PT1656952E - Conjugados de polietileno-glicol e interferão beta 1a e as suas utilizações - Google Patents

Conjugados de polietileno-glicol e interferão beta 1a e as suas utilizações Download PDF

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Margot Brickelmaier
Adrian Whitty
Paula Hochman
Laura Runkel
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Description

DESCRIÇÃO
CONJUGADOS DE POLIETILENO-GLICOL DO INTERFERÃO BETA
IA E AS SUAS UTILIZAÇÕES
ANTECEDENTES DA INVNEÇÃO A utilização de polipéptidos e de proteínas para o tratamento sistémico de doenças específicas, é hoje bem aceite na prática médica. 0 papel que estas substâncias desempenham na terapia é tão importante que muitas actividades de investigação têm sido dirigidas para a síntese de grandes quantidades, por meio da tecnologia do ADN recombinante. Muitos destes polipéptidos são moléculas endógenas que são muito potentes e específicas no desencadear das suas acções biológicas.
Um factor principal que limita a utilidade destas substâncias proteináceas na sua aplicação nos casos pretendidos é que, quando dadas parentericamente, são eliminadas do corpo num curto espaço de tempo. Isto pode ocorrer como resultado do metabolismo por meio das proteases ou por eliminação, utilizando as vias normais da eliminação das proteínas, tais como, por meio da filtração nos rins. A via oral de administração destas substâncias é ainda mais problemática porque, para além da proteólise no estômago, a elevada acidez do estômago destrói-as antes delas atingirem o tecido alvo que se pretende atingir. Os problemas associados com estas vias de administração das proteínas são bem conhecidos na indústria farmacêutica e têm-se utilizado várias estratégias nas tentativas de resolução destes problemas. 1 Já foram publicados muitos trabalhos que tratam da estabilização das proteínas. São conhecidos vários caminhos de conjugação das proteínas com materiais poliméricos, incluindo a utilização de dextranos, polivinil-pirrolidonas, glicopéptidos, polietileno-glicol e poli-aminoácidos. Os polipéptidos conjugados resultantes, têm sido referidos pelo facto de reterem as suas actividades biológicas e a solubilidade na água, em aplicações parentéricas.
Uma família de péptidos que tem sido o foco da maior parte do trabalho clínico e em que se têm feitos esforços para melhorar a sua administração e bio-assimilação é a família dos interferões. Os interferões têm sido ensaiados numa grande variedade de estados de doenças clínicas. A utilização do interferão beta humano, um dos membros desta família, está bem estabelecida no tratamento da esclerose múltipla. Recentemente foram licenciadas, na Europa e nos Estados Unidos da América, duas formas de interferão-beta recombinante, para o tratamento desta doença. Uma das formas é o interferão beta la (marca registada, vendido sob o nome de AVONEX®, fabricado pela Biogen, Inc., Cambridge, MA) e aqui referido a seguir como "interferão beta la" ou "IFN-beta-la" ou "ΙΕΝ-β-la" ou "interferão β la", que se podem utilizar de forma intermutável. A outra forma é o interferão beta 1b (marca registada e vendido sob o nome de BETASERON®. Berlex, Richmond, CA) , aqui referido a seguir como, "interferão beta lb" . 0 interferão beta la é produzido em células de mamíferos, utilizando a sequência dos genes humanos naturais e é glicosilado, enquanto o interferão beta lb é produzido nas bactérias E. coli, utilizando uma sequência modificada de gene humano, que contém uma substituição de cisteína em serina feita por engenharia genética nos aminoácidos da posição 17 e que não está 2 glicosilada.
Anteriormente, alguns autores compararam directamente as potências relativas, in vitro, do interferão beta la e do interferão beta 1b, em ensaios funcionais e demonstrou-se que a actividade específica do interferão beta la, é aproximadamente 10 vezes maior do que a actividade específica do interferão beta 1b (Runkel et al. , 1998, Pharm. Res. 15: 641-649). A partir de estudos feitos para identificar a base da estrutura destas diferenças de actividade, os requerentes identificaram a glicosilação como a única das diferenças estruturais conhecidas entre os produtos que afectam a actividade específica. 0 efeito dos hidratos de carbono foi largamente manifestado através do seu papel estabilizador na estrutura. 0 efeito de estabilização dos hidratos de carbono foi evidente nas experiências de desnaturação térmica e na análise por SEC. A falta de glicosilação foi também correlacionada com um aumento da agregação e uma sensibilidade acrescida para a desnaturação térmica. A eliminação enzimática dos hidratos de carbono do interferão beta la com PNGase F causou uma precipitação extensa do produto desglicosilado.
Estes estudos indicam que, apesar da conservação na sequência, entre o interferão beta la e o interferão beta 1b, são entidades bioquímicas distintas e, por isso, muito daquilo que é conhecido, acerca do interferão beta 1b, não pode ser aplicado ao interferão beta la e vice versa. A patente WO 87/00056 descreve conjugados entre um homopolímero de polietileno-glicol ou um poliol poli-oxietilado e um interferão beta (cf. resumo; página 13, linhas 15-35) . Neste documento não se prevê a combinação 3 específica de um interferão beta la, o seu acoplamento com o polímero mencionado antes, no terminal N e via uma ligação que se pode obter por uma alquilação redutora,
Katre N. V. (Advanced Drug Delivery Reviews, 10 (1993), 91-114) descreve o acoplamento selectivo dos radicais de polialquileno-glicol no terminal N das diferentes dos interferões.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os requerentes exploraram as vantagens do interferão-beta glicosilado relativamente às formas não glicosiladas. Em particular, os requerentes desenvolveram uma composição de interferão beta la com uma maior actividade relativamente ao interferão beta lb e que também tem propriedades salutares das proteínas ligadas a polietileno-glicol, em geral, sem nenhuma perda efectiva da actividade, quando comparadas com as formas do interferão beta la, que não estão conjugadas. Assim, se se fazem modificações, de tal maneira que os produtos (conjugados de polímero-interferão beta la) retêm todas ou a maior parte das suas actividades biológicas, podem resultar nas seguintes propriedades: farmacocinética e farmacodinâmica alteradas conduzindo a um semi-período de vida aumentado e a alterações na distribuição do tecido (por exemplo, capacidade de permanecer na vasculatura durante períodos de tempo mais longos), estabilidade em solução aumentada, imunogenicidade reduzida, protecção da digestão proteolítica e subsequente abolição de actividade. Uma tal formulação constitui um avanço substancial nas técnicas farmacêuticas e médicas e contribuirá significativamente para o tratamento de várias doenças em que o interferão tem alguma utilidade, tal como, esclerose múltipla, fibrose e outras 4 doenças inflamatórias ou auto-imunes, cancros, hepatite e outras doenças virais. Em particular, a capacidade de retenção na vasculatura, durante períodos de tempo mais longos, permite que o interferão beta la seja utilizado para inibir a angiogénese e para potencialmente atravessar a barreira de sangue-cérebro. Além disso, a estabilidade térmica que se ganha pela criação de conjugados de polímero-interferão beta la é uma vantagem quando se fazem formulações de interferão beta la sob a forma de um pó, para serem utilizadas em administrações subsequentes, por via de inalação.
Os requerentes utilizaram o seu conhecimento da estrutura cristalográfica do interferão beta la e desenvolveram um conjugado de interferão beta la-polímero, em que o polímero está ligado aos sítios do interferão beta la, o que permitirá que o conjugado retenha toda a actividade do interferão beta la, quando comparado com o interferão beta la que não está conjugado.
Um dos aspectos da presente invenção, é um complexo de interferão beta la conjugado, em que o interferão beta la está ligado covalentemente a um polímero, que incorpora como uma das suas partes integrais, um polialquileno-glicol.
Num aspecto particular, a presente invenção tem por objecto uma composição de interferão beta la activa sob o ponto de vista fisiológico, que compreende o interferão beta la activo sob o ponto de vista fisiológico, acoplado com um polímero que compreende uma parte de polialquileno-glicol, em que o interferão beta la e a parte de polialquileno-glicol, estão arranjadas de modo que o interferão beta la activo sob o ponto de vista fisiológico, na composição, tem um semi- 5 período de vida aumentado relativamente ao interferão beta la isolado (isto é, numa forma não conjugada desprovida do polímero acoplado).
Um outro aspecto da presente invenção, tem por objecto uma composição do interferão beta la que compreende o interferão beta la, activo sob o ponto de vista fisiológico, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida no quadro 1, acoplado com um polímero, em que o interferão beta la é uma proteína de fusão, preferencialmente uma fusão de imunoglobulina. Nesse complexo, a extrema proximidade da terminação N (sítio de conjugação com o polímero) e da terminação C (sítio de fusão com a parte Ig) sugere que a conjugação do polímero pode reduzir a imunogenicidade da proteína de fusão.
Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma composição de interferão beta la activa sob o ponto de vista fisiológico, compreendendo um interferão beta la activo sob o ponto de vista fisiológico, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida no quadro 1, acoplado com um polímero que compreende uma parte de polialquileno-glicol, em que o interferão beta la e a parte de polialquileno-glicol, estão arranjadas de tal maneira que o interferão beta la activo sob o ponto de vista fisiológico, na composição, tem uma actividade acrescida relativamente ao interferão beta 1b isolado (isto é, uma forma não conjugada, desprovida do polímero acoplado).
Outro enquadramento da presente invenção, é uma proteína do interferão beta la conjugado cuja parte de interferão beta la tenha sido mutada para providenciar mutaínas que aumentam selectivamente a actividade antiviral e/ou anti- 6 proliferativa, relativamente às formas não mutadas do interferão beta la. A presente invenção tem ainda por objecto um outro aspecto que consiste num complexo de interferão beta la conjugado, solúvel em água e estável, que compreende um interferão beta la activo sob o ponto de vista fisiológico, que compreende a sequência de aminoãcidos estabelecida no quadro 1, ligado covalentemente a uma parte de polietileno-glicol compatível sob o ponto de vista fisiológico. Nesse complexo, o interferão beta la pode estar acoplado covalentemente com a parte polietileno-glicol compatível sob o ponto de vista fisiológico, por meio de uma ligação covalente lábil, no grupo de aminoãcido livre do interferão beta la, em que a ligação covalente lãbil é severizada, in vivo, perla hidrólise bioquímica e/ou proteólise.
Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma forma de dosagem, que compreende um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e um complexo de interferão beta la, solúvel em água, estável, tal como se definiu antes, que compreende o interferão-beta acoplado com um polietileno-glicol, compatível sob o ponto de vista fisiológico.
Num outro aspecto, as composições de interferão beta la acopladas covalente, tais como, as descritas antes, podem utilizar interferão beta la destinado ao diagnóstico ou a aplicações in vitro, em que o interferão beta la é, por exemplo, um reagente de diagnóstico para imuno-ensaios ou outros diagnósticos ou aplicações que não sejam in vivo. Nessas aplicações não terapêuticas, os complexos da presente invenção são altamente úteis quando utilizados como composições estabilizadas, que podem, por exemplo, ser 7 formuladas no seio de dissolventes compatíveis ou outras formulações à base de soluções, para providenciar formar de composição estáveis, que têm uma maior resistência à degradação.
Modificações do interferão beta la com um polímero não tóxico podem oferecer algumas vantagens. Se as modificações são feitas de tal maneira que os produtos (conjugados de polímero-interferão beta la) retêm todas ou a maior parte das actividades biológicas, podem resultar nas seguintes propriedades: farmacocinética alterada e farmacodinâmica conduzindo a um semi-período de vida aumentado e alterações na distribuição do tecido (por exemplo, capacidade de permanecer na vasculatura durante períodos de tempo mais longos), estabilidade aumentada em solução, imunogenicidade reduzida, protecção da digestão proteolítica do interferão beta la modificado e subsequente abolição de actividade; estabilidade térmica aumentada, conduzindo a uma formulação mais eficaz de interferão beta la em pó para utilização oral ou inalada. 0 interferão beta la provido com propriedades aumentadas descritas antes pode ser eficaz em terapia no seguimento de administração quer oral, quer por meio de aerossóis ou parentérica. Outras vias de administração, tal como a nasal e a transdérmica, podem também ser possíveis utilizando o interferão beta la modificado.
Um outro aspecto da presente invenção consiste num medicamento que contém os conjugados reivindicados para serem utilizados num processo de inibição da angiogénese e da neovascularização. Como resultado do aumento do nível e da duração do interferão na vasculatura, o produto ligado a 8 deve ser polietileno-glicol, de presente invenção, particularmente eficaz como inibidor de angiogénese.
Em aplicações não terapêuticas (por exemplo, de diagnóstico), a conjugação das espécies de reagentes e/ou de diagnóstico de interferão-beta é também contemplada. 0 agente conjugado resultante é resistente a factores de degradação ambientais, incluindo os processos de degradação mediados por dissolventes ou soluções. Como um resultado dessa resistência aumentada e estabilidade aumentada do interferão beta la, a estabilidade do ingrediente activo é capaz de estar significativamente aumentada, com concomitante fiabilidade da composição contendo o interferão beta la na utilização final específica para a qual foi utilizado.
Com base na presente memória descritiva, a presente invenção tem por objecto uma composição que compreende um interferão beta 1 a ou uma proteína de fusão que contém o interferão beta la, em que o interferão beta 1 a consiste na sequência de amínoãcídos:
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAAL
TIYEMLQNIF AIFRQDSSSTGWKETIVENLLAKEVYHQINHLKTVLSEKLSKSDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLK ΆΚΕYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN e em que o interferão beta la ocorrência não natural, numa referido interferão beta la, entre o interferão beta la obter utilizando um processo está acoplado a um polímero de extremidade na terminação N do em que o referido acoplamento e o referido polímero se pode de alquilação redutora e em que o referido polímero contém uma parte de polialquileno-glicol, 9
Num aspecto relacionado, a presente invenção tem por objecto uma composição que contêm um mutante de interferáo beta la ou interferao consiste na uma proteína de fusão que contém o mutante do beta la. em que o mutante do interferão beta la sequência de arainoãeidos: (i) MAYAALGALQASSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPFFIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN,
(i i) MSYNLLGFLQRSSNAACAALLAALNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ
LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN,
(iii) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRAAACAADRMNFDIPEEIKQ
LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK
TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (iv) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRAAFAIPAEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFRGALMSSLHLKRYYGRELHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRN FYRINRLTGYLRN, (v) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIAA AAAFAAADAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN,
(vi) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLANIASIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK 10 TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (vii) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LGQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFAAASSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVL E E KL E KE D FIRGALMS S LHLKRYYGRILHYLΚΑΚΕYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN,
(vii i) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNASIVAALLSNVYHQINILK TVL E E KL E KE D FIRGALMS S LHLKRYYGRILHYLΚΑΚΕYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (ix) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LGQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVAHQIAHLA AVLEEKLEKEDFRTGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN,
(x) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNWAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKT VLAAKLAAADFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRN FYRINRLTGYLRN, (xi) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVL E E KL E KEAATAGAAMSALH L KRYYGRILHYLΚΑΚΕYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (xii) MSYNLLGFLQR5SNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVL E E KL E KE D FTRGALMS S LH L KRYYGAIAAYLAAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, 11 (xiii) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAAAYSHCAWTIVRVEILR NFYRTNRLTGYLRN,
(xiv) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRLHYLKAKEYAACAWTIVRVETGYL RN, (xv) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRAEILA NFARIARLTGYLRN, em que o mutante do interferão beta, la está acoplado a um único polímero de ocorrência não natural, na terminação N do referido mutante do interferão beta la, em que o referido acoplamento entre o mutante do interferão beta la ε o referido polímero se pode obter utilizando um processo de alquilação redutora e em que o referido polímero contém uma parte de polialquileno-glicol. Num outro aspecto, a presente invenção tem per objecto um processoxn vitro de prolongamento da actívidade do interferão beta la num sistema in vitro, compreendendo o acoplamento do referido interferão beta la, na extremidade de terminal N, com um radical de polímero único de ocorrência não natural, utilizando um processo de alquilação redutora, produz uma composição de um oolímero acoplado a um interferão beta la e a introdução da composição de um polímero acoplado a um interferão beta la nc sistema in vitro, em que o referido radical de polímero de ocorrência não natural contém u.m radical de polialquileno-glicol. 12 A presente invenção e as suas várias modalidades estão estabelecidas nas reivindicações em anexo.
Outros aspectos, características e modificações da presente invenção, tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição e das reivindicações em anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Ligação dos mutantes de interferão beta la substituídos em alanina a uma proteína de fusão dimérica, compreendendo o domínio extracelular da cadeia do receptor do interferão do tipo I, IFNAR2/Ig (ecto-domínio de IFNAR2 fundido com o domínio constante da IgGl humana).
As afinidades de ligação dos mutantes de IFN substituídos de alanina (Al-E) para a cadeia do receptor IFNAR2, foram determinadas tal como se descreveu no exemplo 1 (subsecção D) . 0 histograma apresenta as suas afinidades de ligação neste ensaio relativamente ao his-IFN-beta de tipo natural (% em peso) . Os valores da % em peso foram calculados como (afinidade de his-IFN-beta de tipo natural)/a afinidade do mutante de IFN-beta x 100. A % em peso (0) para as experiências individuais (n = 3) e uma média da percentagem em peso (x) para a experiência estão indicadas. Os mutantes A2, ABI, AB2, e E não se ligaram a IFNAR2/FC em concentrações 500 vezes mais elevadas do que o peso de his-IFN-beta CE 50 (*).
Figura 2. Ligação dos mutantes de interferão beta la substituídos em alanina com os complexos do receptor da superfície das células do interferão do tipo I ("complexo IFNAR1/2"), expresso nas células de linfoma de Daudi 13
Burestojot.
As propriedades de ligação do receptor dos mutantes de substituição de alanina (Al-E) foram determinadas utilizando uma FACS, um ensaio de ligação do receptor da superfície das células, tal como descrito no exemplo 1 (sub-secção D). 0 histograma apresenta as suas afinidades de ligação do receptor neste ensaio relativamente a his-IFN-beta do tipo natural (% em peso) . A % em peso para cada mutante foi calculada como {afinidade de his-IFN-beta do tipo natural)/a afinidade dos mutantes de IFN-beta x 100. Os valores da % em peso (0) para as experiências individuais e uma média dos valores da % em peso para o conjunto da experiência (x), estão indicados.
Figura 3. Actividades antivirais dos mutantes de interferão beta la substituídos em alanina.
As actividades antivirais dos mutantes de substituição de alanina (Al-E) foram determinadas em células A549 humanas, infectadas com o vírus EMC, tal descrito no exemplo 1 (sub-secção E). 0 histograma apresenta as suas actividades neste ensaio relativamente ao his-IFN-beta de tipo natural (% em peso) . Calculou-se a % em peso como (concentração de his-IFN-beta em peso [50 % de cpe]/concentração do mutante de IFN-beta [50 % de cpe] x 100. A % em peso (0) para os múltiplos ensaios e a média do conjunto dos dados das experiências (x) estão indicadas.
Figura 4. Actividades anti-proliferativas relativas dos mutantes de interferão beta la substituídos de alanina. A actividade anti-proliferação dos mutantes de substituição de alanina (Al-E) foi determinada em células de linfoma de Daudi Birestojot, tal como descrito no 14 exemplo 1 (sub-secção E). 0 histograma apresenta as suas actividades neste ensaio relativamente a his-IFN-beta de tipo natural (% em peso) . A % em peso foi calculada como (concentração em peso de his-IFN-beta [inibição de crescimento de 50 %]/concentração do mutante de IFN-beta [inibição de crescimento de 50 %] x 100. A % em peso (0) para os ensaios múltiplos no conjunto dos dados experimentais (x), estão indicados.
Figura 5. Actividades antivirais e anti-proliferativas relativas dos mutantes de interferão beta la substituídos de alanina.
As actividades relativas dos mutantes de substituição de alanina (Al-E), nos ensaios antivirais (eixo de x) e anti-proliferação (eixo do y) , foram comparados. A percentagem média de his-IFN-beta de tipo natural (% em peso, x) apresentada nas figuras 3 e 4 foram utilizadas para esta comparação. Estes mutantes que exibem uma alteração coordenada em ambas as actividades vão cair na linha vertical. Os mutantes que exibem uma alteração na actividade antiviral, que é desproporcionada em relação à alteração na actividade de anti-proliferação, caem significativamente fora da linha diagonal (DEI, D, Cl) . Determinou-se as significâncias a partir da consideração dos desvios padrão inerentes aos valores médios das percentagens em peso utilizadas.
Figura 6. Localização do sítio de tratamento de polietileno-glicol pelo mapeamento do péptido. 0 interferão β la tratado com polietileno-glicol e não modificado foi suj eito a uma análise de mapeamento do péptido. As amostras foram digeridas com endoprotainase Lis-C e submetidas a uma CLAR de fase inversa numa coluna 15 C4. Tratou-se a coluna com um gradiente de 0 - 70 % de acetonitrilo no seio de ácido trifluoracético a 0,1 %. Controlou-se o efluente da coluna a 214 nm. No painel a, temos o interferão-β-la não modificado. No painel b o interferão-β-la tratado com polietileno-glicol. Os topos das setas marcam a posição da eluição do péptido Lis da endoproteinase de terminação N do interferão-β-la contendo os resíduos de aminoácidos 1-19.
