivos y, en consecuencia, han encontrado que un complejo de interferón β, según la reivindicación 7, logra los objetivos indicados anteriormente.
El residuo de lisina localizado en la posición 19 se ha indicado previamente como uno de los residuos de lisina que deben eliminarse cuando el PEG se une al grupo amino del interferón β (véase la publicación internacional No. WO01/15736). Por lo tanto, este sitio de unión no puede esperarse a partir de técnicas convencionales. En cuanto al residuo de lisina localizado en la posición 134, tampoco se ha dado a conocer hasta ahora que la unión selectiva a este sitio de una sustancia modificadora con un peso molecular elevado minimice la reducción en la actividad de interferón β.
A saber, la presente invención da a conocer un procedimiento para producir un complejo de interferón β según la reivindicación 1.
El complejo de interferón β de la presente invención presenta una solubilidad en sangre, una actividad de interferón β y una estabilidad física y biológica elevadas, y es útil como fármaco en el tratamiento, la prevención y el alivio de todos los síntomas y enfermedades a los que se aplica el interferón β.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama que muestra la separación y purificación en una columna Poros HS de un complejo de interferón β que tiene polietilenglicol unido al grupo amino de la lisina localizada en la posición 19. En el dibujo, la flecha superior indica la proporción de disolvente B mezclado y la flecha inferior indica la absorbancia a 280 nm;
la figura 2 es un diagrama que muestra el resultado del análisis de los componentes de los picos 1 a 4 (en el dibujo,
(i) a (iv)) obtenidos mediante la separación y purificación en una columna Poros HS de un complejo de interferón β que tiene polietilenglicol unido al grupo amino de la lisina localizada en la posición 19, en la que los componentes se separan mediante SDS-PAGE y, a continuación, se analizan mediante tinción con plata;
la figura 3 es un diagrama que muestra la separación y purificación en una columna SP-5PW de un complejo de interferón β que tiene polietilenglicol unido al grupo amino de la lisina localizada en la posición 19;
la figura 4 es un diagrama que muestra la secuencia de aminoácidos del interferón β y los sitios de escisión previstos por la lisil endopeptidasa en la misma;
la figura 5 es un diagrama que muestra el mapa peptídico (tratado con lisil endopeptidasa) de los componentes eluidos de los picos 2 a 4 (en el dibujo, indicados por (ii) a (iv)) separados con la columna SP-5PW después de la reacción de unión con PEG con un peso molecular de 40K, así como el mapa peptídico del interferón β (en el dibujo, indicado por Pre en la parte más inferior) antes de la reacción con PEG;
la figura 6 es un diagrama que muestra la retención, en sangre de conejo, del interferón β que tiene PEG con un peso molecular de 40K unido a la lisina localizada en la posición 19;
la figura 7 es un diagrama que muestra la evolución con el tiempo de la inducción de un marcador farmacológico (actividad de 2-5A sintetasa) en un conejo por el interferón β que tiene PEG con un peso molecular de 40K unido a la lisina localizada en la posición 19;
la figura 8 es un diagrama que muestra el resultado de analizar las fracciones de los picos obtenidas mediante la separación con la columna TOYOPEARL CM 650 de un complejo de interferón β que tiene polietilenglicol unido al grupo amino de la lisina localizada en la posición 134, en el que las fracciones se analizan mediante SDS-PAGE (A), y la fracción del pico 3 (en el dibujo, (iii)), se analiza adicionalmente con la columna SP-5PW (B) (cada uno de los cromatógrafos se representó de abajo a arriba en el orden de elución);
la figura 9 es un diagrama que muestra las actividades de un complejo de interferón β PEGilado de manera múltiple de forma no selectiva con 2 o más moléculas de PEG y un complejo de interferón β monoPEGilado con PEG unido de manera selectiva a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134. En el dibujo, se muestran, con correspondencia entre los mismos, un cromatograma obtenido con la columna TOYOPEARL CM 650(S) (Tosoh) (B), el resultado del análisis SDS-PAGE correspondiente a cada fracción separada (A) y el valor de la actividad antiviral por la cantidad de proteínas de cada fracción y la tasa de retención de la actividad en relación con la actividad específica de IFN-β antes de la unión a PEG (C); y
la figura 10 es un diagrama que muestra la retención, en sangre, de un complejo de IFN-β unido a PEG de peso molecular de 20.000 (20K) o 40.000 (40K), que se ha administrado por vía intravenosa en un conejo.
El presente documento comprende contenidos descritos en el documento de la solicitud de patente de Japón No. 2003-299850 que sirve como base para la prioridad de la presente solicitud.
Modo óptimo para llevar a cabo la invención
Tal como se ha descrito anteriormente, un procedimiento de la presente invención puede unir de manera eficaz polietilenglicol a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 en la secuencia de aminoácidos del interferón β y separar los productos no unidos y subproductos del mismo.
Como interferón β sometido al procedimiento de la presente invención se pueden utilizar el interferón β natural, un interferón β que tiene una cadena de azúcares alterada con respecto a la natural, o un interferón β recombinante con
- o sin una cadena de azúcares. En el procedimiento de la presente invención, se puede utilizar como dicho interferón β un producto disponible comercialmente. El interferón β natural tiene una asparagina unida a la cadena de azúcares en la posición 80 que está próxima a la lisina localizada en la posición 19 desde el punto de vista de la estructura tridimensional. Cuando se une al mismo un PEG de peso molecular elevado o similar, es preferente utilizar un interferón β recombinante sin una cadena de azúcares porque el posible impedimento estérico reduce la eficacia de la reacción. Como interferón β sometido al procedimiento de la presente invención también se puede utilizar cualquiera de aquéllos que tengan la secuencia de aminoácidos del interferón β natural con la deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos, en el que el complejo de interferón β obtenido mantiene una actividad del 10%
- o superior de la actividad antiviral del interferón β que no se ha unido a polietilenglicol cuando la actividad antiviral del interferón β se determina mediante un bioensayo utilizando células FL de amniocitos humanos y el virus sindbis o el virus de la estomatitis vesicular combinados.
El interferón β de la presente invención también comprende, interferón β natural, interferón β recombinante y una forma alterada de los mismos, en el que el complejo de interferón β obtenido mantiene una actividad del 10% o superior de la actividad antiviral del interferón β que no se ha unido a polietilenglicol cuando la actividad antiviral del interferón β se determina mediante un bioensayo utilizando células FL de amniocitos humanos y el virus sindbis o el virus de la estomatitis vesicular combinados. La forma alterada significa cualquiera de aquéllos obtenidos mediante la alteración o modificación de la secuencia de aminoácidos o la cadena de azúcares del interferón natural tal como se ha descrito anteriormente, en el que el complejo de interferón β obtenido mantiene una actividad del 10% o superior de la actividad antiviral del interferón β que no se ha unido a polietilenglicol cuando la actividad antiviral del interferón β se determina mediante un bioensayo utilizando células FL de amniocitos humanos y el virus sindbis o el virus de la estomatitis vesicular combinados. En el presente documento, la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 está representada por el número de aminoácido para la secuencia de aminoácidos de este interferón β natural (figura 4 y SEQ ID NO: 1). El número de aminoácido de dicha lisina para la forma alterada se cambia de manera que corresponda a la posición de la lisina en la secuencia de aminoácidos del interferón β natural.
