JPWO2005019260A1 - インターフェロンβ複合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、高い生物活性を有するインターフェロンβとポリエチレングリコールとの複合体、及びこれを高効率で製造するための方法に関する。すなわち、本発明は、糖単位の数が５以下の少糖類及び単糖類、これらの糖アルコール、並びに炭素数２乃至６の多価アルコールから成る群より選ばれる少なくとも１種の添加剤存在下で、インターフェロンβとポリエチレングリコールとを結合させることを特徴とするインターフェロンβ複合体の製造方法、及び該方法によって製造される、インターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目、あるいは１３４番目のリジンに特異的にポリエチレングリコールが結合したインターフェロンβ複合体に関する。

Description

本発明は、インターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目、あるいは１３４番目のリジン特異的にポリエチレングリコールを結合させたインターフェロンβ複合体及びその製造方法に関する。

ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーをタンパク質医薬に代表される生体分子に結合すると、物理的安定性、熱安定性、蛋白分解酵素に対する抵抗性、溶解性の向上、生体内での分布容積の低下、血中滞留性の向上などの効果がもたらされ、臨床的な有用性が付加されることが知られている（Ｉｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ５，３４３（１９９０）；Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９，２４９（１９９２）；Ｋａｔｒｅ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０，９１（１９９３）参照）。
天然型あるいは天然型と同一の一次構造を持つインターフェロンβに水溶性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合するには、各種の方法が用いられ得る。例えば、Ｋａｔｒｅらは、リジンなどのアミノ基修飾をインターフェロンβのＰＥＧ化に応用している（米国特許第４７６６１０６号、米国特許第４９１７８８８号、国際公開第ＷＯ８７／０００５６号参照）。具体的には、分子量約３００〜１００，０００の水溶性ポリマー（ＰＥＧ）を組換え型インターフェロンβあるいはＩＬ−２に、そのアミノ酸配列の１〜１０個のリジン残基を介して結合させた複合体が報告されている。また、リンホカインのアミノ基にＰＥＧを結合させる技術についても「化学修飾リンホカインおよびその製造法」において既に報告されている（特開昭６０−２２６８２１号参照）。しかしながら、実際に上記の方法でインターフェロンβにＰＥＧを結合させると、インターフェロンβの活性は１０％未満に低下してしまい、実用に供することはできない。
従来のいずれの報告においても、インターフェロンβの特定のリジンのアミノ基に選択的にＰＥＧを結合する技術に関する記載は全く無い。もし、ＰＥＧの結合によるインターフェロンβの生物活性の低下率が低いリジンを選択し、特異的に修飾することが可能となれば、医薬品として投与する総蛋白質量を抑えることにより患者への副作用の低減、更には、品質管理を容易にすることにつながる。
一方、リジン残基を介さず、還元的アルキル化方法を用いてインターフェロンのアミノ末端のαアミノ基を選択的に活性化させるのに適したｐＨで反応させることにより、水溶性ポリマーをアミノ末端に選択的に結合させる方法も知られている（特開平９−２５２９８号、参照）。しかし、この方法によりインターフェロンβをＰＥＧ化すると、実際にはモノＰＥＧ化は起こらず、いずれかのリジン残基又はＮ末端の非選択的ＰＥＧ化が起こり、十分な抗ウイルス活性及び細胞増殖抑制活性を持たない不均一な混合物が生成してしまう。
さらに重要なことは、Ｐｅｐｉｎｓｋｙらが報告しているように（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２９７，ｐ１０５９−１０６６，（２００１）参照）、精製したＮ末端にＰＥＧを結合させたインターフェロンβにおいても、ＰＥＧの分子量が２０，０００より大きくなると残存活性（結合前インターフェロンβの活性に対する比）が劇的に低下し、分子量４０，０００のＰＥＧを結合させた場合は活性が消失することが知られている。
インターフェロンαにおいても、Ｂａｉｌｏｎらはインターフェロンαのリジン残基に非選択的に分子量４０，０００の高分子分岐鎖ＰＥＧを１分子結合させている（Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１２，１９５（２００１））。しかしながら、高分子量である４０，０００のＰＥＧを結合させると、インターフェロンβのＮ末端にＰＥＧを結合させた時と同様に、インターフェロンαの残存活性は７％と大きく低下すると報告している。
すなわち、低分子量のＰＥＧで修飾するために見いだされてきた技術（ＰＥＧの結合個数や結合部分）を、そのまま高分子量のＰＥＧに応用することは難しい。つまり、医薬品としての有用性に繋がるインビボの循環半減期の延長やクリアランス値の減少などの効果を十分に得るために必要な分子量（２０，０００以上）のＰＥＧを結合させた、高活性のインターフェロンβ複合体を得るためには、新たな技術が必要であった。
以上のとおり、これまで、高分子量の水溶性ポリマーを結合する際に起きるインターフェロンβの活性低下を回避する修飾対象リジン残基の選択や、そのための技術は報告されていない。また、インターフェロンβ中に存在する１１残基のリジンの何れか一つに選択的にＰＥＧ等の高分子水溶性ポリマー結合することで、活性の高いインターフェロンβ複合体が得られることも報告されていない。

