KR101157679B1

KR101157679B1 - 인터페론β 복합체

Info

Publication number: KR101157679B1
Application number: KR1020067003751A
Authority: KR
Inventors: 히데끼 나루미; 요시아끼 쯔시마; 고지 야마시따; 사부로우 소네; 미유끼 사또
Original assignee: 다니구찌, 다다쯔구; 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2003-08-25
Filing date: 2004-08-24
Publication date: 2012-06-20
Also published as: KR20060134905A; AU2004266969B2; CN1871257A; CA2536643C; CN100519581C; US20100145017A1; JP4850514B2; CN101880326A; EP1666496B1; JPWO2005019260A1; US7915386B2; US20060246034A1; PT1666496E; WO2005019260A1; EP1666496A1; CN101880326B; AU2004266969A1; ES2452640T3; CA2536643A1; PL1666496T3

Abstract

본 발명은, 높은 생물 활성을 갖는 인터페론β와 폴리에틸렌글리콜의 복합체, 및 이것을 고효율로 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은, 당 단위의 수가 5 이하인 소당류 및 단당류, 이들의 당 알코올, 및 탄소수 2 내지 6의 다가 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제의 존재하에서, 인터페론β와 폴리에틸렌글리콜을 결합시키는 것을 특징으로 하는 인터페론β 복합체의 제조 방법, 및 그 방법에 의해서 제조되는, 인터페론β의 아미노산 서열의 19번째 또는 134번째의 리신에 특이적으로 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인터페론β 복합체에 관한 것이다.

인터페론β 복합체, 폴리에틸렌글리콜, 리신

Description

인터페론β 복합체 {INTERFERON-β COMPOSITE}

본 발명은, 인터페론β의 아미노산 서열의 19번째 또는 134번째의 리신에 특이적으로 폴리에틸렌글리콜을 결합시킨 인터페론β 복합체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 폴리머를 단백질 의약으로 대표되는 생체 분자에 결합시키면, 물리적 안정성, 열 안정성, 단백 분해 효소에 대한 저항성, 용해성의 향상, 생체 내에서의 분포 용적의 저하, 혈중 체류성의 향상 등의 효과가 초래되어, 임상적인 유용성이 부가되는 것으로 알려져 있다(Inada et al., J. Bioact and Compatible Polymers 5, 343(1990); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, 249(1992); Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10, 91(1993) 참조).

천연형 또는 천연형과 동일한 일차 구조를 갖는 인터페론β에 수용성 폴리머인 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시키기 위해서는, 각종 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, Katre 등은, 리신 등의 아미노기 수식을 인터페론β의 PEG화에 응용하고 있다(미국 특허 제4766106호, 미국 특허 제4917888호, 국제 공개 제WO87/00056호 참조). 구체적으로는, 분자량 약 300～100,000의 수용성 폴리머(PEG)를 재조합 형 인터페론β 또는 IL-2에, 그 아미노산 서열의 1～10개의 리신 잔기를 통해 결합시킨 복합체가 보고되어 있다. 또한, 림포카인의 아미노기에 PEG를 결합시키는 기술에 관해서도 「화학 수식 림포카인 및 그 제조법」에서 이미 보고되어 있다(일본 특허 공개 소60-226821호 참조). 그러나, 실제로 상기 방법으로 인터페론β에 PEG를 결합시키면, 인터페론β의 활성은 10% 미만으로 저하되어, 실용에 제공할 수는 없다.

종래의 모든 보고에서, 인터페론β의 특정한 리신의 아미노기에 선택적으로 PEG를 결합시키는 기술에 관한 기재는 전혀 없다. 만약, PEG의 결합에 의한 인터페론β의 생물 활성 저하율이 낮은 리신을 선택하여, 특이적으로 수식하는 것이 가능하게 된다면, 의약품으로서 투여하는 총 단백질량을 억제함으로써 환자에서의 부작용 감소, 나아가, 품질 관리를 쉽게 할 수 있게 될 것이다.

한편, 리신 잔기를 통하지 않고, 환원적 알킬화 방법을 이용하여 인터페론의 아미노 말단의 α아미노기를 선택적으로 활성화시키기에 적합한 pH로 반응시킴으로써, 수용성 폴리머를 아미노 말단에 선택적으로 결합시키는 방법도 알려져 있다(일본 특허 공개 평9-25298호 참조). 그러나, 이 방법에 의해 인터페론β를 PEG화하면, 실제로는 모노 PEG화는 일어나지 않고, 어느 하나의 리신 잔기 또는 N말단의 비선택적 PEG화가 일어나서, 충분한 항바이러스 활성 및 세포 증식 억제 활성이 없는 불균일한 혼합물이 생성된다.

더욱 중요한 것은, Pepinsky 등이 보고하고 있는 바와 같이(Pepinsky et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol.297, p1059-1066(2001) 참조), 정제한 N말단에 PEG를 결합시킨 인터페론β에서도, PEG의 분자량이 20,000보다 커지면 잔존 활성(결합전 인터페론β의 활성에 대한 비)이 극적으로 저하하고, 분자량 40,000의 PEG를 결합시킨 경우는 활성이 소실하는 것으로 알려져 있다.

인터페론α에서도, Bailon 등은 인터페론α의 리신 잔기에 비선택적으로 분자량 40,000의 고분자 분지쇄 PEG를 1분자 결합시키고 있다(Bailon et al., Bioconjugate Chem. 12, 195(2001)). 그러나, 고분자량인 40,000의 PEG를 결합시키면, 인터페론β의 N말단에 PEG를 결합시켰을 때와 마찬가지로, 인터페론α의 잔존 활성이 7%로 크게 저하된다고 보고하고 있다.

즉, 저분자량의 PEG로 수식하기 위해서 발견되어 온 기술(PEG의 결합 개수나 결합 부분)을, 그대로 고분자량의 PEG에 응용하는 것은 어렵다. 요컨대, 의약품으로서의 유용성으로 이어지는 생체내 순환 반감기의 연장이나 클리어런스 값의 감소 등의 효과를 충분히 얻기 위해서 필요한 분자량(20,000 이상)의 PEG를 결합시킨, 고활성의 인터페론β 복합체를 얻기 위해서는, 새로운 기술이 필요하였다.

이상과 같이, 지금까지는 고분자량의 수용성 폴리머를 결합할 때에 일어나는 인터페론β의 활성 저하를 회피하는 수식 대상 리신 잔기의 선택 또는 이를 위한 기술은 보고되어 있지 않다. 또한, 인터페론β 중에 존재하는 11 잔기의 리신 중의 어느 하나에 선택적으로 PEG 등이 고분자 수용성 폴리머 결합함으로써, 활성이 높은 인터페론β 복합체가 얻어지는 것도 보고되어 있지 않다.