Figura 7. Actividade antiviral do interferão beta la conj ugado e não conj ugado. A actividade do interferão beta la ou do interferão beta la tratado com polietileno-glicol na concentração indicada no eixo do x, foi avaliada em ensaios antivirais utilizando células (A549) de carcinoma do pulmão humano, infectadas com vírus de encefalomiocardite. Passados dois dias de incubação com o vírus, as células viáveis foram coradas com MTT, leram-se as placas a 450 nm e a absorvência, que é um reflexo da viabilidade das células, está indicado no eixo do y. Os desvios padrão estão indicados como barras de erro. A concentração do interferão beta la ou do interferão beta la tratados com polietileno-glicol, que ofereceu 50 % de morte virai (o "efeito citopático a 50 %") (DO450 máximo a 50 %), foi de 11 pg/mL e o efeito citopático a 50 % para o interferão beta la tratado com polietileno-glicol, foi de cerca de 11 pg/mL.
Figura 8. Avaliação da estabilização dos conjugados utilizando desnaturação térmica. O interferão beta la ligado a polietileno-glicol e o interferão beta la não tratado, de controlo, em HEPES 20 mM, a pH 7,5, NaCl 20 mM, foram aquecidos a 16 velocidades fixas de 1 grau/minuto. A desnaturação foi seguida pela monitorização das alterações de absorvência a 280 nM. (a) interferão beta la não modificado, (b) interferão beta la ligado a polietileno-glicol.
Figura 9. Medições da actividade antiviral no interferão-beta no plasma de ratos tratados com interferão beta la ou interferão beta la tratado com polietileno-glicol.
Inj ectaram -se ratos, iv, com 50 000 unidades de interferão beta la, quer com 50 000 unidades de interferão beta la tratado com polietileno-glicol (contendo 20 K de PEG) . Obteve-se o sangue destes ratos por via de hemorragias retro-orbitais em vários momentos após a injecção do interferão, tal como indicado no eixo do x. Há pelo menos 3 ratos sangrados no mesmo momento e preparou-se o plasma e congelou-se até se avaliar a actividade do interferão-beta em ensaios antivirais utilizando células (A549) do carcinoma do pulmão humano, infectadas com o vírus de encefalomiocardite. Coraram-se as células viáveis com uma solução de MTT, leram-se as placas a 450 nm, para determinar a absorvência que é um reflexo da viabilidade das células e a actividade do interferão-beta. Geraram-se curvas padrão para cada placa utilizando o interferão beta la e utilizaram-se para determinar a quantidade de actividade de interferão-beta em cada amostra. Indicam-se os dados dos animais individualmente.
Figura 10. Sequência completa do ADN do gene do interferão-beta marcado com histidina e do seu produto de proteína.
Indicam-se a sequência completa de ADN (SEQ ID N°. 1) e a da proteína (SEQ ID N° . 2) do IFN beta la marcado com 17 histidina. A sequência de sinal VCAM-1 clivada deixa 3 resíduos de aminoácidos (SerGliGli) a montante do marcador de histidina (Hise, posições 4-9) . A sequência ligante de enterocinase (AspAspAspAspLis) está separada do marcador de histidina por um espaçador (posições 10-12, SerSerGli). A sequência natural da proteína de IFN-beta-la encontra-se nas posições (Metl8-Asnl83).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
Tal como se utiliza aqui, a expressão "acoplado covalentemente", significa que as partes especificadas estão ligadas covalentemente quer directamente uma à outra, ou ainda estão ligadas covalentemente indirectamente uma à outra através de uma parte ou de partes intervenientes, tais como, uma ponte, um espaçador ou uma parte ou partes de ligação.
Interferão - um "interferão" (também referido como "IFN") é um polipéptido de cadeia simples pequeno, específico de uma espécie, produzidos por células de mamíferos em resposta à exposição a uma variedade de indutores, tais como, vírus, polipéptidos, agentes mitogénicos e similares. 0 interferão mais preferido, utilizado na presente invenção, é o interferão-beta humano, glicosilado, que está glicosilado no resíduo 80 (Asn 80) e que deriva, preferencialmente, por meio de tecnologias recombinantes do ADN. Este interferão-beta glicosilado preferido é designado por "interferão beta la" ou "IFN-beta-la" ou "IFN-β-la" ou "interferão beta la" ou "interferão-β-la" todos utilizados intermutavelmente. 0 termo "interferão beta la", também é suposto englobar os seus mutantes (por exemplo, exemplo 1) , desde que esses mutantes 18 estejam glicosilados no resíduo 80 (Asn 80). Os processos de ADN recombinante para a produção de proteínas, incluindo os interferões são conhecidos. Ver, por exemplo, as patentes de invenção norte-americanas U.S. 4 399 216, 5 149 636, 5 179 017 (Axel et al.) e 4 470 461 (Kaufman).
Os polinucleótidos de interferão beta la preferidos, que podem ser utilizados nos processos da presente invenção, derivam das sequências dos genes de interferão-beta do tipo natural de vários vertebrados, preferencialmente, mamíferos e obtêm-se utilizando processos que são bem conhecidos pelos especialistas na matéria, tal como, os processos descritos nas seguintes patentes de invenção norte-americanas: patente de invenção norte-americana U.S. 5 641 656 (publicada em 24 de Junho de 1997, pró-proteína de interferão de tipo I de aves, que codificam o ADN e interferão do tipo I de aves maduras); patente de invenção norte-americana 5 605 688 (25 de Fevereiro de 1997, interferões recombinantes do tipo I de cães e cavalos); patente de invenção norte-americana U.S. 5 231 176 (27 de Julho de 1993, molécula de ADN que codifica um interferão de leucócito humano); patente de invenção norte-americana U.S. 5 071 761 (10 de Dezembro de 1991, sequência de ADN que codifica para subsequências de interferões LilFN-alfa-2 e LilFN-alfa-3 de linfoblastóides humanos); patente de invenção norte-americana U.S. 4 970 161 (13 de Novembro de 1990, sequência de ADN que codifica para o interferão gama humano); patente de invenção norte-americana U.S. 4 738 931 (19 de Abril de 1988, ADN contendo um gene de interferão-beta humano); patente de invenção norte-americana U.S. 4 695 543 (22 de Setembro de 1987, gene Gx-1 do interferão alfa humano); e patente de invenção norte-americana U.S. 4 456 748 (26 de Junho de 1984, ADN codificando subsequências de interferões de leucócitos 19 diferentes, de ocorrência natural).
Os mutantes do interferão beta la podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. As mutações são desenvolvidas utilizando processos convencionais de mutagénese dirigida, conhecidos pelos especialistas na matéria. Além disso, a presente invenção tem por objecto polinucleótidos de interferão beta la equivalentes sob o ponto de vista funcional, que codificam para os polipéptidos de interferão beta la, equivalentes sob o ponto de vista funcional.
Um primeiro polinucleótido que codifica o interferão beta la é "funcionalmente equivalente" comparado com um segundo polinucleótido que codifica um interferão beta la se satisfaz pelo menos uma das seguintes condições: (a) o "equivalente funcional", é um primeiro polinucleótido que hibridiza com o segundo polinucleótido em condições de hibridização padrão e/ou degenera com a primeira sequência de polinucleótido. Mais preferencialmente codifica um interferão mutante com a actividade de um interferão beta la; (b) o "equivalente funcional", é um primeiro polinucleótido que codifica na expressão para uma sequência de aminoácido codificada pelo segundo polinucleótido.
Em resumo, o termo "interferão" inclui os agentes listados antes, assim como, os seus equivalentes funcionais. Tal como se utiliza aqui, a expressão "equivalente funcional" refere-se por isso a uma ou um polinucleótido de interferão beta la codificando a proteína do interferão beta la, que tem 20 o mesmo efeito benéfico ou um efeito benéfico aumentado no receptor mamífero, que o interferão que é considerado um equivalente funcional. Tal como será entendido por um especialista na matéria, uma proteína equivalente sob o ponto de vista funcional pode ser produzida por técnicas recombinantes, por exemplo, expressando um "ADN equivalente sob o ponto de vista funcional". De acordo com isto, a presente invenção engloba as proteínas de interferão beta la codificadas pelos ADN de ocorrência natural, assim como, pelos ADN de ocorrência não natural, que codificam a mesma proteína que a codificada pelo ADN de ocorrência natural. Devido à degenerescência das sequências de codificação do nucleótido, podem utilizar-se outros polinucleótidos para codificar o interferão beta la. Estes incluem todas ou porções das sequências anteriores, que são alteradas pela substituição dos diferentes codões que codificam o mesmo resíduo de aminoácido dentro da sequência, produzindo assim uma alteração silenciosa. Essas sequências alteradas são olhadas como equivalentes destas sequências. Por exemplo, Fen (F) é codificada por dois codões, TTC ou TTT, Tir (Y) é codificada por TAC ou TAT e His (H) é codificada por CAC ou CAT. Por outro lado, Trp (W) é codificada por um único codão, TGG. De acordo com isto, será evidente que para uma dada sequência de ADN que codifica um interferão particular, haverá muitas sequências de ADN degeneradas que codificaram para ele. Estas sequências de ADN degeneradas estão consideradas dentro do âmbito da presente invenção. "Fusão" - refere-se a uma ligação co-linear de duas ou mais proteínas ou dos seus fragmentos, por via das suas estruturas peptídicas individuais, através da expressão genética de uma molécula de polinucleótido, que codifica essas proteínas. É preferível que as proteínas ou os seus 21 fragmentos sejam de fontes diferentes. Assim, as proteínas de fusão preferidas incluem uma proteína do interferão beta la ou um seu fragmento ligado covalentemente a uma segunda parte que não é um interferão. Especificamente, uma fusão de "interferão beta la/Ig", é uma proteína que compreende uma molécula de interferão beta la da presente invenção ou um seu fragmento, ligada a uma terminação N de uma cadeia de imunoglobulina, em que uma porção da terminação N da imunoglobulina está substituída pelo interferão beta la. "Recombinante", tal como se utiliza aqui, significa que a proteína deriva de sistemas de expressão recombinante de mamíferos. A proteína expressa na maior parte das culturas bacterianas, por exemplo, E. coli, estará isenta de glicano, por isso, esses sistemas de expressão não são preferidos. A proteína expressa em levedura pode ter estruturas de oligossacáridos, que são diferentes das expressas em células de mamíferos. "Activo sob o ponto de vista biológico", tal como se utiliza ao longo desta descrição, como uma característica do interferão beta la, significa que uma molécula particular partilha uma homologia da sequência de aminoácidos suficiente com os enquadramentos da presente invenção aqui descritos de modo de ser capaz de ter actividade antiviral, tal como se mediu em ensaios antivirais in vitro do tipo do que está indicado no exemplo 1 (ver a seguir).
Uma "composição terapêutica", tal como se utiliza aqui, define-se como compreendendo as proteínas da presente invenção e outros ingredientes compatíveis sob o ponto de vista fisiológico. A composição terapêutica pode conter excipientes, tais como, água, minerais e veículos, tais como, 22 proteínas .
Uma "quantidade eficaz" de um agente da presente invenção é a quantidade que produz o resultado ou exerce uma influência numa condição particular a ser tratada. "Aminoácido" - unidade monomérica de um péptido, de um polipéptido ou de uma proteína. Há vinte aminoácidos que se encontram naturalmente nos péptidos, polipéptidos e proteínas, sendo todos eles isõmeros L. 0 termo também inclui análogos dos aminoácidos e isómeros D dos aminoácidos da proteína e os seus análogos.
Um aminoácido "derivado" é um aminoácido natural ou não natural, em que a cadeia lateral ou o grupo terminal que ocorrem normalmente estão modificados por uma reacção química. Essas modificações incluem, por exemplo, gama-carboxilação, beta-carboxilação, sulfação, sulfonação, fosforilação, amidização, esterificação, N-acetilação, carbobenzilação, tosilação e outras modificações conhecidas na técnica. Um "polipéptido derivado" é um polipéptido que contém um ou mais aminoácidos derivados. "Proteína" - qualquer polímero que consiste essencialmente em qualquer um dos 20 aminoácidos. Embora "polipéptido", seja muitas vezes utilizado em referência a polipéptidos relativamente grandes e "péptido" seja muitas vezes utilizado em referência a polipéptidos pequenos, a utilização destes termos na técnica sobrepõe-se e vai variando. 0 termo "proteína", tal como se utiliza aqui, refere-se a péptidos, proteínas e polipéptidos, a não ser que seja indicado de outra forma. 23 "Mutante" ~ qualquer alteração no material genético do organismo, em particular, qualquer alteração (isto é, eliminação, substituição, adição ou alteração) numa sequência de polinucleótido de tipo natural ou qualquer alteração numa proteína de tipo natural. 0 termo "mutaína" é utilizado de forma intermutável com "mutante". "De tipo natural" - sequência de polinucleótido de ocorrência natural, de um exão de uma proteína ou de uma parte dela ou uma sequência de proteína ou uma porção dela, respectivamente, tal como existe normalmente in vivo. "Condições de hibridização padrão" - condições dos sais e da temperatura praticamente equivalentes a 0,5 x SSC até cerca de 5 x SSC e 65 °C tanto para a hibridização como para a lavagem. A expressão "condições de hibridização padrão", tal como utilizada aqui, é por isso uma definição operacional e engloba uma gama de condições de hibridização. Condições mais severas podem incluir, por exemplo, a hibridização com um tampão de avaliação de placa (polivinilpirrolidona a 0,2 %, Ficoll 400 a 0,2 %; albumina de soro bovino a 0,2 %, Tris-HC1 50 mM (pH 7,5); NaCl 1 M; pirofosfato de sódio a 0,1 %; SDS a 1 %); sulfato de dextrano a 10 % e 100 pg/mL de ADN de esperma de salmão, desnaturado e submetido a ultra-sons, a 65 °C, durante 12-20 horas e lavagem com NaCl 75 mM/citrato de sódio 7,5 mM (0,5 x SSC)/SDS a 1 %, a 65 °C. Condições menos severas podem incluir, por exemplo, a hibridização com tampão de avaliação de placas, sulfato de dextrano a 10 % e 110 pg/mL de ADN de esperma de salmão desnaturado, submetido a ultra-sons, a 55 °C, durante 12-20 horas e lavagem com NaCl 300 mM/citrato de sódio 30 mM (2,0 x SSC)/SDS a 1 %, a 55 °C. Ver também Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque, Secções 6.3.1-6.3.6, (1989). 24 "Sequência de controlo da expressão" - uma sequência de polinucleótidos, que controla e regula a expressão de genes, quando ligados operacionalmente a esses genes. "Ligada operacionalmente" - uma sequência de polinucleótidos (ADN, ARN), está ligada operacionalmente a uma sequência de controlo de expressão, quando a sequência de controlo de expressão controla e regula a transcrição e a tradução dessa sequência de polinucleótidos. A expressão "ligada operacionalmente" inclui ter um sinal inicial apropriado (por exemplo, ATG) na frente da sequência de polinucleótidos a ser expressa e a manutenção de uma correcta secção de leitura para permitir a expressão da sequência de polinucleótidos sob o controlo da sequência de controlo da expressão e a produção do polipéptido desejado, codificado pela sequência de polinucleótido. "Vector de expressão" - um polinucleótido, tal como um plasmido ou um fago de AND (entre outros exemplos comuns) que permite a expressão de pelo menos um gene quando o vector de expressão é introduzido numa célula hospedeira. 0 vector pode ou não ser capaz de replicar numa célula. "Isolado" (utilizado intermutavelmente com "praticamente puro") - quando aplicado a um ácido nucleico, isto é, a sequências de polinucleótido, que codifica polipéptidos, significa um polinucleótido de ARN ou de ADN, uma porção do polinucleótido genómico, ADNc ou um polinucleótido sintético que, em virtude da sua origem ou manipulação: (i) não está associado com todos os polinucleótidos com os quais está associado na natureza (por exemplo, está presente numa célula hospedeira como um vector de expressão ou como uma sua porção) ; ou (ii) está ligado a um ácido nucleico ou a outra 25 parte química diferente daquela a que está ligado na natureza; ou (iii) não ocorre na natureza. Por "isolado" deve ainda entender-se uma sequência de polinucleótido que é: (i) amplificada in vítro por, por exemplo, uma reacção em cadeia de polimerase (RCP); (ii) quimicamente sintetizado; (iii) produzido de forma recombinante por clonagem; ou (iv) purificado, por exemplo, por clivagem e separação em gel.
Assim, "ácido nucleico praticamente puro" é um ácido nucleico que não está imediatamente contido a uma ou a ambas as sequências de codificação às quais é normalmente contido no genoma de ocorrência natural do organismo a partir do qual o ácido nucleico derivou. ADN praticamente puro, também inclui um ADN recombinante, que faz parte de um gene híbrido, que codifica sequências adicionais. "Isolado" (utilizado intermutavelmente com "praticamente puro") - quando aplicado a polipéptidos significa um polipéptido ou uma sua porção, que em virtude da sua origem ou manipulação: (i) está presente numa célula hospedeira como o produto da expressão de uma porção de um vector de expressão; ou (ii) está ligado a uma proteína ou a outra parte química diferente daquela a que está ligado na natureza; ou (iii) não ocorre na natureza. Por "isolado", entende-se ainda uma proteína que é: (i) sintetizada quimicamente; ou (ii) expressa numa célula hospedeira e purificada fora das proteínas associadas. 0 termo geralmente significa um polipéptido, que tenha sido separado de outras proteínas e ácidos nucleicos com os quais ocorre naturalmente. Preferencialmente, o polipéptido é também separado de substâncias, tais como, anticorpos ou matrizes de gel (poliacrilamida), que são utilizadas para o purificar. 26 "Promotor heterólogo" - tal como se utilize aqui, é um promotor que não está naturalmente associado a um gene ou a um ácido nucleico purificado. "Homólogos" - tal como se utilize aqui, é sinónimo do termo "identidade" e refere-se à semelhança da sequência entre dois polipéptidos, moléculas ou entre dois ácidos nucleicos. Quando uma posição nas duas sequências comparadas está ocupada pela mesma base ou pela mesma subunidade de monõmero de aminoãcido (por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de ADN está ocupada por adenina ou uma posição em cada um dos dois polipéptidos está ocupada por uma lisina), então as respectivas moléculas são homólogas nessa posição. A percentagem de homologia entre duas sequências, é uma função do número de posições coincidentes ou homólogas partilhadas pelas duas sequências, divido pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 das 10 posições nas duas sequências coincidem ou são homólogas, então as duas sequências são 60 % homólogas. A título de exemplo, as sequências de AND CTGACT e CAGGTT partilham 50 % de homologia (3 de um total de 6 posições são coincidentes). Geralmente, faz-se uma comparação quando duas sequências estão alinhadas para dar o máximo de homologia. Esse alinhamento pode ser conseguido, por exemplo, pelo processo de Needleman et al., J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970), implementado convenientemente por programas de computador, tal como, o programa Align (DNAstar, Inc.). As sequências homólogas partilham resíduos de aminoácidos idênticos e similares, em que os resíduos similares representam substituições conservadoras, para ou "mutações de pontos primitivos" de resíduos de aminoácidos correspondentes numa sequência de referência alinhada. Sobre este ponto de vista, uma "substituição conservadora de um resíduo numa sub-sequência 27 de referência, refere-se às substituições que são fisicamente ou funcionalmente semelhantes aos resíduos de referência correspondentes, por exemplo, as que têm uma dimensão, forma, carga eléctrica, propriedades químicas semelhantes, incluindo a capacidade para formar ligações covalentes ou de hidrogénio ou similares. Substituições conservadoras particularmente preferidas são aquelas que preenchem os critérios definidos para uma "mutação num ponto aceite" em Dayhof f et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: supl. 3, capítulo 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D. C. (1978).