El interferón β en cualquiera de estas formas se puede obtener mediante cualquier procedimiento, tal como la extracción de tejido, la síntesis de proteínas y la producción biológica utilizando células naturales o recombinantes. El interferón β modificado genéticamente sin una cadena de azúcares está disponible comercialmente y dicho interferón β disponible comercialmente también se puede utilizar en el procedimiento de la presente invención.
El polietilenglicol (PEG) no es dañino para el cuerpo humano y, cuando se administra como un complejo de
interferón β unido al mismo, confiere una solubilidad en agua a un nivel necesario para disolver el complejo en sangre. Es conocido en la técnica que la unión de PEG a una sustancia fisiológicamente activa permite que la sustancia fisiológicamente activa en organismos vivos consiga una estabilidad física y térmica mejoradas, una protección frente a la degradación enzimática, una mayor solubilidad, una vida media circulatoria in vivo prolongada y valores disminuidos de depuración. A la vista de dichos efectos, el PEG se utiliza de manera preferente en la presente invención.
Se puede utilizar cualquier procedimiento en la activación terminal del PEG para la unión del PEG al grupo amino del residuo de lisina en el interferón β. Por ejemplo, se puede utilizar un PEG que tenga una estructura reactiva con un grupo amino, tal como una estructura de éster de hidroxisuccinimida o de éster de sulfonato de nitrobenceno en el extremo terminal. En el presente documento, a cualquiera de estas estructuras terminales se hace referencia como “grupo funcional reactivo con un grupo amino” y al PEG que tiene cualquiera de estas estructuras terminales se hace referencia como “polietilenglicol activado con un grupo funcional reactivo con un grupo amino”. El PEG que tiene cualquiera de estas estructuras se utiliza ampliamente de manera convencional para la unión a un grupo amino y se puede producir con facilidad mediante un procedimiento sintético conocido habitualmente o está disponible comercialmente. En la presente invención, de manera preferente, también se puede utilizar dicho producto disponible comercialmente.
El peso molecular promedio del PEG es de 10.000 o superior y, de manera preferente, es aproximadamente de
10.000 a 60.000, de manera más preferente, aproximadamente de 20.000 a 40.000, desde el punto de vista de permitir que el interferón β en organismos vivos consiga una estabilidad física y térmica, una protección frente a la degradación enzimática, una mayor solubilidad, una vida media circulatoria in vivo prolongada y valores disminuidos de depuración.
La reacción de unión entre el interferón β y el PEG se realiza mediante la reacción del interferón β con PEG a pH de 5,0 a 8,5, de manera preferente a pH de 5,0 a 8,0, y en presencia de un agente contra la reducción para la actividad del interferón β, de manera preferente en una solución tampón, tal como soluciones tampón de fosfato o citrato. El agente contra la reducción para la actividad del interferón β no sólo suprime la agregación del interferón β causada por su situación bajo una atmósfera de pH 5,0 a 8,5 adecuado para la reacción, sino que también ayuda en la reacción de la unión específica del PEG a la lisina diana localizada en las posiciones 19 ó 134 o en un sitio próximo a las mismas. El agente contra la reducción para la actividad del interferón β para la unión eficaz del PEG al sitio deseado manteniendo la actividad del interferón β se selecciona del grupo que comprende oligosacáridos con 5 o menos unidades de azúcar, monosacáridos, sus correspondientes alcoholes de azúcar, alcoholes polihídricos C2-6. Son particularmente preferentes disacáridos o monosacáridos, tales como glucosa, manitol, sorbitol, sacarosa o trehalosa, sus correspondientes alcoholes de azúcar y alcoholes polihídricos C2-3, tales como etilenglicol o glicerol. Estos agentes contra la reducción para la actividad del interferón β se pueden utilizar solos o en cualquier combinación de dos o más de ellos.
La concentración del agente contra la reducción para la actividad del interferón β sometido al procedimiento de la presente invención es del 1 al 50% (en total, cuando se utilizan varios agentes contra la reducción para la actividad del interferón β; en lo sucesivo especificado de la misma manera), de manera preferente, aproximadamente del 10 al 30%, con respecto al peso total de la mezcla de reacción. La proporción de la mezcla interferón β:PEG no está particularmente limitada y, sin embargo, es habitualmente aproximadamente una proporción molar de 1:1 a 1:400 y, de manera preferente, aproximadamente una proporción molar de 1:4 a 1:100 para el PEG activado con éster succinimidílico. La temperatura de reacción adecuada para el procedimiento de la presente invención es habitualmente de 4 a 40ºC, de manera preferente de 4 a 25ºC. Aunque el tiempo de reacción se determina aproximadamente según la temperatura de reacción y así sucesivamente, habitualmente son adecuados aproximadamente de 1 hora a 24 horas.
El polietilenglicol se une de manera específica a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 en la secuencia de aminoácidos del interferón β. El término “específico” o “de manera específica” se refiere a la unión selectiva y preferente del polietilenglicol a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 o al sitio estéricamente próximo a las mismas. Esta unión específica produce un interferón β monoPEGilado homogéneo.
En la reacción de unión con el grupo tiol de la cisteína se utiliza un polímero soluble en agua con una estructura reactiva al grupo tiol, tal como una estructura de disulfuro de ortopiridilo, vinilsulfona, maleimida o yodoacetamida, en el extremo terminal, de manera preferente un polímero soluble en agua con una estructura de maleimida. Para la unión del PEG con un peso molecular particularmente deseado de 10.000 a 60.000 al residuo de cisteína en la secuencia de aminoácidos del interferón β, se utiliza, de manera preferente, un interferón β con una cadena de azúcares más pequeña que la del natural, un interferón β del que se ha eliminado una cadena de azúcares, o un interferón β que originalmente no tiene cadenas de azúcares. La utilización de dicho interferón β permite la reacción de unión sin una disociación reductora para proceder con una eficacia elevada en una sola etapa.
Después de la reacción de unión, el interferón β y el PEG no reaccionados y los subproductos se pueden extraer mediante cualquiera de los procedimientos, o cualquier combinación de los mismos, tales como un cromatograma
utilizando un portador de intercambio iónico, un portador de filtración de gel o un portador hidrofóbico o hidrofílico, para purificar o concentrar el complejo de interferón β deseado que tiene PEG unido a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134.