본 발명의 목적은, 폴리에틸렌글리콜 등의 고분자 수식물을 결합시키더라도, 생물 활성을 손상하는 일이 없는 인터페론β 복합체의 구조를 발견하는 것, 및 이것을 고효율로 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다. 특히, 분자량이 40,000에 이르는 고분자량의 PEG를 결합시키더라도 인터페론β의 활성이 10% 이상 유지되어 있는 인터페론β 복합체를 얻는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 여러 가지로 검토한 결과, 천연형의 인터페론β에서는 80번째의 아스파라긴에 당쇄가 결합되어 있고, 3차원 구조상 이것에 근접한 19번째나 134번째의 리신 잔기에 선택적으로 고분자량의 수식물을 결합시키는 것이 활성 저하를 억제하는 수단임을 발견하였다. 분자량 10,000을 초과하는 고분자(예를 들면, PEG)라도, 상기 19번째 또는 134번째의 리신에 선택적으로 결합시키면, 인터페론β의 활성 저하를 억제할 수 있다.

19번째의 리신 잔기는, 지금까지는 PEG를 인터페론β의 아미노기에 결합할 때 제거되어야 할 리신의 하나로 인식되어(국제 공개 WO01/15736호 참조), 종래의 기술로부터는 해당 결합 부위를 추정할 수 없다. 또한, 134번째의 리신 잔기에 관해서도, 해당 부위에 고분자량 수식물을 선택적으로 결합시킴으로써 인터페론β의 활성의 저하가 억제되는 것도 지금까지 보고된 바 없다.

즉, 본 발명은, 당 단위의 수가 5 이하인 소당류 및 단당류, 이들의 당 알코올, 및 탄소수 2 내지 6의 다가 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제의 존재하에서, 인터페론β와 폴리에틸렌글리콜을 결합시키는 것을 특징으로 하는 인터페론β 복합체의 제조 방법, 및 그 방법에 의해서 제조되는 인터페론β 복합체, 특히, 인터페론β의 아미노산 서열의 19번째의 리신 또는 134번째의 리신에 특이적으로 폴리에틸렌글리콜을 결합시키는 것을 특징으로 하는 인터페론β 복합체를 제공한다.

본 발명의 인터페론β 복합체는, 높은 혈액 용해성, 인터페론β 활성, 물리적 및 생물학적 안정성을 갖고, 의약으로서, 인터페론β가 적용되는 모든 증상?질환의 치료, 예방, 완화에 유용하다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에서는, 인터페론β의 아미노산 서열의 19번째 또는 134번째의 리신에 폴리에틸렌글리콜을 효율적으로 결합시켜, 비결합물이나 부산물을 분리할 수 있다.

본 발명의 방법에 제공되는 인터페론β로는, 천연형, 천연형의 당쇄의 부분을 개변한 것, 또는 당쇄를 갖거나 당쇄를 갖지 않는 재조합형을 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에서는, 이와 같은 인터페론β로서, 시판되는 것을 사용하여도 된다(시판품으로서는 베타페론(Betaferon)이 있고, 베타페론은 천연형 인터페론β의 1번째의 메티오닌이 결실되고 17번째의 시스테인이 세린으로 치환된 개변체이다). 또한, 천연형에서는 19번째의 리신과 3차원 구조상 근접한 위치에, 당쇄가 결합되어 있는 80번째의 아스파라긴이 존재하여, 고분자량의 PEG 등을 결합시키는 경우, 입체 장애로 인해 반응 효율이 저하될 가능성이 있기 때문에, 당쇄를 갖지 않는 재조합형을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 방법에 제공되는 인터페론β로서는, 천연형의 아미노산 서열에 1개 또는 여러개의 아미노산을 결실?치환?부가를 행한 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 인터페론β에는, 천연형 인터페론β 외에, 재조합형 인터페론β나 이들의 개변체도 포함한다. 또한, 개변체란, 상기한 바와 같은, 천연형 인터페론의 아미노산 서열 또는 당쇄에 개변이나 수식을 행한 것을 의미한다. 본 명세서에서의 19번째 또는 134번째의 리신이란, 이 천연형 인터페론β의 아미노산 서열(도 4 및 서열 번호 1)에서의 아미노산 번호이고, 개변체의 경우는 해당 서열 중의 상기 리신에 대응하는 아미노산 번호이다.

이들 인터페론β는, 조직으로부터의 추출, 단백질 합성, 천연 세포 또는 재조합 세포를 사용한 생물학적 제조 등, 임의의 방법으로 얻어지는 것일 수 있다. 유전자 공학적으로 생산된, 당쇄를 갖는 않는 인터페론β는 시판되고 있으며, 본 발명의 방법에서는, 이와 같은 시판 인터페론β도 사용할 수 있다.

폴리에틸렌글리콜(PEG)은, 인체에 무해하고, 인터페론β에 결합시켜 복합체로서 투여하였을 때, 그 복합체가 혈액에 용해되는 데 필요한 레벨의 수용성을 부여한다. 생리 활성 물질에 PEG를 결합함으로써, 생체 내에서의 그 생리 활성 물질의 물리적 및 열 안정성의 향상, 효소 분해에 대한 보호, 용해도의 증가, 생체내 순환 반감기의 연장, 클리어런스 값의 감소가 달성되는 것은 공지되어 있으며, 본 발명에서도, 이와 같은 효과로부터 PEG를 바람직하게 사용할 수 있다.

인터페론β 중의 리신 잔기의 아미노기에 PEG를 결합시키기 위한 PEG 말단 활성화는 어떠한 방법을 사용하여도 된다. 예를 들면, 말단에 히드록시숙신이미드에스테르 또는 니트로벤젠술포네이트에스테르 구조와 같은, 아미노기 반응성의 구조를 갖는 PEG를 사용할 수 있다. 본 명세서에서는, 이들 말단 구조를 「아미노기 반응성의 관능기」, 이들 말단 구조를 갖는 PEG를 「아미노기 반응성의 관능기에 의해 활성화된 폴리에틸렌글리콜」이라고 기재한다. 이들 구조를 갖는 PEG는, 종래부터 아미노기와의 결합을 위해 널리 사용되고 있고, 주지의 합성 방법에 의해 용이하게 제조할 수도 있고, 또한 시판되고 있다. 본 발명에서는, 이와 같은 시판품도 바람직하게 사용할 수 있다.