As expressões "sequência de polinucleótido" e "sequência de nucleótido" são também utilizadas de forma intermutável nesta descrição. "Angiogénese" e "neovascularização" significam, no seu sentido mais amplo, o recrutamento de novas bases sanguíneas. Em particular, a angiogénese também se refere ao recrutamento de novos vasos sanguíneos num sítio de tumor. "IFNAR2", "IFNAR1", "IFNAR1/2", refere-se a proteínas conhecidas por comporem o receptor do interferão do tipo I da superfície das células. A porção extracelular, porção (de ecto-domínio) da cadeia IFNAR2 sozinha, pode ligar-se ao interferão alfa ou beta. A prática da presente invenção irá utilizar, a menos que se j a indicado de outra forma, técnicas convencionais da biologia das células, da cultura de células, da biologia molecular, da microbiologia, do ADN recombinante, da química das proteínas e da imunologia, que estão dentro das técnicas conhecidas pelos especialistas. Essas técnicas estão 28 descritas na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição. (Sambrook, Fritsch e Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I e II (D. N. Glover, ed) , 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; patente de invenção norte-americana U.S. N° . 4.683.195 (Mullis et al. ,); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames e S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames e S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed) . Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 e 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller e M. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer e Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I - IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
0 INTERFERÃO BETA 0 interferão beta la é útil como um agente para o tratamento, a remissão ou a atenuação de um estado de doença, de condições fisiológicas, de sintomas ou de factores etiológicos ou para avaliação ou o seu diagnóstico. 0 termo também se refere ao interferão beta la que é ele próprio parte de uma proteína de fusão, tal como, uma proteína de fusão de imunoglobulina-interferão beta la, tal como descrito no pedido de patente de invenção co-pendente WO 00/23114. A preparação das proteínas de fusão é geralmente do conhecimento dos especialistas na matéria. 29
Os requerentes encontraram sítios únicos para a ligação do polímero que não destroem a função do interferão beta la. Além disso, os requerentes utilizaram processos de mutagénese dirigidos ao sítio para investigar de forma independente sítios para a ligação do polímero (ver, exemplo 1). Em resumo, os requerentes fizeram uma análise mutacional do interferão beta la humano com o fim de mapear os resíduos requeridos para a actividade e a ligação do receptor. A disponibilidade da estrutura do cristal em 3D do interferão beta la humano (ver, o antecedente e o exemplo 1) permitiu aos requerentes identificar, para as substituições de alanina (ou serina), os resíduos expostos ao dissolvente disponíveis para as interacções do receptor do interferão-beta e para reter os aminoãcidos envolvidos nas ligações intramoleculares. Preparou-se um painel de quinze mutações por meio da alanina, que estavam substituídas entre os resíduos dois e oito ao longo de regiões distintas em cada uma das estruturas helicoidais (A, B, C, D, E) e anéis (ABI, AB2, AB3, GDI, CD2, DEI, DE2) do interferão beta la. Ver exemplo 1.
Incluiu-se o marcador de histidina do terminal amino (marcador "his") para a purificação por afinidade dos mutantes expressos em células de mamíferos (figura 10 e SEQ ID N°s: 1 e 2 para as sequências de ADNc e de aminoácidos dela deduzidas, respectivamente. As sequências funcionais destas mutações foram avaliadas em ensaios antivirais e de anti-proliferação. Desenvolveu-se um ensaio de ligação não radioactiva para analisar estes mutantes, no que respeita a sua ligação ao receptor da célula da superfície do interferão -beta (receptor da superfície da célula IFNAR1/2). Além disso, utilize-se um ensaio à base de ELISA empregando uma proteína de fusão IFNAR2-ecto-domínio/Ig para ligar o 30 interferão, para mapear as interacções de superfície entre um interferão beta la e ο IFNAR2 (ver, exemplo 1). Estas análises mutacionais demonstraram que os terminais N e C estão numa porção da molécula do interferão-beta, que não é importante para a ligação do receptor nem para a função biológica.
Os mutantes são ainda variantes da parte do interferão beta la da presente invenção, que podem ser particularmente úteis, como tal, jã que eles exibem novas propriedades não encontradas no interferão beta la de tipo natural (ver, exemplo 1). Os requerentes identificaram três tipos de efeitos que foram causados por mutagéneses marcadas. Estes efeitos podem ser vantajosos para o desenvolvimento de fármacos de interferão em certas circunstâncias. Os três tipos de efeitos são os seguintes: (a) mutantes com actividade antiviral mais elevada do que o interferão beta la de tipo natural marcado com his (por exemplo, o mutante Cl); (b) mutantes que exibem actividade tanto em ensaios antivirais como de anti-proliferação, mas para os quais a actividade de anti-proliferação é desproporcionadamente baixa em relação à actividade antiviral, comparadas com as do interferão beta la de tipo natural marcado com histidina (por exemplo, mutantes Cl, D e DEI); e (c) antagonistas funcionais (por exemplo, Al, B2, CD2 e DEI), que mostram actividades antivirais e anti-proliferativas, que são des proporcionalmente baixas em relação à ligação do receptor comparadas com as do interferão beta la do tipo natural marcado com histidina.
0 RADICAL DE POLÍMERO
No âmbito da presente invenção, pode-se utilizar uma 31 única molécula de polímero para a conjugação com um interferão beta la, embora também esteja contemplado que pode estar mais do que uma molécula ligada de polímero. As composições de interferão beta la conjugadas da presente invenção podem ter utilidade tanto em aplicações in vivo como em aplicações não in vivo. Além disso, dever-se-á reconhecer que o polímero de conjugação pode utilizar quaisquer grupos, partes ou outras espécies conjugadas, conforme apropriado para aplicação do seu uso final. A título de exemplo, poderão ser úteis nalgumas aplicações para ligar covalentemente ao polímero uma parte funcional, que confere resistência à degradação por UV ou anti-oxidação ou outras propriedades ou características a conferir ao polímero. Como um outro exemplo, pode ser vantajoso, nalgumas aplicações, funcionalizar o polímero para o tornar reactivo ou dar-lhe um carácter de reticulação, para melhorar várias propriedades ou características do material conjugado de uma forma global. De acordo com isto, o polímero pode conter qualquer funcionalidade, grupos de repetição, ligações ou outras estruturas constituintes que não colidam com a eficácia da composição de interferão beta la conjugado para os fins pretendidos. Outros obj ectivos e vantagens da presente invenção, serão compreendidos mais facilmente no seguimento da presente descrição e das reivindicações em anexo.
Polímeros ilustrativos que podem ser utilizados com utilidade para atingir estas características desejadas, estão descritos aqui a seguir nos esquemas de reacção dos exemplos. Em aplicações de péptidos ligados covalentemente, o polímero pode ser funcionalizado e depois ser acoplado aos aminoácidos livres dos péptidos para formar ligações lábeis. 0 interferão beta la é conjugado de uma forma mais 32 preferencial por via de um grupo reactivo terminal no polímero embora as conjugações possam também ser ligadas a grupos reactivos não terminais. 0 polímero com um grupo reactivo é designado aqui como "um polímero activado". 0 grupo reactivo reage selectivamente com o grupo amino livre no terminal N da proteína. 0 polímero activado reage de tal modo que pode ocorrer a ligação a qualquer grupo amino do interferão beta la no terminal N.
Geralmente utiliza-se entre cerca de 1,0 e cerca de 10 moles do polímero activado por mole de proteína, consoante a concentração da proteína. A quantidade final é o equilíbrio entre a maximização da extensão da reacção enquanto se minimizam as modificações não específicas do produto e, ao mesmo tempo, se definem as químicas que vão manter uma actividade óptima, enquanto ao mesmo tempo se optimiza, se possível, o semi-período de vida da proteína. Preferencialmente, pelo menos cerca de 50 % da actividade biológica da proteína é retida e, mais preferencialmente, 100 % fica retida.
As reacções podem ter lugar por qualquer processo apropriado utilizado para fazer reagir materiais activos sob o ponto de vista biológico com polímeros inertes, preferencialmente, a um pH de cerca de 5-7 se os grupos reactivos estiverem no grupo alfa-amino na terminação N. Geralmente, o processo envolve a preparação de um polímero activado (que pode ter pelo menos um grupo hidroxilo terminal) e depois faz-se reagir a proteína com o polímero activado para produzir a proteína solúvel apropriada para a formulação. A reacção de modificação anterior pode ser realizada por vários métodos, que podem envolver uma ou mais etapas. 33
Tal como se mencionou antes, os enquadramentos mais preferidos da presente invenção, utilizam a terminação do terminal N do interferão beta la como a ligação com o polímero. Os processos apropriados estão disponíveis para se obter selectivamente um interferão beta la modificado com uma terminação N. Um dos processos é exemplificado por um processo de alquilação redutora, que explora a reactividade diferencial dos diferentes tipos de grupos amino primários (os grupos épsilon-amino na lisina versus os grupos amino na metionina na terminação N), disponíveis para serem derivados no interferão beta la. Em condições de selecção apropriadas, pode conseguir-se uma derivação praticamente selectiva do interferão beta la na sua terminação N com um polímero contendo o grupo carbonilo. A reacção realiza-se a um pH que permite tirar vantagem das diferenças de pKa entre os grupos épsilon-amino dos resíduos de lisina e o grupo alfa-amino do resíduo de interferão beta la com terminação N. Este tipo de química é bem conhecido dos especialistas na matéria.
Os requerentes utilizaram um esquema de reacção em que se mantém esta selectividade realizando reacções a um pH baixo (geralmente, 5-6) em condições em que um polímero de PEG-aldeído reage com o interferão beta la na presença de cianoboro-hidreto de sódio. Isto resulta, após purificação do PEG-interferão beta la e análise por SDS-PAGE, espectrometria de massa de MALDI e sequenciação/mapeamento de péptidos, resultando num interferão beta la cuja terminação N está especificamente marcada pela parte PEG.
A estrutura de cristal do interferão beta la é tal que as terminações N e C estão localizadas próximas uma da outra (Karpusas et al. , 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. 94: 11813-11818). Assim, as modificações da extremidade de terminação C 34 do interferão beta la devem também um efeito mínimo na actividade. Embora não haja uma estratégia química simples para atingir um polímero de polialquileno-glicol, tal como, PEG na terminação C será fácil para tratar por engenharia genética um sítio, que pode ser utilizado para atingir a parte de polímero. Por exemplo, a incorporação de um Cis num sítio que está na terminação N ou próximo dela, permitirá uma modificação específica utilizando maleimida, vinilssulfona ou polialquileno-glicol activado por haloacetato (por exemplo, PEG) . Estes derivados podem ser utilizados especificamente para a modificação das cisteínas tratadas por engenharia genética, devido à elevada selectividade destes reagentes para Cis. Outras estratégias como a incorporação do marcador de histidina, que pode ser atingido (Fancy et al., (1996) Chem. & Biol. 3: 551) ou um sítio adicional de glicosilação, representam outras alternativas para a modificação da terminação C do interferão beta la. 0 glicano no interferão beta la está também numa posição que permitirá mais modificações sem alterar a actividade. Os processos para atingir os açúcares nos sítios para as modificações químicas, são também bem conhecidos e por isso é possível que o polímero de polialquileno-glicol possa ser adicionada directamente e especificamente ais açucares no interf erão beta la que tenha sido activado por meio de oxidação. Por exemplo, uma hidrazida de polietileno-glicol pode ser gerada de tal maneira que forme uma ligação de hidrazona relativamente estável, por condensação com aldeídos e com cetonas. Esta propriedade tem sido utilizada para a modificação de proteínas através de ligações de oligossacáridos oxidadas. Ver, Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179: 301. Em particular, o tratamento da hidrazida de PEG-carboximetilo com nitrito produz azida de 35 PEG-carboximetilo, que é um grupo activo sob o ponto de vista electrofílico reactivo em relação aos grupos amino. Esta reacção pode ser utilizada para preparar proteínas modificadas por polialquileno-glicol. Ver, as patentes de invenção norte-americanas U.S. N°s. 4 101 380 e 4 179 337.
Os requerentes verificaram antes que a química mediada pelo ligante de tiol podia ainda facilitar a reticulação das proteínas. Em particular, os requerentes geraram multímeros homotípicos de LFA-3 e CD4 utilizando um processo tal que gera aldeídos reactivos nas partes dos hidratos de carbono com periodato de sódio, formando conjugados de cistamina através dos aldeídos e induzindo uma reticulação por via dos grupos de tiol nas cistaminas. Ver Pepinsky, B. et al. , (1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249 e Chen, L. L. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237-18243. Por isso, os requerentes pensaram que este tipo de química seria apropriada para a modificação com polímeros de polialquileno-glicol, em que está incorporado o ligante no açúcar e o polímero de polialquileno-glicol está ligado ao ligante. Embora os ligantes de aminotiol ou os ligantes contendo hidrazina permitam a adição de um único grupo de polímero, a estrutura do ligante pode variar de tal modo que se adicionam polímeros múltiplos e/ou que a orientação espacial do polímero no que respeita ao interferão beta la fica alterada. Tal como se estabelece nas reivindicações em anexo, contudo, o acoplamento entre o interferão beta la e o polímero pode-se obter utilizando um processo de alquilação redutora.
Na prática da presente invenção, incorporam-se, com vantagem, nos sistemas de polímeros de interesse, resíduos de polialquileno-glicol de polialquileno-glicóis de alquilo Cl-C4, preferencialmente, polietileno-glicol (PEG) ou resíduos 36 de polioxialquileno-glicol desses glicóis. Assim, o polímero ao qual a proteína está ligada pode ser um homopolímero de polietileno-glicol (PEG) ou é um poliol polioxietilado, desde que em todos os casos o polímero seja solúvel em água à temperatura ambiente. Exemplos desses polímeros incluem homopolímeros de óxido de polialquileno, tal como, PEG ou polipropileno-glicóis, glicóis polioxietilenados, os seus copolímeros e os seus copolímeros de bloco, desde que a solubilidade em água do copolímero de bloco seja mantida. Exemplos de polióis polioxietilados incluem, por exemplo, glicerol polioxietilado, sorbitol polioxietilado, glicose polioxietilada. A estrutura de glicerol do glicerol polioxietilado, é a mesma estrutura que ocorre naturalmente, por exemplo, nos animais e nos seres humanos nos mono-, di- e triglicéridos. Por isso, esta ramificação não será necessariamente vista como um agente estranho no corpo. 0 polímero não precisa de ter qualquer peso molecular, mas é preferível que o peso molecular esteja entre cerca de 300 e 100.000, mais preferencialmente, entre 10.000 e 40.000. Em particular, as dimensões de 20.000 ou mais são melhores na medida em que evitam a perda de proteína devida à filtração nos rins. A derivação de polialquileno-glicol tem um certo número de propriedades vantajosas na formulação de conjugados de polímero-interferão beta la na prática da presente invenção, porque está associada com as seguintes propriedades dos derivados de polialquileno-glicol: melhoria da solubilidade em água, enquanto, ao mesmo tempo, não causa resposta antigénica ou imunogénica; elevados de graus de biocompatibilidade; ausência de biodegradação in vivo dos derivados de polialquileno-glicol; e facilidade de excreção 37 pelos organismos vivos.
Além disso, num outro aspecto da presente invenção, pode-se utilizar interferão beta la ligado covalentemente à componente do polímero em que a natureza da conjugação envolve ligações químicas covalentes cliváveis. Isto permite o controlo em termos de período de tempo, durante o qual o polímero pode ser clivado do interferão beta la. Esta ligação covalente entre o fármaco de interferão beta la e o polímero, pode ser clivada por reacções clínicas ou enzimãticas. 0 produto do polímero-interferão beta la retém uma quantidade aceitável de actividade. Simultaneamente estão presentes porções de polietileno-glicol no polímero da conjugação para permitir um conjugado de polímero-interferão beta la com uma elevada solubilidade em água e uma capacidade de circulação no sangue prolongada. Como resultado destas características melhoradas a presente invenção contempla a administração parentérica, nasal e oral de ambas as espécies de polímero-interferão beta la activas e, no seguimento da clivagem hidrolítica, biodisponibilidade do interferão beta la per se em aplicações in vivo. A reacção do polímero com o interferão beta la para se obter os produtos conjugados com terminação N mais preferidos, é facilmente realizada utilizando uma grande variedade de esquemas de reacção. A actividade e a estabilidade dos conjugados de interferão beta la podem variar de algumas formas utilizando um polímero com uma dimensão molecular diferente. As solubilidades dos conjugados podem variar alterando a proporção e a dimensão do fragmento de polietileno-glicol incorporado 11a composição de polímero. 38
Utilidade A única propriedade dos polímeros derivados de polialquileno-glicol com valor para aplicações terapêuticas da presente invenção, é a sua biocompatibilidade em geral. Os polímeros têm várias propriedades de solubilidade em água e não são tóxicos. Crê-se que não são imunogénicos e não antigénicos e não interferem com as actividades biológicas da parte de interferão beta la quando conjugados nas condições aqui descritas. Têm um longo período de circulação no sangue e são facilmente excretados pelos organismos vivos.
Os produtos da presente invenção têm-se mostrado úteis na sustentação do semi-período de vida do interferão beta la terapêutico e podem ser preparados para administração terapêutica, por exemplo, dissolvendo-os em água ou num meio líquido aceitável. A administração faz-se por via parentérica, aerossol ou oral. Podem preparar-se suspensões coloidais finas para administração parentérica para produzir um efeito de depósito ou utilizando a via oral, sendo que a formulação do aerossol pode ser líquida ou pode ter uma natureza de pó anidro. No estado anidro, liofilizado ou em formulações de solução, os conjugados de interferão beta la-polímero da presente invenção devem ter uma boa estabilidade na armazenagem. A estabilidade térmica do conjugado de interferão beta la (exemplo 3) é vantajosa em processos de formulação em pó, que têm uma etapa de desidratação. Ver, por exemplo, a patente de invenção WO 95/31479 ("Methods and Compositions for Dry Powder of Interferons").
Os conjugados terapêuticos de polímeros da presente invenção, podem ser utilizados para a profilaxia ou o tratamento de qualquer condição ou estado de doença para o 39 qual o interferão beta la se mostra eficaz. Além disso, os conjugados à base de polímeros da presente invenção, podem ser utilizados no diagnóstico de constituintes, condições ou estados de doença em sistemas ou espécies biológicos, assim como, para fins de diagnóstico em sistemas nâo fisiológicos.
Na utilização terapêutica, a presente invenção compreende composições para serem utilizadas no processo de tratamento dum indivíduo animal, que tem susceptibilidade ou latência para essas condições ou estados de doença e que necessita desse tratamento, compreendendo a administração a esse animal de uma quantidade efectiva de um conjugado de polímero da presente invenção, que é efectiva sob o ponto de vista terapêutico para essa condição ou estado de doença. Os indivíduos a serem tratados pelos conjugados de polímeros da presente invenção incluem indivíduos mamíferos e, mais preferencialmente, seres humanos. Consoante a condição ou o estado de doença específico a ser combatido, os indivíduos animais podem receber conjugados de polímeros da presente invenção em qualquer dose efectiva sob o ponto de vista terapêutico e apropriada e que seja segura, tal como pode ser facilmente determinado no âmbito da técnica e sem experimentação desnecessária. Por causa das barreiras das espécies de interferões do tipo I, pode ser necessário gerar conjugados de interferão-polimero, tal como se descreveu aqui com interferões de espécies apropriadas. A actividade proliferativa anti-celular do interferão beta la é bem conhecida. Em particular, alguns dos conjugados de polímero-interferão beta la aqui descritos, são úteis para o tratamento de tumores e cancros, tais como, sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfocítica aguda, carcinoma da mama, melanoma e carcinoma nasofaríngeo, assim como, 40 condições auto-imunitárias, tais como, fibrose, lúpus e esclerose múltipla. É ainda espectável que a actividade antiviral exibida pelas proteínas conjugadas, em particular alguns dos conjugados de mutaína e interferão beta la aqui descritos, possam ser utilizadas no tratamento de doenças virais, tais como, infecção por ECM, gripe e outras infecções do tracto respiratório, raiva e hepatite. É também espectável que as actividades imuno-modu1adoras do interferão beta la exibidas pelas proteínas conjugadas aqui descritas, possam ser utilizadas no tratamento de doenças auto-imunitárias e inflamatórias, tais como, fibrose e esclerose múltipla. A capacidade dos interferões para inibirem a formação de novos vasos sanguíneos (isto é, para inibirem a angiogénese e a neovascularização) permite que os conjugados da presente invenção sejam utilizados para tratar doenças angiogénicas, tais como, retinopatia diabética, retinopatia dos prematuros, degeneração macular, rejeição de enxertos da córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeose e síndrome de Osler Webber.
Além disso, a actividade anti-endotelial do interferão é já conhecida a algum tempo e o mecanismo potencial da acção do interferão, pode ser interferir com a actividade das células endoteliais por meio da inibição da produção ou da eficácia dos factores angiogénicos produzidos pelas células de tumores. Alguns tumores vasculares, tais como, hemangiornas, são particularmente sensíveis ao tratamento com interferão. 0 tratamento com interferão alfa, é o único tratamento documentado para esta doença. É espectável que o tratamento com conjugados de interferão beta la da presente invenção, ofereçam benefícios farmacêuticos substanciais em termos da farmacocinética e da farmacodinâmica, dado que é espectável que o conjugado permaneça na vasculatura durante 41 um período de tempo maior do que os interferões não conjugados, levando assim a uma maior eficiência e a uma terapia eficaz para ser utilizado como um agente anti-angiogénico. Ver exemplo 8.