Este es el procedimiento más eficaz para purificar y concentrar el complejo de interferón β que tiene PEG unido a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134. El portador de intercambio iónico utilizado es, de manera preferente, un portador de intercambio catiónico, de manera más preferente, un portador en el que un grupo sulfopropilo, ácido sulfónico o carboximetilo está unido a un material base, y cualquiera de estos portadores de intercambio iónico están disponibles comercialmente. Por ejemplo, cuando se utilizan HiTrap SP HP (Amersham Pharmacia), Poros HS (Applied Biosystems) o SP-5PW (Tosoh), un complejo de interferón β diPEGilado presente en cantidades de trazas en la solución de reacción se eluye inicialmente mediante un gradiente de concentración de sales. Posteriormente, se eluye el complejo de interferón β deseado que tiene PEG unido a la lisina localizada en la posición 19 en la secuencia de aminoácidos del interferón β en una proporción del 40% o más de las fracciones totales eluidas, seguido de la elución y fraccionamiento de los complejos que tienen PEG unido al grupo amino N-terminal o a la lisina localizada en las posiciones 33, 46 ó 108 como isómeros menores de los sitios unidos a PEG, y del interferón β no reaccionado. En este procedimiento, se puede aislar a la vez el complejo de interferón β que tiene PEG unido a la lisina localizada en la posición 134.
La unión al portador de intercambio catiónico se realiza mediante el ajuste de la solución de reacción a la fuerza iónica adecuada para la unión a un pH de 3,0 a 8,0. En este caso, el portador de intercambio catiónico se puede cargar en una columna o suspenderse en la solución de reacción. Sin embargo, cuando la agregación de un polímero hidrofílico que no ha reaccionado en el portador de intercambio catiónico reduce la eficacia de separación del complejo deseado, es preferente cargar el portador en la columna después de la suspensión y la unión para realizar la elución. La elución del portador de intercambio catiónico se puede llevar a cabo mediante la realización de un gradiente por etapas o una elución isocrática con concentraciones crecientes de sales o incrementos del pH en una solución tampón compuesta de citrato, acetato, fosfato, o similares.
El sitio unido a PEG en el complejo de interferón β fraccionado y eluido se puede analizar, tal como se describe en el ejemplo 3, mediante un mapeo peptídico, seguido del análisis o secuenciación de los aminoácidos del fragmento unido a PEG obtenido.
La actividad antiviral del complejo de interferón β que tiene PEG único a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 producido de este modo se puede medir con facilidad mediante un procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, Armstrong, J. A., Methods In Enzymology, 78, 381-387, (1981); Rubinstein y otros, J. Virol. 37, 755 (1981); y Borden y otros, Canc. Res. 42, 4948 (1982)). El interferón β que tiene PEG con un peso molecular de 40.000 unido a la lisina localizada en la posición 19 mantiene el 10% o más de la actividad antes de la unión, y esta actividad es equivalente a la actividad del interferón β unido a PEG con un peso molecular de 20.000. De manera alternativa, el interferón β que tiene PEG con un peso molecular de 40.000 unido a la lisina localizada en la posición 134 mantiene del 70 al 100% de la actividad antes de la unión. Se ha descrito previamente que la actividad restante de un complejo que tiene PEG con un peso molecular de 40.000 unido al extremo N-terminal del interferón β es del 0% (Pepinsky y otros, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, volumen 297, págs. 1059-1066, (2001)). Por consiguiente, esto demuestra que la utilización de la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 como el sitio del interferón β unido a PEG de peso molecular elevado es extremadamente útil.
Además, el procedimiento de la presente invención se puede aplicar a la inmovilización del interferón β sobre un conjunto de soportes, por ejemplo, la superficie plana o gránulos de un material de azúcar, vidrio o resina. A saber, la utilización de la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 como punto de unión entre el interferón β y cualquiera de un conjunto de soportes permite la inmovilización del interferón β sin reducir su actividad. Este procedimiento de inmovilización requiere la introducción de un agente reticulante que tenga un grupo funcional similar reactivo al grupo amino o la unión previa del agente reticulante al soporte.
El complejo entre el interferón β y el PEG de la presente invención se puede utilizar en el tratamiento de un conjunto de enfermedades que explotan la actividad biológica del IFN. Por ejemplo, el complejo se puede utilizar en el tratamiento de la hepatitis B activa crónica, la hepatitis C crónica y otras enfermedades virales; un conjunto de neoplasmas malignos, tales como glioblastoma, meduloblastoma, astrocitoma y melanoma maligno de piel; y enfermedades autoinmunes, tales como esclerosis múltiple. Además, se puede utilizar en el tratamiento de enfermedades que acompañan a la vascularización, por ejemplo, enfermedades inflamatorias (por ejemplo, artritis reumática o psoriasis), enfermedades oculares (por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, glaucoma neovascular, síndrome de Stevens-Johnson y su enfermedad relacionada, penfigoide ocular y su enfermedad relacionada, quemadura química de la córnea, o tracoma) y cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de próstata, melanoma maligno, cáncer renal, tumores de cerebro o sarcoma de Kaposi).
El complejo de interferón β de la presente invención se puede administrar a través de una vía oral o parenteral, ya sea de forma directa o como una composición farmacéutica preparada mediante la mezcla del complejo con un portador o excipiente farmacológicamente aceptable conocido en la técnica. Sin embargo, es preferente la
administración realizada mediante inyección hipodérmica, intramuscular o intravenosa.
Entre los ejemplos concretos de una forma de dosificación para la administración oral se incluyen comprimidos, pastillas, cápsulas, gránulos, jarabes, emulsiones y suspensiones. Dichas formas de dosificación se producen mediante un procedimiento per se conocido en la técnica y contienen un portador o excipiente utilizado habitualmente en el sector farmacéutico.
Entre los ejemplos del portador o excipiente para comprimidos se incluyen lactosa, maltosa, sacarosa, almidón y estearato de magnesio. Entre los ejemplos de una forma de dosificación para la administración parenteral se incluyen gotas oculares, pomadas, inyecciones, cataplasmas, supositorios, agentes de absorción transnasal, agentes de absorción transpulmonar, agentes de absorción transdérmica y agentes de liberación prolongada de manera local.
Se pueden preparar preparaciones líquidas mediante un procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante la disolución o suspensión del complejo de interferón β en una solución acuosa estéril utilizada habitualmente para inyecciones o mediante el emulsionado o la introducción en un liposoma del complejo de interferón β.
Se pueden preparar preparaciones sólidas mediante un procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante la adición de un excipiente, tal como manitol, trehalosa, sorbitol, lactosa, o glucosa, al complejo de interferón β para producir un producto liofilizado. Este producto liofilizado adicionalmente se puede administrar como polvo, o de otro modo, este polvo se puede mezclar y solidificar con ácido poliláctico o ácido glicólico para su utilización.