PEG의 평균 분자량은, 특별히 한정되지 않지만, 생체 내에서의 인터페론β의 물리적 및 열 안정성, 효소 분해에 대한 보호, 용해도의 증가, 생체내 순환 반감기의 연장, 클리어런스 값의 감소를 도모하는 관점에서, 바람직하게는 약 10,000～60,000, 더욱 바람직하게는 약 20,000～40,000이다.

인터페론β와 PEG의 결합 반응은, pH 5.0～8.5, 바람직하게는 pH 5.5～8.0에서, 또한 인터페론β 활성 저하 억제제의 존재하에, 바람직하게는 인산, 시트르산 등의 완충액 중에서, 인터페론β와 PEG를 반응시킴으로써 행할 수 있다. 또한, 인터페론β 활성 저하 억제제란, 인터페론β를 반응에 적합한 pH 5.0～8.5의 환경에 두는 것에 의한 응집 등을 억제할 뿐만 아니라, 표적인 19번째 또는 134번째의 리신, 나아가 그 근방에의 특이적인 PEG의 결합 반응을 돕는 것이다. 인터페론β의 활성을 유지한 상태에서, 원하는 부위에 PEG를 효율적으로 결합시키기 위한 활성 저하 억제제의 예로서, 당류, 특히, 당 단위의 수가 5 이하인 소당류 및 단당류, 이들의 당 알코올, 및 탄소수 2～6의 다가 알코올 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 글루코스, 만니톨, 솔비톨, 수크로오스 또는 트레할로오스와 같은 이당류나 단당류, 및 이들의 당 알코올, 및 에틸렌글리콜이나 글리세롤과 같은, 탄소수 2 또는 3의 다가 알코올이 바람직하다. 이들 인터페론β 활성 저하 억제제는, 단독으로 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 제공되는 인터페론β 활성 저하 억제제의 농도는, 특별히 한정되지 않지만, 반응 혼합물 전체의 중량에 대하여, 약 1～90%(복수 종류의 인터페론β 활성 저하 억제제를 사용하는 경우에는 합계량, 이하 동일), 더 바람직하게는 약 1～50%, 더욱 바람직하게는 약 10～30% 정도이다. 인터페론β와 PEG의 혼합 비율(인터페론β:PEG)도, 특별히 한정되지 않지만, 통상 약 1:1～1:400 정도의 몰비이고, 숙신이미딜에스테르 활성화 PEG에서는 약 1:4～1:100이 바람직하다. 본 발명의 방법에 적합한 반응 온도는 통상 4～40℃, 바람직하게는 4～25℃이다. 반응 시간은, 반응 온도 등에 따라 적절히 설정되지만, 통상, 약 1시간～24시간 정도가 적당하다.

상기 반응 방법에 의해, 인터페론β의 아미노산 서열의 19번째 또는 134번째의 리신, 또는 이들에 입체적으로 근접한 부위에 특이적으로 폴리에틸렌글리콜을 결합시킬 수 있다. 또한, 「입체적으로 근접한 부위」란, 인터페론β의 활성인 컨포메이션에서의 근접 부위로서, 구체적으로는, 19번째의 리신이라면, 17번째의 시스테인, 80번째의 아스파라긴(특히, 이것에 결합된 당쇄)이다. 또한, 특이적이란, 선택적, 우선적으로 19번째 또는 134번째의 리신, 또는 이들에 입체적으로 근접한 부위에 폴리에틸렌글리콜이 결합시키는 것으로서, 이에 의해 균일한 모노 PEG화 인터페론β가 얻어진다.

또한, 시스테인의 티올기와의 결합 반응에서는 말단에 오르토피리딜디술피드, 비닐술폰, 말레이미드 또는 요오드아세트아미드 구조와 같은 티올기 반응성의 구조를 갖는 수용성 폴리머, 바람직하게는 말레이미드 구조를 갖는 것을 사용한다. 특히 바람직한 분자량인 10,000～60,000의 PEG를 인터페론β의 아미노산 서열의 시스테인 잔기에 결합시키기 위해서는, 인터페론β의 당쇄가 천연형보다 작은 것, 또는 당쇄가 제거되어 있거나 당쇄를 본래 갖지 않는 것이 바람직하다. 이와 같은 인터페론β를 사용함으로써, 1단계의 반응에서, 환원 해열이 없는 결합 반응을 고효율로 진행시킬 수 있다.

결합 반응 후, 예를 들면, 이온 교환, 겔 여과, 소수 또는 친화성 담체를 사용한 크로마토그래피 등의 방법, 또는 이들의 조합에 의해, 미반응의 인터페론β나 PEG, 부산물을 제거하여, 19번째 또는 134번째의 리신에 PEG가 결합된 원하는 인터페론β 복합체를 정제 또는 농축할 수 있다.

가장 효율적으로 19번째 또는 134번째의 리신에 PEG가 결합된 인터페론β 복합체를 정제, 농축하는 방법의 하나는, 이온 교환 담체를 사용한 크로마토그램이다. 사용하는 이온 교환 담체는 바람직하게는 양이온 교환 담체이고, 더욱 바람직하게는 술포프로필기, 술폰산기 또는 카르복시메틸기를 기재에 결합시킨 담체이고, 모두 시판품으로서 입수하여 이용이 가능하다. 예를 들면, HiTrap SP HP(아마샴 파마시아), Poros HS (아프라이드 바이오시스템) 또는 SP-5PW(토소)를 사용한 경우, 염 농도 구배에 의해, 반응액 중에 존재하는 아주 약간의 2분자의 PEG가 결합된 인터페론β 복합체, 다음으로 목적하는 인터페론β의 아미노산 서열의 19번째의 리신에 PEG가 결합된 복합체가 전체의 40% 이상의 비율로 용출되고, 그 후에 마이너 (minor)한 결합 위치의 이성체로서 N말단 아미노기, 또는 33, 46, 108번째의 리신에 PEG가 결합된 복합체나 미반응의 인터페론β가 용출, 분획된다. 이 때, 동시에 134번째의 리신에 PEG가 결합된 인터페론β 복합체를 단리할 수 있다.