Os conjugados de polímero - interferão beta la da presente invenção podem ser administrados per se, assim como, sob a forma de ésteres, sais e outros dos seus derivados funcionais sob o ponto de vista fisiológico e aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Nessas formulações farmacêuticas e medicamentosas, utiliza-se preferencialmente o interferão beta la em conjunto com um ou mais veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico e, eventualmente, com quaisquer outros ingredientes terapêuticos. Os veículos devem ser aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não causarem efeitos prejudiciais ao seu receptor. 0 interferão beta la é dado numa quantidade efectiva para se conseguir o efeito farmacológico desejado, tal como se descreveu antes e numa quantidade apropriada para se obter a dose diária desejada.
As formulações incluem as que são apropriadas para administração parentérica, assim como, para administração não parentérica e as modalidades de administração específicas incluem a administração oral, rectal, bocal, tópica, nasal, oftálmica, subcutânea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal, intra-articular, intra-arterial, sub-araquinóidica, brônquica, linfática, vaginal e intra-uterina. As formulações preferidas são as apropriadas para administração oral, nasal e parentérica.
Quando se utiliza o interferão beta la numa formulação 42 compreendendo uma formulação líquida, a formulação pode ser administrada, com vantagem, oralmente ou parentericamente. Quando se utiliza um interferão beta la numa formulação em suspensão líquida ou sob a forma de pó numa formulação com um veículo compatível, a formulação pode ser administrada, com vantagem, oralmente, rectalmente ou bronquicamente.
Quando se utiliza o interferão beta la directamente, sob a forma de um sólido em pó, o interferão beta la pode ser administrado com vantagem oralmente. Alternativamente pode ser administrado nasalmente ou bronquicamente, por via da nebulização do pó num gás veicular, para formar uma dispersão gasosa do pó, que é expirada pelo paciente a partir do circuito de respiração, que compreende um dispositivo nebulizador apropriado.
As formulações que compreendem os conjugados de polímeros da presente invenção podem apresentar-se, convenientemente, em forma de dosagem unitárias e podem ser preparadas por qualquer um dos processos bem conhecidos da técnica de farmácia. Esses processos geralmente incluem a etapa de juntar os ingredientes activos em associação com um veículo, que constituem um ou mais ingredientes acessórios. Normalmente, as formulações são preparadas misturando intimamente e uniformemente os ingredientes activos em associação com um veículo líquido, um veículo sólido finamente dividido ou ambos e depois, se necessário, modulação do produto em formas de dosagem da formulação desej ada.
As formulações da presente invenção, apropriadas para administração oral, podem apresentar-se como unidades discretas, tais como, cápsulas, comprimidos ou pastilhas, 43 cada uma delas contendo uma quantidade pré-determinada do ingrediente activo sob a forma de pó ou grânulos; ou uma suspensão num licor aquoso ou num líquido não aquoso, tal como um xarope, um elixir, uma emulsão ou por inalação.
Pode-se fazer um comprimido por compressão ou moldagem, eventualmente, com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos sujeitos a compressão podem ser preparados comprimindo numa máquina apropriada, com o composto activo numa forma que flui livremente, tal como, um pó ou grânulos, que eventualmente estão misturados com um ligante, um desintegrante, um lubrificante, um diluente inerte, um agente tensioactivo ou um agente de descarga. Os comprimidos moldados compreendem uma mistura dos conjugados do polímero em pó com o veículo apropriado e podem ser feitos por moldagem numa máquina apropriada.
Pode-se fazer um xarope adicionando comporto activo a uma solução aquosa concentrada de um açúcar, por exemplo, sacarose, ao qual também se associa qualquer ingrediente acessório. Esses ingredientes acessórios podem incluir agentes aromatizantes, conservantes apropriados, agentes para retardar a cristalização do açúcar e agentes para aumentar a solubilidade de qualquer um dos outros ingredientes, tais como, álcool de poli-hidroxi, por exemplo, glicerol ou sorbitol.
As formulações apropriadas para administração parentérica compreendem, de uma forma conveniente, uma preparação aquosa esterilizada do conjugado activo, que é preferencialmente isotónica com o sangue do receptor (por exemplo, solução salina fisiológica). Essas formulações podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes ou outros 44 sistemas em micropartícuias que são preparados para levar o composto aos componentes do sangue ou a um ou mais órgãos. As formulações podem apresentar-se em formas de doses únicas ou de doses múltiplas.
As formulações em aerossóis nasais compreendem soluções aquosas purificadas do conjugado activo com agentes conservantes e com agentes isotónicos. Essas formulações são preferencialmente ajustadas para um pH e um estado isotónico compatíveis com as membranas da mucosa nasal.
As formulações para administração rectal, podem apresentar-se como supositórios com um veículo apropriado, tal como, manteiga de cacau, gorduras hidrogenadas ou ácidos carboxílicos gordos hidrogenados.
As formulações oftálmicas, tais como, as gotas para os olhos, preparam-se por meio de um processo similar ao spray nasal, excepto no facto de o pH e os factores isotónicos se ajustarem, preferencialmente, às condições do olho.
As formulações tópicas compreendem os conjugados da presente invenção dissolvidos ou suspensos em um ou mais meios, tais como, óleo mineral, petróleo, álcoois de poli -hidroxi ou outras bases utilizadas para formulações farmacêuticas tópicas.
Para além dos ingredientes mencionados antes, as formulações da presente invenção podem ainda incluir um ou mais ingredientes acessórios seleccionados entre diluent.es, tampões, agentes aromatizantes, desintegrantes, agentes tensioactivos, espessantes, lubrificantes, conservantes (incluindo anti-oxidantes). 45
De acordo com isto, a presente invenção contempla a produção de polímeros apropriados para a estabilização in vitro do interferão beta la em solução, como uma aplicação ilustrativa preferida das aplicações não terapêuticas. Os polímeros podem ser utilizados, por exemplo, para aumentar a estabilidade térmica e a resistência à degradação enzimãtica do interferão beta la. A melhoria das características da estabilidade térmica do interferão beta la por via da conjugação da forma indicada na presente invenção, providencia um meio de aumentar o semi-período de vida, a estabilidade à temperatura ambiente e a robustez dos reagentes e estojos de investigação.
Em particular, deve entender-se que as experiências em animais, in vivo, aqui descritas, podem variar, de modo a que sejam possíveis modificações e variações da metodologia básica. Por exemplo, no exemplo 5, um especialista na matéria poderá utilizar outros ensaios de neopterina ou poderá alterar o número e o tipo de primatas utilizados. Estas modificações e variações dos exemplos devem ser olhadas como estando dentro do espírito e do âmbito da presente invenção. EXEMPLO 1: Estudos da estrutura/actividade do interferão beta la humano, utilizando as mutações de substituição da alanina/serina: análise dos sítios de ligação do receptor e dos domínios funcionais A. Visão Global
Realizou-se uma análise mutacional muito extensa do interferão beta la humano (IFN-beta-la) com o fim de mapear os resíduos necessários para a actividade e ligação do receptor. A disponibilidade da estrutura de cristal em 3D do IFN-beta humano (Karpusas, M. et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. 94: 11813-11818) permitiu aos requerentes identificar substituições de alanina (ou serina), os resíduos expostos aos dissolventes disponíveis para interaeções do receptor e para reter os aminoácidos envolvidos nas ligações intramoleculares. Preparou-se um painel de 15 mutações de substituição da alanina, que substituíram entre os resíduos 2 e 8 ao longo de regiões distintas de cada uma das hélices (A, B, C, D, E) e dos anéis (AB, CD, DE) . Um marcados de histidina de terminação amino compreendendo seis resíduos de histidina, foi incluído para a purificação por afinidade, assim como, um sítio de clivagem de enterocinase para a eliminação da extensão do terminal amino. Os interferões resultantes são referidos como "interferão (IFN)-beta marcado com his" ou "His-interferão-beta" ou "His6-interferão-beta" e similares. Vários plasmidos de expressão de mutantes de IFN-beta marcado com his foram preparados utilizando uma estrutura de gene de IFN-beta de tipo natural como uma matriz para a mutagénese. A estratégia da mutagénese envolveu primeiro a introdução de sítios únicos de clivagem da enzima de restrição ao longo do gene de IFN-beta marcado com his de tipo natural, substituindo assim as sequências de ADN de substituição distintas entre os sítios de restrição escolhidos com duplex de oligonucleótidos sintéticos, que codificam as mutações de substituição da alanina ou da serina). Finalmente, os genes mutantes de IFN, foram sub-clonados num plasmido, que dirigiu a expressão das células de mamíferos numa linha de células 293 humana do rim.
As consequências funcionais destas mutações foram avaliadas em ensaios antivirais e anti-proliferação. 47
Desenvolveu-se um ensaio de ligação de IFN não radioactivo para analisar estes mutantes na sua ligação ao receptor de superfície (complexo de IFNAR 1/2") de células de linfoma humano de Daudi Burestojot. Além disso, desenvolveu-se um ensaio para mapear as superfícies de interacção entre os mutantes de his-IFN-beta e IFNAR2, que utilizaram uma proteína de fusão IFNAR2/Ig, que compreendia o domínio extracelular de IFNAR2 da proteína do receptor de IFN fundido com a articulação, domínio CH2 e CH3 de IgGl humana. 1. Criação de um gene de interferão-beta como matriz para a mutagénese A estratégia dos requerentes para gerar mutantes de IFN-beta substituídos em alanina (ou serina), foi criar primeiro um gene de IFN-beta modificado, que modificou a proteína de tipo natural, mas que comportava sítios de clivagem únicos da enzima de restrição espalhados ao longo do gene. OS sítios únicos foram utilizados para permutar sequências de tipo natural por duplex de oligonucleótidos sintéticos que codificam os codões mutados. Para se obter uma cassete de expressão de IFN-beta-la humana apropriada para a criação dos genes mutantes, amplificou-se o ADNc de IFN-beta (GenBank número de acesso #E00029) por RCP. Foi necessária uma clonagem inicial do gene de IFN-beta no plasmido pMJB107, um derivado de pACYC184, ver Rose, et. al., 1988, Nucleic Acids Res. 16 (1) 355) , de modo a realizar a mutagénese dirigida ao sítio do gene num plasmido a que faltavam os sítios de restrição específicos que iriam ser gerados durante a mutagénese.
Os iniciadores de RCP utilizados para subclonar as sequências de codificação do gene de IFN-beta humano, também 48 permitiram aos requerentes introduzir um sítio de clivagem de enterocinase a montante e numa secção com o gene de IFN-beta (iniciador de RCP de 5' 5'TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAA CTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3' (SEQ ID N° . 3: "BET-021", e iniciador de RCP de 3' 5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTG TAAGTC-3' (SEQ ID N° . 4: "BET-022") e sítios de enzima de restrição de flanqueio (BspEI e Xhol) úteis para a clonagem em sítios do plasmido pMJB107. 0 ADN resultante é referido como um fragmento A de RCP.
Uma sequência de sinal eficiente da sequência de sinal da molécula 1 de adesão de células vasculares humanas (VCAM-1) e um marcador de seis histidinas foram introduzidos na estrutura final de um segundo fragmento de ADN, criado a partir de pDSW247 (fragmento B) . 0 plasmido pDSW247 é um derivado de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , do qual se eliminou o gene EBNA-1 e que comporta a sequência de sinal VCAM-1 (VCAMss) fundida a montante e na secção com um marcador de seis histidinas. Os iniciadores de RCP foram utilizados para gerar a VCAMss-1/parte da cassete de marcação de histidina com KID-369 (iniciador de RCP de 5' 5'AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3' : SEQ ID N° . 5) e KID-421 (iniciador de RCP de 3' 5'-CCGGAGCTATGATGATGATGATGAT GGCCCCCGGA-3': SEQ ID N° . 6) incorporando os sítios de clivagem da enzima de restrição que flanqueiam (Notl e BspEI), que permitiram a excisão do ADN do fragmento B.
Para criar um vector de plasmido que comporta a sequência de sinal VCAM-1, fez-se uma ligação do marcador de his e o gene de interferão beta por três vias, utilizando fragmentos de ADN purificados em gel do vector de plasmido pMJB107 (Notl e Xhol clivado) , fragmento A RCP (BspEI e Xhol clivado) e fragmento B (Notl e BspEI clivado). Utilizou-se o 49 plasmido ligado para transformar quer as células de JA221 ou XLl-Blue de E. coli e retomaram-se as colónias resistentes a ampicilina e ensaiaram-se no que respeita às inserções por meio de uma análise do mapa de restrição. 0 ADN da Maxiprep foi feito e a sequência da inserção foi verificada por meio da sequenciação do ADN. A estrutura resultante foi designada por pCMG26 0. 2. Criação de mutantes de substituição de alanina de interferão-beta humano em pCMG260 0 plasmido pCMG260 foi utilizado como uma matriz em vários ciclos de mutagénese (estojo de mutagénese dirigido ao sítio U.S.E. (Boehringer-Mannheim), que introduziu sítios únicos de clivagem de restrição em posições ao longo da sequência de codificação da proteína de IFN-beta, mas não alterou a sequência da proteína resultante. Os plasmidos mutagenizados foram utilizados para transformar quer as estirpes JA221 ou XLl-Blue de E. coli, quer as colónias recombinantes seleccionadas pela resistência ao cloranfenicol. As colónias resistentes ao cloranfenicol foram ainda ensaiadas para avaliar a presença do sítio da enzima de restrição único desejado, por meio de mapeamento da restrição do ADN. 0 plasmidos de IFN-beta resultante, pCMG2 75.8, continha o conjunto completo dos sítios de clivagem únicos da enzima de restrição e a sequência de ADN do gene foi verificada. As sequências completas do ADN (SEQ ID N°. 1) do gene do interferão beta marcado com his, modificado, em conjunto com a sequência de codificação da proteína (SEQ ID N°. 2), estão indicadas na figura 10. O conjunto completo das mutações de substituição de alanina, está descrito no quadro 1 (a seguir) . Os nomes dos 50 mutantes especificam as regiões estruturais (hélices e anéis) em que se introduziram as mutações. Todo o painel de mutações de alanina (serina), resulta na mutação de 65 dos 155 aminoácidos de IFN-beta humano. 0 painel de mutantes foi criado a partir de pCMG275.8 substituindo os segmentos de ADN entre os sítios de restrição únicos por duplexes de oligonucleótidos sintéticos, que comportavam a informação de codificação genética descrita no quadro 2 (ver a seguir). Para criar os vários plasmidos mutantes de substituição de alanina, ligou-se, em comjunto, o vector pCMG275.8 purificado em gel (clivado com a enzima de restrição apropriada, tal como indicado na lista a seguir para região estrutural de IFN-beta) e os duplexes de oligonucleótidos (codificando as sequências da estruturas helicoidais, que estão indicadas no quadro 2. Utilizaram-se as misturas de ligação para transformar a estirpe JA221 de E. coli e as colónias recombinantes seleccionadas pela resistência à ampicilina. Ensaiaram-se as colónias resistentes à ampicilina pela presença da inserção das mutações avaliando os sítios de enzima de restrição apropriados. Para dois mutantes (A2 e CD2), a estratégia de clonagem gizada utilizou dois duplexes de oligonucleótidos sintéticos (indicados no quadro 2), que comportam extremidades ramificadas complementares para lhes permitir ligarem-se uns aos outros e a estrutura do vector de IFN-beta numa ligação de três vias. A lista que se segue ilustra os sítios que foram utilizados para clonar os oligonucleótidos mutados do quadro 2. 0 esquema de clonagem (sub-secção B) mostra as posições destes sítios únicos do gene do interferão beta. 51 QUADRO 1.
Posições das mutações de substituição de alanina de HUIFN-β 1 10 20 30 40 50 «... . » . ......1 . .....I ...
IFN-β MSYMLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKE AI -A-AA—A—A —------———---------------------- A2 --------------AA-AA—AA--------------------- ABI ---------------------------AAA-AA-------------------- AB2 -------------- ——-----—------------AA-A—A----——
AB3 -------------—------—--------------------------AAAAA-AAA
.helix A | j_anel de AB 60
70 I 80
90 I
100 I XFN-β BI B2 Cl C2 CD1 i . . . I . . . » . . . . . .. ... DAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWtn^IVENIJANVXBQINHLKTVLEEKLEKE ----------A—AS-----------------—------------------------ -----------------AAA------------———-----—------------ -AS—AA—S-
helix B 110 I. . 120 »
130 I
140 I
ISO I
-AA--------- -----AA—AAA _j j. anel de CD 160 I IFN-β CD2 D DEI DE2 Ξ DFTRGAIiMSSLgLKRYYGRILHYLKAKEYSHGAOTrVRVEIIJRISFYRINELTGyLFiN AA-A--A—A----------------------------------------------- -----—------A-AA—A— ———----------------- --------------------------AA----------------------------- -----------------------------AA-------------------------- --------------------------------------A---A—A—A-------- anel de CD4 j helix D_j helix E_ i A linha designada por IFN-β mostra a sequência de IFN-β humano natural. As substituições de alanina ou de serina dos resíduos de IFN-β estão indicadas para cada um dos mutantes e os extractos abaixo das regiões relevantes, indicam sequências do tipo natural. As estruturas em hélice e em anel são indicadas pelas linhas a cheio abaixo dos mutantes. 0 anel DE mostra o intervalo entre as hélices D e E. geraram-se dois mutantes adicionais de substituição de alanina (H93A, H97A e H121A) e analisaram-se em ensaios antivirais para avaliar os efeitos das mutações destas histidinas, que vão quelar o zinco no dímero na estrutura de cristal. Ambos estes mutantes retiveram completamente a actividade do tipo natural 52 nos ensaios antivirais, sugerindo que a formação do dímero mediada pelo zinco não é importante para a actividade do IFN- β- QUADRO 2 AI SEQ ID N° , 7 BET- 053 A2 SEQ ID N° . 8 BET- 039 SEQ ID Νΰ. BET-041 9 ABI SEQ ID N°, BET-080 10 AB2 SEQ ID N°. ΒΞΤ-082 11 AE3 SEQ ID N°. BET-084 12 SEQ ID Nc. BET-086 13 BI SEQ ID N°. BET-110 14 B2 SEQ ID N°. ΒΞΤ-112 15 Cl SEQ ID Νΰ. BET-114 16 C2 SEQ ID N°, BET-092 17 CD1 SEQ ID Nc. BET-094 18 CD2 SEQ ID N°. BET-096 19 SEQ ID N°. BET-106 20 Dl SEQ ID N°. BET-108 21 DEI SEQ ID N° > BET-116 22 DB2 SEQ ID N°. BET-118 23 EI SEQ ID N°. BET-104 24
CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTACAAGC
TTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC
GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGAGGCTT
GAATACT
GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGACATCC
CTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGCTATCCC
TGCAGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACA
TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA
CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTCAGACAA
GATTCATCTAGCACTGGCTGGAA
CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCGCTGCAG
CTTCATCTAGCACTGGCTGGAA
GGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATCATCAGATAAACCATC
TGAAGACAGTTCTAG
GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGATAGCACATC
TGGCTGCAGTTCTAG
CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT
CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGA
GCGCGCTGCACCTGAAAAGA
TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTCACACTGT
CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATACCTG
GCAGCCAAGGAGTACTCACACTGT
CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTG
AAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGAT
CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGA
AGGCAAAGGAGTACGCTGCATGTGCCTGGACGAT
CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAG 5
Construção dos plasmidos de expressão EBNA 293
Os genes do tipo natural e os genes mutantes de IFN-beta, fundidos com a sequência de sinal VCAM-1, marcados com his e o sítio de clivagem da enterocinase, foram purificados em gele como fragmentos de restrição de 761 pares de bases Notl e BamHI. Os genes purificados foram subclonados no vector pDSW24 7 do plasmido clivado de Notl e BamHI, como se mostra no esquema. 0 plasmido pDSW247 é um vector de expressão para a expressão transiente da proteína em células 53 ΕΒΝΑ 293 de rins humanos (Invitrogen, Carlsbad, CA). Contêm o promotor do gene precoce de citomegalovírus e os elementos reguladores de EBV, que são necessários para uma expressão de genes de alto nível nesse sistema, assim como, marcadores seleccionáveis para células de E. coli (resistência à ampicilina) e células EBNA 293 (resistência à higromicina) como se viu no esquema da estratégia de clonagem (a seguir). Os plasmidos ligados foram utilizados para transformar quer as células JA221 ou as XLl-Blue de E. coli e repescaram-se as colónias resistentes a ampicilina e ensaiaram-se para avaliar as inserções por meio da análise do mapa de restrição. Preparou-se o ADN Maxiprep e verificou-se a sequência das inserções pela sequenciação do ADN. Os clones positivos exibiam as sequências mutagenizadas desejadas e foram utilizados para transfectar células EBNA 293 do rim humano, como se descreve a seguir. A estratégia global da clonagem apresenta-se a seguir: 54
Representação esquemática da estratégia de clonagem e dos plasmidos de expressão de ΙΡΝ-β
Ensaio Anti-proíiferatívo
Ligação de IFNAR?>Fc C. Expressão e quantificação dos mutantes de substituição de alanina em IFN-beta-la
Mantiveram-se as células humanas EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Chittenden, T. (1989) J. Virol. 63: 3016-3025) em culturas sub-confluentes em meio de Eagle modificado por Dulbecco, complementado com soro bovino fetal a 10 %, glutamina 2 mM e 250 pg/mL de geneticina (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Os plasmidos de expressão pDSW247 foram transfectados de forma transiente em células EBNA 293, utilizando o protocolo de lipofectamina (Gibco/BRL, Life Technologies). Colheu-se o meio condicionado 3-4 dias após a 55 transfecção, eliminaram-se os fragmentos de células por centrifugação e quantificou-se a concentração de his-IFN-beta por ELISA.