Se pueden preparar agentes gelificantes mediante un procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante la disolución del complejo de interferón β en un espesante o polisacárido, tal como glicerina, polietilenglicol, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, ácido hialurónico o sulfato de condroitina. Cualquiera de estas preparaciones se puede complementar con albúmina de suero humano, inmunoglobulina humana, α2-macroglobulina, aminoácido, o similares, como estabilizantes, y se puede complementar con alcohol, alcohol de azúcar, un surfactante iónico, un surfactante no iónico, o similares, como dispersante o promotor de absorción en un intervalo que no afecta a la actividad biológica del IFN. De manera alternativa, también se pueden añadir al mismo, de manera opcional, trazas de metales o una sal de un ácido orgánico.
La dosis del complejo de la presente invención se determina de manera apropiada según la edad y el peso corporal de un paciente, la enfermedad o síntomas a tratar, la forma y vía de administración, el peso molecular del PEG, y así sucesivamente. Sin embargo, en general, el complejo de la presente invención se administra en un intervalo de una dosis/mes a una dosis/día, de manera preferente de una dosis/mes a una dosis/semana, con 1.000 unidades a 100 millones de unidades/dosis, de manera preferente, de 10.000 unidades a 18 millones de unidades/dosis.
Ejemplos
En lo sucesivo se describirá la presente invención de forma más completa haciendo referencia a los ejemplos.
[Ejemplo 1]
Efecto del aditivo en la reacción de unión de polietilenglicol activado con éster de hidroxisuccinimida al grupo amino en interferón β recombinante:
Se añadió glucosa, glicerol o etilenglicol a cada concentración final de 1, 5, 10 y 20% a interferón β humano recombinante (concentración final: 200 μg/ml; que se expresó y purificó con Escherichia coli recombinante según el procedimiento de Goeddel y otros, Nucleic Acid. Res. Volumen 8, 4057-4074 (1980)) almacenado en cloruro de sodio 0,5 M y una solución de tampón acetato 100 mM (pH 5,0). Se ajustó el pH de estas soluciones y un control libre de aditivo a pH 7,8 utilizando una solución de hidrogenofosfato de disodio 1 M. Se mezcló polietilenglicol (peso molecular promedio: 40K; fabricado por Shearwater Polymers, INC y adquirido de NOF Corp) activado con éster de hidroxisuccinimida en una proporción molar de aproximadamente 10 por mol de interferón β con cada una de las soluciones resultantes, seguido de la reacción de unión durante la noche a 4ºC. Después de la reacción, se extrajo el interferón β no reaccionado, y se midió la actividad de interferón β en cada una de las soluciones de reacción preparadas.
La medición de la actividad se llevó a cabo utilizando una técnica de anticuerpos y enzimas (inmunoensayo sándwich) (véase Eiji Ishikawa, "Enzyme Immunoassay" (“Inmunoensayo con enzimas”) 3ª edición, pág. 180, Igaku-shoin). De manera específica, se inmovilizaron anticuerpos contra interferón β de conejo en una inmunoplaca, a la que se añadieron, a continuación, junto con la muestra, anticuerpos monoclonales de ratón marcados con la enzima que reconocían sólo las estructuras de interferón β activo. Después del lavado de los productos no unidos, se añadió un sustrato de color a la inmunoplaca para calcular la actividad de interferón β de la muestra mediante la comparación con el valor de la coloración de un patrón (se confirmó que el resultado en la actividad de interferón β
era igual al resultado obtenido mediante un procedimiento de medición de actividad biológica basado en la actividad antiviral de las células cultivadas). Paralelamente, la adición de un surfactante Tween 80 o HCO-60 de las misma manera indicada anteriormente suprimió la agregación de interferón β y, sin embargo, también suprimió de manera amplia la progresión de la reacción de unión del PEG, conduciendo a una medición no satisfactoria de la actividad del conjugado.
Tal como se muestra en la tabla 1, se observó un efecto evidente de mejora de la actividad en la solución de reacción que contenía una cantidad adecuada de glucosa, glicerol o etilenglicol, en comparación con el control (actividad del complejo PEG-interferón β obtenida mediante la reacción de unión de PEG en ausencia del aditivo).
[Tabla 1]
- Aditivo
- Concentración (%) Actividad del interferón β (10E+7 IU)
- Por solución de reacción
- Por peso de proteína
- 1 2 3 4
- Glucosa 1 5 10 20 1,79 1,95 2,49 2,62 1,62 2,46 4,96 5,03
- 5 6 7 8
- Glicerol 1 5 10 20 2,28 2,19 2,53 2,51 1,73 1,87 1,81 2,24
- 9 10 11 12
- Etilenglicol 1 5 10 20 1,74 2,24 2,77 2,96 1,37 1,68 2,04 2,37
- 13
- Ausente 1,70 1,09
[Ejemplo 2]
Separación y purificación del complejo de interferón β que tiene polietilenglicol unido al grupo amino de la lisina localizada en la posición 19:
Se añadió etilenglicol a la concentración final del 20% a interferón β humano recombinante (concentración final: 200 μg/ml) almacenado en cloruro de sodio 0,5 M y una solución de tampón acetato 100 mM (pH 5,0), seguido del ajuste del pH hasta 7,6 utilizando una solución de hidrogenofosfato de disodio 1 M. Se mezcló con la solución resultante polietilenglicol (peso molecular promedio: 40K; adquirido de NOF Corp) activado con éster de hidroxisuccinimida, seguido de la reacción de unión durante la noche a 4ºC. La solución de reacción se dializó durante la noche a 4ºC frente a una solución de tampón acetato 20 mM (pH 4,5) que contenía NaCl 10 mM-Tween 20 al 0,05%. La solución dializada se aplicó a una columna de intercambio catiónico Poros HS con 1,7 ml de gel (fabricada por Applied Biosystems) o SP-5PW (Tosoh). Se realizó la elución mediante el incremento de la proporción del disolvente B (solución de tampón acetato 20 mM (pH 4,5 a 4,7) que contenía NaCl 1 M) mezclado con disolvente A (solución de tampón acetato 20 mM (pH 4,5 a 4,7) que contenía NaCl 10 mM). De manera específica, la elución se realizó mediante un incremento por etapas de la proporción del disolvente B hasta el 30, 40, 50 y 100% en la columna Poros HS y mediante la utilización de un gradiente continuo del 0 al 100% en la columna SP-5PW. En la figura 1 se muestra un cromatograma de absorbancia obtenido mediante la elución con la columna Poros HS. Los componentes en el cromatograma de absorbancia eluidos mediante el incremento por etapas de la proporción de disolvente B hasta el 30, 40, 50 y 100% se designan como los picos 1 a 4 (en el dibujo, (i) a (iv)), respectivamente.
En la figura 2 se muestra el resultado de analizar cada componente de los picos (1 a 4) mediante tinción con plata después de una separación con SDS-PAGE. El complejo de interferón β deseado que tiene PEG con un peso molecular de 40K unido al residuo de lisina localizado en la posición 19 se pudo obtener en el pico 2. Los isómeros menores de sitios unidos a PEG que no se pudieron controlar de forma completa mediante reacción se pudieron separar como subproductos, los cuales incluyen un complejo de interferón β que tiene PEG unido al residuo de lisina localizado en la posición 33 (en el pico 3) y un complejo de interferón β que tiene PEG unido al grupo amino N-terminal o a un residuo de lisina localizado en las posiciones 108 ó 134 (en el pico 4). El interferón β no reaccionado y el interferón β diPEGilado se pudieron separar en los picos 4 y 1, respectivamente.