양이온 교환 담체에의 결합은, 반응액을 pH 3.0～pH 8.0으로 결합에 적합한 이온 강도로 조정하여 행한다. 이 때, 양이온 교환 담체는 칼럼에 충전되어 있어도, 반응액 중에 현탁시키고 있어도 되지만, 미반응의 친수성 폴리머가 양이온 교환 담체 중에서 응고되어 목적하는 복합체의 분리의 효율을 저하시킬 때에는, 현탁 결합시킨 후에 담체를 칼럼에 충전하여 용출하는 것이 바람직하다. 양이온 교환 담체로부터의 용출은, 시트르산, 아세트산, 인산 등으로 구성되는 완충 용액 중에서 염 농도나 pH의 구배로 또는 구배 없이 단계적 증가시킴으로써 행할 수 있다.

분획 용출한 인터페론β 복합체에서의 PEG의 결합 부위의 해석은, 실시예 3에 나타낸 바와 같이 펩티드 매핑, 얻어진 PEG 결합 단편의 아미노산 분석이나 서열 결정에 의해 행할 수 있다.

이와 같이 하여 제조된 19번째 또는 134번째의 리신에 PEG를 결합시킨 인터페론β 복합체의 항바이러스 활성은, 공지의 방법(예를 들면, Armstrong, J. A., Methods In Enzymology, 78, 381-387(1981) 또는 Rubinstein et al., J. Virol. 37, 755(1981); Borden et. Al., Canc. Res. 42, 4948(1982) 등)에 의해 용이하게 측정할 수 있다. 19번째의 리신에 분자량 40,000의 PEG를 결합시킨 인터페론β는 결합 전의 활성의 10% 이상의 활성을 유지하고 있고, 이는 분자량 20,000의 PEG를 결합시켰을 때와 동등한 활성이다. 또한, 134번째의 리신에 분자량 40,000의 PEG를 결합시킨 인터페론β는 결합 전의 활성의 70～100%의 활성을 유지하고 있다. 종래, 인터페론β의 N말단에 분자량 40,000의 PEG를 결합시킨 복합체의 잔존 활성은 0%인 것이 보고되어 있고(Pepinsky et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol.297, p1059-1066(2001)), 인터페론β에서의 고분자량 PEG의 결합 부위로서 19번째 또는 134번째의 리신을 사용하는 것은 매우 유용함을 알 수 있다.

본 발명의 방법은, PEG 이외의 물질에 관해서도, 인터페론β의 활성 저하를 수반하지 않는 복합체 제조 방법으로서 적용할 수 있다. PEG 이외의 물질은, 히드록시숙신이미드에스테르 또는 니트로벤젠술포네이트에스테르 구조와 같은, 아미노기 반응성의 구조를 갖고 있는 것이 바람직하다. 제2의 분자는 PEG, 혈청 단백질 등의 생체내 안정성을 부여하기 위한 분자에 한하지 않고, 효소, 사이토카인 또는 항체 분자 등 또는 이들의 일부와 같이 전혀 다른 기능을 갖는 생리 활성 물질이어도 된다. 이들의 복합체는, 인터페론β의 활성을 겸비하는 융합 분자나 표식체를 구축할 때에 유효하다.

또한, 본 발명의 방법은, 인터페론β를 각종 지지체, 예를 들면 당, 유리, 수지 소재의 평면 또는 입자로 고상화할 때에도 응용할 수 있다. 즉, 인터페론β와 각종 지지체의 결합점으로서, 19번째 또는 134번째의 리신을 사용함으로써, 활성 저하를 일으키지 않고 인터페론β를 고상화시킬 수 있다. 또한, 이 방법에서는, 마찬가지의 아미노기 반응성의 관능기를 갖는 가교제를 도입하거나, 지지체에 이들을 미리 결합시켜 둘 필요가 있다.

상기한 본 발명의 인터페론β와 PEG의 복합체는, IFN의 생리 활성을 이용한 여러 가지 질환의 치료에 사용할 수 있다. 예를 들면, B형 만성 활동성 간염, C형 만성 간염 및 기타 바이러스성 질환, 교아종, 수아종, 성세포종, 피부 악성 흑색종 등 여러 가지 악성 신생물, 다발성 경화증 등의 자기 면역 질환 등의 치료에 사용할 수 있다. 또한, 혈관신생을 수반하는 질환, 예를 들면, 류머티즘성 관절염, 건선 등의 염증성 질환, 당뇨병 망막증, 미숙아 망막증, 혈관 신생 녹내장, Stevens-Johnson 증후군 및 그 관련 질환, 안류 천포창 및 그 관련 질환, 각막 부식 또는 트라코마 등의 안 질환 및 암(유방암, 전립선암, 악성 흑색종, 신장암, 뇌종양, 카포지 육종 등)의 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 인터페론β 복합체는, 그대로 또는 공지의 약리학상 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합한 의약 조성물로서 경구 또는 비경구로 투여할 수 있지만, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다.

경구 투여를 위한 제형으로서는, 구체적으로는 정제, 환제, 캡슐제, 과립제, 시럽제, 유제, 현탁제 등을 들 수 있다. 이러한 제형은, 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조되고, 제제 분야에서 통상 사용되는 담체 또는 부형제를 함유한다.

예를 들면, 정제용의 담체, 부형제로서는, 락토스, 말토스, 사카로오스, 전분, 스테아르산마그네슘 등을 들 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형으로서는, 예를 들면, 점안제, 연고제, 주사제, 습포제, 좌약, 경비 흡수제, 경폐 흡수제, 경피 흡수제, 국소 서방제 등을 들 수 있다.

용액 제제는, 공지의 방법, 예를 들면, 인터페론β 복합체를 통상, 주사제에 사용되는 무균의 수용액에 용해 또는 현탁시키거나, 또는 유화 또는 리포솜에 포매시킴으로써 조제될 수 있다.

고체 제제는, 공지의 방법, 예를 들면, 인터페론β 복합체에 만니톨, 트레할로오스, 소르비톨, 락토스, 글루코스 등을 부형제로서 첨가하여, 동결 건조물로 만들어 조제될 수 있다. 상기 동결 건조물은, 다시 분체화하거나, 다시 이 분체를 폴리락트산이나 글리콜산 등과 섞어 고체화하여 사용할 수도 있다.

겔화제는, 공지의 방법, 예를 들면, 인터페론β 복합체를 글리세린, 폴리에틸렌글리콜, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히알루론산, 콘드로이틴황산 등의 증점제나 다당에 용해함으로써 조제될 수 있다. 모든 제제에는, 안정화제로서 인간 혈청 알부민, 인간 면역 글로불린, α2 매크로글로불린, 아미노산 등을 첨가할 수 있고, 또한 분산제 또는 흡수 촉진제로서 IFN의 생리 활성을 손상하지 않는 범위에서 알코올, 당 알코올, 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 등을 첨가할 수 있다. 또한, 미량 금속이나 유기산염도 필요에 따라 첨가할 수 있다.