本発明の目的は、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾物を結合しても、生物活性を損なうことのないインターフェロンβ複合体の構造を見いだすこと、及びこれを高効率で製造する方法を提供することにある。特に、分子量が４０，０００に至るような高分子量のＰＥＧを結合させてもインターフェロンβの活性が１０％以上保持されるているインターフェロンβ複合体を得ることを課題とする。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、天然型のインターフェロンβには８０番目のアスパラギンに糖鎖が結合しており、３次元構造上これに近接する１９番目や１３４番目のリジン残基に選択的に高分子量の修飾物を結合することが活性低下を抑える手段であることを見出した。分子量１０，０００を越えるような高分子（例えば、ＰＥＧ）であっても、上記１９番目、あるいは１３４番目のリジンに選択的に結合させれば、インターフェロンβの活性低下を抑えることができる。
１９番目のリジン残基は、これまでＰＥＧをインターフェロンβのアミノ基に結合する際には除去されるべきリジンの一つとして挙げられており（国際公開ＷＯ０１／１５７３６号参照）、従来の技術からは当該結合部位は推定し得ないものである。また、１３４番目のリジン残基についても、当該部位に高分子量修飾物を選択的に結合させることでインターフェロンβの活性の低下が抑えられることもこれまで報告されたことはない。
すなわち、本発明は、糖単位の数が５以下の少糖類及び単糖類、これらの糖アルコール、並びに炭素数２ないし６の多価アルコールから成る群より選ばれる少なくとも１種の添加剤存在下で、インターフェロンβとポリエチレングリコールとを結合させることを特徴とするインターフェロンβ複合体の製造方法、及び該方法によって製造されるインターフェロンβ複合体、特に、インターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目のリジンあるいは１３４番目のリジンに特異的にポリエチレングリコールを結合させることを特徴とするインターフェロンβ複合体を提供する。
本発明のインターフェロンβ複合体は、高い血液溶解性、インターフェロンβ活性、物理的及び生物学的安定性を有し、医薬として、インターフェロンβが適用される全ての症状・疾患の治療、予防、緩和に有用である。

上記の通り、本発明の方法では、インターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目、あるいは１３４番目のリジンにポリエチレングリコールを効率よく結合させ、非結合物や副生物を分離することができる。
本発明の方法に供されるインターフェロンβは、天然型、天然型の糖鎖の部分を改変したもの、もしくは糖鎖を有するあるいは糖鎖を有しない組み換え型を用いることができる。本発明の方法では、このようなインターフェロンβとして、市販のものを用いてもよい。なお、天然型では１９番目のリジンと３次元構造上近接する位置に、糖鎖が結合している８０番目のアスパラギンが存在し、高分子量のＰＥＧなどを結合する場合、立体障害により反応効率が低下する可能性があるため、糖鎖を持たない組換え型を用いることが好ましい。また本発明の方法に供されるインターフェロンβとしては、天然型のアミノ酸配列に１個あるいは数個のアミノ酸を欠失・置換・付加を加えたものを用いることができる。
本発明のインターフェロンβには、天然型インターフェロンβのほか、組換え型インターフェロンβやそれらの改変体も含む。なお、改変体とは、上記したような、天然型インターフェロンのアミノ酸配列あるいは糖鎖に改変や修飾を加えたものを意味する。本明細書における１９番目、あるいは１３４番目のリジンとは、この天然型インターフェロンβのアミノ酸配列（図４及び配列番号１）におけるアミノ酸番号であり、改変体の場合は当該配列中の前記リジンに対応するアミノ酸番号となる。
これらのインターフェロンβは、組織からの抽出、タンパク質合成、天然細胞又は組換え細胞を用いた生物学的製造など、いかなる方法で得られるものであってもよい。遺伝子工学的に生産された、糖鎖を持たないインターフェロンβは市販されており、本発明の方法では、このような市販のインターフェロンβも用いることができる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、人体に無害で、インターフェロンβに結合させて複合体として投与した際、該複合体が血液に溶解するのに必要なレベルの水溶性を付与する。生理活性物質にＰＥＧを結合することにより、生体内での該生理活性物質の物理的及び熱安定性の向上、酵素分解に対する保護、溶解度の増加、インビボの循環半減期の延長、クリアランス値の減少が達成されることは公知であり、本発明においても、このような効果からＰＥＧを好ましく用いることができる。
インターフェロンβ中のリジン残基のアミノ基にＰＥＧを結合させるためのＰＥＧ末端活性化はいずれの方法を用いてもよい。例えば、末端にヒドロキシスクシンイミドエステル又はニトロベンゼンスルホネートエステル構造のような、アミノ基反応性の構造を有するＰＥＧを用いることができる。本明細において、これら末端構造を「アミノ基反応性の官能基」、これら末端構造を持つＰＥＧを「アミノ基反応性の官能基により活性化されたポリエチレングリコール」と記載する。これらの構造を有するＰＥＧは、従来よりアミノ基との結合のために広く用いられており、周知の合成方法により容易に製造することもでき、また市販されてもいる。本発明では、このような市販品も好ましく用いることができる。
ＰＥＧの平均分子量は、特に限定されないが、生体内でのインターフェロンβの物理的及び熱安定性、酵素分解に対する保護、溶解度の増加、インビボの循環半減期の延長、クリアランス値の減少を図る観点から、好ましくは約１０，０００〜６０，０００、さらに好ましくは、約２０，０００〜４０，０００である。