Realizou-se o ensaio de ELISA utilizando anticorpos policlonais de coelho (IgG purificada por proteína A, anticorpos que tinham sido originados para purificar IFN-beta- la humano) para revestir placas de ELISA com 96 microtubos e uma forma biotinilada da mesma IgG policlonal de coelho, foi utilizada como um reagente secundário para permitir a detecção do interferão utilizando peroxidase de rábano ligada e estreptavidina (PRS: Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA) . A diluição das séries de interferão beta la, foi utilizada para gerar as curvas de concentração padrão. 0 meio condicionado contendo his-IFN-beta dos transfectantes de EBNA foi diluído para se obterem amostras com concentrações variando entre 10 ng/mL e 0,3 ng/mL no ensaio de ELISA. Para confirmar as concentrações de IFN-beta no meio determinadas por ELISA, realizou-se uma análise de mancha de Western. Submeteu-se os sobrenadantes da cultura reduzidos e os padrões de IFN-beta-la a EGPA-SDS (electroforese em gel de poliacrilamida e sulfato de dodecilo e sódio) em geles com um gradiente de 10-20 % (Novex, San Diego, CA) e fez-se a análise de mancha em membranas de PDVF. Detectaram-se as bandas imunoreactivas com um anti-soro anti-IFN-beta-la policlonal de coelho (#447, Biogen, Inc., um Segundo anti-soro que tinha sido produzido contra IFN-beta-la), seguido do tratamento com IgG anti-coelho de burro ligada a PRS (Jackson ImmunoResearch). 56 D. Avaliação dos mutantes de interferão beta no que respeita à ligação ao receptor
As propriedades de ligação do receptor dos mutantes de interferão-beta descritas em C, foram avaliadas utilizando dois ensaios de ligação diferentes. Um dos ensaios mediu a ligação dos mutantes de interferão-beta a uma proteína de fusão, IFNAR2/Ig, compreendendo um domínio extracelular da cadeia do receptor humano de IFNAR2, fundido com parte da região constante de uma IgG humana. IFNAR2-Fc foi expresso em células de ovário de hamster chinês (OHC) e purificado por cromatografia de afinidade em coluna de sefarose de proteína A, de acordo com as instruções do fabricante (Pierce Chem. Co. , Rockford, IL, catálogo #20334) . A ligação dos mutantes do interferão-beta a IFNAR2-Fc, foi medida num ensaio do formato ELISA. Prepararam-se as placas do ensaio de ELISA por revestimento de placas de 96 microtubos de fundo plano, durante a noite, a 4 °C, com 50 pL/microtubo de anticorpo monoclonal de IgGl anti-humano (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) a 10 pg/mL em tampão de revestimento (NaHC03 50 mM, MgCl2 0,2 mM, CaCl2 0,2 mM, a pH 9,6). Lavaram-se as placas duas vezes com SBF contendo Tween-20 a 0,05 % e bloquearam-se com leite em pó, sem gordura a 0,5 % em SBF, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Após de mais duas lavagens, adicionou-se 50 pL de 1 pg/mL de IFNAR2-Fc em leite a 0,5 % em SBF, contendo Tween-20 a 0,05 %, a cada tubo e incubou-se durante 1 hora, à temperatura ambiente e depois lavaram-se as placas mais duas vezes. Mediu-se a ligação dos mutantes de interferão-beta a IFNAR2-Fc, adicionando 50 pL/tubo de interferão-beta mutante em meio condicionado, diluído em série em meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD), complementado com soro bovino fetal a 10 % e fez-se a incubação durante 2 horas, a 4 °C. As diluições do mutante de interferão-beta variaram normalmente 57 desde aproximadamente 1 μΜ até 10 pM. Depois da lavagem, detectou-se o interferão-beta ligado às placas por meio da adição de 50 pL/tubo de um cocktail consistindo numa diluição de 1:1000 de um anticorpo anti-interferão policlonal de coelho (#447) mais IgG anti-coelho de burro marcado com peroxidase de rábano (PRS) (Jackson ImmunoResearch) e incubou-se durante 15 minutos, a 4 °C. Após duas lavagens, adicionou-se substrato de PRS e incubou-se a placa a 4 °C antes de s e ler num leitor de placas de ELISA a uma absorvência a 450 nm. Desenharam-se os dados como a absorvência em função da concentração do interferão-beta mutante e determinou-se a afinidade para a ligação do interferão-beta mutante a IFNAR2-Fc, fazendo a substituição dos dados numa equação simples de ligação hiperbólica. Os resultados destas análises estão indicados na figura 1, em que a afinidade de ligação para cada mutante, determinada em pelo menos três experiências independentes, está expressa como a percentagem medida de interferão beta la de tipo natural, marcado com Hiss.
Utilizou-se um segundo ensaio de ligação do receptor para medir a afinidade com que os mutantes de interferão-beta se ligam a células de Daudi expressando tanto as cadeias do receptor, IFNAR1 e IFNAR2, que compreendem o conjunto do receptor para o interf erão-beta. Este ensaio à base de EGPA utilizou um anticorpo monoclonal de bloqueio, dirigido contra o domínio extracelular de IFNAR1, EA12 (Biogen, Inc.), para distinguir o receptor não ocupado (livre) do receptor ao qual está ligado o interferão-beta. Colocaram-se células de Daudi (20 pL a 2,5 x 107 células/mL) em placas de ELISA com um fundo em V e de 96 microtubos e incubou-se durante 1 hora, a 4 °C, com várias concentrações do mutante do interferão-beta (20 pL em tampão de EPAG; SBF a 5 %, NaN3 a 0,1 % no seio de 58 SBF). As diluições em série desejáveis dos mutantes de interferão-beta variaram de cerca de 0,5 μΜ até cerca de 0,5 pM. Adicionou-se a cada tubo 100 ng de anticorpo monoclonal anti-IFNARl de murino biotinilado EA12 (10 pL) e incubaram-se as placas durante mais 2 minutos, à temperatura ambiente antes de se lavar duas vezes com tampão de EGPA (4 °C). Fez-se então a incubação das células durante 30 minutos, a 4 °C com 50 pL/tubo de uma diluição de R-ficoeritrina conjugada com estreptavidina 1:200 (Jackson ImmunoResearch), lavou-se duas vezes num tampão de EGPA, fez-se novamente a suspensão no seio de 300 pL de tampão de EGPA contendo para-formaldeído a 0,5 % e transferiu-se para tubos de poliestireno de 12x75 mm (Falcon 2052). Analisaram-se então as amostras por citometria de fluxo num digitalizador de EGPA (Becton Dickinson). Desenharam-se os fagos como a intensidade média da fluorescência do canal (IMFC) versus a concentração do mutante de interferão-beta; definiram-se as afinidades de ligação como a concentração do mutante de interferão-beta, que dava 50 % de inibição da coloração do anticorpo. Cada mutante foi ensaiado múltiplas vezes. A figura 2 mostra as afinidades de ligação do receptor para cada mutante de interferão-beta, determinadas por este método, expressas como uma percentagem da afinidade medida para o interferão beta la, de tipo natural, marcado com Hiss, em cada experiência. E. Avaliação dos mutantes do interferão beta quanto à sua função
Fez-se também a análise dos mutantes de interferão-beta no que respeita à sua actividade funcional utilizando ensaios in vitro para a actividade antiviral e para a capacidade do interferão-beta para inibir a proliferação das células. Realizou-se para cada mutante um mínimo de três ensaios 59 antivirais, cada um deles com pontos de verificação em triplicado. Incluiu-se, em cada experiência, como referência, o interferão beta la, de tipo natural, marcado com His6. Realizaram-se os ensaios antivirais tratando células de carcinoma humano do pulmão A54 9 (ATCC CCL 185) , durante a noite, com diluições em série de duas vezes dos mutantes de interferão-beta em concentrações que variavam no intervalo entre uma protecção antiviral completa e nenhuma protecção da morte das células virais. No dia seguinte, infectaram-se as células durante dois dias com vírus de encefalomiocardite (VECM) numa diluição, que resultou numa morte completa das células na ausência do interferão. Trataram-se então as placas com um corante metabólico MTT (2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil]-2H-tetrazolio-5-carboxianilida) (M5655,
Sigma, St. Louis, MO). Preparou-se uma solução concentrada de MTT a 5 mg/mL, no seio de SBF e filtrou-se de forma esterilizada e diluiu-se 50 pL desta solução em culturas de células (100 pL por tubo). No seguimento da incubação, à temperatura ambiente, durante 30-60 minutos, deitou-se fora a solução de MTT/meio, lavaram-se as células com 100 pL de SBF e, finalmente, solubilizou-se o corante metabolizado em 100 pL de ácido clorídrico 1,2 N, no seio de isopropanol a 90 %. Quantificaram-se as células viáveis (como foi evidenciado pela presença do corante) pela absorvência a 450 nm. Os dados analisados foram desenhados como absorvência em função da concentração do mutante de interferão-beta e a actividade de cada mutante foi definida como a concentração à qual 50 % das células foram mortas. A figura 3 mostra a actividade de cada mutante, expressa como uma percentagem da actividade medida para um interferão beta la, de tipo natural, marcado com His, em cada experiência.
Os mutantes de interferão beta foram também avaliados no 60 que respeita à função num ensaio anti-proliferação. Semearam-se células humanas de linfoma de Daudi Burestojot (ATCC# CCL 213) , a 2 x 10b células/mL, no seio de RPMI 1620, complementado com soro bovino fetal a 10 % definido (Hyclone, Logan Utah) e L-glutamina 2 mM. Cada tubo também continha uma dada concentração do mutante de interferão-beta num volume final total de 100 pL de meio por tubo; as concentrações do interferão-beta utilizadas, foram escolhidas de modo a estarem num intervalo de inibição máxima da proliferação de células de Daudi até à não inibição (isto é, proliferação completa). Utilizaram-se pontos experimentais em duplicado para cada concentração do mutante de interferão-beta ensaiado e incluiu-se em todas as experiências um conjunto em duplicado de células não tratadas. As células foram incubadas durante dois dias, a 3 7 °C, em incubadores com C02 a 5 %, depois do que se adicionou a cada tubo 1 pCi por tubo de timidina tritiada ((metil-3H) , timidina, Amersham TRK758), no seio de 50 pL de meio e incubou-se durante mais 4 horas. Recolheram-se as células utilizando um equipamento de colheita da placa de LKB e mediu-se a incorporação da timidina tritiada, utilizando m leitor de placas LKB beta. Fizeram-se as médias dos valores experimentais em duplicado e determinaram-se os desvios padrão. Os dados foram desenhados como as contagens médias por minuto versus a concentração de mutante de interferão-beta e a actividade de cada mutante foi definida como a concentração requerida para dar 50 % da inibição do crescimento máxima observada. Os ensaios múltiplos para cada mutante foram realizados. A figura 4 mostra os resultados expressos como uma percentagem da actividade encontrada para este interferão beta la, de tipo natural, marcado com his, em cada experiência. 61 F. Propriedades dos mutantes do interferão beta
Verificou-se que o interferão beta la, de tipo natural, marcado com histidina, tinha actividades nos ensaios antivirais e anti-proliferação que eram cada uma delas cerca de 3 vezes inferiores às actividades correspondentes encontradas para o interferão beta la, de tipo natural não marcado. Dado que todos os mutantes de interferão-beta Al-E, contêm a sequência do marcador his idêntica na sua terminação N, os efeitos nas mutações das propriedades da molécula, foram determinados comparando as actividades destes mutantes no ensaio antiviral, anti-proliferação e de ligação com a actividade observada para este interferão beta la, de tipo natural, marcado. Ao fazer isto, os requerentes assumem que variações na actividade dos mutantes Al-E, comparadas com as do interferão beta la, de tipo natural, marcado com his, são qualitativamente e quantitativamente praticamente as mesmas, dado que os efeitos que as mesmas mutações teriam na ausência do marcador de his na terminação N. Fez-se uma associação equivalente para as estruturas marcadas ou de fusão de outras citocinas solúveis que é normalmente suportada como verdadeira pelos técnicos da técnica de mutagénese de digitalização da alanina, especialmente, quando a actividade funcional in vitro das estruturas marcadas ou de fusão, estão próximas das de citocina, de tipo natural, tal como é o caso aqui. Ver, por exemplo, Pearce K. H. Jr, et al. , J. Biol. Chem. 272: 20595-20602 (1997) e Jones J. T., et al., J. Biol. Chem. 273: 11667-11674 (1998).
Os dados indicados nas figuras 1-4 sugerem três tipos de efeitos que foram causados pela mutagénese dirigida. Estes efeitos podem ser vantajosos para o desenvolvimento de fármacos de interferão, em certas circunstâncias. Os três 62 tipos de efeitos são os seguintes: (a) mutantes com actividade antiviral superior às do interferão beta la de tipo natural (por exemplo, mutante Cl) ; (b) mutantes que exibem actividades tanto nos ensaios antivirais como nos ensaios anti-proliferação, mas para os quais a actividade anti-proliferação é desproporcionadamente baixa em relação à actividade antiviral, comparada com o interferão beta la de tipo natural (por exemplo, mutantes Cl, De DEI) ; e (c) antagonistas funcionais (por exemplo, Al, B2, CD2 e DEI), que exibem actividades antivirais e anti-proliferativa que são desproporcionadamente baixas no que respeita à ligação do receptor, comparadas com o interferão beta la de tipo natural. Pode-se ver que alguns mutante caem em meios do que uma classe. Estas classes estão revestidas a seguir. Embora se tenham caracterizado estas classes de mutantes no que respeita aos exemplos que se listam, deve entender-se que outras mutações nessas regiões também podem resultar do mesmo modo ou pode-se mesmo ter efeitos melhorados na actividade: (a) 0 mutante Cl possui actividade antiviral, que é aproximadamente 6 vezes maior do que a do interferão beta la, de tipo natural, marcado com his. Este mutantes e outros deste tipo é previsível que sejam úteis na redução da quantidade interferão-beta, que deve ser administrada para se alcançar um dado nível de efeito antiviral. Baixando a quantidade de proteína administrada, é espectável que se reduza a imunogenicidade da proteína e também se possam reduzir os efeitos colaterais de toxicidades à base de não mecanismo. As mutações nesta classe é previsível que sejam vantajosas em situações em que o benefício terapêutico da administração do interferão-beta, resulta dos seus efeitos antivirais e em que os efeitos anti-proliferativos contribuem para a toxicidade ou para efeitos colaterais indesejados. 63 (b) As actividades relativas (% de tipo natural) dos mutantes substituídos de alanina no ensaio antiviral e anti -proliferação, estão comparadas na figura 5. As actividades alteradas de forma coordenada (isto é, actividades antivirais e anti-proliferação, que diferem do mesmo factor das actividades do interferão beta la, de tipo natural, marcado com his), são vistas na maior parte dos mutantes (os que estão na linha diagonal). Contudo, vários mutantes mostram maiores alterações nas actividades num dos ensaios relativamente ao outro, comparados com o interferão beta la, de tipo natural, marcado com his, como é evidenciado pelo seu desvio da diagonal. Três desses mutantes estão indicados no quadro 3 a seguir. 0 mutante Cl mostra uma actividade antiviral, que é cerca de 6 vezes mais elevada do que a do interferão beta la, de tipo natural, marcado com his, mas a sua actividade no ensaio anti-proliferação é semelhante a do tipo natural. 0 mutante Cl tem assim uma actividade antiviral, que é superior de um factor de 5,6 em relação à sua actividade anti-proliferação, relativamente, ao interferão beta la, de tipo natural, marcado com his. Do mesmo modo, o mutante D exibe 6 5 % de actividade de tipo natural no ensaio antiviral, mas apenas 20 % de actividade natural no ensaio anti-proliferação e assim tem uma actividade antiviral que está aumentada de 3,4 vezes em relação à sua actividade anti-proliferação, comparada com a do tipo natural. 0 mutante DEI exibe 26 % de actividade de tipo natural, no ensaio antiviral, mas apenas 8,5 % no ensaio anti-proliferação e assim tem uma actividade antiviral que está aumentada 3,0 vezes em relação à actividade anti-proliferação comparada com o do interferão beta la, de tipo natural, marcado com his. Quando administrado numa concentração suficiente para se atingir um nível desejado de actividade antiviral, estas proteínas mutantes exibirão 64 níveis francamente menores de actividade anti-proliferativa do que a proteína de tipo natural. As mutações nessa classe, tal como, as da classe da (a) é previsível que sejam vantajosas em situações em que o benefício terapêutico da administração do interferão-beta resulta dos seus efeitos antivirais e em que os efeitos anti-proliferativos contribuem para a toxicidade ou os efeitos colaterais indesejáveis.
Quadro 3.
Mutante Actividade antiviral (AV) (% de tipo natural) Actividade Anti-proliferativa (AP) (% de tipo natural) AV/AP Cl 571 109 5,2 D 65 19 3,4 DEI 26 8,5 3,0 (c) Mutantes com actividades antivirais e anti-prolif erativas , que são baixas em relação da ligação ao receptor, quando comparadas com o interferão beta la, de tipo natural, marcado com his (ver, quadro 4 a seguir). 0 mutante AI exibe actividades antivirais e anti-proliferativas, que são 2,6 vezes e 1,8 vezes mais elevadas do que as observadas para o interferão beta la, de tipo natural, marcado com his, mas liga-se ao receptor cognato das células de Daudi com uma afinidade que é 29 vezes superior à de tipo natural. A ligação deste mutante do receptor de INF-beta, é assim aproximadamente 15 vezes comparada com as actividades antiviral e anti-proliferativa da proteína. Do mesmo modo, os mutantes B2, CD2 e DEI exibem melhores ligações em relação à actividade antiviral de 4,60, 4,6 e 18 vezes respectivamente e em relação à actividade anti-proliferação de 3,5, 15 e 54 vezes. É previsível que estas proteínas sejam úteis como antagonistas funcionais da actividade de IFN-beta endógeno e 65 possivelmente, de outros interferões endógenos do tipo I, porque têm a capacidade de se ligar e de ocupar o receptor e ainda geram apenas uma pequena fracção da resposta funcional nas células alvo, que seriam vistas com o IFN-beta, do tipo natural. QUADRO 4.
Mutante Actividade antivirai (AV) (% em peso) Actividade anti- proliterativa (AP)(% em peso) Actividade de ligação da célula (% em peso) Ligação/AV Ligação/AP AI 200 180 2900 15 16 B2 7,1 9 2 33 4,6 3,5 CD2 150 46 690 4,6 15 DEI 26 8,5 460 18 54 G. Relação da muteína com a estrutura tri-dimensional do interferão
Embora as estruturas cristalinas publicadas, para uma forma não glicosilada de interferão-beta de murino (T. Senda, S. Saitoh e Y. Mitsui. Refined Crystal Structure of
Recombinant Murine Interferon-β at 2,15 Ã Resolution. J. Mol. Biol. 253: 187-207 (1995)) e para o interferão-alfa-2b humano (R. Radhakrishnan, L. J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P. P Trotta, T. L. Nagabhushan e M. R. Walter. Zinc Mediated Dimer of Human Interferon-a2b Revealed by X-ray Crystallography. Structure. 4: 1453-1463 (1996)) , tenham fornecido modelos para a estrutura do polipéptido do interferão-beta humano, os requerentes resolveram recentemente a estrutura para o interferão beta la no seu estado glicosilado (M. Karpusas, M. Noite, C. B. Benton, W. Meier, W. N. Lipscomb e S. E Goelz. The Crystal Structure of Human Interferon-β at 2,2 À resolution. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 94: 11813-11818 (1997)). 66
Os resultados das análises mutacionais feitas pelos requerentes, podem ser resumidos no que respeita à estrutura 3D de interferão beta la (não apresentada aqui) . Algumas mutações criaram uma redução na actividade (reduzida a 2 a >5 vezes). As regiões mutadas correspondem a substituições dadas nos quadros 1 e 2. Os resíduos importantes para a actividade antiviral e anti-proliferativa, estão localizados na metade inferior da molécula de IFN-beta-la (painel a e b) . As mutações na metade superior da molécula, onde estão posicionados os terminais amino e carboxi, não têm efeitos nas actividades biológicas ou na ligação do receptor.
As mutações na hélice A2, no anel AB, AB2 e na hélice E, são as mais significativas nos seus efeitos na função e resultam numa redução dramática tanto na actividade como na ligação do receptor da superfície da célula. Esta região (hélice A2, anéis AB e AB2 e hélice E) corresponde ao sítio de ligação de IFNAR2, dado que nenhum destes mutantes se ligou ao IFNAR/Fc no ensaio dos requerentes.
Embora estas mutações tenham sido importantes para a ligação de IFNAR2, também afectam a ligação da célula, as propriedades da ligação da superfície da célula e também são influenciadas pelos resíduos noutras regiões da molécula (hélice Bl, hélice C2) . Pode ver-se nos modelos em 3D (não apresentados aqui), que apesar dos efeitos dos mutantes de substituição de alanina, que têm a terminação N, a terminação C e as regiões em hélice C glicosiladas da molécula do IFN-beta-la, elas não estão dentro do sítio de ligação do receptor. As mutações nestas regiões não reduziram a actividade biológica nem reduziram a ligação do receptor da superfície da célula. 67 EXEMPLO 2: Preparação e caracterização do interferão beta la conjugado A. Preparação do interferão tratado com polietileno-glicol
Diluiu-se um produto intermédio a granel de interferão beta la, não formulado (vendido como AVONEX®) a 250 pg/mL no seio de fosfato de sódio 100 mM, a pH 7,2, NaCl 200 mM), com um volume igual de MES 100 mM e ajustou-se o pH para 5,0 com HC1. Carregou-se a amostra numa coluna de SP-Sefarose® FF (Pharmacia, Piscataway, NJ) , a 6 mg de interferão beta la/mL de resina. Lavou-se a coluna com fosfato de sódio 5 mM, a pH 5,5, NaCl 75 mM e eluiu-se o produto com fosfato de sódio 30 mM, a pH 6,0, NaCl 600 mM. Analisaram-se as fracções da eluição para determinar os seus valores de absorvência a 280 nm e estimou-se a concentração de interferão nas amostras a partir da absorvência, utilizando um coeficiente de extinção de 1,51 para 1 mg/mL de solução.
Adicionou-se, a uma solução de 1 mg/mL do interferão beta la do produto eluído de SP, fosfato de sódio 0,5 M, a pH 6,0, a cianoboro-hidreto de sódio 50 mM (Aldrich, Milwaukee, WI) , adicionou-se a aldeído-PEG 20 K (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) a 5 mg/mL. Incubou-se a amostra à temperatura ambiente, durante 20 horas. Purificou-se o interferão tratado com polietileno-glicol a partir dos produtos da reacção, por etapas de cromatografia sequenciais numa coluna de dimensionamento de Superose® 6 FPLC (Pharmacia), com uma fase sólida de fosfato de sódio 5 mM, a pH 5,5, NaCl 150 mM e SP-Sepharose® FF. A coluna de dimensionamento resultou numa separação da linha base do interferão-beta modificado E não modificado (cromatógrafo não apresentado aqui). Diluiu-se o conjunto dos produtos da diluição contendo PEG-interferão- 68 beta a partir da filtração do gel, para uma diluição com água de 1:1 e carregou-se a 2 mg de interferão-beta/mL de resina numa coluna de SP-Sepharose®. Lavou-se a coluna com fosfato de sódio 5 mM, a pH 5,5, NaCl 75 mM e depois eluiu-se o interferão-beta tratada com polietileno-glicol a partir da coluna, com fosfato de sódio 5 mM, a pH 5,5, NaCl 800 mM, Analisaram-se as fracções da eluição para avaliar o teor de proteína por absorvência a 280 nm, A concentração do interferão tratado com polietileno-glicol está referida como equivalentes de interferão, porque a parte de PEG não contribui para a absorvência a 280 nm. B. Caracterização bioquímica do interferão tratado com polietileno-glicol.
Analisaram-se as amostras para avaliar o grau de modificação por meio de EGPA-SDS (não apresentado aqui). A adição simples de PEG resultou numa deslocação da massa aparente do interferão de 20kDa a 55 kDa que foi rapidamente evidente após a análise. Na amostra tratada com polietileno-glicol não havia evidência de interferão beta la não modificado nem de formas de massa mais elevadas resultantes da presença de grupos adicionais de PEG. A presença de um único PEG foi verificada por espectrometria de massa de MALDI. A especificidade da reacção de tratamento com polietileno-glicol, foi avaliada pelo mapeamento do péptido. Foi feita a digestão de alíquotas de 20 pg de interferão beta la tratado com polietileno-glicol e bão modificado, como um controlo, no seio de 240 pL de Tris HC1 200 mM, a pH 9,0, EDTA 1 mM, com 1,5 pg de endoproteinase de lisilo da Achromobacter (Wako Bioproducts, Richmond, VA), durante 3-4 horas, a 27 °C. Adicionou-se a cada amostra 200 mg HC1 de guanidina e fraccionaram-se os produtos de clivagem numa 69 coluna Vydac C4 (0,46 X 25 cm) utilizando um gradiente de 0 a 70 % de acetonitrilo, no seio de TFA a 0,1 %, durante 30 minutos, a uma taxa de fluxo de 1,4 mL/minuto. Controlou-se o efluente da coluna para a absorvência a 214 nm.
Os resultados das análises estão indicados na figura 6. Todos os péptidos previsto a partir do produto da digestão da endoproteinase Lis-C do interfgerão-beta-la foram identificados por sequenciação da terminação N e espectometria de massa destes, apenas o péptido que continha a terminação do interferão (AP8) foi alterado pela modificação como é evidente pelo seu desaparecimento do mapa. Os dados do mapeamento indicam por isso que a parte PEG está ligada especificamente a este péptido. Os dados indicam mais que a modificação de PEG é verificada na terminação N da proteína dado que apenas a modificação da terminação N resultará na perda específica deste péptido.
Uma evidência adicional para esta conclusão foi obtida, isolando o péptido do terminal N tratado com polietileno-glicol a partir do produto da digestão da endoprotainase Lis-C, fazendo a digestão do péptido ainda com brometo de cianogénio (CNBr) e submetendo esta amostra a uma análise da sequência da diminuição da fonte após a ionização da desabsorção a laser assistida da matriz (MALDI PSD). A digestão com CNBr do péptido de terminação N, vai ainda clivar este péptido em dois fragmentos, a parte de PEG contendo a terminação de metionina (Ml) e SYNLLGFLQR (resíduos 2-11 na sequência madura de interferão-beta). As análises de sequências identificaram o péptido não modificado SYNLLGFLQR, que era o resultado previsto deste tratamento. A actividade antiviral das amostras de interferão beta 70 la foi ensaiada em células do carcinoma do pulmão humano (células A549) que foram expostas a vírus de encefalo-miocardite (EMC) utilizando os processos envolvendo os corante de MTT sublinhados antes. Em resumo, fez-se um pré-tratamento das células A549, durante 24 horas, com interferão beta la ou com interferão beta la modificado por PEG (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5, 31,25, 50, 33,3, 22,2, 14,8, 9,9, 6,6, 4,39 pg/mL) antes da infecção com o vírus. Realizou-se o ensaio utilizando pontos de dados em duplicado para cada concentração de interferão beta la. Os desvios padrão estão indicados como barras de erros na figura 7. A concentração do interferão beta la (formulado ou a granel), que ofereceu uma morte virai de 50 % (o "efeito citopático de 50 %") (DO450 máxima a 50 %) , foi de cerca de 11 pg/mL e o efeito citopático a 50 % para o interferão beta la modificado por PEG foi de cerca de 11 pg/mL. Assim, a concentração com PEG não altera a actividade antiviral do interferão beta la. Neste ensaio, os requerentes verificaram por rotina, que a actividade específica do interferão beta la é cerca de 10 vezes maior do que a actividade específica do interferão beta lb e, por isso, o interferão beta la tratado com polietileno-glicol é significativamente mais activo do que qualquer produto de interferão beta lb. 0 interferão beta la foi também tratado com polietileno-glicol, com uma parte de PEG-aldeído de 5 K, que foi comprado à Fluka, Inc. (Cat. N° . 75936, Ronkonkoma, NY) , seguindo o mesmo protocolo que se descreveu para a modificação com PEG-aldeído 20 K, excepto no facto da reacção conter 2 mg/mL do PEG 5 K. A modificação com PEG 5 K, foi altamente específica para a terminação N e não alterou a actividade antiviral do interferão beta la. Tal como o sal de adição 20 K, o interferão beta la tratado com PEG 5 K não se distinguia do 71 interferão beta la não modificado no ensaio antiviral. EXEMPLO 3: 0 tratamento com PEG protege o interferão beta la da agregação induzida por pressão A agregação do interferão beta tem um efeito prejudicial na actividade. Previamente, os requerentes mostraram que a glicosilação tem um efeito dramático na estabilidade do interferão beta la versus as formas não glicosiladas do interferão-beta e inferiram que a glicosilação contribui para uma actividade específica mais elevada do interferão beta la (Runkel L. et al, Pharm. Res. 15: 641-649) . Para investigar se a conjugação com o polímero de polialquileno-glicol pode estabilizar mais o interferão-beta, os requerentes submeteram o interferão beta la tratado com PEG a um choque térmico, utilizando o seguinte protocolo:
Realizou-se a desnaturação térmica utilizando um espectrómetro visível de UV CARY 3, ligado a um computador controlado, e a um suporte de uma cuvete aquecida termo-electricamente. Equilibraram-se as soluções de interferão beta la em HEPES 20 mM, a pH 7,5, NaCl 20 mM, a 25 °C, numa cuvete 1 mL. A temperatura do suporte da cuvete foi então aumentada de 25 °C para 80 °C, a uma velocidade de 2 °C/minuto e a desnaturação da proteína foi seguida por uma monitorização contínua da absorvência a 280 nm. 0 ponto médio do evento cooperativo não dobrado, Tm, foi obtido a partir das curvas de fusão, determinando a temperatura à qual a absorvência medida estava a meio caminho dos valores definidos pelas linhas extrapoladas das regiões lineares de cada lado das transições cooperativas não dobradas. 72
Os resultados destas análises estão indicados na figura 8. Enquanto no interferão beta la não tratado com PEG, desnaturado e agregado com um ponto de transição de 50 %, a 60 °C, não houve evidência de agregação do interferão tratado com PEG mesmo a 80 °C. Numa análise independente, os requerentes estenderam o tratamento de pressão térmica para 95 °C e mesmo a uma temperatura mais elevada e não viram evidência de agregação. Assim, a conjugação com este polímero de polietileno-glicol tem um efeito profundo e benéfico na estabilidade da proteína. Vê-se uma estabilização similar com interferão beta la modificado contendo o PEG 20 K e de 5 K.
EXEMPLO 4. Medição da actividade antiviral do interferão beta la no plasma de ratos tratados com interferão beta la e interferão beta la tratado com PEG
Injectaram-se ratos (C57B1/6) i. v. através da veia da cauda ao mesmo tempo que se davam 50.000 unidades de interferão beta la ou 50.000 unidades de interferão beta la tratado com PEG, contendo o PEG 20 K ou um volume igual de tampão de fosfato dado como um controlo. Obteve-se o sangue destes ratos por via de hemorragias retro-orbitais em diferentes momentos, após a injecção (imediatamente, 0,25, 1, 4, 24 e 48 horas). Estas amostras de plasma foram então ensaiadas em ensaios antivirais.
As amostras de plasma foram diluídas numa diluição de 1:10 num meio isento de soro e passaram através de um filtro de seringa de 0,2 pm. Ensaiaram-se as amostras diluídas em ensaios antivirais. Titularam-se as amostras em tubos designados de uma placa de cultura de tecido de 96 tubos, contendo células A549. As diluições do interferão beta la padrão (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 e 0,6 U/mL) e de quarto 73 amostras de plasma, que foram ensaiadas em cada placa. As células A549 foram pré-tratadas com amostras de plasma diluído, durante 24 horas, antes da infecção com um vírus de EMC. No seguimento de um período de incubação de 2 dias com o vírus, coraram-se as células viáveis com uma solução de MTT (a 5 mg/niL em tampão de fosfato) , durante 1 hora, lavou-se com tampão de fosfato e solubilizou-se com HC1 1,2 N no seio de isopropanol. Leram-se os tubos a 450 nm. Traçaram-se curvas padrão para cada placa e utilizaram-se para determinar a actividade do com interferão beta la em cada amostra de ensaio. A actividade das amostras dos diferentes ratos, estão desenhadas em função do tempo na figura 9. A perda mais lenta de interferão beta la tratado com PEG na circulação, em função do tempo, indica que o semi-período de vida da amostra tratada com PEG é muito mais longe do controlo do interferão beta la não tratado. Enquanto o controlo tinha desaparecido praticamente passadas 4 horas, detectou-se uma fracção significativa do produto tratado com PEG após 48 horas. Com base nos níveis iniciais de actividade no soro e os que permaneceram após 4 8 horas, os requerentes inferiram que o semi-período de vida do interferão tratado com PEG fica prolongado quando comparado com o semi-período de vida de interf erão beta la não purificado. Uma segunda verificação altamente significativa deste estudo, foi que muito pouco ou nada de formas tratadas com PEG foi perdida durante a fase de distribuição, tal como foi evidenciado pelos níveis altos semelhantes de actividade no momento 0 e passados 60 minutos. Os dados indicam que, ao contrário do interferão beta la de controlo, a distribuição do produto tratado com PEG está largamente limitada à vasculatura. 74 EXEMPLO 5: Farmacocinética e farmacodinâmica comparativas em primatas (protocolos gerais)
Realizaram-se estudos comparativos com conjugados de polímero-interferão beta la e interferão beta la natural (sob a forma de interferão beta la intermédio, a granel, não formulado, no seio de fosfato de sódio e NaCl, a pH 7,2) para determinar a sua estabilidade relativa e actividade em primatas. Nestes estudos, comparam-se a farmacocinética e a farmacodinâmica do conjugado de polímero-interferão beta la com as do interferão beta la natural e podem fazer-se extrapolações razoáveis em relação aos seres humanos.
Animais e processos
Concepção do estudo
Trata-se de um grupo paralelo, de um estudo com doses repetidas, para avaliar, comparativamente, a farmacocinética e a farmacodinâmica de interferão beta la conjugado e não conjugado.
Utilizaram-se, para este estudo, primatas saudáveis (preferencialmente, macacos Rhesus). Antes da dosagem, todos os animais foram avaliados quanto aos seus sinais de saúde e de doença, por um veterinário de um laboratório de animais, em duas ocasiões, num prazo de 14 dias antes da administração do produto de ensaio; uma das avaliações deve ser feita no prazo de 24 horas antes da primeira administração do produto de ensaio. Apenas os animais saudáveis irão receber o produto do ensaio. As avaliações incluirão um exame físico geral e colheitas de sangue pré-doses para fixar a patologia clínica básica e o nível básico de anticorpos do interferão beta la. 75
Pesaram-se todos os animais e registaram-se as temperaturas do corpo 24 horas antes das administrações dos produtos do ensaio.
Doze indivíduos foram incluídos em grupos para receber 1 UM/kg de interferão beta la, sob a forma de conjugado de PEG-interferão beta la ou não conjugado mas de qualquer modo idêntico ao interferão beta la. A administração é feita quer pelas via subcutânea (SC) ou pela intra\^enosa (IV) . Todos os animais devem ser "virgens" em relação aos tratamentos com interf erão beta. Deu-se uma dose a cada animal, em duas ocasiões; as doses foram separadas de quatro semanas. 0 volume da dose será de 1,0 mL/kg. 0 sangue é separado para análise farmacocinética em vários períodos de tempo, no seguimento de cada injecção. As amostras de sangue para as medições do marcador de resposta biológica induzida por interferão, neopterina do soro, são também recolhidas no seguimento da administração do fármaco do estudo.
As avaliações durante o período do estudo incluem observações clínicas realizadas 30 minutos e 1 hora após a dose para avaliar os sinais de toxicidade. Realizaram-se todos os dias observações das gaiolas e da aparência geral, sinais de toxicidade, desconforto e alterações no comportamento e tudo foi registado. Os pesos do corpo e as temperaturas do corpo foram registados a intervalos regulares durante 21 dias após a dose. Métodos de ensaio
Quantificaram-se os níveis de interferão beta no soro, 76 utilizando um ensaio de efeito citopático (ECP). As medições do ensaio de ECP medem os níveis de actividade antiviral mediada pelo interferão. 0 nível de actividade antiviral nas amostras reflecte o número de moléculas de interferão activo contido nessa amostra, no momento em que o sangue foi colhido. Esta abordagem tem sido o método-padrão para avaliar a farmacocinética do interferão-beta. 0 ensaio de ECP utilizado no presente estudo, detecta a capacidade do interferão beta para proteger as células de carcinoma humano do pulmão (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD), a partir da toxicidade devida ao vírus de encefalomiocardite (EMC). Faz-se uma pré-incubação das células durante 15 a 20 horas com amostras de soro, para permitir a indução e a síntese de proteínas indutíveis por interferão, que produzem então uma resposta antiviral. Depois de se ter adicionado o vírus EMC e de se ter feito a incubação durante mais 30 horas antes, faz-se a avaliação da toxicidade utilizando um corante violeta de cristal. Faz-se ao mesmo tempo um ensaio de um padrão interno de interferão-beta, assim como, um padrão interno de conjugado de PEG, com amostras em cada placa de ensaio. Faz-se a calibração deste padrão em função de um padrão de referência de interferão de fibroblasto humano natural (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53) . Cada placa de ensaio também inclui poços de controlo do crescimento das células não contendo interferão beta de nenhuma espécie nem EMC e poços de controlo do vírus contendo células e EMC, mas não contendo interferão beta. As placas de controlo contendo o padrão e as amostras são também preparadas de forma a determinar o efeito, se houver algum, das amostras no crescimento das células. Faz-se a coloração destas placas sem a adição de vírus. 77
As amostras e os padrões são ensaiados em duplicado em cada uma das duas das placas de ensaio replicadas, originando quatro recolha de dados por amostra. Regista-se a média geométrica da concentração dos quatro replicados. 0 limite de detecção neste ensaio é de 10 unidades (U)/mL.
As concentrações da neopterina no soro são determinadas numa unidade farmacológica clínica utilizando ensaios disponíveis comercialmente.
Farmacocinêtica e métodos estatísticos
Utiliza-se o programa informático RstripTM (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT) para ajustar os dados a modelos farmacocinéticos. Desenham-se, num gráfico, as médias geométricas das concentrações, em função do tempo, para cada grupo. Dado que os resultados do ensaio estão expressos como as médias geométricas das diluições, considera-se que as médias geométricas são mais apropriadas do que as médias aritméticas. Os níveis de interferão no soro são ajustados para os valores de base e as concentrações no soro não detectáveis são consideradas como 5 U/mL, o que representa metade do limite inferior de detecção.
Para os dados de infusão IV, ajusta-se o modelo de infusão IV de dois compartimentos, para as concentrações no soro detectáveis para cada indivíduo e ajustam-se os dados de SC a um modelo de injecção de dois compartimentos.
Calculam-se os parâmetros farmacocinéticos que se seguem: (i) pico da concentração observado, Cmax (U/mL) ; 78 (ii) área sob a curva de 0 a 48 horas, ASC utilizando a regra trapezoidal; (iii) eliminação do semi-período de vida; e, a partir dos dados da infusão IV (se se utilizar IV): (iv) distribuição do semi-período de vida (h); (v) purificação (mL/h); (vi) volume aparente de distribuição, (Vd (L).
Utiliza-se o programa informático WinNonlin (Scientific Consulting Inc., Apex, NC) para calcular as eliminações dos semi-períodos de vida após as injecções SC e IM.
Para a neopterina, apresentam-se as médias aritméticas em função do tempo, para cada grupo. Calcula-se também Emax, a alteração máxima em relação à linha de base. Submete-se C^x, ASC e Emax a uma análise de variância de uma via para comparar os grupos de dosagem. Cmax e ASC são transformados logaritmicamente antes da análise. Registam-se as médias geométricas. EXEMPLO 6: Avaliação comparativa do interferão beta la tratado com PEG e a farmacocinética do interferão beta la em macacos Rhesus
Materiais e processos
Administrou-se interferão beta la ou IFN beta la tratado com PEG a macacos Rhesus no dia 1 e novamente no dia 29, pelas vias intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) , tal como descrito no protocolo geral do exemplo 5. No dia 1, seis macacos receberam IFN beta la (3 por cada via) e outros seis 79 macacos receberam IFN beta la tratado com PEG (3 por cada via) . No dia 29, repetiram-se as doses. A dose IV foi administrada como uma injecção lenta numa veia cefálica ou na safena. A dose SC foi administrada sob a pele, nas costas, depois de se ter barbeado o sítio da injecção. Recolheu-se o sangue por via da veia femoral em períodos de tempo especificados e deixou-se coagular para se obter um soro. Analisou-se o soro quanto aos níveis das substâncias funcionais de fármaco utilizando um processo de ECP validado sob o ponto de vista antiviral e, para a neopterina do soro os níveis de beta2-microglobulina como medidas da actividade farmacodinâmica. Os parâmetros farmacológicos foram calculados utilizando a versão 2.0 do programa informático WinNonlin (Scientific Consulting Inc., Apex, NC).
Os dados da concentração foram analisados por processos independentes do modelo-padrão (análise não compartimentai), para se obter os parâmetros farmacocinéticos. Calculou-se a área sob a curva (ASC) utilizando a regra trapezoidal. Realizaram-se as análises estatísticas, incluindo a média aritmética e o desvio padrão, utilizando a versão 5.0 do programa informático Excel da Microsoft (Microsoft Corp., Redmond WA). Os valores da concentração referidos como limites abaixo da quantificação (limites LAQ) não foram utilizados na análise farmacocinética. Devido ao facto de que computadores diferentes e programas de computadores diferentes arredondam ou truncam os números de forma diferente, os valores nalguns dos quadros (por exemplo, médias, desvios- padrão ou valores individuais) podem diferir ligeiramente de outros noutros quadros, a partir de dados calculados individualmente ou a partir de dados da análise 80 estatística. Nem a integridade nem a interpretação dos dados ficam afectadas por estas diferenças.
Resultados e discussão
Dentro de cada via de administração, o IFN beta la tratado com polietileno-glicol, exibiu uma disponibilidade maior (quando medida pela área sob a curva de concentração de soro em função do tempo) . Além disso, o IFN beta la tratado com PEG tinha uma biodisponibilidade absoluta mais elevada, quando comparada com a do IFN beta la, quando administrado por via SC. Os requerentes resumiram os parâmetros farmacocinéticos no quadro 5. A administração de IFN beta la tratado com PEG, tanto pela via IV como pela via SC, resulta num aumento do semi-período de vida, assim como, da ASC de IFN beta la. QUADRO 5: Média (+ desvio-padrão) Parâmetros farmacocinéticos de BG9418 no seguimento da administração por via IV ou SC (dose 1) de 1 UM/kg de IFN b la ou IFN b la tratado com PEG a macacos Rhesusd
Formulação (via. de a dmrnistraçSo) Cmax ASC U*hr/vaL CL (roL/kg) Ves (mL/kq) 1:1/2 IFN-b-1" (IV) 6400 ( + 0) 0,083 (+0) 4 453 (+799) 229 (+38) 543 (+147) 3,2 (_♦_]., 4 ) JFN-b-la tratado corr. PEG (IV) J.C 800 ( + 3 811) 0,083 (+0) 34 373 (+5 601) 29 (+3) 250 (+30) 9,5 (+2,1.) — IFN-b-ía (SC) 211 (+75) 5,3 (+1,2) 4 758 (+3 170) N/A N/A 10,0 (±2.9) IFN·b-la tratado com PEG (SC) 1 08C (+381) 3,3 (+1,2) 42 283 (+5 934) N/A N/A 22,0 ó*_3,4) an=3
No seguimento da administração IV da primeira dose, as concentrações médias ( + desvio padrão) no soro do pico (Cmax) de IFN beta la e IFN beta la tratado com PEG, foram de 6 400 (+0) e de 10 800 (+3,5) U/mL, respectivamente. Os valores médios de ASC ( + desvio-padrão) foram de 4 4 53 ( + 799) e de 81 34 373 (+3 601) U*h/mL, respectivamente. No seguimento da primeira administração SC, o Cmax médio ( + desvio-padrão) de IFN beta la e IFN beta la tratado com PEG, foram de 277 (+75) e 1 080 (+381) U/mL, respectivamente. Os valores médios da ASC (+ desvio-padrão) foram de 4 753 (+ 3 170) e de 44 952 (+ 1 443) U*hr/mL, respectivamente.
Avaliaram-se tanto os níveis de neopterina no soro, como os de beta-2-microglobulina após o tratamento com IFN-beta e IFN beta tratado com polietioleno-glicol, indicando a actividade farmacológica dos produtos. Com doses elevadas dos compostos de ensaios utilizados, não houve diferença na actividade farmacológica de IFN beta la e IFN beta la tratado com PEG, em nenhuma das vias de administração (dados não indicados). EXEMPLO 7: Avaliação comparativa do interferão beta la tratado com peg e da farmacocinética do interferão beta la em ratos, seguindo várias vias de administração
Administração 0 objectivo deste estudo foi determinar a biodisponibilidade comparativa do interferão beta la e do interferão beta la tratado com PEG, por várias vias de administração.
Materiais e Processos
Utilizaram-se ratos-fêmeas Lewis (190 gramas cada) para as análises farmacocinéticas com dois ratos por via/ formulação. Introduziu-se uma cânula na jugular dos ratos e administrou-se, a cada um deles, quer interferão beta la 82 humano, quer interferão beta la humano tratado com PEG de 5K ou interferão beta la humano de 20 K (num veículo consistindo em 14 mg/mL de HSA, no seio de fosfato de sódio 50 mM, NaCl 100 mM, a pH 7,2), por via intravenosa, intraperitoneal, oral, subcutânea ou intra-traqueal. Tratou-se o sangue, várias vezes, durante um período de 72 horas aos 0,5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 75 minutos, 3 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas. Apresenta-se o protocolo no quadro 6. O bio-ensaio do efeito citopático (ECP) foi realizado em amostras de soro para detectar o interferão beta no soro. Os resultados gerados com interferão beta la não modificado e interferão beta la tratado com polietileno-glicol (PEG 20 K) , estão apresentados no quadro 7. Em todos os casos, o tratamento com PEG resultou em aumentos significativos em ti/2 e ASC. 83 QUADRO 6
QUADRO 7
Parâmetros farmacocinéticos no seguimento da administração de interferão beta la (IFN) Por Via IV, SC, IP ou IT e IFN beta la tratado com PEG (IFN-PEG) em ratos
Formulação (via de administração) Cmax Tmax ASC/Dose (U hr)/(mL ug) Tl/2 (hr) IFN (IV, dose de 20 ug) 64000 0,25 3035 1,25 IFN-PEG (IV, dose de 3 ug) 23970 0, 08 47728 8,44 IFN (SC, dose de 20 ug) 2400 1,00 464,4 0, 96 IFN-PEG (SC, dose de 3 ug) 2400 7,00 14688 11,9 IFN (IP, dose de 20 ug) 26000 1,25 4159 1,53 IFN-PEG (IP, dose de 3 ug) 9700 1,25 52148 16,2 84 IFN ' IT, dose de 15 ug) 240 1,5 70,7 1,29 IFN-E EG (IT, dose de 15 ug) 270 7,0 2,3 3 f b 6,21 EXEMPLO 8: Efeitos anti-angiogénicos do interferão beta la conjugado com polímero: avaliação da capacidade do interferão beta la tratado com PEG para inibir a proliferação in vitro das células endoteliais
Mantiveram-se em cultura células endoteliais venosas humanas (Cell Systems, Cat. #2VO-P75) e células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (Cell Systems, Cat.# 2M1-C25) com um estojo do meio CS-C (Cell Systems, Cat. # 4Z0-500). Vinte quatro horas antes da experiência fez-se a tripsinização das células, voltaram a suspender-se em meio de ensaio, M199 a 90 % e soro bovino fetal (SBF) a 10 % e ajustou-se para a densidade de células desejada. As células foram então colocadas em placas revestidas com gelatina, placas com 24 ou 96 poços, à razão de, respectivamente, 12 500 células/poço ou 2 000 células/poço.
Depois da incubação, durante a noite, substituiu-se o meio de ensaio por meio fresco contendo 20 ng/mL de factor de crescimento de fibroblasto, básico, recombinante, humano (Becton Dickinson, Cat.# 40060) e prepararam-se várias concentrações de proteínas de interferão beta Ia, conjugado e não conjugado, ou controlo positivo (pode-se utilizar como controlo positivo a endostatina como se pode utilizar um anticorpo de bFGF). 0 volume final é ajustado para 0,5 mL nas placas de 24 poços ou 0,2 mL em placas de 96 poços.
Passadas setenta e duas horas, as células são tripsinizadas para a contagem por Coulter, congeladas para a leitura da fluorescência CyQuant ou marcadas com [3H]timidina. A inibição, in vitro, da proliferação das 85 células endoteliais por meio de interferão beta la conjugado e não conjugado são comparáveis, indicando que o tratamento com PEG não interferiu com a capacidade do interferão para funcionar neste conjunto.
Estes ensaios, in vitro, analisam as moléculas de interferão beta humano da presente invenção no que respeita aos efeitos na proliferação de células endoteliais que podem ser indicativos de efeitos anti-angiogénicos, in vivo. Ver, 0'Reilly, M. S., T. Boehm, Y. Shing, N. Fukal, G. Vasios, W. Lane, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen e J. Folkman. (1997) . Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogensis and Tumor Growth. Cell 88, 277-285. EXEMPLO 9: Modelo in vivo para ensaiar os efeitos anti-angiogénicos e de neovascularização do interferão beta la conjugado
Desenvolveu-se uma variedade de modelos para ensaiar os efeitos anti-angiogénicos e anti-neovascularização das moléculas aqui descritas. Alguns destes modelos já tinham sido descritos nas patentes de invenção norte-americanas 5 733 876 (31 de Março de 1998: "Method of inhibiting angiogenesis) e 5.135.919 (4 de Agosto de 1992: "Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis"). Outros ensaios incluem o ensaio da membrana corioalantóica sem revestimento (MCA) de S. Taylor e J. Folkman; Nature, 297, 307 (1982) e R. Crum. S. Szabo e J. Folkman; Science. 230. 1375 (1985) ; um modelo anti-angiogénese do processo do saco de ar dorsal do rato de Folkman, J. et al.; J. Exp. Med., 133, 275 (1971) e o ensaio da microbolsa córnea do rato de Gimbrone, Μ. A. Jr. et al., J. Natl. Câncer Inst. 52, 413 (1974) em que se induz a 86 vascularização da córnea em ratos machos adultos da estirpe Sprague-Dawley (Charles River, Japão) por meio da implantação de 500 ng de FGF básico (bovino, R & D Systems, Inc.) , impregnado de EVA (copolímero de acetato de etileno-vinilo) em pérolas, em cada córnea.
Outros processos de ensaio de interferão-beta de murino tratado com PEG para avaliar os efeitos anti-angiogénicos num modelo animal incluem (mas não se limitam) a protocolos para o rastreio de novos agentes potenciais anti-cancro, tal como descrito no original de Câncer Chemotherapy Reports, Part 3, Vol. 3, No. 2, September 1972 and the supplement In Vivo Câncer Models, 1976-1982, NIH Publication No. 84-2635, Fevereiro de 1984.
Por causa das barreiras das espécies dos interferões do tipo I, para avaliar a actividade anti-angiogénica do interferão-beta conjugado com o polímero, em modelos de roedores, geraram-se preparações de interferão beta de roedor conjugado com polímeros. Esses processos de rastreio estão exemplificados num protocolo de ensaio para os efeitos anti-angiogénicos, do interf erão beta de murino tratado com PEG, no carcinoma do pulmão de Lewis, implantados subcutaneamente.
Origem da linha de tumor:
Apareceu espontaneamente em 1951 como o carcinoma do pulmão em ratos C57BL/6.
Resumo dos processos de ensaio:
Implanta-se um fragmento de tumor, subcutaneamente, na região axilar de um rato B6D2F1. Administra-se o agente de 87 ensaio (isto é, um interferão tratado com PEG da presente invenção), em várias doses, subcutaneamente (SC) ou intraperitonealmente (IP), em vários dias, no seguimento da implantação do tumor. 0 parâmetro medido é o tempo médio de sobrevivência. Os resultados estão expressos como uma percentagem de tempo de sobrevivência do controlo.
Animais:
Propagação: Ratos C57BL/6 Ensaio: Ratos B6D2F1.
Peso: Os ratos devem ter entre 3 g de peso com um mínimo de peso de 18 g para os machos e 17 g para as fêmeas. Género: Utiliza-se só um género para todos os ensaios e animais de controlo numa experiência.
Fonte: Uma fonte, se possível, para todos os animais de uma experiência.
Dimensão da experiência:
Dez animais por cada grupo de ensaio.
Transferência do tumor: PROPAGAÇÃO:
Fragmento: Prepara-se um fragmento de 2-4 mm de um tumor de um dador s.c.
Tempo: 13-15 dias. Sítio: Implante do fragmento s.c. na região axilar com uma picada na região inguinal. 88 ENSAIO:
Fragmento: Prepara-se um fragmento de 2-4 mm de um tumor de um dador s.c.
Tempo: 13-15 dias. Sítio: Implante do fragmento s.c. na região axilar com uma picada na região inguinal.
Esquema de ensaio:
Dia 0: Dia 1: Dia 2 : Dia 5: Dia 14 Dia 48 Dia 60
Implante do tumor. Realização das culturas bacterianas. Composto do controlo positivo de ensaio em cada uma das experiências. Preparação dos materiais. Registo diário de mortes.
Verificação das culturas. Eliminação dos elementos da experiência se contaminados. Aleatorização dos animais. Tratamento conforme instruções (no dia 1 e nos dias seguintes).
Mova verificação das culturas. Eliminação das experiências se contaminadas.
Peso do dia 2 e dia da avaliação inicial da toxicidade do agente de ensaio.
Controlo das mortes precoces do dia.
Controlo do dia da não ingestão.
Final e avaliação da experiência. Exame grosseiro dos pulmões para avaliar o tumor.
Controlo de qualidade:
Agendou-se a administração do composto de controlo positivo (NSC 26271 (citoxano numa dose de 100 mg/kg/injecção)) em cada uma das experiências enumeradas, o regime para o qual é intraperitonial apenas no dia 1. 0 89 limite inferior do ensaio/controlo para o controlo positivo é de 14 0 %. O tempo médio de sobrevivência do controlo não tratado aceitável é de 19-35,6 dias.
Avaliação: O parâmetro medido é o tempo médio de sobrevivência, os pesos médios do corpo do animal para os dias 1 e 5, o tratamento em computador da relação ensaio/controlo para todos os grupos de ensaio. Os pesos corporais médios do animal para os dias de permanência e o dia da avaliação final são tratados em computador. A relação ensaio/controlo é tratada em computador para todos os grupos do ensaio com > 65 % de sobreviventes no dia 5. Um valor da relação ensaio/controlo > 86 % indica toxicidade. Uma diferença de alteração do peso do corpo excessiva (controlo menos ensaio) pode ser utilizada como uma avaliação da toxicidade.
Critérios para a actividade:
Considera-se necessária uma relação inicial dos compostos de ensaio/controlo maior ou igual a 140 %, para demonstrar uma actividade moderada. Um valor da relação composto de ensaio/controlo reprodutível maior ou igual a 150 %, é considerado como actividade significativa.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Biogen Idec MA Inc. < 120> Conjugados de polímero de interferão beta la e as suas utilizações 90 < 13 0 > Ρ2 8 S 4 5 Ερ - D1 - PCT < 14 0 > EP060Q3415.4 <141 > 1999-10-15 < 15 0 > 99970609.6 <151 > 1999-1.0-15 < 15 0 > 60/104 .. 572 <151 > 1998-10-16 <150> 60/120 161 < 1 3 1 X1, 1999-02-16 < 16 0 > 4 0 <170> Patentln ver. 3 < 210 > 1 < 211 > 549 <212> ADN < 213 > Mus sp. < 4 υ 0 > 1 <210 > 2 < 211 > 183 < 212 > < 213 > Mus sp. Λ Ο Ο V 9 <210 > 3 <211> 6 0 91 < 212 > ADN < 213 > Hemo sapiens < 4 00 > 3 t t.ctccg gno s.c qa q ati qa caaqa l qaqc. l acaac ti ’ic] c tuggat <210 > 4 < 211 > 3 9 <212> ADN < 213 > Homo sapiens A O O V 4 gccgctc gag ttatcagttt cggaggtaac ctgtaagtc 3 9 < 210 > <211> 3 5 <212 > ADN < 213 > Homo sapiens Λ O O V agcttco ggg ggccatcatc atcatcatca fcagct O CT <210> 6 < 211 > 3 5 < 212 > ADN < 213 > Homo sapiens < 4 00 > /· O ccggagc t a c gatgatigat g atgatggccc c c gg a :· ·:: a C a ei a q .¾ cl q C Ò 0 92
< 21 Ο >< 211 > <212> ADN 87 O ~3 -2. Home sapiens : 4 0 0 > 7 :210> 8 : 211 > 6 0 ; 212 > ADN : 213 > Home sapiens A O O 8 3. L C ’13 C] C cl cl L·’· Cl C ogcctgo gctgccctcc : 210 > 3 :211> 52 : 212 > ADM : 213 > Home sapiens A O O τφ 3 •octcaa gga cagqatgaac tfctgacatcc : 2 10 > 10 :211> 7 6 - .2 -!. o ADN ; 213 > Home sapiens : 4 0 0 > 10 : 210 > 11 :211> 76 : 212 > ADN : 213 > Home sapiens jcc 11 ojaa tgggagg act 60 jaqat taageaqctg ca 93 11 <400 > < 210 > 12
<211> 51 <212 > ADN < 21.3 > Homo sapiens Λ Ο Ο V 12 aaktgaaí :gg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaaotfc < 210 > 13 <211> 4 3 < 212 > ADN < 21.3 > Homo sapiens < 4 0 0 > 13 t ccctçfar. jga gaktgctgca gctgcagctt kcgctgcagc t.ga 43 < 2 1 0 > 14 < 211 > 7 8 < 212 > ADN < ^ 2, 2:· > Homo sapiens < 4 0 0 > 14 <210> 15 <211 > 78 < 212 > ADN < 213 > Homo sapiens Α Ο ο V 15 < 210 > 16 < 211 > < 212 > ADN 94 < 21.3 > Homo sapiens < 4 00 > 16 < 21 0 > 1 7 < 211 > "7 0 < 212 > ADH <213> Homo sapiens Λ O o v ; η <210 > 18 < 211 > 44 < 212 > ADM < 213 > Homo sapiens < 4 0 0 > 18 ctagctgcaa aactggctgc agctgatttc accaggggaa aact < 21 0 > 19 < 211 > 69 < 212 > ADH Homo sapiens <400 > 19 <210> 2 0 < 211 > 51 < 212 > ADN < 213 > Homo sapiens < 4 0 0 > 2 0 t ai" 1 at gcscja goal tcacjca < r a c c V- a a a o' CjCcaaiCsgagl dctcdcdcto l 51 95 < 21 0 > 21 < 211 > 76 < 212 > ADN < 2 jl 3 > Home sapiens <400 > 21
eatgagcagt ctgcacctga aâagatãtta tggggcaatt gctgcatacc tggcagccaa 60 ggagtictca cactgt ?B < 210 > O ·"> < 211 > < Σ ± á > ADN < 213 > Homo sapiens Λ o o V 22 eatgagcagt ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccge 60 tgcatactça cactgtgcct ggacgat S? <210 > 2 3 < 211 > 87 < 212 > ADN < 213 > Homo sapiens A O o V 2 3 eatgagcagt ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggcaaa 60 ggagtacgct gcatgtgcct ggacgat S? < 210 > 24 < 211 > 50 < 2 .12 > ADN < 213 > Homo sapiens 96 <400> 24
cgtcagagct qaaat <210> 25
<212> PR
mt. ser Tyr· Asm teu teu 1 S
Gly Phe Leu Gin Arg ser ser 10'
Ase Phe Gin 15
Cys Gin Lys teu Leu Trp Gin Leu asr Gly Arg teu Glu Tyr cys Leu 20 25 30
Lys Asp Ara mt Asn Phe Asp xle Pro Gly Glu Ile Lys Gin Leu Gin 35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr ile Tyr Glu «et Leu g!« 50 55 60
Aso lie Phe Ala lie Phe Arg Gin Asp Ser ser ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80
Glu Thr ile Vai Glu A$n Leu Leu Ala Asn Vai Tyr His Gin lie Asn 85 95
His teu Lys Thr vai teu Glu Glu tys teu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110
Arg Gly Lys teu Met Ser Ser teu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125
He t|u hís Tyr teu Lys Ala Lys Glu ryr ser «is cys Ala Trp Thr
Xle Val Arg Vai Glu lie Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 14S 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Asn 0> 26 <211> 166
2 > PRT <213> Home saciens 97 <400> 26 «et 1 Ala Tyr Ala Ala S Leu Gly Ala Leu Gin 10 Ala Ser Ser Asn phe IS Gin Cys Gin Lys teu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 cys Leu Lys ASp Arg «et Asn Phe Asp Xle Pro Glu Glu xle Lys Gin Leu Gin 35 40 4¾ Gire phe Gin Lys Glu ASp Ala Ala Leu Thr xle W Glu «et Leu Glf? SO 55 60 Asn xle Phe Ala Ile Phe Arg Gin ASp ser ser ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Vai Gl u Asn Leu Leu Ala Asn Vai Tyr His Gin Ile Asn 85 00 05 Bis Lêu Lys Thr vai Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu «et Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr tyr Gly Arg 115 120 125 lie Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 ile vai Arg vai Glu xle Lêli Arg Asn Phe Tyr Phe xle Asn Arg Leu 14 S ISO 155 160 Thr Gly Tyr teu Arg Asn 165
<210> 27 <211> 166 < 212> PRT <2i3> Komo sapiens <400> 27
Net Ser Tyr Asn Leu Leu Gly teu Arg Ser ser A$n Ala Ala 1 S 10 15
Cys Ata Ata Leu Leu Ala Ala Leu Asn <Sly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30
Lys Asp Arg Asn phe asp £le Pro Glu ile tys Gin Leu Gin 5 < 210 > 28 < 211> 166 98 40
< 212 > PRT <213> Homo saoiens < 4 00 > 2 8
3S
Gin Phe Gin Lys Gly Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gin SG SS 60 as» ile Fhe Ala xle Fhe Arg Gin Asp ser ser ser Thr Gly xrp aso 65 70 75 80
Gly Thr lia Vai Gly Asn Leu Leu Ala Asn vai Tyr Nis Gin lie Aso B5 30 35 Hís Leu Lys Thr vai Leu Glu Glu Lys Leu Gly Lys Gly Asp Phe Thr 100 105 110
Lys Leu «et Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 120 125 lie teu hís ryr Leu Lys Ala lvs Glu Tyr Ser His tys Ala Trp Thr 130 135 140 ile Vai Arg Vai Glu Ile Leu Arg Aso The Tyr Phe lie Asn Arg Leu 145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165
<210> 29 < 211> 16 6 < 212 > PRT <213> Homo saoiens <400> 29 99 «et Ser Tvr Asn teu 1 5 Cvs Gin Lys Leu Leu 20 Ala Asp Arg Met Asn SS Gin f*h« Gin Lys Glu 50
Leu Gly Phe Leu
Trp Gin Leu Asn 25
Gin Arg ser ser Asn Phe Gin 10 15 Gly Arg Ala Ala Ala Cys Ala
Phe Asp ile Pro Glu Glu rle Lys Gin Leu Gin 40 4!
Asp Ala Ala Leu SS
Asn ile Phe Ala Xle Phe Arg Gin Asp 65 70 Asm Leu teu Ala
Glu Thr lie Vai Glu SS Bis Leu Lys Thr Vai 100 Arg Gly Lys Leu Met 115 xle teu Hls Tyr teu 130 1¼ vai Arg vai Glu 145
Leu Glu Glu Lys 105 ser ser Leu His 120 Lys Ala Lys Glu 135 xle Leu Arg aso 150
Thr xle Tjjr Glu_ «et Leu Gin ser ser ser Thr Gly Trp Asn /5 go Asn vai Tyr hIs Gin xle Asn 90 95 Leu Glu Lys çiu asd Phe Thr 110 Leu Lys Arg yyr Tyr Arg 125 Tyr ser His cys Ala Trp Thr 140 p^e phe xle Asn Arg Leu 1,5:5 180
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Λ ÍO t--â O V 3 0 < 211 > 166 < A 12 > PRT <213 > Komo Λ tfLa O o V 30 100
«et ser Tyr A$rs teu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin * 5 10 IS
Cys Gin Lys teu Leu Trp Glrs Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu 20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp xle Pro Glu Glu xle Ala Ala Ala Ala 35 40 45
Ala Phe Ala Ala Ala Asp Ala Ala Leu Thr lie Tyr Glu Met Leu Gin 50 £5 60
Asn ile Phe Ala xle Phe Arg g'1 « asp ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 BQ
Glu Thr xle vai Glu Asn Leu Leu Ala Asn Vai Tyr His Gin Xle Asn 85 90 95
His Leu tys Thr vai Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 HO
Lys teu Met ser ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Ârg AÍS y 115 120 125 -ia jey hís Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr ser His cys Ala Trp Thr Ϊ30 135 140
<210 > 31 . ο Ί 1 '> 166 < vi Á -J- " < 212 > PRT < 213 > Homo sapiens <4 v0 -*' 31 101 fiei*" ser "Tyr A$n teu Leu Gly Phe teu 61n Arg Ser Ser Asn Phe Gin 1 5 10 is
Cys Gin tys teu Leu Trp Gin teu Asn Gly Arg teu Glu Tyr cys Leu 20 25 30 tys As» Arg Met Asn Phe Asp ile Pro Gly Gly n@ tys Gin teu Gin 35 40 . 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ale Ais Leu Thr ile Tyr Glu «et teu Ala 50 55 60
Asn xle Ala Sêf xle Phe Arg Gin Asp Ser Ser ser Thr Gly Trp asr 65 20 75 80
Glu Thr xle Vai Glu Asn Leu Leu Ala Asn Vai Tyr His Gin xle Asn 85 90 95
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Thr Gly Tyr teu Arg Asn 16¾
<210> 32 <211> 166 < 212 > PRT <213> Home sapiens <400> 32 102 mi Ser Tyr 1 cys Gin Lys
Lys asp arg * 35 Gin Phe Gin 50 Asn lie Phe 65 Glu Thr ile
His Leu Lys
Arg Gly Lys 115 lie teu His 130 Xle vai Arg 145
Asn Leu Leu Glv Phe Leu Gin Arg ser ser Asn Phe Gin S 10 15 teu Lêu Trp Gin Leu asíí Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu 20 25 30
Mst Asn Phe Asp ile pro Glu Glu rle lvs Gin teu Gin 40 45*
Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr ile Tyr Glu Met Leu Gin 55 60
Ala ile Phe Ala Ala Ala Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 70 75 80
Vai Glu Asn Leu Leu Ala Asn Vai Tyr His Gin lie Asn 85 90 95
Thr vai Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110
Leu Met Ser Ser teu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 120 125
Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr ser His Cys Ala tra Thr 135 140 val Glu xle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe ile Asn Arg Leu ISO 153 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165
<210> 33 <211> 166 <212> PRT <213 > Horac sapiens <400> 33 103
Met ser Tyr Asn Leu teu Gly Phe i 5
Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu 20
Lys asd Arg net Asn Phe asp lie 3S 40
Gin Pise Gin Lys Glu Asp Ala Ala SO 55
Asn lie Phe Ala ile nhe Arg Gin 65 70
Ala ser xle vai Ala Ala Leu Leu S$
His teu Lys Thr vai Leu Glu Glu 100
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu 115 120
He leu hís xyr Leu Lys Ala Lys 130 135 xl« vai Arg vai Glu He Leu Arg 145 150
Thr Gly Tyr teu Arg Asn 165
Leu Gin Arg ser Ser Asn Phe Gin 10 IS
Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu 25 30
Pro Glu Glu lie Lys Gin Leu Gin 45
Leu Thr lie Tyr Glu fêet Leu Gin 60
Asp Ser Ser ser Thr Gly rrp Asn 75 80
Ser Asn Vai Tyr His Gin ile Asn 90 95
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 105 110
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 12 S
Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 140
Asn Phe Tyr phe lie Asn Arg Leu 155 160
<210> 34 < 211> 166 <212 > PRT <213> Home sapiens <400> 34 104
Het Ser Tyr asp Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin 1 5 10 IS
Cys Glr? Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu 20 25 30
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Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Ley Thr lie Tvr Gly Hat Ley Gin 50 55 60
Asn ile Phe Ala Ile Phe Arg Gin Asp ser ser ser Thr Gly Trp asp 65 70 ?$ S0
Glu Thr He vai Glu asp Leu Leu Ala Asn vai Ala His Gin lie Ala S5 90 95
His teu Ala Ala vai Ley Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110
Arg Gly uys Ley «et ser Ser Ley «Is Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 ^20 125
Xle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr' Ser his Cys Ala Trp Thr 9 130 135 140 ile vai Arg vai Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe xle asp Arg Leu 145 150 * 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165
<210> 35 < 211> 166 <212> PRT <213> Homo sapíens <400 > 35 105
Met i ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Cys Gin Lys Leu 20 teu Trp Gin Lys ASp Arg 35 ptet Asn phe ASp Gin Phe 5Θ Gin Lys Glu Asp Ala 55 Asn 65 Πβ Phe Ala ile Phe Arg 70 Glu Thr lie vai Glu 85 Asn teu His Leu Lys Thr vai 100 Leu Ala Arg Gly Lys 115 Leu Ket ser ser ile Leu 150 HiS Tyr Leu Lys Ala 135 Xle 145 Vai Arg val Glu Ile 150 Leu Thr Gly Tyr Leu Arg 165 Asn <210 > 3 6 <211 > j. 6 6 <212 > PRT <213 > Komo sap ien; 3 <400 > 3 6
Leu 61 η ΑΓδ ser ser Asn Phe Gin sr - «- ψ «· pro 61 u Ql« He L|s Gin Leu Gin
Leu Thr Ile Tyr Glu mt Leu Gin 60
Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 75 80
Ala Asii vai Tyr His Gin lie Asn 90 gs
Lys Leu Ala Ala Ala Asp phe Thr 10S no
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 1 Λ Λ ” asr Phe Tyr Phe sle Asn Arg Leu *^·* 160 106
«et ser Tyr Asn teu teu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser asei Alie Gin 1 5 10 IS
Cys Gin tys teu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg teu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 tvs A$p Arg «et Asn Phe Asp ile pro Gly Glu ile tys Gin teu Gin 35 40 45
Glrs Phe Gin tys Glu asu Ala Ala Leu Thr ile Tyr Glu «et teu Gin 50 - 55 m
Asn Ile Phe Ala ile Phe Arg Gin Asp Ser ser ser Thr Gly rrp Asn 65 70 75 §0
Glu Thr ile vai olu Asn Leu Leu Ala asei vai Tyr His Gin ile Asn
S5 90 9S
His teu tys Thr Vai teu Glu Glu tys teu Glu tys Glu Ala Ala Thr 100 105 110
Ala Gly Lys Ala «et ser Ala Leu k1s teu tys Arg Tyr Tyr Gly Arg 11$ 120 12S
Ile teu His Tyr leu tys Ala Lys Glu Tyr ser His cys Ala rrp Thr 130 135 140 160 145 150
Ile Vai Arg vai Glu ile teu Arg Asn Phe Tyr Phe ile Asn Arg teu <210> 37 1> 166 <212> PR' i> Home sapiens <400> 37 107
Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe 1 5
Cys G|n Lys teu Leu Trp Gin Leu
Lys Asp Arg Net Asm Phe Asp He 35 40
Olf? Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala S0 55
Asn lie Phe Ala lie Phe Arg Glm 65 7Q
Gly rhr ile vai gIu-asr Leu Leu 85
His Leu Lys Thr vai Leu Glu Glu 100
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Thr Gly Tyr Leu Arg Asa
Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin 10 15
Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu 25 30 pro Glu Glu ile lys Gin Leu Gin 45
Leu Thr lie T^r Glu Het Leu Gin
Asp ser ser ser Thr Gly Trp Asn 75
Ala A$n vai Tyr His Gin He Asn 90
Lys Leu Glu Lys Glu asp Phe Thr 105 110
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Ala
Glu Tyr ser His cys Ala Trp Thr 140
Asn Phe Tvr Phe lie Asm Arg Leu 155 160
<210> 38 <211> 166 <212> PRT <213> Home saoiens <400 > 38
Leu Gin Arg Ser 10 Asn Gly Arg teu 25 ΡΓΟ GlU Glu He Leu rhr Os Tyr 60 Asp ser ser Ser 7S
Ser Asn pne uin Glu Tyr cys Leu 30 Lys Gln Leu Gln 45 Glu Net teu Gin rhr Gly Trp asp 80 ser ryr Asn Leu Leu <*1y 1 5 cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu 20
Lys Asp Arg Asn Phe Asp *1* 35 40
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala 50 55
Asn He Phe Ala He Phe Arg Gin 65 70 108
Glu Thr ile vai Glu Asn Leu teu Ala aso vai Tyr His Gin ιΊ« aso SS 90 9S
His Leu tys Thr Vai Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu ASp Phe Thr 100 10$ no
Ara Gly Lys Leu mt ser Ser teu His Leu Lys Arg Tyr Tyr sly Arg 1ÍS 120 12$
Ile Leu His Tyr teu Lys Ala Ala Ala Tyr Ser His tys Ala Trp Thr 130 135 140 ile vai Arg vai Glu lie Leu Arg Asn Phe Tvr Phe Ile aso Arg Leu 145 150 155 160
Thr C ;ly Tyr Leu Ar| aso < 21 0 > 3 9 < 211 > 166 <212> PRT <213> Hoino sapiens < 4 0 0 > 3 9
Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg ser ser Asn phe Λ Vt Gin 1 5 10 15 Cys g1 n Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asm Gly Arg l«u Glu Tyr cys Leu 20 25 JU Lys ASP Arg 3$ Het Asn Phe Asp Ile 40 pro Glu Glu H® Lys 4$ Gin i Leu Gin Gin phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr ile Tyr Glu Met Leu Gin 50 SS 60 Asn 6$ xle phe Ala He Phe 70 Arg Gin Asp Ser Ser 75 ser Thr Gly Trp Asn 80 Glu Thr He val Glu SS Asrt teu Leu Ala Asn 90 Val Tyr His Gin He 95 Asn His Leu Lys Thr 100 Val Leu Gl u Glu Lys 105 Leu Glu Glu ASp 110 Phe Thr Arg Gly Lys 115 Leu Ser Ser Leu 120 Hf S Leu Lys Arg Tyr 12 S Tyr Gly Arg He Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala 135 Lys Glu Tyr Ala J40 Cys Ala Trp Thr He 145 val Arg Vai Glu ile ISO Leu Arg Asn Phe Tyr 1SS phe Ile Asn Arg Leu 260
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 109 < 2 J. 0 > 4 0 < 211 > 16 6 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400 > 4 0 Met Ser tyr Asn Leu Leu oi y 1 5 Cys Gin Lys teu 20 teu Trp Gl n Lys asp Arg 35 Met Asn Phe Asp oln Phe Gin Lys Glu Asp Ala 50 55 ASO ile phe Ala 11 e Phe Arg 65 70 Glu Thr Ile val Glu Asn Leu S5 HÍS teu Lys Thr val Leu Glu 100 Arg Gly L|| teu Met Ser Ser xle Leu HÍS Tyr Leu Lys Ala 130 135 Xle Vai Arg Ala Glu ile teu 145 ISO Thr Gly Tyr teu Arg Asn 165
Leu Gin Arg ser ser Am Phe Gin 10 15
Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys teu 25 30
Pro Glu Gly xle Lys gin Leu sln
Leu Thr lie Tyr Glu Met teu Gin 60 asp Ser ser ser Thr Gly Trp Asn 75 βΟ
Ala Asn Vai Tyr His Gin He Asn 90 95
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 105 110
Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 140
Asn Phe Ala Phe lie Ala Arg teu 155 160
Lisboa, 14 de Fevereiro de 2 1

Claims (26)

  1. REINVINDICAÇÕES 1. Composição, caracterizada pelo facto de compreender um interferão beta la ou uma proteína de fusão que compreende o interferão beta la, caracterizada pelo facto de o interferão beta la consiste na sequência de aminoãcidos: MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKE DAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKL EKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINR LTGYLRN, e em que o interferão beta la está acoplado a um polímero de ocorrência não natural, numa extremidade com a terminação N do referido interferão beta la, em que o acoplamento entre o interferão beta la e o referido polímero pode obter-se utilizando um processo de alquilação redutora e em que o referido polímero contém um radical de polialquileno-glicol.
  2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a proteína de fusão conter uma porção de uma molécula de imunoglobulina.
  3. 3. Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o polímero ter um peso molecular entre cerca de 5 e 40 kilodalton. i
  4. 4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de conter a composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
  5. 5. Utilização da composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica.
  6. 6. Utilização da composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de se destinar ao tratamento de tumores e cancros, estados clínicos autoimunes, doenças virais ou doenças angiogênicas.
  7. 7. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de os referidos tumores e cancros serem selecionados no grupo que consiste em sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfática aguda, carcinoma da mama, melanoma ou carcinoma nasofaríngeo.
  8. 8. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de os referidos estados clínicos auto-imunes se seleccionarem no grupo que consiste em fibrose, lúpus e esclerose múltipla.
  9. 9. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de as referidas doenças virais se seleccionarem no grupo que consiste em infecção por ECM, gripe, infecções virais do tracto respiratório, raiva e hepatite.
  10. 10. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, referidas doenças as caracterizada pelo facto de angiogénicas se seleccionarem no grupo que consiste em retinopatia diabética, retinopatia dos prematuros, degeneração macular, rejeição de enxertos da córnea, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentais, rubeose e síndrome de Osler-Webber.
  11. 11. Composição caracterizada pelo facto de compreender um mutante de interferão beta la ou uma proteína de fusão que compreende um mutante do interferão beta la, em que o mutante do interferão beta la consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada entre (i) MAYAALGALQA5SNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPFFIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (ii) MSYNLLGFLQRSSNAACAALLAALNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (i i i) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRAAACAADRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (iv) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRAAFAIPAEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFRGALMSSLHLKRYYGRELHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRN FYRINRLTGYLRN, (v) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIAA AAAFAAADAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK 3 TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (vi) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLANIASIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (vii) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFAAASSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVL E E KL E KE D FIRGALMS S LHLKRYYGRILHYLΚΑΚΕYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (vi i i) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNASIVAALLSNVYHQINILK TVLEEKLEKEDFIRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (ix) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVAHQIAHLA AVLEEKLEKEDFRTGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (x) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNWAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKT VLAAKLAAADFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRN FYRINRLTGYLRN, (xi) MSYNLLGFLQR5SNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVL E E KL E KEAATAGAAMSALH L KRYYGRILHYLΚΑΚΕYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, 4 (xii) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGAIAAYLAAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYRINRLTGYLRN, (xiii) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAAAYSHCAWTIVRVEILR NFYRTNRLTGYLRN, (xiv) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRLHYLKAKEYAACAWTIVRVETGYL RN, (xv) MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQ LQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRAEILA NFARIARLTGYLRN, e em que o mutante do interferão beta la está acoplado a um polímero simples de ocorrência não natural, na terminação N do referido mutante do interferão beta la, em que o acoplamento entre o mutante do interferão beta la e o referido polímero se podem obter utilizando um processo de alquilação redutora e em que o referido polímero contém uma parte de polialquileno-glicol.
  12. 12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo facto de a proteína de fusão conter uma porção de uma molécula de imunoglobulina. 5
  13. 13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender a composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 11 a 12.
  14. 14. Processo in vitro para prolongar a actividade do interferão beta la num sistema in vitro, caracterizado pelo facto de compreender o acoplamento do referido interferão beta la, na extremidade da terminação N, com uma parte de polímero simples de ocorrência não natural, utilizando um processo de alquilação redutora para se obter uma composição de polímero e interferão beta la acoplados e a introdução da composição de polímero e interferão beta la acoplados num sistema in vitro, compreendendo a referida parte de polímero de ocorrência não natural, um radical de polialquileno-glicol.
  15. 15. Utilização de um radical de polímero de ocorrência não natural, para se obter uma composição de polímero, acoplada com interferão beta la, tal como definido em uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica, compreendendo o referido radical de polímero de ocorrência não natural, que contém um radical de polialquileno-glicol.
  16. 16. Utilização da composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para inibir a angiogénese num indivíduo.
  17. 17. Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 2, 11 e 12, caracterizada pelo facto de o polímero ser polietileno-glicol. 6
  18. 18 . Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 2, 11, 12 e 17, caracterizada pelo facto de o polímero ter um peso molecular entre 10 000 e 40 000 dalton.
  19. 19 . Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo facto de o polímero ter um peso molecular de 20 000 dalton.
  20. 20 . Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de se utilizar no tratamento de tumores e cancros, estados clínicos autoimunes, doenças virais ou doenças angiogénicas.
  21. 21 . Composição para se utilizar de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de os referidos tumores e cancros se seleccionarem no grupo que consiste em sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfática aguda, carcinoma da mama, melanoma ou carcinoma nasofaríngeo.
  22. 22 . Composição para se utilizar de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de os referidos estados clínicos autoimunes se seleccionarem no grupo que consiste em fibrose, lúpus e esclerose múltipla.
  23. 23 , Composição para se utilizar de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de as referidas doenças virais se seleccionarem no grupo que consiste em infecção por ECM, gripe, infecções virais do tracto respiratório, raiva e hepatite. 7
  24. 24. Composição para se utilizar de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de as referidas doenças angiogénicas se seleccionarem no grupo que consiste em retinopatia diabética, retinopatia dos prematuros, degeneração macular, rejeição de enxertos da córnea, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentais, rubeose e síndrome de Osler-Webber.
  25. 25. Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de se utilizar no tratamento de esclerose múltipla.
  26. 26. Utilização da composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de esclerose múltipla. Lisboa, 14 de Fevereiro de 2014.
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