En la figura 3 se muestra un cromatograma de absorbancia obtenido mediante la elución con la columna SP-5PW. La columna SP-5PW era capaz de una separación similar a la separación con la columna Poros HS. El complejo de interferón β deseado que tiene PEG con un peso molecular de 40K unido al residuo de lisina localizado en la posición 19 justifica, como el pico 2, aproximadamente el 65% de la cantidad total de proteínas (su proporción era del 65% o más con respecto a todos los complejos PEGilados, a excepción del interferón β no reaccionado).
[Ejemplo 3]
Confirmación del sitio unido a polietilenglicol del interferón β recombinante:
Cada fracción de los picos separada con la columna SP-5PW en el ejemplo 2 se desaló y concentró con un cartucho de extracción en fase sólida (OASIS HLB; Waters) y, a continuación, se desecó con un evaporador centrífugo. El producto resultante se disolvió en una solución de tampón Tris (pH 9) que contenía guanidina 6 mol/l, seguido de la reducción de Cys con ditiotreitol y la carboxiamidometilación con yodoacetamida. Después de la adición de lisil endopeptidasa, la mezcla resultante se incubó a 37ºC durante 5 horas para realizar una digestión específica de la estructura. La reacción enzimática se terminó con ácido acético para producir una muestra pretratada para el análisis.
Esta muestra se sometió a un análisis por HPLC de fase inversa bajo las siguientes condiciones: columna: Cadenza CD-C (184,6 x 150); longitud de onda de detección: 214 nm (UV); temperatura de la columna: 40°C; cauda l: 0,8 ml/min; fase móvil A: ácido acético/TFA/agua destilada (1/0,2/1000); fase móvil B: ácido acético/TFA/acetonitrilo/agua destilada (0,9/0,2/800/200); gradiente: 5% a 70% de fase móvil B en 80 minutos, seguido de 70% a 100% de fase móvil B en 5 minutos; y ciclo de análisis: 120 minutos.
En las figuras 4 y 5 (pre) se muestran los picos (K1 a K12) en el cromatograma de HPLC correspondientes a los fragmentos de digestión con la lisil endopeptidasa del interferón β antes de la reacción de unión PEG. Las flechas en la figura 4 indican los sitios de escisión con la lisil endopeptidasa. Los fragmentos peptídicos generados mediante escisión se designaron como K1 a K12. Los símbolos K1 a K12 en la figura 5 corresponden a los fragmentos peptídicos K1 a K12 en la figura 4, respectivamente. En cambio, tal como se muestra en la figura 5-2 (en el dibujo, (ii); en lo sucesivo especificado de la misma manera), en el mapa peptídico del pico 2 se observó una disminución destacable de los fragmentos peptídicos K1 y K2. Esto es probablemente debido a que la introducción de PEG en el grupo amino en la cadena lateral de la lisina localizada en la posición 19 permitía a este sitio evitar la digestión con la lisil endopeptidasa, dando lugar a la no generación de los fragmentos peptídicos K1 y K2. A partir de este resultado, se estimó que el sitio en el que se introducía el PEG era la lisina localizada en la posición 19.
El mapa peptídico del pico 3 produjo el resultado mostrado en la figura 5-3, en el que se observó la ausencia destacable del fragmento peptídico K2. Esto es probablemente debido a que la introducción de PEG en el grupo amino en la cadena lateral de la lisina localizada en la posición 33 permitía a este sitio evitar la digestión con la lisil endopeptidasa, dando lugar a la no generación del fragmento peptídico K2. A partir de este resultado, se estimó que el sitio principal en el que se introducía el PEG era la lisina 33.
Debido a que se observó una disminución en el fragmento peptídico K1 en el pico 4 tal como se muestra en la figura 5-4, se estimó la presencia de un conjugado N-terminal. Además, disminuyó una mitad el fragmento peptídico K10, sugiriendo que probablemente contenía un isómero con Lys134 o Lys123.
A continuación, se sometió a un análisis de la secuencia de aminoácidos un fragmento del conjugado PEG-péptido que aparecía como un pico alrededor del minuto 75 en el análisis de picos mediante HPLC de fase inversa. Este resultado e información obtenidos a partir del mapa peptídico demostraron que el pico 2, un producto principal de la reacción, es el complejo deseado que tiene PEG unido a la lisina localizada en la posición 19. Como subproductos minoritarios se separaron en los picos 3 y 4, respectivamente, un isómero posicional que tiene PEG unido a la lisina localizada en la posición 33 y un isómero posicional que tiene PEG unido a la lisina localizada en las posiciones 134 ó 108 o en el extremo N-terminal
[Ejemplo 4]
Medición de la actividad restante del complejo de interferón β que tiene PEG con un peso molecular de 40K o 20K unido de manera selectiva al residuo de lisina localizado en la posición 19:
Se sintetizó, aisló y purificó mediante el procedimiento del ejemplo 2, un complejo de interferón β humano recombinante que tenía PEG con un peso molecular de 40K o 20K unido de manera selectiva al residuo de lisina localizado en la posición 19, seguido de la comparación de la actividad con el interferón β humano recombinante antes de la unión a PEG. La comparación de la actividad del interferón β se realizó midiendo la actividad antiviral. De manera específica, la valoración se realizó mediante un bioensayo utilizando células FL de amniocitos humanos en combinación con el virus sindbis o el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Armstrong, J. A., Methods In Enzymology, 78, 381-387, (1981)).
Como resultado, la actividad del interferón β humano recombinante antes de la unión a PEG fue de 1,22x108 MIU/mg, mientras que el conjugado que tenía PEG de 40K presentaba una actividad antiviral de 5,5x107 MIU/mg y un valor de actividad restante, como máximo, del 45%. La actividad restante del conjugado que tenía PEG de 20K medida de la misma manera fue del 38,7%.