インターフェロンβとＰＥＧとの結合反応は、ｐＨ５．０〜８．５、好ましくはｐＨ５．５〜８．０において、またインターフェロンβ活性低下抑制剤の存在下、好ましくはリン酸、クエン酸などの緩衝液中で、インターフェロンβとＰＥＧとを反応させることにより行うことができる。なお、インターフェロンβ活性低下抑制剤とは、インターフェロンβを反応に適したｐＨ５．０〜８．５の環境に置くことによる凝集などを抑制するのみならず、標的である１９番目、あるいは１３４番目のリジン、さらにはその近傍への特異的なＰＥＧの結合反応を助けるものである。インターフェロンβの活性を保持した状態で、所望の部位にＰＥＧを効率よく結合させるための活性低下抑制剤の例として、糖類、とりわけ、糖単位の数が５以下の少糖類及び単糖類、これらの糖アルコール、並びに炭素数２〜６の多価アルコール等を挙げることができる。なかでも、グルコース、マンニトール、ソルビトール、シュクロース又はトレハロースのような二糖類や単糖類、及びこれらの糖アルコール、並びにエチレングリコールやグリセロールのような、炭素数２又は３の多価アルコールが好ましい。これらのインターフェロンβ活性低下抑制剤は、単独でも２種以上組み合わせても用いることができる。
本発明の方法に供されるインターフェロンβ活性低下抑制剤の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体の重量に対し、約１〜９０％（複数種類のインターフェロンβ活性低下抑制剤を用いる場合には合計量、以下同じ）、より好ましくは約１〜５０％、さらに好ましくは約１０〜３０％程度である。インターフェロンβとＰＥＧとの混合比率（インターフェロンβ：ＰＥＧ）も、特に限定されないが、通常、モル比で、約１：１〜１：４００程度であり、スクシンイミジルエステル活性化ＰＥＧでは約１：４〜１：１００が好ましい。本発明の方法に適した反応温度は通常４〜４０℃、好ましくは４〜２５℃である。反応時間は、反応温度等に応じて適宜設定されるが、通常、約１時間〜２４時間程度が適当である。
上記反応方法により、インターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目又は１３４番目のリジン、あるいはこれらに立体的に近接する部位に特異的にポリエチレングリコールを結合させることができる。なお、「立体的に近接する部位」とは、インターフェロンβの活性なコンフォーメーションにおける近接部位であって、具体的には、１９番目のリジンであれば、１７番目のシステイン、８０番目アスパラギン（特に、これに結合した糖鎖）、である。また、特異的とは、選択的、優先的に１９番目もしくは１３４番目のリジン、あるいはこれらに立体的に近接する部位にポリエチレングリコールが結合することであって、これにより均一なモノＰＥＧ化インターフェロンβが得られる。
なお、システインのチオール基との結合反応には末端にオルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、マレイミド又はヨードアセトアミド構造のようなチオール基反応性の構造を有する水溶性ポリマー、好ましくはマレイミド構造を有するものを用いる。特に望ましい分子量である１０，０００〜６０，０００のＰＥＧをインターフェロンβのアミノ酸配列のシステイン残基に結合させるには、インターフェロンβの糖鎖が天然型より小さいもの、もしくは糖鎖が除去されているか、糖鎖を本来有しないものが好ましい。このようなインターフェロンβを用いることにより、一段階の反応で、還元解裂することのない結合反応を高効率で進行させることができる。
結合反応後、例えば、イオン交換、ゲル濾過、疎水又は親和性担体を用いたクロマトグラム等の方法、もしくはこれらの組み合わせにより、未反応のインターフェロンβやＰＥＧ、副生成物を除去して、リジン１９番目、あるいは１３４番目にＰＥＧが結合した所望のインタフェロンβ複合体を精製、あるいは濃縮することができる。
最も効率よくリジン１９番目あるいは１３４番目にＰＥＧが結合したインタフェロンβ複合体を精製、濃縮する方法の一つは、イオン交換担体を用いたクロマトグラムである。用いるイオン交換担体は好ましくは陽イオン交換担体であり、更に好ましくはスルホプロピル基、スルホン酸基あるいはカルボキシメチル基を基材に結合させた担体であり、何れも市販品として入手利用が可能である。例えば、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（アマシャムファルマシア）、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ（アプライドバイオシステムズ）あるいはＳＰ−５ＰＷ（東ソー）を用いた場合、塩濃度勾配により、反応液中に存在する極僅かな２分子のＰＥＧが結合したインターフェロンβ複合体、次に目的のインターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目のリジンにＰＥＧが結合した複合体が全体の４０％以上の比率で溶出され、その後にマイナーな結合位置の異性体としてＮ末端アミノ基、又は３３、４６、１０８番目のリジンにＰＥＧが結合した複合体や未反応のインターフェロンβが溶出、分画される。この時、同時に１３４番目のリジンにＰＥＧが結合したインターフェロンβ複合体を単離することができる。
陽イオン交換担体への結合は、反応液をｐＨ３．０〜ｐＨ８．０で結合に適したイオン強度に調整して行う。このとき、陽イオン交換担体はカラムに充填されていても、反応液中に縣濁させていてもよいが、未反応の親水性ポリマーが陽イオン交換担体中で凝固することで目的の複合体の分離の効率を下げる時は、縣濁結合させた後に担体をカラムに充填して溶出するのが好ましい。陽イオン交換担体からの溶出は、クエン酸、酢酸、リン酸などから構成される緩衝溶液中で塩濃度やｐＨの勾配もしくは無勾配段階的増加させることにより行うことができる。
分画溶出したインターフェロンβ複合体におけるＰＥＧの結合部位の解析は、実施例３に記したようにペプチドマッピング、得られたＰＥＧ結合断片のアミノ酸分析や配列決定により行うことができる。