본 발명의 복합체의 투여량은, 환자의 연령, 체중, 투여 대상 질환, 증상, 투여 형태, 투여 경로, PEG의 분자량 등에 따라, 적절히 결정되는데, 일반적으로는 1,000단위～10,000만 단위/회, 바람직하게는 10,000단위～1,800만 단위/회로 1회/월～1회/일, 바람직하게는 1회/월～1회/주의 범위로 투여된다.

도 1은, 19번째의 리신의 아미노기에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인터페론β 복합체의 Poros HS 칼럼에 의한 분리 정제를 나타내는 도면이다. 도면 중, 위의 화살표는 용매 B의 혼합 비율을, 아래의 화살표는 280㎚의 흡광도를 나타낸다.

도 2는, 19번째의 리신의 아미노기에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인터페론β 복합체를 Poros HS 칼럼으로 분리 정제하였을 때의 피크 1～4(도면 중(ⅰ)～(ⅳ))의 성분의 SDS-PAGE에 의한 분리 후, 은 염색에 의해 해석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 3은, 19번째의 리신의 아미노기에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인터페론β 복합체의 SP-5PW 칼럼을 사용한 분리 정제를 나타내는 도면이다.

도 4는, 인터페론β의 아미노산 서열과 리실 엔도펩티다아제 (lysyl endopeptidase)에 의한 절단 예상 부위를 나타내는 도면이다.

도 5는, 분자량 40K의 PEG와의 결합 반응 후에 SP-5PW로 분리한 2～4(도면 중에서는 (ii) 내지 (iv)로 표시하고 있다.)의 용출 성분, 및 PEG 반응 전의 인터페론β(최하단 Pre)의 리실 엔도펩티다아제 처리에 의한 펩티드 맵을 나타내는 도면이다.

도 6은, 분자량 40K의 PEG를 19번째의 리신으로 결합시킨 인터페론β의, 토끼에서의 혈중 체류성을 나타내는 도면이다.

도 7은, 분자량 40K의 PEG를 19번째의 리신으로 결합시킨 인터페론β에 의한 토끼에서의 약리 마커(2-5A 합성 효소의 활성)의 유도를 시간의 경과에 따라 나타낸 도면이다.

도 8은, 134번째의 리신의 아미노기에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인터페론β 복합체를 TOYOPEARL CM 650에 의해 분리하였을 때의 각 피크 분획의 SDS-PAGE (A), 피크 3(도면 중 (ⅲ))의 분획을 SP-5PW (B)에 의해 분석한 결과를 나타낸 도면이다(용출순으로 크로마토 차트를 아래에서 위로 나열하였다).

도 9는, PEG가 비선택적으로 2분자 이상 결합된 인터페론β 복합체와 19번째 또는 134번째의 리신에 선택적으로 PEG가 1분자 결합된 복합체의 활성을 나타낸 도면이다. TOYOPEARL CM 650(S)(토소) 칼럼에 의한 크로마토그램 (B)와, 분취한 분획에 대응하는 SDS-PAGE에 의한 분석 결과 (A), 및 각 분획의 단백량 당 항바이러스 활성값과 PEG 결합 전의 IFN-β의 비(比)활성에 대한 활성 유지율 (C)를 대응시켜 나타냈다.

도 10은, 분자량 20,000(20K)과 40,000(40K)의 PEG를 결합시킨 IFN-β 복합체의 토끼 정맥내 투여 후의 혈중 체류성을 나타낸 도면이다.

본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2003-299850호의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 더 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

재조합형 인터페론β의 아미노기로의 히드록시숙신이미드에스테르 활성화 폴리에틸렌글리콜 결합 반응에서의 첨가제의 영향:

0.5M 염화나트륨, 100mM 아세트산 완충액(pH 5.0)에 보존한 재조합형 인간 인터페론β(최종 농도 200㎍/㎖, Goeddel 등의 방법(Nucleic Acid. Res. Vol.8, 4057-4074(1980))에 따라서 재조합 대장균에 의해 발현 정제를 행하였다.)에 각각, 글루코스, 글리세롤 또는 에틸렌글리콜을 최종 농도가 1, 5, 10, 20%로 되도록 첨가한 후, 비첨가 대조군과 함께 1M 인산수소이나트륨 용액을 사용하여 pH를 7.8로 조절하였다. 히드록시숙신이미드에스테르 활성화 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 40K, Shearwater Polymers, INC사 제품, 닛폰유시로부터 구입)을 인터페론β에 대하여 약 10배몰 혼합하고, 4℃에서 하룻밤 결합 반응을 시켰다. 반응 후, 미반응의 인터페론β를 제거하고, 각각 조제한 반응액의 인터페론β 활성을 측정하였다.

활성의 측정은, 효소 항체(샌드위치 면역 분석)법을 이용하였다(이시카와 에이지 「효소 면역 측정법」(제3판), 180페이지, 의학서원 참조). 구체적으로는, 토끼 항인터페론β 항체를 이뮤노플레이트에 고상화하고, 시료와 동시에 활성을 갖는 인터페론β 구조만을 인식하는 마우스 모노클로날 항체의 효소 표식체를 첨가하였다. 미결합물을 세정 후, 발색 기질을 첨가하여, 표준품의 발색값과의 대비로부터 시료의 인터페론β 활성을 산출하였다(인터페론β 활성은 배양 세포의 항바이러스 활성에 기초한 생물 활성 측정법과 동등한 결과가 얻어지는 것을 확인하였다). 마찬가지로 계면활성제인 Tween80 또는 HCO60을 첨가한 경우에는, 인터페론β의 응집은 억제되지만, PEG의 결합 반응의 진행도 크게 억제되었기 때문에, 결합체의 활성을 측정할 수는 없었다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 글루코스, 글리세롤, 에틸렌글리콜을 적당량 반응 용액에 존재시킨 경우, 대조군(첨가제 비존재하에서의 PEG 결합 반응으로 얻어진 PEG-인터페론β 복합체의 활성)에 비해, 분명한 활성 향상 효과가 인정되었다.

	첨가제 농도(%)	인터페론β활성(10E+7 IU)
	첨가제 농도(%)	반응 용액 당	단백 중량 당
1 2 3 4	글루코스 1 5 10 20	1.79 1.95 2.49 2.62	1.62 2.46 4.96 5.03
5 6 7 8	글리세롤 1 5 10 20	2.28 2.19 2.53 2.51	1.73 1.87 1.81 2.24
9 10 11 12	에틸렌글리콜 1 5 10 20	1.74 2.24 2.77 2.96	1.37 1.68 2.04 2.37
13	없음	1.70	1.09

[실시예 2]

19번째의 리신의 아미노기에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인터페론β 복합체의 분리 정제:

0.5M 염화나트륨, 100mM 아세트산 완충액(pH 5.0)에 보존한 재조합형 인간 인터페론β(최종 농도 200㎍/㎖)에 에틸렌글리콜(최종 농도 20%)을 첨가한 후, 1M 인산수소이나트륨 용액을 사용하여 pH를 7.6으로 조절하였다. 히드록시숙신이미드에스테르 활성화 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 40K, 닛폰유시로부터 구입)을 혼합하고, 4℃에서 하룻밤 결합 반응을 시켰다. 반응액을 10mM NaCl-0.05% Tween20을 포함하는 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)에 대하여 4℃에서 하룻밤 투석을 행하였다. 투석액을 양이온 교환 칼럼인 Poros HS 1.7mL-gel(아프라이드 바이오시스템 제조), 혹은 SP-5PW(토소)에 제공하였다. 용출은 용매 A:10mM NaCl을 포함하는 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5～4.7)에 대한 용매 B:1M NaCl을 포함하는 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5～4.7)의 혼합 비율을 높임으로써 행하였다. 구체적으로는, Poros HS에서는 용매 B의 비율을 30, 40, 50, 100%로 비연속적으로, SP-5PW에서는 0→100%의 연속 구배에 의해 용출을 행하였다. 도 1에 Poros HS 용출의 흡광 크로마토 차트를 나타냈다. 흡광 크로마토 차트 상, 용매 B의 비율을 30, 40, 50, 100%로 단계적으로 상승시켰을 때에 용출된 성분을 각각 피크 1～4(도면 중 (ⅰ)～(ⅳ))라고 명명하였다.

도 2에 각 피크(1～4) 성분을 SDS-PAGE에 의해 분리한 후에 은 염색에 의해 해석한 결과를 나타냈다. 피크 2에서 목적하는 19번째의 리신 잔기에 분자량 40K의 PEG를 결합시킨 인터페론β 복합체를 얻을 수 있었다. 부산물로서 피크 3에서 33번째의 리신 잔기에 PEG가 결합된 인터페론β 복합체, 피크 4에서 N말단 아미노기, 및 108, 134번째의 리신 잔기에 PEG가 결합된 인터페론β 복합체 등, 반응에서는 완전히 제어할 수 없어 존재하는 약간의 PEG 결합 부위의 이성체를 분리하는 것이 가능하였다. 미반응의 인터페론β는 피크 4에서, PEG가 2분자 결합된 인터페론β는 피크 1에서 분리할 수 있었다.

도 3에 SP-5PW로 용출하였을 때의 흡광 크로마토 차트를 나타냈다. SP-5PW에서도, Poros HS를 사용하였을 때와 마찬가지의 분리가 가능하고, 목적하는 19번째의 리신 잔기에 분자량 40K의 PEG를 결합시킨 인터페론β 복합체는 피크 2로서 전체 단백량의 약 65%(미반응의 인터페론β를 제외한 PEG 복합체에서의 비율은 65% 이상이다)를 차지하고 있었다.

[실시예 3]

재조합형 인터페론β의 폴리에틸렌글리콜의 결합 부위의 확인:

실시예 2에서 분리한 SP-5PW의 각 피크 분획을, 고상 추출 카트리지(OASIS HLB, Waters)로 탈염?농축한 후, 원심 증발기로써 건고시켰다. 또한, 6mol/L 구아니딘을 포함하는 트리스 완충액(pH 9)으로 용해한 후, 디티오트레이톨에 의한 Cys의 환원, 요오드아세트아미드에 의한 카르복시아미드메틸화를 행한 후, 리실 엔도펩티다아제를 첨가하여 37℃에서 5시간 방치하여, 구조 특이적 소화를 행하였다. 마지막으로 아세트산으로써 효소 반응을 중지시키고, 전처리를 마친 분석용 시료를 얻었다.

먼저, 이 시료의 역상 HPLC 분석(칼럼:Cadenza CD-C(184.6×150)를 이용하여, 검출 파장:214㎚(UV), 칼럼 온도:40℃, 유속:0.8mL/분, 이동상 A:아세트산/TFA/증류수(1/0.2/1000), 이동상 B:아세트산/TFA/아세토니트릴/증류수(0.9/0.2/800/200), 구배:80분으로 이동상 B를 5%로부터 70%로 하였다. 그 후, 5분으로 이동상 B를 70%로부터 100%로 하였다. 분석 사이클:120분)을 행하였다.

PEG 결합 반응 전의 인터페론β의 리실 엔도펩티다아제 단편에 대응하는 HPLC 크로마토 차트에서의 피크(K1～K12)를 도 4, 도 5-pre에 나타냈다. 도 4의 화살표는, 리실 엔도펩티다아제 절단 부위를 나타낸다. 절단에 의해 생기는 펩티드 단편을 K1～K12라고 명명하였다. 도 5의 K1～K12는, 각각 도 4의 펩티드 단편 K1～K12에 상응한다. 이에 대하여, 피크 2의 펩티드 맵은 도 5-2(도면 중 (ⅱ), 이하 마찬가지임)에 나타낸 바와 같이, 펩티드 K1 및 K2의 현저한 감소가 인정되었다. 이는, 19번째의 리신 측쇄의 아미노기에 PEG가 도입되고, 소화를 피함으로써 펩티드 K1 및 K2가 생성되지 않는 것에 의한 것으로 생각되고, PEG 도입 부위는 19번째의 리신이라고 추정되었다.

피크 3의 펩티드 맵은 도 5-3에 나타낸 결과로, 펩티드 K2의 현저한 소실이 인정되었다. 이는, 33번째의 리신 측쇄의 아미노기에 PEG가 도입되고, 소화를 피함으로써 펩티드 K2가 생성되지 않기 때문이라고 생각되고, PEG 도입 부위는 Lys33이 대부분인 것으로 추정되었다.

피크 4에 관해서는 도 5-4에 나타낸 바와 같이, K1의 감소가 인정되는 점에서 N말단 결합체가 존재하는 것으로 추정되었다. 그 외에, K10 펩티드가 반감하고 있는 점에서, Lys134 또는 Lys123 이성체가 포함될 가능성이 시사되었다.

다음으로, 피크의 역상 HPLC 분석에서 75분 부근의 피크로서 나타나는 PEG 펩티드 결합 단편의 아미노산 서열 분석을 행하였다. 이 결과와 전술한 펩티드 맵의 정보로부터, 반응 주생성물인 피크 2가 목적의 19번째의 리신에 PEG가 결합된 복합체로 확인되었다. 각각 약간의 부산물로서, 피크 3에서 33번째의 리신, 피크 4에서 134, 108번째의 리신 및 N말단에 PEG가 결합된 위치 이성체가 분리되어 있었다.

[실시예 4]

19번째의 리신 잔기에 선택적으로 분자량 40K 및 20K의 PEG를 결합시킨 인터페론β 복합체의 잔존 활성 측정:

19번째의 리신 잔기에 선택적으로 분자량 40K 및 20K의 PEG를 결합시킨 재조합형 인간 인터페론β 복합체를 실시예 2의 방법으로 합성?단리 정제하여, PEG 결합 전의 재조합형 인간 인터페론β와의 활성 비교를 행하였다. 인터페론β 활성의 비교는 항바이러스 활성을 측정함으로써 판정하였다. 구체적으로는, 인간 양막 세포인 FL 세포와 신드비스(sindbis) 바이러스, 또는 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스(VSV)를 조합한 바이오어세이 (bioassay)법을 이용함으로써 판정하였다(Armstrong, J. A., Methods In Enzymology, 78, 381-387(1981)).

그 결과, PEG 결합 전의 재조합형 인간 인터페론β의 활성은 1.22×10⁸MIU/㎎, 40K의 PEG 결합체의 항바이러스 활성은 5.5×10⁷MIU/㎎이고, 잔존 활성은 45%로 높은 값이었다. 마찬가지로 하여 측정한 20K의 PEG 결합체의 잔존 활성은 38.7%였다.

[실시예 5]

19번째의 리신 잔기에 선택적으로 분자량 40K의 PEG를 결합시킨 인터페론β 복합체의 체내 동태, 약효 마커 유도 활성 평가:

19번째의 리신 잔기에 선택적으로 분자량 40K의 PEG를 결합시킨 재조합형 인간 인터페론β 복합체를 실시예 2의 방법으로 합성?단리 정제하여, 토끼(NZW, 수컷)에게 9M/㎏으로 투여하였다. 투여 전 및 투여 15분, 1.5시간, 3.5시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 후에 채혈하여, 혈장의 항바이러스 활성의 측정 및 전혈의 2-5A 합성 효소의 활성을 행하였다. 항바이러스 활성의 측정은 실시예 1에 기재한 방법으로, 2-5A 합성 효소의 활성 측정은 2-5A 키트 '에이켄'(에이켄가가쿠)을 사용하여, 지정된 방법에 따라서 행하였다. 도 6에 항바이러스 활성 측정에 기초한 시간의 경과에 따른 인터페론β의 혈중 잔존 활성, 도 7에 약효 지표로서의 2-5A 합성 효소의 활성의 결과를 그래프로 나타냈다. 분자량 40K의 PEG를 결합시킴으로써, 인터페론β의 혈중 잔존 활성(AUC)이 20.8배 증가하고, 이는 약효 마커의 유도 활성의 상승(PEG 결합에 의해 AUC가 7.6배, 7일 후에도 미수식 인터페론β의 약리 마커 유도 최고값을 상회하고 있었다)으로 이어졌다.

[실시예 6]

134번째의 리신의 아미노기에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인터페론β 복합체의 분리 정제:

실시예 2와 마찬가지로 하여 얻은 재조합형 인간 인터페론β의 PEG 결합 반응 용액에 5배 용량의 10mM 아세트산 완충액(pH4.5)을 첨가하고, 동일 완충액으로 평형화한 양이온 교환 칼럼(TOYOPEARL CM 650(S)(토소))에 제공하였다.

1M의 염화나트륨을 포함하는 동일 완충액이 0 내지 65%로 되도록 연속 구배로 혼합비를 높여 용출되는 단백질을 분획하였다. 용출된 분획을 SDS-PAGE 및 SP-5PW 칼럼(토소)으로 분석하였다. 각각의 결과를 도 8-A 및 B에 나타냈다.

그 결과, 실시예 2와 마찬가지로 3개의 피크가 얻어졌지만, 3번째의 피크(도 8-A의 피크 (ⅲ))에 포함되는 분획을 개별적으로 SP-5PW 칼럼으로 분석하면, 다시 몇 개의 성분으로 단리됨을 알 수 있었다(도 8-B). 이 중에서 구성비가 가장 높고, 마지막으로 용출되는 피크(도 8-B의 화살표)를 포함하는 분획을 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 분석한 결과, 134번째의 리신에 PEG가 결합된 IFN-β 복합체가 단리되어 있었다.

[실시예 7]

PEG 결합 리신이 비선택적인 반응 방법과 선택적인 결합 반응에 의해서 얻어지는 PEG 인터페론β의 활성 비교:

실시예 2와 마찬가지의 방법으로, 0.5M 염화나트륨, 100mM 아세트산 완충액(pH 5.0)에 보존한 재조합형 인간 인터페론β 또는 천연형 인터페론에 에틸렌글리콜을 최종 농도 20%로 되도록 첨가한 후, 1M 인산수소이나트륨 용액을 사용하여 pH 5.5(반응 조건 1) 또는 7.6 전후(반응 조건 2)로 조절하였다. 히드록시숙신이미드에스테르 활성화 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 10K, 20K, 40K Shearwater Polymers, INC사 제품, 닛폰유시 가부시끼가이샤로부터 구입)을 인터페론β 1분자에 대하여 45배로 되도록 혼합하고, 4℃에서 하룻밤 결합 반응을 시켰다.

동시에, 재조합형 인간 인터페론β 또는 천연형 인터페론β 용액에 SDS를 최종 농도가 0.1%로 되도록 첨가한 후, 반응액의 pH를 9.0으로 되도록 조정하였다(반응 조건 3). 이것을 히드록시숙신이미드에스테르 활성화 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 10K, 20K, 40K)을 인터페론β 1분자에 대하여 45배로 되도록 혼합하고, 4℃에서 하룻밤 결합 반응을 시켰다.

각각 반응 후의 용액 중의 인터페론β 활성을 실시예 4와 마찬가지로 항바이러스 활성 측정법으로 평가하고, SDS-PAGE로써 결합 반응의 진행을 확인하였다.