[Ejemplo 5]
Análisis farmacocinético del complejo de interferón β que tenía PEG con un peso molecular de 40K unido de manera selectiva al residuo de lisina localizado en la posición 19 y evaluación de su actividad de inducción del marcador farmacodinámico:
Se sintetizó, aisló y purificó mediante el procedimiento del ejemplo 2, un complejo de interferón β humano recombinante que tenía PEG con un peso molecular de 40K unido de manera selectiva al residuo de lisina localizado en la posición 19. Se administró el complejo de interferón β a 9 MIU/kg a un conejo (NZW, macho). Se recogió sangre del conejo antes de la administración y después de 15 minutos, 1,5 horas, 3,5 horas, 8 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días y 7 días de la administración para medir la actividad antiviral en plasma y la actividad de la 2-5A sintetasa en la sangre completa. La actividad antiviral se midió mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1, mientras que la actividad de la 2-5A sintetasa se midió utilizando el kit 2-5A "Eiken" (Eiken Chemical) según el protocolo especificado. La evolución con el tiempo de la actividad restante del interferón β en sangre basado en la medición de la actividad antiviral se muestra en forma de gráfico en la figura 6. La evolución con el tiempo de la actividad de 2-5A sintetasa que se usa como marcador farmacodinámico se muestra en forma de gráfico en la figura 7. La unión de PEG que tenía un peso molecular de 40K dio lugar a un incremento de 20,8 veces en la actividad restante (AUC) del interferón β en sangre. Este incremento condujo a un aumento en la actividad de inducción del marcador farmacodinámico (se incrementó la AUC en 7,6 veces por la unión de PEG y superó el valor más elevado de la inducción del marcador farmacodinámico por el interferón β no modificado incluso después de 7 días después de la administración).
[Ejemplo 6]
Separación y purificación del complejo de interferón β que tiene polietilenglicol unido al grupo amino de la lisina localizada en la posición 134:
Se complementó una solución de reacción de la unión entre el interferón β humano recombinante y el PEG obtenida de la misma manera que el ejemplo 2 con un volumen de 5 veces de una solución de tampón acetato 10 mM (pH 4,5) y se aplicó a una columna de intercambio catiónico (TOYOPEARL CM 650 (S) (Tosoh)) equilibrada con la misma solución tampón.
Se eluyeron las proteínas con la misma solución tampón que contenía cloruro de sodio 1M mediante el incremento de la proporción de la solución tampón mezclada a partir del 0 al 65% en un gradiente continuo y, a continuación, se fraccionó. Las fracciones eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE y con una columna SP-5PW (Tosoh). Los resultados respectivos se muestran en las figuras 8-A y 8-B.
Como resultado, se obtuvieron tres picos como en el ejemplo 2. Sin embargo, cuando la fracción contenida en el tercer pico (pico (iii) en la figura 8-A) se analizó por separado con la columna SP-5PW, se observó que la fracción estaba separada adicionalmente en varios componentes (figura 8-B). Entre estos componentes, se analizó, de la misma manera que en el ejemplo 3, la fracción que contenía un pico (flecha en la figura 8-B) que constituía el porcentaje más elevado del tercer pico y se eluyó el último. Como resultado, se aisló de la misma un complejo de IFN-β que tenía PEG unido a la lisina localizada en la posición 134.
[Ejemplo 7]
Comparación de la actividad entre el complejo de PEG e interferón β obtenido mediante la reacción de unión no selectiva de PEG a lisina y el complejo de PEG e interferón β obtenido mediante la reacción de unión selectiva de los mismos:
Se añadió etilenglicol a la concentración final del 20% a interferón β humano recombinante o interferón natural almacenado en una solución de cloruro de sodio 0,5 M y tampón acetato 100 mM (pH 5,0), seguido del ajuste del pH hasta 5,5 (condición de reacción 1) o hasta aproximadamente 7,6 (condición de reacción 2) utilizando una solución de hidrogenofosfato de disodio 1 M, del mismo modo que en el ejemplo 2. Se mezcló polietilenglicol (peso molecular promedio: 10K, 20K o 40K; fabricado por Shearwater Polymers, INC y adquirido de NOF Corp) activado con éster de hidroxisuccinimida en una cantidad de 45 veces en relación con una molécula de interferón β con la solución resultante, seguido de la reacción de unión durante la noche a 4ºC.
Al mismo tiempo, se añadió SDS a la concentración final del 0,1% a una solución de interferón β humano recombinante o interferón β natural, seguido del ajuste del pH de la solución de reacción hasta 9,0 (condición de reacción 3). Se mezcló polietilenglicol (peso molecular promedio: 10K, 20K o 40K) activado con éster de hidroxisuccinimida en una cantidad de 45 veces en relación con una molécula de interferón β con la solución resultante, seguido de la reacción de unión durante la noche a 4ºC.
Se evaluó la actividad del interferón β en cada una de las soluciones después de la reacción mediante el mismo
procedimiento de medición de la actividad antiviral que en el ejemplo 4. La progresión de la reacción de unión en cada una de las soluciones se confirmó mediante SDS-PAGE.
Tal como se muestra en la tabla 2, la actividad del interferón β disminuyó hasta el 10% o menos independientemente del peso molecular de PEG en la condición de reacción 3 que no aseguraba la selectividad de unión de PEG a lisina. Por otro lado, se confirmó que se mantenía, como mínimo, el 10% o superior de la actividad del interferón β independientemente del peso molecular de PEG en las condiciones de reacción 1 y 2 que aumentaban la selectividad de unión de PEG a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134.
[Tabla 2]
- Tipo de IFN β
- IFN β natural (unido a cadenas de azúcares) IFN β recombinante de E. coli
- Peso molecular de PEG
- 40K 20K 10K 40K 20K 10K
- Condición de reacción 1 Condición de reacción 2 Condición de reacción 3
- 100% 86% 94% 54% 29% 15% 1% 2% 1% 94% 54% 61,9% 48% 21% 22% 2,8% 0,7% 1,5%
[Ejemplo 8]
Comparación de la actividad entre el complejo de interferón β PEGilado de manera múltiple de forma no selectiva con 2 o más moléculas de PEG y el complejo de interferón β monoPEGilado con PEG unido de manera selectiva a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134:
Después de la reacción de unión de PEG de la misma manera que en el ejemplo 6, se separaron con una columna TOYOPEARL CM 650 (S) (Tosoh) una fracción que contenía un complejo de interferón β PEGilado de manera múltiple de forma no selectiva con 2 o más moléculas de PEG y una fracción que contenía un complejo de interferón β monoPEGilado con PEG unido de manera selectiva a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 para medir sus actividades del interferón β mediante el procedimiento de medición de la actividad antiviral descrita en el ejemplo 4. Como resultado, tal como se muestra en la figura 9, el complejo de interferón β PEGilado de manera múltiple de forma no selectiva con 2 o más moléculas de PEG mantuvo solamente aproximadamente el 1% de la actividad, mientras que el complejo de interferón β monoPEGilado con PEG de 40K unido de manera selectiva a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 mantuvo el 10% o más de la actividad.
[Ejemplo 9]
Comparación de la retención en sangre entre el complejo de IFN-β unido con PEG con un peso molecular de 20.000 y el complejo de IFN-β unido con PEG con un peso molecular de 40.000:
Se marcaron IFN-β unido con PEG con un peso molecular de 20.000 ó 40.000 e IFN-β no PEGilado con 125I y se administraron por vía intravenosa a un conejo. Se recogió sangre del conejo de manera cronológica hasta 6 días. Se midió la cantidad de cada interferón β restante en sangre midiendo la radioactividad con un contador γ. La evolución con el tiempo de cada interferón β restante en sangre se muestra en la figura 10 con una radioactividad en el momento de la administración del 100%. La integral de la cantidad de interferón β restante en sangre para el IFN-β unido con PEG con un peso molecular de 40.000 hasta 6 días produjo un incremento 5,5 veces mayor que el del IFN-β no PEGilado. La integral de la cantidad de interferón β restante en sangre para el IFN-β unido con PEG con un peso molecular de 20.000 se quedó en un incremento 1,5 veces mayor que el del IFN-β no PEGilado. Este resultado demostró que es importante para la retención del complejo de IFN-β en sangre unir a IFN-β un PEG con un peso molecular de 20.000 o superior, manteniendo la actividad.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en el presente documento se incorporan en el mismo por referencia en su totalidad.