このようにして製造された１９番目、あるいは１３４番目のリジンにＰＥＧを結合させたインターフェロンβ複合体の抗ウイルス活性は、公知の方法（例えば、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７８，３８１−３８７，（１９８１）やＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７，７５５（１９８１）；Ｂｏｒｄｅｎ ｅｔ．Ａｌ．，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４２，４９４８（１９８２）等）により容易に測定することができる。１９番目のリジンに分子量４０，０００のＰＥＧを結合させたインターフェロンβは結合前の活性の１０％以上の活性を保持しており、これは分子量２０，０００のＰＥＧを結合させた時と同等の活性である。また、１３４番目のリジンに分子量４０，０００のＰＥＧを結合させたインターフェロンβは結合前の活性の７０〜１００％の活性を保持している。従来、インターフェロンβのＮ末端に分子量４０，０００のＰＥＧを結合した複合体の残存活性は０％であることが報告されており（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２９７，ｐ１０５９−１０６６，（２００１））、インターフェロンβへの高分子量ＰＥＧの結合部位として１９番目、あるいは１３４番目のリジンを用いることは極めて有用であることがわかる。
本発明の方法は、ＰＥＧ以外の物質についても、インターフェロンβの活性低下を伴わない複合体作製方法として適用できる。ＰＥＧ以外の物質は、ヒドロキシスクシンイミドエステル又はニトロベンゼンスルホネートエステル構造のような、アミノ基反応性の構造を有していることが好ましい。第二の分子はＰＥＧ、血清タンパク質などの生体内安定性を付与するための分子に限らず、酵素、サイトカイン若しくは抗体分子等又はこれらの一部のように全く異なる機能を持つ生理活性物質であってもよい。これらの複合体は、インターフェロンβの活性を併せ持つ融合分子や標識体を構築する際に有効である。
さらに、本発明の方法は、インターフェロンβを各種支持体、例えば糖、硝子、樹脂素材の平面あるいは粒子に固相化する際にも応用できる。すなわち、インターフェロンβと各種支持体の結合点として、１９番目、あるいは１３４番目のリジンを使用することにより、活性低下を起こさずインターフェロンβを固相化することができる。なお、この方法では、同様なアミノ基反応性の官能基を持った架橋剤を導入するか、支持体にこれらを予め結合しておく必要がある。
上記した本発明のインターフェロンβとＰＥＧの複合体は、ＩＦＮの生理活性を利用した種々の疾患の治療に用いることができる。例えば、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型慢性肝炎及びその他ウィルス性疾患、膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、皮膚悪性黒色腫等種々の悪性新生物、多発性硬化症等の自己免疫疾患等の治療に用いることができる。更に、血管新生を伴う疾患、例えば、リウマチ性関節炎、乾癬等の炎症性疾患、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群及びその類縁疾患、眼類天疱瘡及びその類縁疾患、角膜腐蝕あるいはトラコーマ等等の眼疾患及び癌（乳癌、前立腺癌、悪性黒色腫、腎癌、脳腫瘍、カポジ肉腫等）の治療に用いることができる。
本発明のインターフェロンβ複合体は、そのまま、もしくは公知の薬理学に許容される担体、賦形剤などと混合した医薬組成物として経口又は非経口に投与することができるが、皮下、筋肉内あるいは静脈内注射により投与することが好ましい。
経口投与のための剤型としては、具体的には錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる剤型は、自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体もしくは賦形剤を含有するものである。
例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ラクトース、マルトース、サッカロース、澱粉、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。非経口投与のための剤型としては、例えば、点眼剤、軟膏剤、注射剤、湿布剤、坐薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤、局所徐放剤などがあげられる。
溶液製剤は、公知の方法、例えば、インターフェロンβ複合体を通常、注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解、又は懸濁させ、あるいは乳化又はリポソームに包埋させたることにより調製されうる。
固体製剤は、公知の方法、例えば、インターフェロンβ複合体にマンニトール、トレハロース、ソルビトール、ラクトース、グルコースなどを賦形剤として加え、凍結乾燥物とすることにより調製されうる。前記凍結乾燥物は、さらに粉体化したり、さらにこの粉体をポリ乳酸やグリコール酸などと混ぜ固体化して用いることもできる。
ゲル化剤は、公知の方法、例えば、インターフェロンβ複合体をグリセリン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などの増粘剤や多糖に溶解することにより調製されうる。いずれの製剤においても、安定化剤としてヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２マクログロブリン、アミノ酸などを添加することができ、また分散剤あるいは吸収促進剤としてＩＦＮの生理活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコール、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などを添加することができる。また、微量金属や有機酸塩も必要に応じて加えることができる。
本発明の複合体の投与量は、患者の年齢、体重、投与対象疾患、症状、投与形態、投与ルート、ＰＥＧの分子量などに応じて、適宜決定されるが、一般的には１，０００単位〜１０，０００万単位／回、好ましくは１０，０００単位〜１，８００万単位／回で１回／月〜１回／日、好ましくは１回／月〜１回／週の範囲で投与される。

図１は、１９番目のリジンのアミノ基にポリエチレングリコールが結合したインターフェロンβ複合体のＰｏｒｏｓ ＨＳカラムによる分離精製を示す図である。図中、上の矢印は溶媒Ｂの混合比率を、下の矢印は２８０ｎｍの吸光度を示す。
図２は、１９番目のリジンのアミノ基にポリエチレングリコールが結合したインターフェロンβ複合体をＰｏｒｏｓ ＨＳカラムで分離精製した際のピーク１〜４（図中（ｉ）〜（ｉｖ））の成分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、銀染色により解析した結果を示す図である。
図３は、１９番目のリジンのアミノ基にポリエチレングリコールが結合したインターフェロンβ複合体のＳＰ−５ＰＷカラムを用いた分離精製を示す図である。
図４は、インターフェロンβのアミノ酸配列とリジルエンドペプチダーゼによる切断予想部位を示す図である。
図５は、分子量４０ＫのＰＥＧとの結合反応後にＳＰ−５ＰＷで分離した２〜４（図中では丸付き数字で表示してある。）の溶出成分、及び、ＰＥＧ反応前のインターフェロンβ（最下段 Ｐｒｅ）のリジルエンドペプチダーゼ処理によるペプチドマップを示す図である。
図６は、分子量４０ＫのＰＥＧを１９番目のリジンで結合したインターフェロンβのウサギにおける血中滞留性を示す図である。
図７は、分子量４０ＫのＰＥＧを１９番目のリジンで結合したインターフェロンβによるウサギにおける薬理マーカー（２−５ＡＳ合成酵素の活性）の誘導を経時的に示した図である。
図８は、１３４番目のリジンのアミノ基にポリエチレングリコールが結合したインターフェロンβ複合体をＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ ６５０により分離した際の各ピーク分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）、ピーク３（図中（ｉｉｉ））の分画をＳＰ−５ＰＷ（Ｂ）により分析した結果を示した図である（溶出順にクロマトチャートを下から上の順に並べた）。
図９は、ＰＥＧが非選択的に２分子以上結合したインターフェロンβ複合体と１９番目あるいは１３４番目のリジンに選択的にＰＥＧが１分子結合した複合体の活性を示した図である。ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ ６５０（Ｓ）（東ソー）カラムによるクロマトチャート（Ｂ）と、分取した分画に対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果（Ａ）、及び、各画分のタンパク量当たりの抗ウイルス活性値とＰＥＧ結合前のＩＦＮ−βの比活性に対する活性保持率（Ｃ）を対応させて示した。
図１０は、分子量２０，０００（２０Ｋ）と４０，０００（４０Ｋ）のＰＥＧを結合したＩＦＮ−β複合体のウサギ静脈内投与後の血中滞留性性を示した図である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−２９９８５０号の明細書に記載された内容を包含する。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
［実施例１］
組換え型インターフェロンβのアミノ基へのヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ポリエチレングリコール結合反応における添加剤の影響：
０．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に保存した組換え型ヒトインターフェロンβ（最終濃度２００μｇ／ｍｌ、Ｇｏｅｄｄｅｌらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．８，４０５７−４０７４（１９８０）に従って組み換え大腸菌により発現精製を行った。）に各々、グルコース、グリセロール又はエチレングリコールを最終濃度が１、５、１０、２０％となるように添加した後、非添加コントロールと共に１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．８に調節した。ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ポリエチレングリコール（平均分子量４０Ｋ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＩＮＣ社製品、日本油脂より購入）をインターフェロンβに対して約１０倍モル混合し、４℃で一晩結合反応をさせた。反応後、未反応のインターフェロンβを除き、各々調製した反応液のインターフェロンβ活性の測定を行った。
活性の測定は、酵素抗体（サンドイッチイムノアッセイ）法を用いた（石川榮治「酵素免疫測定法」（第３版）、１８０頁、医学書院を参照）。具体的には、ウサギ抗インターフェロンβ抗体をイムノプレートに固相化し、試料と同時に活性を持つインターフェロンβ構造のみを認識するマウスモノクローナル抗体の酵素標識体を添加した。未結合物を洗浄後、発色基質を添加し、標準品の発色値との対比から試料のインターフェロンβ活性を算出した（インターフェロンβ活性は培養細胞の抗ウイルス活性に基づく生物活性測定法と同等の結果が得られることを確認した）。同様に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ８０あるいはＨＣＯ６０を添加した場合は、インターフェロンβの凝集は抑制されるものの、ＰＥＧの結合反応の進行も大きく抑制されたため、結合体の活性を測定するには至らなかった。
表１に示したように、グルコース、グリセロール、エチレングリコールを適量反応溶液に存在させた場合、コントロール（添加剤非存在下でのＰＥＧ結合反応で得られたＰＥＧ−インターフェロンβ複合体の活性）に比較して、明らかな活性向上効果が認められた。

［実施例２］
１９番目のリジンのアミノ基にポリエチレングリコールが結合したインターフェロンβ複合体の分離精製：
０．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に保存した組換え型ヒトインターフェロンβ（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）にエチレングリコールを（最終濃度２０％）添加した後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．６に調節した。ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ポリエチレングリコール（平均分子量４０Ｋ、日本油脂より購入）を混合し、４℃で一晩結合反応をさせた。反応液を１０ｍＭ ＮａＣｌ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して４℃で一晩透析を行った。透析液を腸イオン交換カラムである Ｐｏｒｏｓ ＨＳ １．７ｍＬ−ｇｅｌ（アプライドバイオシステムズ製）、あるいはＳＰ−５ＰＷ（東ソー）に供した。溶出は溶媒Ａ：１０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜４．７）に対する溶媒Ｂ：１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜４．７）の混合比率を上げることにより行った。具体的には、Ｐｏｒｏｓ ＨＳにおいては溶媒Ｂの比率を３０、４０、５０、１００％と非連続的に、ＳＰ−５ＰＷにおいては０→１００％の連続勾配により溶出を行った。図１にＰｏｒｏｓ ＨＳ溶出の吸光クロマトチャートを示した。吸光クロマトチャート上、溶媒Ｂの比率を３０、４０、５０、１００％に段階的に上昇させた際に溶出された成分をそれぞれピーク１〜４（図中（ｉ）〜（ｉｖ））と名付けた。
図２に各ピーク（１〜４）成分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後銀染色により解析した結果を示した。ピーク２に目的の１９番目のリジン残基に分子量４０ＫのＰＥＧを結合したインタフェロンβ複合体を得ることができた。副生物として３のピークに３３番目のリジン残基にＰＥＧが結合したインタフェロンβ複合体、４のピークにＮ末端アミノ基、及び１０８、１３４番目のリジン残基にＰＥＧが結合したインタフェロンβ複合体など、反応では完全に制御することができずに存在する僅かなＰＥＧ結合部位の異性体を分離することが可能であった。未反応のインターフェロンβはピーク４、ＰＥＧが２分子結合したインターフェロンβはピーク１に分離することができた。
図３にＳＰ−５ＰＷで溶出したときの吸光クロマトチャートを示した。ＳＰ−５ＰＷでも、Ｐｏｒｏｓ ＨＳを用いた時と同様の分離が可能であり、目的の１９番目のリジン残基に分子量４０ＫのＰＥＧを結合したインタフェロンβ複合体はピーク２として全タンパク量の約６５％（未反応のインターフェロンβを除いたＰＥＧ複合体における割合は６５％以上である）を占めていた。
［実施例３］
組換え型インターフェロンβのポリエチレングリコールの結合部位の確認：
実施例２で分離したＳＰ−５ＰＷの各ピーク画分を、固相抽出カートリッジ（ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ、Ｗａｔｅｒｓ）で脱塩・濃縮した後、遠心エバポレーターにて乾固した。さらに、６ｍｏｌ／Ｌグアニジンを含むトリス緩衝液（ｐＨ９）で溶解した後、ジチオスレイトールによるＣｙｓの還元、ヨードアセトアミドによるカルボキシアミドメチル化を行った後、リジルエンドペプチダーゼを添加し３７℃で５時間放置し、構造特異的消化を行った。最後に酢酸にて酵素反応を停止し、分析のための前処理済み試料とした。
初めに、この試料の逆相ＨＰＬＣ分析（カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ（１８４．６ｘ１５０）を用い、検出波長：２１４ｎｍ（ＵＶ）、カラム温度：４０℃、流速：０．８ｍＬ／分、移動相Ａ：酢酸／ＴＦＡ／蒸留水（１／０．２／１０００）、移動相Ｂ：酢酸／ＴＦＡ／アセトニトリル／蒸留水（０．９／０．２／８００／２００）、グラジエント：８０分で移動相Ｂを５％から７０％にした。その後、５分で移動相Ｂを７０％から１００％にした。分析サイクル：１２０分）を行った。
ＰＥＧ結合反応前のインターフェロンβのリジルエンドペプチダーゼ断片に対応するＨＰＬＣクロマトチャートにおけるピーク（Ｋ１〜Ｋ１２）を図４、図５−ｐｒｅに示した。図４の矢印は、リジルエンドペプチダーゼ切断部位を示す。切断により生じるペプチド断片をＫ１〜Ｋ１２と名付けた。図５のＫ１〜Ｋ１２は、それぞれ図４のペプチド断片Ｋ１〜Ｋ１２に相当する。これに対し、ピーク２のペプチドマップは図５−２（図中（ｉｉ）、以下同様）に示したように、ペプチドＫ１及びＫ２の顕著な消失が認められた。このことは、１９番目のリジン側鎖のアミノ基にＰＥＧが導入され、消化を免れることによりペプチドＫ１及びＫ２が生成されないことによるものと考えられ、ＰＥＧ導入部位は１９番目のリジンであると推定された。
ピーク３のペプチドマップは図５−３に示した結果となり、ペプチドＫ２の顕著な消失が認められた。これは、３３番目のリジン側鎖のアミノ基にＰＥＧが導入され、消化を免れることによりペプチドＫ２が生成されないためと考えられ、ＰＥＧ導入部位はＬｙｓ３３が主であると推定された。
ピーク４については図５−４に示したように、Ｋ１の減少が認められることからＮ末結合体が存在することが推定された。その他に、Ｋ１０ペプチドが半減していることから、Ｌｙｓ１３４あるいはＬｙｓ１２３異性体が含まれる可能性が示唆された。
次に、ピークの逆相ＨＰＬＣ分析において７５分付近のピークとして現れるＰＥＧペプチド結合断片のアミノ酸配列分析を行った。この結果と前述のペプチドマップの情報から、反応主生成物であるピーク２が目的の１９番目のリジンにＰＥＧが結合した複合体であると確認された。それぞれ僅かな副生物として、ピーク３に３３番目のリジン、ピーク４に１３４、１０８番目のリジン及びＮ末端にＰＥＧが結合した位置異性体が分離されていた。
［実施例４］
１９番目のリジン残基に選択的に分子量４０Ｋ及び２０ＫのＰＥＧを結合したインターフェロンβ複合体の残存活性測定：
１９番目のリジン残基に選択的に分子量４０Ｋ及び２０ＫのＰＥＧを結合した組換え型ヒトインターフェロンβ複合体を実施例２の方法で合成・単離精製し、ＰＥＧ結合前の組換え型ヒトインターフェロンβとの活性比較を行った。インターフェロンβ活性の比較は抗ウイルス活性を測定することで判定した。具体的には、ヒト羊膜細胞であるＦＬ細胞とシンドビス（ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、あるいは水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス（ＶＳＶ）を組み合わせたバイオアッセイ法を用いることで判定した（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７８，３８１−３８７，（１９８１））。
その結果、ＰＥＧ結合前の組換え型ヒトインターフェロンβの活性は１．２２×１０^８ＭＩＵ／ｍｇ、４０ＫのＰＥＧ結合体の抗ウイルス活性は５．５×１０^７ＭＩＵ／ｍｇであり、残存活性は４５％と高値であった。同様にして測定した２０ＫのＰＥＧ結合体の残存活性は３８．７％であった。
［実施例５］
１９番目のリジン残基に選択的に分子量４０ＫのＰＥＧを結合したインターフェロンβ複合体の体内動態、薬効マーカー誘導活性評価：
１９番目のリジン残基に選択的に分子量４０ＫのＰＥＧを結合した組換え型ヒトインターフェロンβ複合体を実施例２の方法で合成・単離精製し、ウサギ（ＮＺＷ、雄）に９Ｍ／ｋｇで投与した。投与前及び投与１５分、１．５時間、３．５時間、８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日後に採血し、血漿の抗ウイルス活性の測定及び全血の２−５ＡＳ合成酵素の活性を行った。抗ウイルス活性の測定は実施例１に記載した方法で、２−５ＡＳ合成酵素の活性測定は２−５Ａキット‘栄研’（栄研化学）を用い、指定された方法に従って行った。図６に抗ウイルス活性測定に基づく経時的なインターフェロンβの血中残存活性、図７に薬効指標としての２−５ＡＳ合成酵素の活性の結果をグラフで示した。分子量４０ＫのＰＥＧを結合させることで、インターフェロンβの血中残存活性（ＡＵＣ）が２０．８倍増加し、これは薬効マーカーの誘導活性の上昇（ＰＥＧ結合によりＡＵＣが７．６倍、７日後においても未修飾インターフェロンβの薬理マーカー誘導最高値を上回っていた）に繋がっていた。
［実施例６］
１３４番目のリジンのアミノ基にポリエチレングリコールが結合したインターフェロンβ複合体の分離精製：
実施例２と同様にして得た組換え型ヒトインターフェロンβのＰＥＧ結合反応溶液に５倍容の１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加し、同緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラム（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ ６５０（Ｓ）（東ソー））に供した。
１Ｍの塩化ナトリウムを含む同緩衝液が０から６５％となるように連続勾配で混合比を上げて溶出されるタンパク質を分画した。溶出された分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＰ−５ＰＷカラム（東ソー）で分析した。それぞれの結果を図８−Ａ及びＢに示した。
その結果、実施例２と同様に３つのピークが得られたが、３番目のピーク（図８−Ａのピーク（ｉｉｉ））に含まれる分画を個別にＳＰ−５ＰＷカラムで分析すると、更に幾つかの成分に単離していることが判った（図８−Ｂ）。この中で構成比が最も高く、最後に溶出されるピーク（図８−Ｂの矢印）を含む画分を実施例３と同様の方法で分析した結果、１３４番目のリジンにＰＥＧが結合したＩＦＮ−β複合体が単離されていた。
［実施例７］
ＰＥＧ結合リジンが非選択的な反応方法と選択的な結合反応によって得られるＰＥＧインターフェロンβの活性比較：
実施例２と同様の方法で、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に保存した組換え型ヒトインターフェロンβあるいは天然型インターフェロンにエチレングリコールを最終濃度２０％となるように添加した後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨ５．５（反応条件１）もしくは７．６前後（反応条件２）に調節した。ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ポリエチレングリコール（平均分子量１０Ｋ、２０Ｋ、４０Ｋ Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＩＮＣ社製品、日本油脂株式会社より購入）をインターフェロンβ１分子に対して４５倍となるように混合し、４℃で一晩結合反応をさせた。
同時に、、組換え型ヒトインターフェロンβあるいは天然型インターフェロンβ溶液にＳＤＳを最終濃度が０．１％になるように添加した後、反応液のｐＨを９．０になるように調整した（反応条件３）。これを、ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ポリエチレングリコール（平均分子量１０Ｋ、２０Ｋ、４０Ｋ）をインターフェロンβ１分子に対して４５倍となるように混合し、４℃で一晩結合反応をさせた。
それぞれ反応後の溶液中のインターフェロンβ活性を実施例４と同様に抗ウイルス活性測定法で評価し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて結合反応の進行を確認した。
表２に示したように、ＰＥＧの結合するリジンの選択性を確保していない反応条件３ではインターフェロンβの活性がＰＥＧ分子量に因らず、１０％以下に低下していた。一方、１９番目あるいは１３４番目のリジンへの結合選択性を上げた反応条件１および２では、ＰＥＧ分子量に因らず、インターフェロンβの活性は最低でも１０％以上保持されていることが確認された。

［実施例８］
ＰＥＧが非選択的に２分子以上結合したインターフェロンβ複合体と１９番目あるいは１３４番目のリジンに選択的にＰＥＧが１分子結合した複合体の活性比較：
実施例６と同様にＰＥＧ結合反応後、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ ６５０（Ｓ）（東ソー）カラムで分離した、ＰＥＧが非選択的に２分子以上結合したインターフェロンβ複合体と１９番目あるいは１３４番目のリジンに選択的にＰＥＧが１分子結合した複合体をそれぞれ含む画分のインターフェロンβ活性を抗ウイルス活性測定法（実施例４記載）で測定した。その結果、図９に示すようにＰＥＧが非選択的に２分子以上結合したインターフェロンβ複合体が１％程度の活性しか保持していないのに対し、１９番目あるいは１３４番目のリジンに選択的に４０ＫのＰＥＧが１分子結合した複合体は１０％以上の活性を保持していた。
［実施例９］
分子量２０，０００と４０，０００のＰＥＧを結合したＩＦＮ−β複合体の血中滞留性比較：
分子量２０，０００と４０，０００のＰＥＧを結合したＩＦＮ−β及びＰＥＧを結合していないＩＦＮ−βを１２５Ｉで標識し、ウサギの静脈内に投与後、６日目まで経時的に採血し、γカウンターで放射活性を測定して血中に残留している各インターフェロンβ量を測定した。図１０に投与時の放射活性を１００％としたときの血中残留量の経時変化を表示した。６日目までの血中残留量の積分値はＰＥＧの分子量が４０，０００の時はＰＥＧを結合していないＩＦＮ−βの５．５倍に上昇していた。またＰＥＧの分子量が２０，０００の時はＰＥＧを結合していないＩＦＮ−βの１．５倍の上昇に止まった。このことから、分子量が２０，０００以上のＰＥＧを活性を保持したままＩＦＮ−βに結合することは、ＩＦＮ−β複合体の血中滞留性にとって重要であることが確認された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、インターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目、あるいは１３４番目のリジンに特異的にポリエチレングリコールを特異的に結合させることができる。本発明の方法で得られるインターフェロンβ複合体は高い活性を保持しつつ、生体内での十分な溶解性と物理的・生物学的安定性、並びに優れた循環半減期とクリアランス値を有する。したがって、本発明のインターフェロンβ複合体は、副作用が少なく、効果の高い医薬品として有用である。

Claims (13)

1. 糖単位の数が５以下の少糖類及び単糖類、これらの糖アルコール、並びに炭素数２ないし６の多価アルコールから成る群より選ばれる少なくとも１種の添加剤存在下で、インターフェロンβとポリエチレングリコールとを結合させることを特徴とするインターフェロンβ複合体の製造方法。
2. 前記添加剤が、二糖類、単糖類及びこれらの糖アルコール、並びに炭素数２及び３の多価アルコールから成る群より選ばれる、請求項２記載の製造方法。
3. 前記添加剤が、グルコース、マンニトール、ソルビトール、シュクロース、トレハロース、エチレングリコール及びグリセロールから成る群より選ばれる、請求項１乃至３記載の製造方法。
4. 前記インターフェロンβが、天然型インターフェロンβあるいは組換え型インターフェロンβ、もしくはそれらの改変体である、請求項１乃至４記載の製造方法。
5. 前記ポリエチレングリコールの平均分子量が１０，０００〜６０，０００である、請求項１乃至４記載のインターフェロンβ複合体の製造方法。
6. インターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目又は１３４番目のリジン、あるいはこれらに立体的に近接する部位に特異的にポリエチレングリコールを結合させることを特徴とする、請求項１乃至５記載の製造方法。
7. インターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目又は１３４番目のリジンに特異的にポリエチレングリコールを結合させることを特徴とする、請求項１乃至５記載の製造方法。
8. ｐＨ５．０〜８．５にてポリエチレングリコールをインターフェロンβと反応させることを特徴とする、請求項１乃至７記載の製造方法。
9. ｐＨ５．０〜８．５にてアミノ基反応性の官能基により活性化されたポリエチレングリコールとインターフェロンβを反応させた後、イオン交換担体による濃縮精製工程を経てインターフェロンβのアミノ酸配列の１９番目、あるいは１３４番目のリジンに特異的にポリエチレングリコールが結合したインターフェロンβ複合体を得ることを特徴とする、請求項１乃至８記載の製造方法。
10. ヒドロキシスクシンイミドエステル又はニトロベンゼンスルホネートエステル構造を有する化合物によりポリエチレングリコールを活性化することを特徴とする、請求項９記載の製造方法。
11. 請求項１乃至１０記載の方法によって製造されるインターフェロンβ複合体。
12. 抗ウイルスアッセイにおけるインターフェロンβ活性が、結合前のインターフェロンβの１０％以上の効力を保持していることを特徴とする、請求項１１記載のインターフェロンβ複合体。
13. 請求項１１又は１２記載のインターフェロンβ複合体を含む医薬組成物。

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