표 2에 나타낸 바와 같이, PEG가 결합되는 리신의 선택성을 확보하지 않은 반응 조건 3에서는 인터페론β의 활성이 PEG 분자량에 관계없이, 10% 이하로 저하되었다. 한편, 19번째 또는 134번째의 리신에의 결합 선택성을 높인 반응 조건 1 및 2에서는, PEG 분자량에 관계없이, 인터페론β의 활성은 최저 10% 이상 유지되어 있음이 확인되었다.

IFN-β종류	천연형(당쇄 결합) INF-β	대장균 재조합형 INF-β
PEG 분자량	40K 20K 10K	40K 20K 10K
반응 조건 1 반응 조건 2 반응 조건 3	100% 86% 94% 54% 29% 15% 1% 2% 1%	94% 54% 61.9% 48% 21% 22% 2.8% 0.7% 1.5%

[실시예 8]

PEG가 비선택적으로 2분자 이상 결합된 인터페론β 복합체와 19번째 또는 134번째의 리신에 선택적으로 PEG가 1분자 결합된 복합체의 활성 비교:

실시예 6과 마찬가지로 PEG 결합 반응후, TOY0PEARL CM 650(S)(토소) 칼럼으로 분리한, PEG가 비선택적으로 2분자 이상 결합된 인터페론β 복합체와 19번째 또는 134번째의 리신에 선택적으로 PEG가 1분자 결합된 복합체를 각각 포함하는 분획의 인터페론β 활성을 항바이러스 활성 측정법(실시예 4 기재)으로 측정하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 PEG가 비선택적으로 2분자 이상 결합된 인터페론β 복합체가 1% 정도의 활성만 유지하고 있음에 비하여, 19번째 또는 134번째의 리신에 선택적으로 40K의 PEG가 1분자 결합된 복합체는 10% 이상의 활성을 유지하고 있었다.

[실시예 9]

분자량 20,000과 40,000의 PEG를 결합시킨 IFN-β 복합체의 혈중 체류성 비교:

분자량 20,000과 40,000의 PEG를 결합시킨 IFN-β 및 PEG가 결합되어 있지 않은 IFN-β를 125I로 표식하고, 토끼의 정맥 내에 투여 후, 6일째까지 시간의 경과에 따라 채혈하고, γ 카운터로 방사 활성을 측정하여 혈중에 잔류하고 있는 각 인터페론β량을 측정하였다. 도 10에 투여시의 방사 활성을 100%로 하였을 때 혈중 잔류량의 시간의 경과에 따른 변화를 표시하였다. 6일째까지의 혈중 잔류량의 적분값은 PEG의 분자량이 40,000일 때에는 PEG가 결합되어 있지 않은 IFN-β의 5.5배로 상승하였다. 또한 PEG의 분자량이 20,000일 때에는 PEG가 결합되어 있지 않은 IFN-β로 1.5배의 상승하여 멈추었다. 이 점으로부터, 분자량이 20,000 이상인 PEG를 활성을 유지한 채로 IFN-β에 결합시키는 것은, IFN-β 복합체의 혈중 체류성에 있어서 중요한 것으로 확인되었다.

본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 도입하는 것으로 한다.

본 발명에 의하면, 인터페론β의 아미노산 서열의 19번째 또는 134번째의 리신에 특이적으로 폴리에틸렌글리콜을 결합시킬 수 있다. 본 발명의 방법으로 얻어지는 인터페론β 복합체는 높은 활성을 유지하면서, 생체 내에서의 충분한 용해성과 물리적?생물학적 안정성, 및 우수한 순환 반감기와 클리어런스 값을 갖는다. 따라서, 본 발명의 인터페론β 복합체는, 부작용이 적고, 효과가 높은 의약품으로서 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries Inc. <120> Interferon beta complex <130> PH-2231-PCT <140> <141> <150> JP2003-299850 <151> 2003-08-25 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Inventor: Narumi, Hideki Inventor: Tsushima, Yoshiaki Inventor: Yamashita, Koji Inventor: Sone, Saburou Inventor: Sato, Miyuki <400> 1 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165

Claims

당 단위의 수가 5 이하인 소당류 및 단당류, 이들의 당 알코올, 및 탄소수 2 내지 6의 다가 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제의 존재하에서, 인터페론β와 폴리에틸렌글리콜을 결합시키는 것을 특징으로 하는 인터페론β 복합체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 첨가제가, 이당류, 단당류 및 이들의 당 알코올, 및 탄소수 2 및 3의 다가 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 첨가제가, 글루코스, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스, 트레할로오스, 에틸렌글리콜 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인터페론β가, 천연형 인터페론β 또는 재조합형 인터페론β, 또는 천연형 인터페론β의 아미노산 서열의 1번째의 메티오닌이 결실되고 17번째의 시스테인이 세린으로 치환된 개변체인 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량이 10,000～60,000인 인터페론β 복합체의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인터페론β의 아미노산 서열의 19번째 또는 134번째의 리신, 또는 개변체의 경우, 그에 대응하는 리신에 특이적으로 폴리에틸렌글리콜을 결합시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, pH 5.0～8.5에서 폴리에틸렌글리콜을 인터페론β와 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, pH 5.0～8.5에서 아미노기 반응성의 관능기에 의해 활성화된 폴리에틸렌글리콜과 인터페론β를 반응시킨 후, 이온 교환 담체에 의한 농축 정제 공정을 거쳐, 인터페론β의 아미노산 서열의 19번째 또는 134번째의 리신에 특이적으로 폴리에틸렌글리콜이 결합되어 있는 인터페론β 복합체를 얻는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제8항에 있어서, 히드록시숙신이미드에스테르 또는 니트로벤젠술포네이트에 스테르 구조를 갖는 화합물에 의해 폴리에틸렌글리콜을 활성화하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
인터페론β의 아미노산 서열의 19번째 또는 134번째 리신, 또는 개변체의 경우, 그에 대응하는 리신에 특이적으로 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인터페론β 복합체.
제10항에 있어서, 상기 인터페론β가, 천연형 인터페론β 또는 재조합형 인터페론β, 또는 천연형 인터페론β의 아미노산 서열의 1번째의 메티오닌이 결실되고 17번째의 시스테인이 세린으로 치환된 개변체인 인터페론β 복합체.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량이 10,000～60,000인 인터페론β 복합체.
바이러스성 질환, 종양 및 암, 및 자기 면역 질환으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 치료하기 위한 제10항 또는 제11항의 인터페론β 복합체를 포함하는 의약 조성물.
바이러스성 질환, 종양 및 암, 및 자기 면역 질환으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 치료하기 위한 제12항의 인터페론β 복합체를 포함하는 의약 조성물.