Aplicación industrial
Según la presente invención, el polietilenglicol se puede unir de manera específica a la lisina localizada en las posiciones 19 ó 134 en la secuencia de aminoácidos del interferón β. Un complejo de interferón β producido mediante el procedimiento de la presente invención mantiene una actividad elevada, teniendo a la vez una solubilidad y estabilidad física y biológica suficientes, así como unos valores excelentes de vida media circulatoria y depuración, en los organismos vivos. De este modo, el complejo de interferón β de la presente invención produce menos efectos secundarios y es útil como fármaco muy eficaz.
LISTADO DE SECUENCIAS
5 <110> Toray Industries Inc.
<120> Complejo de interferón beta
<130> PH-2231-PCT 10
<140>
<141>
<150> JP2003-299850 15 <151> 2003-08-25
<160> 1
<170> PatentIn Ver. 2.1 20
<210> 1
<211> 166
<212> PRT
<213> Homo sapiens 25
<220>
<223> Inventor: Narumi, Hideki
Inventor: Tsushima, Yoshiaki
Inventor: Yamashita, Koji
30 Inventor: Sone, Saburou Inventor: Sato, Miyuki
<400> 1
35 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30
40 Lys Asp Arg Met Asn phe Asp 1le pro Glu Glu 1le Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr 1le Tyr Glu Met Leu Gln
45 50 55 60 Asn 1le phe Ala 1le phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80
50 Glu Thr 1le val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gln 1le Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp phe Thr 100 105 110
55 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 1le Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
60 130 135 140 1le val Arg val Glu 1le Leu Arg Asn phe Tyr phe 1le Asn Arg Leu 145 150 155 160
65 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165
Claims (11)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Procedimiento para producir un complejo de interferón β que tiene un polietilenglicol unido de manera específica y covalente a un residuo de lisina en las posiciones 19 ó 134 en la secuencia de aminoácidos del interferón β o en la correspondiente posición a las mismas en una secuencia de aminoácidos de un mutante del interferón β, que comprende: unir de manera específica y covalente polietilenglicol, que tiene un peso molecular de 10.000 o superior y está activado con un grupo funcional reactivo con un grupo amino, a un residuo de lisina del interferón β según la SEQ ID NO: 1 o un mutante del interferón β según la SEQ ID NO: 1 que presenta una deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos, en presencia, como mínimo, de un aditivo a una concentración del 1-50% en peso seleccionado del grupo que comprende oligosacáridos que tienen 5 o menos unidades de azúcar, monosacáridos, sus correspondientes alcoholes de azúcares y alcoholes polihídricos C2-6, a pH 5,0-8,5; y extraer, después de la reacción de unión, el interferón β no reaccionado, el polietilnglicol y los subproductos mediante la utilización de un portador de intercambio iónico para purificar y concentrar el complejo de interferón β que tiene polietilenglicol unido de manera específica y covalente a un residuo de lisina en las posiciones 19 ó 134 en la secuencia de aminoácidos del interferón β o en la correspondiente posición a las mismas en una secuencia de aminoácidos de un mutante del interferón β, en el que el complejo interferón β mantiene una actividad del 10% o superior de la actividad antiviral del interferón β que no se ha unido a un polietilenglicol, cuando la actividad antiviral del interferón β se determina mediante un bioensayo utilizando células FL de amniocitos humanos y el virus sindbis o el virus de la estomatitis vesicular combinados.
-
- 2.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el aditivo se selecciona del grupo que comprende disacáridos, monosacáridos, sus correspondientes alcoholes de azúcares y alcoholes polihídricos C2-3.
-
- 3.
- Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, en el que el aditivo se selecciona del grupo que comprende glucosa, manitol, sorbitol, sacarosa, trehalosa, etilenglicol y glicerol.
-
- 4.
- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el interferón β es natural o es interferón β recombinante.
-
- 5.
- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de 10.000 a 60.000.
-
- 6.
- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el grupo funcional reactivo con un grupo amino tiene una estructura de éster de hidroxisuccinimida o de éster de sulfonato de nitrobenceno.
-
- 7.
- Complejo de interferón β, en el que el polietilenglicol que tiene un peso molecular de 10.000 o superior está unido de manera específica y covalente a un residuo de lisina en las posiciones 19 ó 134 en la secuencia de aminoácidos del interferón β según la SEQ ID NO: 1 o en la correspondiente posición a las mismas en una secuencia de aminoácidos de un mutante del interferón β según la SEQ ID NO: 1, que presenta una deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos, en el que el complejo interferón β mantiene una actividad del 10% o superior de la actividad antiviral del interferón β que no se ha unido a un polietilenglicol, cuando la actividad antiviral del interferón β se determina mediante un bioensayo utilizando células FL de amniocitos humanos y el virus sindbis o el virus de la estomatitis vesicular combinados.
-
- 8.
- Complejo de interferón β, según la reivindicación 7, en el que el interferón β es natural o es interferón β recombinante.
-
- 9.
- Complejo de interferón β, según la reivindicación 7 u 8, en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de
- 10.000 a 60.000.
- 10. Composición farmacéutica que comprende un complejo de interferón β, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, y un portador farmacéuticamente aceptable.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003299850 | 2003-08-25 | ||
| JP2003299850 | 2003-08-25 | ||
| PCT/JP2004/012452 WO2005019260A1 (ja) | 2003-08-25 | 2004-08-24 | インターフェロンβ複合体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2452640T3 true ES2452640T3 (es) | 2014-04-02 |
Family
ID=34213782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04772408.3T Expired - Lifetime ES2452640T3 (es) | 2003-08-25 | 2004-08-24 | Complejo de interferón beta |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7691975B2 (es) |
| EP (1) | EP1666496B1 (es) |
| JP (1) | JP4850514B2 (es) |
| KR (1) | KR101157679B1 (es) |
| CN (2) | CN101880326B (es) |
| AU (1) | AU2004266969B2 (es) |
| CA (1) | CA2536643C (es) |
| ES (1) | ES2452640T3 (es) |
| PL (1) | PL1666496T3 (es) |
| PT (1) | PT1666496E (es) |
| WO (1) | WO2005019260A1 (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101163716B (zh) * | 2005-04-30 | 2011-09-07 | 成都生物制品研究所 | 白细胞介素-6聚乙二醇结合物及其制备方法和应用 |
| SI2234645T1 (sl) | 2007-12-20 | 2012-07-31 | Merck Serono Sa | Formulacije peg interferon beta |
| GB0912485D0 (en) | 2009-07-17 | 2009-08-26 | Polytherics Ltd | Improved conjugation method |
| EP2762489B1 (en) | 2011-10-01 | 2018-03-28 | Glytech, Inc. | Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same |
| AU2013226944B2 (en) * | 2012-02-29 | 2017-03-23 | Toray Industries, Inc. | Inhibitory agent for body cavity fluid accumulation |
| RU2668163C2 (ru) | 2013-03-29 | 2018-09-26 | Глитек, Инк. | Полипептид, гликозилированный сиалилированной сахарной цепью |
| JP2017100946A (ja) * | 2014-03-28 | 2017-06-08 | 東レ株式会社 | 悪液質の治療剤又は予防剤 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985003934A1 (en) | 1984-03-06 | 1985-09-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein and process for its preparation |
| JP2524586B2 (ja) * | 1985-06-26 | 1996-08-14 | シタス コーポレイション | ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化 |
| US4917888A (en) * | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| PL197568B1 (pl) * | 1997-12-19 | 2008-04-30 | Applied Research Systems | Kompleks zawierający IFN typu I oraz podjednostkę IFNAR, jego zastosowanie, cząsteczka DNA i wektor ją zawierający, komórka gospodarza transformowana wektorem, kompozycja farmaceutyczna, lek, zastosowanie IFNAR, zastosowanie IFN typu I i podjednostki IFNAR, sposób wytwarzania białka fuzyjnego oraz sposób przedłużania okresu trwałości IFN |
| IL142282A0 (en) | 1998-10-16 | 2002-03-10 | Biogen Inc | Compositions containing polymer conjugates of interferon-beta-1a |
| CA2382066C (en) * | 1999-08-20 | 2006-11-21 | Honeybaked Ham, Inc. | Apparatus for coating meat |
| JP2003527090A (ja) * | 1999-08-27 | 2003-09-16 | マキシゲン・エイピーエス | 新規なインターフェロンベータ様分子 |
| US6531122B1 (en) * | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
| CA2395254C (en) * | 1999-12-24 | 2010-05-11 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Branched polyalkylene glycols |
| US7226903B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-06-05 | Neose Technologies, Inc. | Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta |
| JP2004035515A (ja) * | 2002-07-05 | 2004-02-05 | Toray Ind Inc | インターフェロンβ複合体の製造方法 |
-
2004
- 2004-08-24 US US10/569,211 patent/US7691975B2/en active Active
- 2004-08-24 PL PL04772408T patent/PL1666496T3/pl unknown
- 2004-08-24 WO PCT/JP2004/012452 patent/WO2005019260A1/ja active Application Filing
- 2004-08-24 ES ES04772408.3T patent/ES2452640T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-08-24 JP JP2005513387A patent/JP4850514B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-08-24 KR KR1020067003751A patent/KR101157679B1/ko active IP Right Grant
- 2004-08-24 CA CA2536643A patent/CA2536643C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-08-24 CN CN200910142688.6A patent/CN101880326B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-08-24 PT PT47724083T patent/PT1666496E/pt unknown
- 2004-08-24 CN CNB2004800313015A patent/CN100519581C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-08-24 EP EP04772408.3A patent/EP1666496B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-08-24 AU AU2004266969A patent/AU2004266969B2/en not_active Expired
-
2009
- 2009-10-15 US US12/579,438 patent/US7915386B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20100145017A1 (en) | 2010-06-10 |
| PL1666496T3 (pl) | 2014-08-29 |
| JPWO2005019260A1 (ja) | 2007-11-01 |
| EP1666496B1 (en) | 2014-03-12 |
| CA2536643C (en) | 2013-11-12 |
| US7691975B2 (en) | 2010-04-06 |
| KR20060134905A (ko) | 2006-12-28 |
| CA2536643A1 (en) | 2005-03-03 |
| PT1666496E (pt) | 2014-06-24 |
| WO2005019260A1 (ja) | 2005-03-03 |
| JP4850514B2 (ja) | 2012-01-11 |
| KR101157679B1 (ko) | 2012-06-20 |
| CN101880326A (zh) | 2010-11-10 |
| US7915386B2 (en) | 2011-03-29 |
| US20060246034A1 (en) | 2006-11-02 |
| CN1871257A (zh) | 2006-11-29 |
| EP1666496A1 (en) | 2006-06-07 |
| AU2004266969A1 (en) | 2005-03-03 |
| CN101880326B (zh) | 2018-02-16 |
| CN100519581C (zh) | 2009-07-29 |
| AU2004266969B2 (en) | 2010-02-25 |
| EP1666496A4 (en) | 2006-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2383496T3 (es) | Compuestos de insulina lispro pegilados | |
| JP4753867B2 (ja) | ヒトｉｌ−１８を含むコンジュゲートおよびその置換変異体 | |
| RU2485134C2 (ru) | Интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение препарата и его применение | |
| CA2593682C (en) | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor | |
| PT1656952E (pt) | Conjugados de polietileno-glicol e interferão beta 1a e as suas utilizações | |
| US20070166278A1 (en) | Novel g-csf conjugates | |
| US7915386B2 (en) | Method of producing an interferon-β complex | |
| KR20150021087A (ko) | 페길화된 옥신토모둘린 변이체 | |
| ES2738676T3 (es) | Conjugado de insulina específico de sitio | |
| JP2008543304A (ja) | ヒト顆粒球コロニー刺激因子イソ型（ＨｕｍａｎＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ＣｏｌｏｎｙＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒＩｓｏｆｏｒｍｓ） | |
| BRPI0622128A2 (pt) | conjugado de polietileno glicol-g-csf | |
| ES2386575T3 (es) | Interferón alfa 2a modificado por polietilenglicol, su proceso de síntesis y su aplicación | |
| CA2516552A1 (en) | Polyethylene glycol modified interferon compositions and methods of use thereof | |
| TW201703793A (zh) | 聚乙二醇化介白素-11之組合物及方法 | |
| US20040110685A1 (en) | Scatter factor/hepatocyte growth factor antagonist NK4 for the treatment of glioma | |
| Sabar et al. | Synthesis of a new tri-branched PEG-IFNα2 and its impact on anti viral bioactivity | |
| WO2008000881A9 (es) | Muteínas del interferón alfa humano glicosiladas, su procedimiento de obtención y utilización. | |
| RU2576372C2 (ru) | МОЛЕКУЛА ИНТЕРФЕРОНА-β-1а ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ И АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТЯМИ, С ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ, УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, УЛУЧШЕННЫМИ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИМИ И ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИМИ ПАРАМЕТРАМИ, ПРИГОДНАЯ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕЕ ОСНОВЕ | |
| RU2575796C9 (ru) | Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение | |
| RU2575796C2 (ru) | Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение |