BR9915542B1 - composição compreendendo um interferon-beta-1a glicosilado, composição farmacêutica compreendendo a mesma e processo in vitro de prolongar a atividade do interferon-beta-1a em um sistema in vitro. - Google Patents

composição compreendendo um interferon-beta-1a glicosilado, composição farmacêutica compreendendo a mesma e processo in vitro de prolongar a atividade do interferon-beta-1a em um sistema in vitro.

Info

Publication number
BR9915542B1
BR9915542B1 BRPI9915542A BR9915542A BR9915542B1 BR 9915542 B1 BR9915542 B1 BR 9915542B1 BR PI9915542 A BRPI9915542 A BR PI9915542A BR 9915542 A BR9915542 A BR 9915542A BR 9915542 B1 BR9915542 B1 BR 9915542B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
interferon
beta
ifn
seq
polymer
Prior art date
Application number
BRPI9915542A
Other languages
English (en)
Other versions
BRPI9915542C1 (pt
BR9915542A (pt
BR9915542B8 (pt
Inventor
Adrian Whitty
Blake Pepinsky
Laura Runkel
Margot Brickelmaier
Paula Hochman
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Biogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26801696&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BR9915542(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Inc, Biogen Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of BR9915542A publication Critical patent/BR9915542A/pt
Publication of BR9915542B1 publication Critical patent/BR9915542B1/pt
Publication of BR9915542B8 publication Critical patent/BR9915542B8/pt
Publication of BRPI9915542C1 publication Critical patent/BRPI9915542C1/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Abstract

patente de invenção: <b>"conjugados de polímero de interferon beta-1a e usos"<d>. um polipeptídeo de interferon beta que compreende interferon-beta-1a acoplado a um polímero que contém um grupamento polialquileno glicol em que o interferon-beta-1a e o grupamento polialquileno glicol estão dispostos tal que o interferon-beta-1a tenha uma atividade melhorada em relação a uma outra forma terapêutica de interferon beta (interferon-beta-1b) e não exiba decréscimo de atividade comparado ao interferon-beta-1a não conjugado. os conjugados da invenção são utilmente empregados em aplicações de terapia assim como em de não terapia, por exemplo, diagnósticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM INTERFERON-BETA-1A GLICOSILADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO A MESMA E PROCESSO IN VITRO DE PROLONGAR A ATIVIDADE DO INTERFERON-BETA-1A EM UM SISTEMA IN VITRO".
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O uso de polipeptídeos e de proteínas para o tratamento sistêmico de doenças específicas é agora bem aceito em prática de medicina. O papel que estas substâncias representam em terapia é tão importante que muitas atividades de pesquisa estão sendo dirigidas para a síntese de grandes quantidades de tecnologia de DNA recombinante. Muitos destes polipeptídeos são moléculas endógenas que são muito potentes e específicas para provocarem suas ações biológicas.
Um fator principal que limita a utilidade destas substâncias proteiná-ceas para a sua aplicação pretendida é que, quando fornecida parenteralmente, elas são eliminadas do corpo dentro de um curto período de tempo. Isto pode o-correr como um resultado do metabolismo por proteases ou por eliminação usando roteiros normais para a eliminação de proteína tal como por filtração pelos rins. A via oral de administração destas substâncias é ainda mais problemática porque além da proteólise no estômago, a alta acidez do estômago destrói as mesmas antes que elas alcancem seu tecido alvo pretendido. Os problemas associados com estas vias de administração de proteínas são bem conhecidos na indústria farmacêutica e várias estratégias estão sendo usadas na tentativas de resolvê-los.
Foi publicado um grande número de trabalhos que tratam de estabilização de proteínas. São conhecidas várias maneiras de conjugar proteínas com materiais poliméricos, inclusive o uso de dextranos, de polivinil pir-rolidonas, de glicopeptídeos, de polietileno glicol e de poliamino ácidos. É relatado que os polipeptídeos conjugados resultantes mantêm suas atividades biológicas e solubilidade em água para aplicações parenterais.
Uma família de peptídeos que foi o foco de muito trabalho clínico e de esforços para melhorar a sua administração e a sua bioassimilação, consiste nos interferons. Os interferons foram testados em uma variedade de estados clínicos de doença. O uso de interferon beta humano, um membro daquela família é melhor estabelecido no tratamento de esclerose múlti- pia. Duas formas de interferon beta recombinante foram recentemente licenciadas na Europa e nos EUA para o tratamento desta doença. Uma forma é o interferon-beta-1a (marca registrada e comercializada como AVONEX R, mfg. Biogen, Inc., Cambridge, MA) e aqui a seguir, "interferon-beta-1 a" ou "IFN-beta-1a" ou IF-3-1a", usados intercambiavelmente. A outra forma é in-terferon-beta-1 b (marca registrada e comercializada como BETASERON R, Berlex, Richmond, CA), daqui por diante, "interferon-beta-1 b". O interferon-beta-1 a é produzido em células de mamíferos que usam a seqüência de gene humano natural e é glicosilado, enquanto que o interferon-beta-1 b é produzido em bactérias E. coli usando uma seqüência de gene humano modificado que contém uma substituição geneticamente engenheirada de cisteí-na-a-serina na posição 17 do aminoácido e não é glicosilado.
Anteriormente, foram comparadas diretamente as potências relativas in vitro de interferon-beta-1 a e interferon-beta-1 b em ensaios funcionais e mostraram que a atividade específica de interferon-beta-1 a é aproximadamente 10 vezes maior do que a atividade específica de interferon-beta-1 b (Runkel e outros, 1998, Pharm. Res. 15: 641-649). Pelos estudos projetados para identificar a base estrutural para estas diferenças de atividade, foi identificada glicosilação como a única das diferenças estruturais conhecidas entre os produtos que afetaram a atividade específica. O efeito do carboidrato foi manifesto amplamente através de seu papel de estabilizador sobre a estrutura. O efeito estabilizador do carboidrato foi evidente em experimentos de desnaturação térmica e em análise SEC. A falta de glicosilação também estava correlacionada a um aumento em agregação e uma maior sensibilidade a desnaturação térmica. A remoção enzimática do carboidrato do interferon-beta-1 a com PNGase F causou precipitação extensiva do produto desglicosilado.
Estes estudos indicam que, apesar da conservação em seqüência entre o interferon-beta-1 a e o interferon-beta-1 b, estes são entidades bioquímicas distintas e portanto muito do que é sabido a respeito do interfe-ron-beta-1b não pode ser aplicado ao interferon-beta-1 a e vice-versa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Foram exploradas as vantagens de interferon-beta glicosilado em relação a formas não glicosiladas. Em particular, foi desenvolvida uma composição interferon-beta-1a com maior atividade em relação a interferon-beta-1ab e que também tem as propriedades saudáveis de proteínas PE-Guiladas em geral sem perda eficaz em atividade comparado às formas de interferon-beta-1a que não são conjugadas. Assim, se forem feitas modificações de uma tal maneira que os produtos (conjugados de polímero-interfe-ron-beta-1a) mantenham todas ou a maior parte de suas atividades biológicas, podem resultar as propriedades a seguir: farmacocinética alterada e farmacodinâmica que conduz a maior meia-vida e alterações na distribuição de tecido (por exemplo capacidade de permanecer na vasculatura durante períodos de tempo mais longos), maior estabilidade em solução, imunogeni-cidade reduzida, proteção contra digestão proteolítica e subsequente abolição de atividade. Uma tal formulação é um avanço substancial nas técnicas farmacêutica e médica e faria uma significativa contribuição ao controle de várias doenças em que o interferon tem alguma utilidade, tais como esclero-se múltipla, fibrose e outras doenças inflamatórias ou auto-imunes, cânce-res, hepatite e outras doenças virais. Em particular, a capacidade de permanecer durante mais longos períodos de tempo na vasculatura permite que o interferon beta 1a seja usado para inibir angiogênese e potencialmente cruzar a barreira de sangue-cérebro. Além disso, a estabilidade térmica ganha pela criação de conjugados de polímero-interferon-beta-la é uma vantagem quando se formula o interferon-beta-1a em forma de pó para uso em administração subsequente via inalação.
Usou-se nosso conhecimento da estrutura cristalográfica de in-terferon-beta-1a e desenvolveu-se um conjugado de interferon-beta-1a -polímero em que o polímero está ligado àquele (s) sítio (s) de interferon-beta-1a para permitir que o conjugado mantenha atividade completa do in-terferon-beta-1a comparado ao interferon-beta-1 a que não está conjugado.
Um aspecto da invenção é um complexo de interferon-beta-1 a conjugado em que o interferon-beta-1 a está ligado covalentemente a um polímero que incorpora como uma parte integral do mesmo um polialquileno glicol.
Em um aspecto em particular, a presente invenção refere-se a uma composição de interferon-beta-1a que compreende interferon-beta-1 a fisiologicamente ativo acoplado com um polímero que compreende uma porção polialquileno qlicol em que o interferon-beta-1 a e a porção polialquileno glicol estão dispostos de tal forma que o interferon-beta-1 a fisiologicamente ativo na composição tenha uma meia-vida melhorada em relação ao interferon-beta-1 a sozinho (isto é, em uma forma não conjugada desprovida do polímero acoplado ao mesmo).
Um outro aspecto da invenção é uma composição de interferon-beta-1 a que compreende o interferon-beta-1 a fisiologicamente ativo acoplado com um polímero em que o interferon-beta-1 a é uma proteína de fusão, de preferência uma imunoglobina de fusão. Em um tal complexo, a proximidade íntima do terminal N (sítio de conjugação com polímero) e o terminal C (sítio de fusão com a porção Ig) sugere que a conjugação de polímero pode reduzir a imunogenicidade da proteína de fusão.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição interferon-beta-1 a fisiologicamente ativa que compreende o interferon-beta-1 a fisiologicamente ativo acoplado com um polímero que compreende uma porção polialquileno glicol em que as porções interferon-beta-1 a e polialquileno glicol estão dispostas de tal forma que o interferon-beta-1 a fisiologicamente ativo na composição tenha uma atividade melhorada em relação ao interferon-beta-1 b sozinho (isto é, em uma forma não conjugada desprovida do polímero acoplado à mesma).
Uma outra modalidade da invenção é uma proteína interferon- 1 beta-1 a conjugada cuja porção interferon-beta-1 a foi mutada para fornecer para muteínas com atividade antiviral e/ou antiproliferativa seletivamente melhorada em relação às formas não mutadas de interferon-beta-1 a. A invenção refere-se em um outro aspecto a um complexo de interferon-beta-1 a estável, solúvel em água, conjugado que compreende um interferon-beta-1 a fisiologicamente ativo acoplado covalentemente a uma porção polietileno glicol fisiologicamente compatível. Em tal complexo, o interferon-beta-1 a pode estar acoplado covalentemente à porção polietileno glicol fisiologicamente compatível por uma ligação covalente lábil a um grupo aminoácido livre do interferon-beta-1 a, em que a ligação covalente lábil é separada in vivo por hidrólise bioquímica e/ou proteólise.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma forma de dosagem que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e um complexo de interferon-beta-1 a estável, solúvel em água que compreende interferon-beta acoplado a um polietileno glicol fisiologicamente compatível.
Em um outro aspecto, as composições de interferon-beta-1 a acopladas covalentemente tais como descritas acima podem utilizar interfe-ron-beta-1a pretendido para diagnóstico ou aplicações in vitro, em que o interferon-beta-1 a é oor exemDlo um reaaente Dara diaanóstico para imuno-ensaio ou outro diagnóstico ou aplicações não in vivo. Em tais aplicações não terapêuticas, os complexos da invenção são empregados bastante utilmente como composições estabilizadas que podem por exemplo ser formuladas em solventes compatíveis ou outras formulações à base de solução para fornecer formas estáveis de composição que são de maior resistência à degradação. A modificação de interferon-beta-1 a com um polímero não tóxico pode oferecer certas vantagens. Se forem feitas modificações de uma tal maneira que os produtos (conjugados de polímero-interferon-beta-1a) mantenham todas ou a maior parte de suas atividades biológicas podem resultar as propriedades a seguir: farmacocinética e farmacodinâmica alteradas que levam à semi-vida aumentada e alterações da distribuição do tecido (por exemplo capacidade de permanecer na vasculatura por períodos de tempo mais longos) aumento na estabilidade em solução, imunogenicidade reduzida, proteção do interferon-beta-1 a modificado contra digestão proteolítica e subseqüente abolição de atividade; maior estabilidade térmica o que leva à formulação mais eficaz de interferon-beta-1 a pulverizado para uso oral ou inalado. 0 interferon-beta-1 a contemplado com propriedades melhoradas descritas acima pode ser eficaz como terapia após administração oral, aerossol ou parenteral. Outras vias de administração, tais como nasal e transdermal, também podem ser possíveis usando-se o interferon-beta-1 a modificado.
Um outro aspecto da invenção é um processo de inibição de angiogênese e de neovascularização que compreende sujeitar uma quantidade eficaz das composições da invenção. Como um resultado de aumentar o nível e a duração do interferon na vasculatura, o produto PEGuilado da invenção devia ser aproximadamente eficaz como um inibidor de angiogênese.
Em aplicações não terapêuticas (por exemplo, diagnóstico), também é considerada a conjugação de diagnóstico e/ou de espécies rea-gentes de interferon-beta. O agente conjugado resultante é resistente a fatores degradativos ambientais, inclusive processos de degradação mediados por solvente ou por solução. Como um resultado de tal resistência melhorada e estabilidade aumentada de interferon-beta-1 a, a estabilidade do dito ingrediente ativo é capaz de ser significativamente aumentada, com confiabilidade concomitante da composição contendo interferon-beta-1 a no uso final específico para o qual é empregado o mesmo.
Outros aspectos, características e modificações da invenção serão mais completamente evidentes pela divulgação a seguir e reivindicações anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Ligação de mutantes de interferon-beta-1 a substituído com alanina a um processo de fusão dimérico gue compreende o domínio extracelular da cadeia receptora de interferon do tipo I, IFNAR2/lg (ectodomínio IFNAR2 fundido ao domínio constante lgG1 humano).
As afinidades de ligação dos mutantes IFN substituídos com alanina (A1 - s) para a cadeia receptora IFNAR2 foram determinadas como descrito no Exemplo 1 (subseção D). O histograma apresenta suas afinidades de ligação neste ensaio relativo ao his-IFN-beta do tipo selvagem (% em peso). Os valores de % em peso calculados como a (afinidade de his-IFN-beta do tipo selvagem/afinidade de IFN-beta mutante x 100. A % em peso (O) para os experimentos individuais (n=3) e uma % em peso média (x) para o conjunto experimental são apresentados. Os mutantes A2, AB1, AB2 e E não ligaram IFNAR2/Fc às concentrações 500 vezes mais altas do que o peso de his-IFN-beta EC 50 (*).
Figura 2. Ligação de mutantes de interferon-beta-1 a substituído com alanina aos complexos de receptor da superfície da célula de interferon ("complexo IFNAR1/2") expresso em células de linfoma de Daudi Burkitt.
As propriedades de ligação dos mutantes de substituição com alanina (A1 - E) foram determinadas usando-se um ensaio de ligação de receptor da superfície da célula baseado em FACS, como descrito no Exemplo 1 (subseção D). O histograma apresenta suas afinidades de ligação de receptor neste ensaio em relação ao his-IFN-beta do tipo selvagem (% em peso). A % em peso para cada mutante foi calculada como a (afinidade de his-IFN-beta do tipo selvagem/afinidade de IFN-beta mutante x 100. Os valores de % em peso (o) para os experimentos individuais e os valores da % em peso média (x) são apresentados.
Figura 3. Atividades antivirais de mutantes de interferon-beta-1 a interferon substituídos.
As atividades antivirais dos mutantes de substituição com alanina (A1 - E) foram determinadas em células A549 humanas testadas com vírus EMC como descrito no Exemplo 1 (subseção E). O histograma apresenta suas atividades neste ensaio relativa ao his-IFN-beta do tipo selvagem (% em peso). A % em peso foi calculada como a concentração em peso de his-IFN-beta [50% cpe]/concentração de IFN-beta mutante [50% cpe] x 100. A % em peso (O) para múltiplos ensaios e a média do conjunto de dados experimentais (x) são apresentadas.
Figura 4. Atividades antiproliferativas de mutantes de interferon-beta-1 a substituídos com alanina. A atividade antiproliferativa dos mutantes de substituição de alanina (A1 - E) foi determinada em células de linfoma de Daudi Birkitt como descrito no Exemplo 1 (subseção E). 0 histograma apresenta suas atividades neste ensaio em relação ao his-IFN-beta do tipo selvagem (% em peso). A % em peso foi calculada como (concentração em peso de his-IFN-beta [50% inibição de crescimento]/concentração de mutante IFN-beta [50% inibição de crescimento] x 100. A % em peso (O) para ensaios múltiplos e a média do conjunto de dados experimentais (x) são apresentadas.
Figura 5. Atividades antiviral e antioroliferativa de mutantes de interferon-beta-1a substituído com alanina.
Foram comparadas as atividades relativas de mutantes de substituição de alanina (A1 - E) nos ensaios antiviral (eixo dos x) e de antipro-liferação (eixo dos y). As percentagens médias de his-IFN-beta do tipo selvagem (% em peso, x) apresentada nas Figuras 3 e 4 foram usadas para esta comparação. Aqueles mutantes que apresentam uma mudança de coordenada em ambas as atividades cairiam na linha vertical. Aqueles mutantes que apresenta uma mudança em atividade viral que é desproporcional à mudança na atividade de antiproliferação ficam significativamente fora da linha da diagonal (DE1, D, C1). O significado foi determinado pro consideração de desvios padrões inerentes nos valores médios de % em peso usados.
Figura 6. Localização do sito de peguilação por mapeamento do peptídeo. lnterferon-beta-1a peouilacão e não modificado foram sujeitos a análise de mapeamento do peptídeo.
As amostras foram digeridas com endoproteinase LysOC e sujeitas a HPC em fase reversa sobre uma coluna C4. A coluna foi revelada com um gradiente 0-70% de acetonitrila em ácido trifluoroacético a 0,1%. O efluente da coluna foi monitorado a 214 nm. Painel a, interferon-beta-1 a não modificado. Painela b, interferon-beta-1 a peguilação. As setas marcam a posição de eluição do peptídeos Lys da endoproteinase do terminal N de interferon-beta-1 a que contém resíduos de aminoácido 1-19.
Figura 7. Atividade antiviral de interferon-beta-1 a Conjugado e Não Conjugado. A atividade de interferon-beta-1 a ou interferon-beta-1 a PEGui- lado às concentrações indicadas no eixo do X foi avaliada em ensaios anti-virais que usam células (A549) carcinoma de pulmão humano testadas com vírus da encefalomiocardite. Após uma incubação de dois dias com vírus, as células viáveis foram coradas com MTT, as placas foram lidas a 450 nm e a absorbância que é o reflexo da viabilidade da célula é apresentada no eixo dos X. Os desvios padrão são apresentados como barras de erro. A concentração de interferon-beta-1a ou de interferon-beta-1a PEGuilado que ofereceu 50% de eliminação viral (o "efeito citopático de 50%") (OD 450 máximo 50%) foi aproximadamente 11 pg/ml e o efeito citopático de 50% de interferon-beta-1a PEGuilado era aproximadamente 11 pg/ml.
Figura 8. Avaliação da estabilização de conjugados usando desnaturação térmica. lnterferon-beta-1a PEGuilado e interferon-beta-1a de controle não tratado em HEPES 20 mM pH 7,5, NaCI 20 mM foram aquecidos a taxas fixas de 1 grau/minuto. A desnaturação foi seguida por monitoração de mudanças de absorbância a 280 nm. (a) interferon-beta-1 a não modificado (b) interferon-beta-1 a PEGuilado.
Figura 9. Medidas de atividade antiviral do interferon-beta no plasma de ca-mundongos tratados com interferon-beta-1 a ou com interferon-beta-1 a PEGuilado.
Os camundongos foram injetados iv com 50.000 Unidades de interferon-beta-1 a ou com 50.000 Unidades de interferon-beta-1 a PEGuilado (contendo 20 K PEG). O sangue proveniente destes camundongos é obtido por sangramentos retro-orbitais a várias ocasiões após injeção de in-terferon como indicado no eixo do X. Há pelo menos 3 camundongos sangrados em cada ponto do tempo e o plasma é preparado e congelado até que a atividade do interferon-beta com o tempo fosse avaliada em ensaios antivirais usando-se células (A549) de carcinoma humano do pulmão com vírus da encefalomiocardite. As células viáveis foram coradas com uma solução de MTT, as placas foram lidas a 450 nm, para determinar a absorbância que é o reflexo da viabilidade da célula e da atividade do interferon-beta. Foram geradas curvas padrão para cada placa usando-se interferon-beta-1 a e usadas para determinar a quantidade de atividade de interferon-beta em cada amostra. São apresentados os dados provenientes dos animais individuais.
Figura 10, Sequência completa de DNA de gene do interferon beta direcionado à histidina e seu produto de proteína. São apresentados o DNA completo (SEQ ID N°. 1) e as seqüên-cias de proteína (SEQ ID N°. 2) âo IFN-beta-1a direcionado a histidina. A seqüência de sinal VCAM-1 clivada deixa 3 resíduos amino terminais (Ser-GlyGly) a montante da ponta de histidina (Hísq, posições 4-9). A seqüência de ligação da enteroquinase (AspAspAspAspLys) é separada da ponta de histidina por um espaçador (posições 10-12, SerSerGIy). A seqüência de proteína IFN-BETA-1a natural atravessa as posições (Met18-Asn183). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições Como usado neste caso, o termo "acoplado covalentemente" significa que as porções especificadas são ligados covalentemente diretamente um ao outro ou então estão associados covalentemente indiretamente um ao outro por uma porção ou porções que intervém, tais como uma ponte, um espaçador ou uma porção ou porções de ligação.
Interferon - Um "interferon" (também denominado "IFN") é um pequeno polipeptídeo de cadeia simples, espécies-específicas, produzido por células de mamíferos em resposta à exposição a uma variedade de indutores tais como vírus, polipeptídeos, mitógenos e similares. O interferon mais preferido usado na invenção é interferon-beta humano, glicosado que é glicosado no resíduo 80 (Asn 80) e que é de preferência derivado por tecnologias de DNA recombinante. Este interferon-beta glicosado preferido é chamado "interferon-beta-1a" ou "IFN-beta-1a" ou "IFN-p-1a" ou "interferon beta 1a" ou "interferon-p-1a" todos usados intercambiavelmente. O termo "interferon-beta-1a" também significa que abrange mutantes dos mesmos (por exemplo, Exemplo 1), contanto que tais mutantes também sejam glico-silados no resíduo 80 (Asn 80). São conhecidos métodos de DNA recombinante para produzir proteínas, inclusive interferons. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.399.216, 5.149.636, 5.179.017 (Axel e outros) e 4.470.461 (Kaufman).
Os polinucleotídeos do interferon-beta-1a preferidos que podem ser usados nos presentes métodos da invenção são derivados das sequências de gene do interferon beta do tipo selvagem de vários vertebrados, de preferência mamíferos e são obtidos usando métodos que são bem conhecidos daqueles versados na técnica tais como os métodos descritos nas Patentes U.S. a seguir: Patente U.S. 5.641.656 (concedida em 24 de junho de 1997: DNA encoding avian type I interferon proprotein and mature avian type I interferon), Patente U.S. 5.605.688 (25 de fevereiro de 1997 - recom-binant dog and horse type I interferons); Patente U.S. 5.231.176 (27 de julho de 1993, DNA molecule encoding a human leukocyte interferon); Patente U.S. 5.071.761 (10 de dezembro de 1991), DNA sequence coding for sub-sequences of human lymphoblastoid interferons LylFN-alpha-2 and LylFN-alpha-3); Patente U.S. 4.970.161 (13 de novembro de 1990, DNA sequence coding for human interferon-gamma); Patente U.S. 4.738.931 (19 de abril de 1988, DNA containing a human interferon beta gene); Patente U.S. 4.695.543 (22 de setembro de 1987, human alpha-interferon Gx-1 gene) e Patente U.S. 4.456.748 (26 de junho de 1984, DNA coding sub-sequences of different, naturally, ocurring leukocyte interferons).
Os mutantes de interferon-beta-1a podem ser usados de acordo com esta invenção. São desenvolvidas mutações que usam métodos convencionais de mutagênese dirigida, conhecida dos versados na técnica. Além disso, a invenção fornece polinucleotídeos de interferon-beta-1 a equivalentes funcionalmente que codificam para polipeptídeos de interferon-beta-1 a funcionalmente equivalentes.
Um primeiro polinucleotídeo que codifica interferon-beta-1 a é "funcionalmente equivalente" comparado com um segundo polinucleotídeo que codifica o interferon-beta-1 a se este satisfizer pelo menos uma das condições a seguir: (a): o "funcionalmente equivalente" é um primeiro polinucleotídeo que se hibridiza ao segundo polinucleotídeo sob condições padroniza- das de hibridização e/ou é degenerada até a primeira seqüência de nucleo-tídeo. Mais preferivelmente, ele codifica um interferon mutante apresentando a atividade de um interferon-β-Ι a; (b) o "equivalente funcional" é um primeiro polinucleotídeo que codifica expressão para uma seqüência de aminoácido codificado por um segmento polinucleotídeo a expressão para a seqüência de aminoácido codificada pelo segundo polinucleotídeo.
Em resumo, o termo "interferon" inclui, mas não é limitado aos agentes relacionados acima assim como seus equivalentes funcionais. Como usado neste caso, o termo "equivalente funcional" portanto refere-se a uma proteína do interferon-beta-1a ou a um polinucleotídeo que codifica a proteína do interferon-beta-1 a que tem o mesmo ou um efeito vantajoso melhorado sobre o mamífero que vai receber como o interferon do que é considerado um equivalente funcional. Como será considerado por um versado na técnica, uma proteína funcionalmente equivalente pode ser produzidas por técnicas recombinantes, por exemplo, por expressão de um "DNA funcional mente equivalente". Conseqüentemente, a presente invenção a-brange as proteínas de interferon-beta-1 a codificadas por DNAs que ocorrem naturalmente, assim como por DNAs que não ocorrem naturalmente que codificam a mesma proteína como codificada pelo DNA que ocorre naturalmente. Em virtude da degeneração das seqüências de codificação de nucleotídeo, podem ser usados outros polinucleotídeos para codificar o interferon-beta-1 a. Estes incluem todos ou partes das seqüências acima que são alteradas pela substituição de diferentes códons que codificam o mesmo resíduo de aminoácido dentro da seqüência, produzindo desse modo uma variação silenciosa. Tais seqüências alteradas são consideradas equivalentes destas seqüências. Por exemplo, Phe (F) é codificado por dois códons, TTC ou TTT, Tyr (Y) é codificado por TAC ou TAT e His (H) é codificado por CAC ou CAT. Por outro lado, Trp (W) é codificado por um códon simples, TGG. Conseqüentemente, será considerado que para uma dada seqüência de DNA que codifica um interferon em particular muitas seqüências degeneradas de DNA codificarão para ele. Estas seqüências degene- radas de DNA são consideradas dentro do âmbito da invenção. "fusão" - refere-se a uma ligação co-linear de duas ou mais proteínas ou fragmentos dos mesmos por suas cadeias principais de peptí-deo individual por expressão genética de uma molécula de polinucleotídeo que codifica aquelas proteínas. É preferível que as proteínas ou os fragmentos da mesma sejam de fontes diferentes. Assim, as proteínas de fusão preferidas incluem uma proteína ou um fragmento de interferon-beta-1a co-valentemente ligado a uma segunda porção que não é um interferon. Especificamente, um "interferon-beta-1 a/lg fusão" é uma proteína que compreende uma molécula de interferon-beta-1 a da invenção ou fragmento da mesma ligado a um terminal N de uma cadeia de imunoglobina em que uma porção do terminal N da imunoglobina é substituída com o interferon-beta-1 a. "Recombinante" como usado neste caso, significa que uma proteína é derivada de sistemas de expressão de mamíferos, recombinan-tes. A proteína expressa na maioria de culturas bacterianas, por exemplo, E. coli, estará livre de glican assim estes sistemas de expressão não são preferidos. A proteína expressa em levedura pode ter estruturas de oligossacarí-deo que são diferentes daquela expressa em células de mamíferos. "Biologicamente ativo," como usado em todo o relatório descritivo como uma característica do interferon-beta-1 a, significa que uma molécula particular compartilha suficiente homologia de sequência de aminoáci-do com as modalidades da presente invenção aqui divulgadas para ser capaz de atividade antiviral como medida em um ensaio antiviral in vitro do tipo mostrado no Exemplo 1 (ver a seguir).
Uma "composição terapêutica" como usada neste caso é definida como compreendendo as proteínas da invenção e outros ingredientes fisiologicamente compatíveis. A composição terapêutica pode conter excipt-entes tais como água, minerais e veículos tal como proteína.
Uma "quantidade eficaz" de um agente da invenção é aquela quantidade que produz um resultado ou exerce uma influência sobre o estado de saúde em particular que está sendo tratado. "aminoácido" - uma unidade monomérica de um peptídeo, de um polipeptídeo ou de uma proteína. Há vinte aminoácidos encontrados em peptídeos, polipeptídeos e proteínas que ocorrem naturalmente, todos sendo L-isômeros. 0 termo também inclui análogos dos aminoácidos e D-isômeros dos aminoácidos da proteína e seus análogos.
Um aminoácido "derivatizado" é um aminoácido natural ou não natural em que a cadeia lateral ou grupo terminal que ocorre normalmente é modificado por reação química. Tais modificações incluem, por exemplo, gama-carboxilação, beta-carboxilação, sulfação, sulfonação, fosforilação, amidização, esterificação, N-acetilação, carbobenzilação, tosilação e outras modificações conhecidas na técnica. Um "polipeptídeo derivatizado" é um polipeptídeo que contém um ou mais aminoácidos derivatizados. "proteína" - qualquer polímero que consiste essencialmente de qualquer um dos 20 aminoácidos. Embora "polipeptídeo" seja freqüente-mente usado em referência a polipeptídeos relativamente grandes e "peptí-deo" seja frequentemente usado em referência a pequenos polipeptídeos, o uso destes termos na técnica se sobrepõe e é variado. O termo "proteína" como usado neste caso refere-se a peptídeos, proteínas e polipeptídeos, senão observado de outra maneira. "mutante" - qualquer mudança no material genético de um organismo, em particular qualquer mudança (isto é, deleção, substituição, adição ou alteração) em uma sequência de polinucleotídeo do tipo selvagem ou qualquer mudança em uma proteína do tipo selvagem. O termo "muteína" é usado intercambiavelmente com "mutante". "tipo selvagem" - a sequência de polinucleotídeo que ocorre naturalmente de um exon de uma proteína ou de uma parte do mesmo, ou seqüência de proteína ou parte da mesma, respectivamente, como normalmente existe in vivo. "condições padronizadas de hibridização" - sal e condições de temperatura substancialmente equivalentes a 0,5 X SSC até aproximadamente 5 X SSC e 65°C tanto para hibridização como para lavagem. O termo "condições padronizadas de hibridização" como usado neste caso é portanto uma definição operacional e abrange uma faixa de condições de hibri- dização. As condições de maior restrição podem, por exemplo, incluir hibri-dização com tampão de tela de placa (polivinilpirrolidona a 0,2%, Ficoll 400 a 0,2%; albumina de soro bovino a 0,2%, Tris-HCI 50 mM (pH 7,5); NaCI 1 M; pirofosfato de sódio a 0,1%; SDS a 1%); sulfato de dextran a 10% e 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, tratado com ondas sonoras a 65°C durante 12-20 horas e lavagem com NaCI 7,5 mM/citrato de sódio 5 mM (0,5 X SSC)/SDS a 1% a 65°C. As condições de menor restrição podem, por exemplo, incluir hidrogenação com tampão de tela de placa; sulfato de dextran a 10% e 110 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, tratado com ondas sonoras a 55°C durante 12-20 horas e lavagem com NaCI 300 mM/citrato de sódio 30 mM (2,0 X SSC)/SDS a 1% a 55°C. Ver também Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque, Seções 6.3.1-6.3.6, (1989). "seqüência de controle de expressão" - uma seqüência de poli-nucleotfdeos que controla e regula a expressão de genes quando ligados operativamente àqueles genes. ligado operativamente" - uma seqüência de polinucleotídeo (DNA, RNA) está ligada operativamente a uma seqüência de controle de expressão quando a seqüência de controle de expressão controla e regula a transcrição e a tradução daquela seqüência de polinucleotídeo. O termo "ligado operativamente" inclui ter um sinal de início apropriado (por exemplo, ATG) na frente da seqüência de polinucleotídeo a ser expresso e manutenção do quadro de leitura correta para permitir a expressão da seqüência de polinucleotídeo sob o controle da seqüência de controle de expressão e da produção do polipeptídeo desejado codificado pela seqüência de polinucleotídeo. "vetor de expressão" - um polinucleotídeo, tal como um plasmí-deo de DNA ou fago (entre outros exemplos comuns) que permite a expressão de pelo menos um gene quando o vetor de expressão é introduzido em uma célula hospedeira. O vetor pode, ou não, ser capaz de se replicar em uma célula. "Isolado" (usado intercambiavelmente com "substancialmente puro") - quando aplicado a ácido nucléico isto é, seqüências de polinucleo-tídeo, que codificam polipeptídeos, significa um polinucleotídeo de RNA ou de DNA, parte de polinucleotídeo genômico, cDNA ou polinucleotídeo sintético, em virtude de sua origem ou manipulação: (i) não está associado com tudo de um polinucleotídeo com o qual ele está associado em natureza (por exemplo está presente em uma célula hospedeira como um vetor de expressão ou uma parte do mesmo); ou (ii) está ligado a um ácido nucléico ou a outro grupamento químico sem ser aquele ao qual ele está ligado na natureza; ou (iii) não ocorre na natureza. Por "isolado" também se entende uma seqüência de polinucleotídeo que é: (i) amplificada in vitro, por exemplo, por reação de cadeia de polimerase (PCR); (ii) quimicamente sintetizado; (iii) recombinantemente produzido por clonagem; ou (iv) purificado, como por divagem e separação de gel.
Assim, "ácido nucléico substancialmente puro" é um ácido nucléico que não imediatamente contíguo a uma ou a ambas das seqüências de codificação com as quais ele é normalmente contíguo no genoma que ocorre naturalmente do organismo do qual é derivado o ácido nucléico. O DNA substancialmente puro também inclui um DNA recombinante que é parte de um gene híbrido que codifica seqüências adicionais. "Isolado" (usado intercambiavelmente com "substancialmente puro") - quando aplicado a polipeptídeos significa um polipeptídeo ou uma porção do mesmo que, em virtude de sua origem ou manipulação: (i) está presente em uma célula hospedeira como o produto de expressão de uma porção de um vetor de expressão; ou (ii) está ligado a uma proteína ou a outra porção química sem ser aquele ao qual ele está ligado na natureza; ou (iii) não ocorre na natureza. Por "isolado" também se entende uma proteína que é: (i) sintetizada quimicamente ou (ii) expressa em uma célula hospedeira e purificada para se separar das proteínas associadas. O termo geralmente significa um polipeptídeo que foi separado de outras proteínas e de ácido nucléicos com os quais ele ocorre naturalmente. Preferencialmente, o polipeptídeo também é separado de substâncias tais como anticorpos ou matrizes de gel (poliacrilamida) que são usados para purificá-lo. "promotor heterólogo" - como usado neste caso é um promotor que não está naturalmente associado com um gene ou com um a nucléico purificado. "Homólogo" - como usado neste caso é sinônimo do termo "identidade" e refere-se à similaridade de sequência entre dois polipeptí-deos, moléculas ou entre dois ácidos nucléicos. Quando for ocupada uma posição em ambas as duas sequência comparadas pela mesma base ou subunidade de monômero de aminoácido (por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA for ocupada por adenina ou uma posição de cada um dos dois polipeptídeos for ocupada por uma lisina), então as moléculas respectivas são homólogas àquela posição. A homologia da percentagem entre duas seqüências é uma função do número de combinação ou de posições homólogas compartilhadas pelas duas sequências dividido pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 das 10 posições em duas seqüências forem combinadas ou forem homólogas, então as duas seqüências são 60% homólogas. Para fins de exemplo, as seqüências de DNA CTGACT e CAGGTT compartilham 50% de homologia (3 das 6 posições totais são combinadas). Geralmente, é feita uma comparação quando duas seqüências estiverem alinhadas para fornecer homologia máxima. Tal alinhamento pode ser fornecido usando-se, por exemplo, o método de Needleman e outros, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970), implementado convenientemente por programas de computador tal como o programa Align (DNAstar, Inc.). As seqüências homólogas compartilham resíduos de aminoácido idênticos ou similares, quando os resíduos similares forem substituições conservadoras para, ou "mutações de ponto permitido" de, resíduos de aminoácidos correspondentes em uma seqüência alinhada de referência. Sob este aspecto, uma "substituição conservadora" de um resíduo em uma seqüência de referência são aquelas substituições que são fisicamente ou funcionalmente similares aos resíduos de referência correspondentes, por exemplo, que têm propriedades similares de tamanho, de formato, de carga elétrica, de propriedades químicas, inclusive a capacidade de formar ligações covalentes ou de hidrogênio ou similar. As substitui- ções conservadoras particularmente preferidas são aquelas que satisfazem os critérios definidos para uma "mutação de ponto aceito" em Dayhoff e outros, 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Supl. 3, capítulo 22: 354-352. Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978).
Os termos "sequência de polinucleotídeo" e "sequência de nu-cleotídeo" também são usados neste caso intercambiavelmente. "angiongênese" e "neovascularização" significa, em seu sentido mais amplo, o recrutamento de novos vasos sanguíneos. Em particular, a angiongênese também se refere ao recrutamento de novos vasos sanguíneos de um sítio de tumor. "IFNAR2", "IFNARI", "IFNAR1/2", referem-se a proteínas conhecidas para compor o receptor interferon do tipo I da superfície da célula. A parte extracelular (ectodomínio) da cadeia IFNAR2 sozinha pode ligar o interferon alfa ou beta. A prática da presente invenção irá empregar, senão indicado de outra maneira, técnicas convencionais de biologia da célula, de cultura da célula, de biologia molecular, de microbiologia, de DNA recombinante, de química de proteína e de imunologia, que estão dentro da perícia da técnica. Tais técnicas são descritas na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a edição. (Sambrook, Fritsch e Maniatis, eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I e II (D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; Patente US N°. 4.683.195 (Mullis e outros); Nucleic Acid Hybridiza-tion (B.D. Hames e S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames e S.J. Higgins, eds ), 1984; Culture of Animal Cells(R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 e 155 (Wu e outros, eds), Academic Press, Nova Iorque; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Millere M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer e Walker, eds.), Academic Press, Londres, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes l-IV (D.M. Weit e C.C. Blackwell, eds.), 1986; Mani-pulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
O INTERFERQN-BETA 0 interferon-beta-1a é útil como um agente para o tratamento, remissão ou atenuação de um estado de doença, condições fisiológicas, sintomas ou fatores etiológicos ou para a avaliação ou diagnóstico dos mesmos. O termo também se refere a interferon-beta-1 a que é ele próprio parte de uma proteína de fusão tal como uma proteína de fusão de imuno-globulina-interferon-beta-1a como descrito nos pedidos de patente copen-dentes Números de Série 60/104.572 e 60/120.161. A preparação de proteínas de fusão geralmente estão bem dentro do conhecimento de pessoas versadas na técnica.
Foi (Foram) descoberto (s) sítio (s) único (s) para ligação de polímero que não destruiría (m) a função do interferon-beta-1 a. Além disso, usou-se também métodos de mutagênese sítio-dirigida para investigar independentemente o (s) sítio (s) para ligação de polímero (Ver Exemplo 1). Em resumo, iniciou-se uma análise mutacional de interferon-beta-1 a humano com o objetivo de mapear resíduos necessários para ligação de atividade e de receptor. A disponibilidde da estrutura 3D do cristal de interferon-beta-1 a humano (ver acima e Exemplo 1) nos permite identificar, para substituições de alanina (ou serina), os resíduos expostos a solvente disponíveis para interações de receptor de beta interferon e manter os aminoácidos envolvidos em ligações intramoleculares. Foi designado um painel de quinze mutações de varredura de alanina que substituiu entre dois e oito resíduos ao longo de regiões distintas cada uma das hélices (A, B, C, D, E) e circuitos fechados (AB1, AB2, AB3, CD1, CD2. DEI. DE2) e interferon-beta-la. Ver Exemplo 1.
Uma ponta de histidina amino terminal (ponta "his") foi incluída para purificação de afinidade de mutantes expressos em célula de mamífero (Figura 10 e SEQ ID N°s. 1 e 2 para o cDNA e sequências deduzidas de aminoácido, respectivamente). As consequências funcionais destas muga- ções são avaliadas em ensaios antiviral e de antiproliferação. Foi desenvolvido um ensaio de ligação não-radioativo para analisar estes mutantes para sua ligação ao receptor da célula da superfície do interferon beta (receptor de superfície de célula IFNAR 1/2). Além disso um ensaio baseado em ELISA que emprega um IFNAR2-ectodomínio/proteína de fusão Ig para ligar interferon foi usado para mapear interações de superfícies entre interferon-beta-1a e IFNAR2 (Ver Exemplo 1). Estas análises mutacionais demonstraram que os terminais N e C ficam em uma parte da molécula de interferon-beta não importante para a ligação do receptor ou função biológica.
Os mutantes são outras variantes da porção interferon beta 1a da invenção que podem ser particularmente úteis desde que eles apresentem novas propriedades não encontradas no interferon-beta-1 a do tipo selvagem (Ver Exemplo 1). Foram identificados três tipos de efeitos que foram causados por mutagênese direcionada. Estes efeitos podem ser vantajosos para o desenvolvimento de droga interferon sob certas circunstâncias. Os três tipos de efeito são como a seguir: (a) mutantes com atividade antiviral mais alta que do interferon-beta-1 a do tipo selvagem his (por exemplo mutante C1); (b) mutantes que apresentam atividade tanto em ensaios antivi-rais como de antiproliferação, mas para os quais a atividade de antiproliferação é desproporcionalmente baixa em relação à atividade antiviral, comparada com o interferon-beta-1 a do tipo selvagem his (por exemplo mutantes C1, D e DE1); e (c) antagonistas funcionais (por exemplo, A1, B2, CD2 e DE1), que apresentam atividades antivirais e antiproliferativas que são des-proporiconalmente baixas em relação à ligação com receptor, comparado ao interferon-beta-1 a do tipo selvagem his.
A PORÇÃO POLÍMERO
Dentro do amplo âmbito da presente invenção, pode ser empregada uma única molécula de polímero para conjugação com um interferon-beta-1 a, embora também seja considerado que mais de uma molécula de polímero pode ser ligada da mesma forma. As composições conjugadas de interferon-beta 1a da invenção podem encontrar utilidade tanto em aplicações in vivo como não in vivo. Adicionalmente será reconhecido que o polí- mero de conjugação pode utilizar quaisquer outros grupos, porções ou outras espécies conjugadas, quando apropriado para a aplicação de uso final. Para fins de exemplo, pode ser útil em algumas aplicações ligar covalente-mente ao polímero uma porção funcional que confere resistência à degradação por UV ou a antioxidação ou outras propriedades ou características ao polímero. Como um outro exemplo, pode ser vantajoso em algumas aplicações funcionalizar o polímero para torná-lo reativo ou de caráter reticulá-vel, para melhorar várias propriedades ou características do material conjugado global. Consequentemente, o polímero pode conter alguma funcionalidade, grupos de repetição, ligações ou outras estruturas constituintes que não prejudiquem a eficiência da composição de interferon-beta-1a conjugada para sua finalidade pretendida. Outros objetivos e vantagens da presente invenção serão mais completamente aparentes pela divulgação a seguir e reivindicações anexas.
Os polímeros ilustrativos que podem ser empregados utilmente para se conseguir estas características desejáveis são descritos a seguir em exemplos de esquemas de reação. Em aplicações de peptídeos ligado co-valentemente, o polímero pode ser funcionalizado e então acoplado a ami-noácido (s) livre (s) do peptídeo (s) para formar ligações lábeis. O interferon-beta-1 a é conjugado mais preferivelmente por um grupo reativo terminal sobre o polímero embora conjugações também possam ser ramificadas dos grupos reativos não terminais. O polímero com o (s) grupo (s) reativos (s) é designado aqui "polímero ativado". O grupo reativo reage seletivamente com grupos amino livres ou outros grupos reativos sobre a proteína. O polímero (s) ativado (s) é (são) reagido (s) de modo que possa ocorrer ligação em qualquer grupo interferon-beta-1 a amino disponível tal como os grupos alfa amino ou os grupos épsilon-amino de lisinas. Os grupos carboxílicos livres, grupos carbonila adequadamente ativados, porções hidroxila, guanidila, carboidrato oxidado e mercapto do interferon-beta-1a (se disponível) também podem ser usados como sítios de ligação.
Embora o polímero possa ser ligado alhures na molécula de in-terferon-beta-1 a, o sítio mais preferido para o acoplamento do polímero é o terminal N do interferon-beta-1a. O (s) sítio (s) secundário (s) estão a ou próximos ao terminal C e através de porções açúcar. Assim, a invenção considera como suas modalidades mais preferidas: (i) os conjugados de interfe-ron-beta-1a N-terminalmente acoplados; (ii) os conjugados de polímero de interferon-beta-1 a C-terminalmente acoplados; (iii) conjugados acoplados com açúcar de conjugados de polímero; (iv) assim como conjugados de polímero N-, C- e açúcar acoplado de proteínas de fusão de interferon-beta-1 a.
Geralmente são empregados desde aproximadamente 1,0 até aproximadamente 10 moles de polímero ativado por mol de proteína, dependendo da concentração de proteína. A quantidade final é um equilíbrio entre a maximização da extensão da reação enquanto se minimiza as modificações não específicas do produto e, ao mesmo tempo, definindo as químicas que irão manter atividade ótima, embora ao mesmo tempo otimizan-do-se, se possível, a semivída da proteína. Preferencialmente, pelo menos são mantidos aproximadamente 50% da atividade biológica da proteína e mais preferivelmente são mantidos 100%.
As reações podem ocorrer por qualquer método adequado usado para reagir materiais biologicamente ativos com polímeros inertes, de preferência em torno de pH 5-7 se os grupos reativos estiverem sobre o grupo alfa amino no terminal N. Geralmente o processo envolve preparar um polímero ativado (que pode ter pelo menos um grupo hidroxila terminal) e depois disso reagir a proteína com o polímero ativado para produzir a proteína solúvel adequada para formulação. A reação de modificação acima pode ser realizada por diversos métodos, que podem envolver uma ou mais etapas.
Como mencionado acima, as modalidades mais preferidas da invenção utilizam a extremidade do terminal N do interferon-beta-1 a como a ligação ao polímero. Os métodos adequados são disponíveis para obter seletivamente um interferon-beta-1 a modificado N-terminalmente. Um método é exemplificado por um método de alquilação redutora que explora a reativi-dade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primário (os grupos épsilon amino sobre a lisina versus os grupos amino sobre a metionina N- terminal) disponíveis para derivatização sobre o interferon-beta-1a. Sob as condições de seleção apropriadas, pode ser conseguida derivatização substancialmente seletiva de interferon-beta-1 a em seu terminal N com um polímero que contém grupo carbonila. A reação é realizada a um pH que permite que se tire vantagem das diferenças de pKa entre os grupos épsi-lon-amino dos resíduos de lisina e aquele do grupo alfa-amino do resíduo N-terminal de interferon-beta-1 a. Este tipo de química é bem conhecido dos versados na técnica.
Usou-se um esquema de reação em que esta seletividade é mantida por realização de reações a baixo pH (geralmente 5-6) sob condições em que um polímero de PEG-aldeído é reagido com interferon-beta-1 a na presença de cianoborohidreto de sódio. Estes resultados, após a purificação do PEG-interferon-beta-1a e análise com SDS-PAGE, espectrometria de massa de MALDI e seqüenciamento/mapeamento de peptídeo, forneceram um interferon-beta-1 a cujo terminal N é especificamente visado pela porção PEG. A estrutura do cristal de interferon-beta-1 a é tal que os terminais N e C estão localizados próximo um ao outro (ver Karpusas e outros, 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. 94: 11813-11818). Assim, as modificações da extremidade do terminal C de interferon-beta-1 a também devia ter efeito mínimo sobre a atividade. Embora não haja estratégia química simples para direcionar um polímero de polialquileno glicol tal como PEG para o terminal C, seria direto para engenheirar geneticamente um sítio que pode ser usado para direcionar a porção polímero. Por exemplo, a incorporação de um Cys a um sítio que está a ou próximo ao terminal C permitiría modificação específica usando-se um polialquileno glicol ativado por maleimida, vinilsulfona ou ha-loacetato (por exemplo, PEG). Estes derivados podem ser usados especificamente para modificação das cisteínas engenheiradas em virtude da alta seletividade destes reagentes para Cys. Outras estratégias tal como a incorporação de uma ponta de histidina que pode ser direcionada (Fancy e outros, (1996) Chem. & Biol. 3: 551) ou um sítio de glicosilação adicional, representam outras alternativas para modificação do terminal C de interfe- ron-beta-1 a. 0 glicano sobre o interferon-beta-1 a também está em uma posição que permitiría modificação adicional sem alteração da atividade. Os métodos para o direcionamento de açúcares como sítios para modificação química também são bem conhecidos e portanto é provável que um polímero de polialquileno glicol possa ser adicionado diretamente e especificamente a açúcares sobre interferon-beta-1a que foi ativado por oxidação. Por exemplo, pode ser gerada uma polietileno qlicol-hidrazida que forma ligações relativamente estáveis de hidrazona por condensação com aldeídos e cetonas. Esta propriedade foi usada para modificação de proteínas por meio de ligações de oligossacarídeo oxidado. Ver Andresz, H e outros, (1978), Makromol. Chem. 179:301. Em particular, o tratamento da PEG-carboximetil hidrazida com nitrito produz a PEG-carboximetil azida que é um grupo ele-trofilicamente ativo em relação a grupos amino. Esta reação pode ser usada para preparar proteínas modificadas por polialquileno glicol da mesma forma. Ver, as Patentes U.S. 4.101.380 e 4.179.337.
Foi descoberto anteriormente que a química mediada por ligante tiol podia ainda facilitar a reticulação de proteínas. Em particular, foram gerados multímeros homotípicos de LFA-3 e CD4 usando um procedimento tal como a geração de aldeídos reativos sobre as porções carboidrato com pe-riodato de sódio, formando conjugados de cistamina pelos aldeídos e induzindo a reticulação pelos grupos tiol sobre as cistaminas. Ver Pepinsky, B. e outros, (1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249 e Chen, L.L. e outros, (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237-18243. Portanto, imagina-se que este tipo de química também seria apropriado para modificação com polímeros de polialquileno glicol em que um ligante é incorporado ao açúcar e o polímero de polialquileno glicol está preso ao ligante. Enquanto os ligantes que contêm aminotiol ou hidrazina permitem a adição de um único grupo polímero, a estrutura do ligante pode ser variada de modo que são adicionados os múltiplos polímeros e/ou que seja mudada a orientação espacial do polímero em relação ao interferon-beta-1 a.
Na prática da presente invenção, os resíduos de polialquileno glicol de C1-C4 alquil polialquileno glicóis, de preferência polietileno glicol (PEG) ou resíduos de poli (óxi) alquileno glicol de tais glicóis sejam vantajosamente incorporados aos sistemas de polímero de interesse. Assim, o polímero ao qual está ligada a proteína pode ser um homopolímero de polietileno glicol (PEG) ou é um poliol polioxietilado, contanto que em todos os casos o polímero seja solúvel em água à temperatura ambiente. Exemplos não limitativos de tais polímeros incluem os homopolímeros de óxido de polialquileno tal como PEG ou polipropileno glicóis, glicóis polioxilena, copolí-meros dos mesmos e copolímeros em bloco dos mesmos, contanto que seja mantida a solubilidade em água do copolímero em bloco. Exemplo de polióis polioxietilados incluem, por exemplo, glicerol polioxietilado, sorbitol polioxietilado, glicose polioxietilada ou similares. A cadeia principal de glicerol do glicerol polioxietilado é a mesma cadeia principal que ocorre naturalmente, por exemplo, em animais e seres humanos em mono-, di- e triglicerídeos. Portanto, esta ramificação não seria necessariamente observada como um agente estranho no corpo.
Como uma alternativa aos óxidos de polialquileno, podem ser usados dextran, polivinil pirrolidonas, poliacrilamidas, álcoois polivinílicos, polímeros à base de carboidrato e similares. Os versados na técnica irão reconhecer que a lista anterior é simplesmente ilustrativa e que são considerados todos os materiais do polímero que tenham as qualidades aqui descritas. O polímero não precisa ter peso molecular em particular, porém é preferível que o peso molecular esteja entre aproximadamente 300 e 100.000, mais preferivelmente entre 10.000 e 40.000. Em particular, os tamanhos de 20.000 ou mais são melhores para evitar perda de proteína em virtude da filtração nos rins. A derivatização de polialquileno glicol tem algumas propriedades vantajosas na formulação de conjugados de polímero-interferon-beta-1a na prática da presente invenção, como associado com as propriedades a seguir dos derivados de polialquileno glicol: melhoria da solubilidade aquo-sa, embora ao mesmo tempo não provoque resposta antigênica ou imuno- gênica; altos graus de biocompatibilidade; ausência de biodegradação in vivo dos derivados de polialquileno glicol; e facilidade de excreção por organismos vivos.
Além disso, em um outro aspecto da invenção, pode-se utilizar interferon-beta-1a ligado covalentemente ao componente polímero em que a natureza da conjugação envolve ligações químicas covalentes cliváveis. Isto permite controle em termos do período de tempo durante o qual o polímero pode ser clivado do interferon-beta-1a. Esta ligação covalente entre a droga interferon-beta-1a e o polímero pode ser clivada por reação química ou en-zimática. O produto polímero-interferon-beta-1a mantém uma quantidade de atividade aceitável. Concorrentemente, estão presentes porções de polieti-leno glicol no polímero de conjução para conferir ao conjugado de polímero-interferon-beta-1a alta solubilidade aquosa e capacidade de circulação de sangue prolongada. Como um resultado destas características aperfeiçoadas a invenção considerada a administração parenteral, nasal e oral de ambas as espécies ativas de polímero-interferon-beta-1a e, após a divagem hidrolítica, a biodisponibilidade do interferon-beta-1a por si, em aplicações in vivo.
Deve ser entendido que os esquemas da reação aqui descritos são fornecidos com as finalidades de ilustração apenas e não devem ser limitativos em relação às reações e às estruturas que podem ser utilizadas na modificação do interferon-beta-1a, por exemplo, para se conseguir solubilidade, estabilização e afinidade da membrana da célula para administração parenteral e oral. A reação do polímero com o interferon-beta-1a para se obter os produtos N-terminal conjugados mais preferidos é facilmente realizada usando-se uma ampla variedade de esquemas de reação. A atividade e a estabilidade dos conjugados de interferon-beta-1a podem ser variadas de diversas maneiras, pelo uso de um polímero de diferente tamanho molecular. As solubilidades dos conjugados podem ser variadas mudando-se as propriedades e o tamanho do fragmento de polietileno glicol incorporado à composição de polímero.
Utilidades A única propriedade de polímeros derivados de polialquileno glicoi de valor para aplicações terapêuticas da presente invenção é sua bio-compatibilidade geral. Os polímeros têm várias propriedades de solubilidade em água e não são tóxicos. Acredita-se que eles sejam não imunogênicos e não antigênicos e não interfiram nas atividades biológicas do grupamento interferon-beta-1a quando conjugado sob as condições aqui descritas. Eles têm longa circulação no sangue e são facilmente excretados de organismos vivos.
Descobriu-se que os produtos da presente invenção são úteis para manter a semivida de interferon-beta-1 a terapêutico e podem por exemplo ser preparados para administração terapêutica por dissolução em água ou em meio líquido aceitável. A administração é por via parenteral, aerossol ou oral. Podem ser preparadas suspensões coloidais finas para administração parenteral para produzir um efeito de depósito, ou pela via oral enquanto a formulação aerossol pode ser de natureza líquida ou de pó seco. Nas formulações secas, no estado liofilizado ou em solução, os conjugados de interferon-beta-1 a-polímero da presente invenção deviam ter boa estabilidade em estocagem. A estabilidade térmica de interferon-beta-1 a conjugado (Exemplo 3) é vantajosa em processos de formulação em pó que têm uma etapa de desidratação. Ver, por exemplo PCT/US/95/06008 ("Methods and Compositions for Dry Powder of Interferons").
Os conjugados de polímero terapêutico da presente invenção podem ser utilizados para a profilaxia ou para o tratamento de qualquer estado de saúde ou de doença para os quais o constituinte interferon-beta-1 a é eficaz. Além disso, os conjugados à base de polímero da presente invenção podem ser utilizados em diagnóstico de constituintes, estados de saúde ou de doença em sistemas biológicos ou em espécimes, assim como para as finalidades de diagnóstico em sistemas não fisiológicos.
Em uso terapêutico, a presente invenção considera um processo de tratamento de um sujeito animal que tem ou latentemente suscetível de tal (tais) estados de saúde ou de doença e em necessidade de tal trata- mento, que compreende administrar ao tal animal uma quantidade eficaz de um conjugado de polímero da presente invenção que é terapeuticamente eficaz para o dito estado de saúde ou de doença. Os sujeitos a serem tratados pelos conjugados de polímero da presente invenção incluem sujeitos mamíferos e mais preferivelmente sujeitos humanos. Dependendo do estado de saúde ou de doença específico a ser combatido, os podem ser administrados aos sujeitos animais os conjugados de polímero da invenção a qualquer dosagem adequada terapeuticamente eficaz e segura, como pode ser facilmente determinado dentro da perícia na técnica e sem experimentação indevida. Por causa das barreiras de espécie de interferons do Tipo I, pode ser necessário gerar conjugados de interferon-polímero como aqui descrito com interferons provenientes das espécies apropriadas. A atividade proliferativa anticélula de interferon-beta-1a é bem conhecida. Em particular, alguns dos conjugados de polímero de interferon-beta-1a aqui descritos são úteis para tratar tumores e cânceres tais como sarcoma osteogênico, linfoma, leucemia'linfocítica aguda, carcinoma da mama, melanoma e carcinoma nasofaringeal,(assim como estados auto-imunes tais como fibrose, lúpus e esclerose múltipla. É ainda de se esperar que a atividade antiviral exibida pelas proteínas conjugadas, em particular certos conjugados de muteína do interferon-beta-1a aqui descritos, possam ser usados no tratamento de doenças virais. tais como infecção por ECM, influenza e outras infecções do trato respiratório, hidrofobia e hepatite. E também de se esperar que as atividades imunomoduladoras de interferon-beta-1a exibidas pelas proteínas conjugadas aqui descritas, possam ser usadas no tratamento de doenças auto-imunes e inflamatórias, tais como fibrose, esclerose múltipla. A capacidade que tem os interferons de inibirem a formação de novos vasos sanguíneos (isto é, inibir a anaioaênese e a ne-ovascularização) permite que os conjugados da invenção sejam usados para tratar doenças angiogênicas tais como retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, degeneração macular, rejeição de enxerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeose e Síndrome de Osler-Webber.
Além disso, a atividade antiendotelial do interferon foi conhecida durante algum tempo e um mecanismo potencial de ação do interferon pode interferir na atividade da célula endotelial por inibição da produção ou da eficácia de fatores angiogênicos produzidos por células tumorais. Alguns tumores vasculares, tais como hemangiomas, são particularmente sensíveis ao tratamento com o interferon. O tratamento com interferon-alfa é o único tratamento documentado para esta doença. É de se esperar que o tratamento com os conjugados de interferon-beta-1a da invenção ofereçam vantagens farmacêuticas substanciais em termos de farmacocinética e farma-codinâmica, pois é de se esperar que o conjugado permaneça na vasculatu-ra durante um período de tempo mais longo do que os interferons não conjugados, conduzindo assim a terapia mais eficiente e eficaz para uso como um agente antiangiogênico. Ver Exemplo 8.
Os conjugados de polímero-interferon-beta-1a da invenção podem ser administrados por si assim como na forma de ésteres, sais e outros derivados fisiologicamente funcionais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Em tais formulações farmacêuticas e medicamentosas, o interfe-ron-beta-1a é de preferência utilizado juntamente com um ou mais veículo (s) farmaceuticamente aceitável (eis) e opcionalmente quaisquer outros ingredientes terapêuticos. Os veículo (s) deve (m) ser farmaceuticamente aceitável (eis) no sentido de ser (em) compatível (eis) com os outros ingredientes da formulação e não indevidamente prejudicial (ais) ao sujeito que irá receber o (s) mesmo (s). O interferon-beta-1 a é fornecido em uma quantidade eficaz para se conseguir o efeito farmacológico desejado, como descrito acima e em uma quantidade apropriada para se alcançar a dose diária desejada.
As formulações incluem aquelas adequadas para administração parenteral assim como não parenteral e modalidades específicas de administração incluem administração oral, retal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, subcutânea, intramuscular, intravenosa, transdermal, intratecal, intra-articu-lar, intra-arterial, subaracnóide, bronquial, linfática, vaginal e intra-uterina. As formulações adequadas para administração oral, nasal e parenteral são preferidas.
Quando o interferon-beta-1a é utilizado em uma formulação que compreende uma solução líquida, a formulação pode vantajosamente ser administrada oralmente ou parenteralmente. Quando o interferon-beta-1a é empregado em uma formulação líquida em suspensão ou como um pó em uma formulação em veículo biocompatível, a formulação pode vantajosamente ser administrada oralmente, retalmente ou bronquialmente.
Quando o interferon-beta-1 a é utilizado diretamente na forma de um sólido pulverizado, o interferon-beta-1 a pode vantajosamente ser administrado nasalmente ou bronquialmente por meio de nebulização do pó em um gás carreador, para formar uma dispersão aquosa do pó que é inspirada pelo paciente de um circuito de respiração que compreende um dispositivo nebulizador adequado.
As formulações que compreendem os conjugados de polímero da presente invenção podem convenientemente ser apresentadas em formas de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Tais métodos geralmente incluem a etapa de colocar o (s) ingrediente (s) ativo (s) em associação com um veículo que constitui um ou mais ingredientes auxiliares. Tipicamente, as formulações são preparadas colocando uniformente e intimamente o (s) ingrediente (s) ativo (s) em associação com um veículo líquido, um veículo sólido finamente dividido ou ambos e então, se necessário, moldando o produto em formas de dosagem da formulação desejada.
As formulações da presente invenção adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades isolada tais como cápsulas, cachês, comprimidos ou pastilhas, cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo como um pó ou grânulos; ou uma suspensão em uma solução aquosa ou em um líquido não aquoso, tais como um xarope, um elixir, uma emulsão ou um produto para inalação.
Um comprimido pode se feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes auxiliares. Podem ser preparados comprimidos prensados por compressão em uma máquina adequada, com o composto ativo estando em uma forma de escoamento livre tal como um pó ou grânulos que opcionalmente é misturado com um aglutinante, um desintegrador, um lubrificante, um diluente inerte, um agente tensoativo ou um agente de descarregamento. Os comprimidos moldados compreendidos de uma mistura de conjugados de polímero em pó com um veículo adequado podem ser obtidos por moldagem em uma máquina adequada.
Pode ser obtido um xarope por adição do composto ativo a uma solução aquosa concentrada de um açúcar, por exemplo sacarose, ao qual também podem ser adicionados quaisquer ingrediente (s) auxiliar (es). Tais ingrediente (s) auxiliar (es) podem incluir aromatizantes, conservante adequado, agentes para retardar a cristalização do açúcar e agentes para aumentar a solubilidade de algum outro ingrediente, tal como um polihidróxi álcool, por exemplo glicerol ou sorbitol.
As formulações adequadas para administração parenteral convenientemente compreendem uma preparação aquosa estéril do conjugado ativo, que de preferência é isotônico com o sangue da pessoa que recebe (por exemplo solução de soro fisiológico). Tais formulações podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes ou outros sistemas micropar-ticulados que são projetados para direcionar o composto aos componentes do sangue ou um ou mais órgãos. As formulações podem ser apresentadas em forma de dose unitária ou de multidose.
As formulações para spray nasal compreendem soluções aquo-sas purificadas do conjugado ativo com agentes conservantes e agentes isotônicos. Tais formulações são de preferência ajustadas a um pH e estado isotônico compatível com as membranas do muco nasal.
As formulações para administração retal podem ser apresentadas como um supositório com um veículo adequado tais como manteiga de cacau, gorduras hidrogenadas ou ácido carboxílico graxo hidrogenado.
As formulações oftálmicas tais como colírios são preparadas por um método similar ao spray nasal, exceto que o pH e os fatores isotônicos são de preferência ajustados para combinar ao do olho.
As formulações tópicas compreendem os conjugados da inven- ção dissolvidos ou suspensos em um ou mais meios, tais como óleo mineral, petróleo, polihidróxi álcoois ou outras bases usadas para formulações farmacêuticas tópicas.
Além dos ingredientes mencionados antes, as formulações desta invenção podem também incluir um ou mais ingrediente (s) auxiliar (es) selecionados entre diluentes, tampões, agentes aromatizantes, desintegra-dores, agentes tensoativos, espessantes, lubrificantes, conservantes (inclusive antioxidantes) e similares.
Consequentemente, a presente invenção considera a provisão de polímeros adequados para estabilização in vitro de interferon-beta-1a em solução, como uma aplicação ilustrativa preferida de aplicação não terapêutica. Os polímeros podem ser empregados por exemplo para aumentar a estabilidade térmica e a resistência à degradação enzímica do interferon-beta-1a. A melhoria da característica da estabilidade térmica do interferon-beta-1a pela conjugação à maneira da presente invenção fornece um meio de melhorar o prazo de validade, a estabilidade à temperatura ambiente e a robustez dos reagentes de pesquisa e dos kits.
Os Exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar a presente invenção e não devem ser considerados como limitativos da mesma. Em particular, deve ser entendido que os experimentos in vivo com animal aqui descritos podem ser variados, de modo que sejam possíveis outras modificações e variações da metodologia básica. Por exemplo, no Exemplo 5, um versado na técnica podia usar outros ensaios com neopterina ou podia alterar o número e a espécie de primata usada. Estas modificações e variações aos Exemplos devem ser consideradas como estando dentro do espírito e do âmbito da invenção. EXEMPLO 1: Estudos de estrutura/atividade de interferon-beta-1a humano que usa mutações de substituição de alanina/serina: Análise de sítios de ligação de receptor e domínios funcionais A. Levantamento Uma análise mutacional extensiva de interferon-beta-1 a humano (IFN-beta-1a) foi empreendida com os objetivos de mapear os resíduos ne- cessários para atividade e ligação do receptor. A disponibilidade da estrutura de cristal de 3-D de IFN-beta humano (Karpusas,M. et. al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. 94:11813-11818) permitia que se identificasse substituições por alanina (ou serina) dos resíduos expostos a solvente disponível para interações de receptor, e reter os aminoácidos envolvidos em ligações in-tramoleculares. Um conjunto de 15 mutações de substituição de alanina foi projetado que substituiu entre 2 e 8 resíduos ao longo de regiões distintas de cada uma das hélices (A, B, C, D, E) e circuitos fechados (AB, CD, DE). Uma ponta de histidina amino-terminal que compreende seis resíduos de histidina foi incluída para purificação por afinidade, assim como um sítio de divagem de enteroquinase para remoção da extensão amino-terminal. Os interferons resultantes são denominados "interferon (IFN)-beta com ponta his" ou "His-interferon-beta" ou "Hisg-interferon-beta" e similares.
Foram construídos vários plasmídeos de expressão de IFN-beta de ponta his mutante usando-se uma contrução de gene IFN-beta do tipo selvagem como um molde para mutagênese. A estratégia de mutagênese envolvia primeiro a introdução de sítios de divagem únicos de enzima de restrição em todo o gene IFN-beta de ponta his do tipo selvagem com oligo-nucleotídeo sintético duplexes, que codificaram mutações de substituição de alanina (ou de serina). Finalmente, os genes IFN mutantes foram subeiona-dos em um plasmídeo que dirigia a expressão de célula de mamífero em uma linhagem de célula de rim 293 humano.
As consequências funcionais destas mutações foram avaliadas em ensaios antivirais e de antiproliferação. Foi desenvolvido um ensaio de ligação de IFN não radioativo para analisar estes mutantes em sua ligação ao receptor de superfície ("complexo IFNAR1/2") de células de linfoma humano de Daudi Burkitt. Além disso, foi desenvolvido um ensaio para mapear superfícies de interação entre os mutantes his-lFN-beta e IFNAR2 que empregava uma proteína de fusão IFNAR2/lg, compreendida do domínio extra-celular IFNAR2 da proteína receptora IFN fundido à dobradiça, domínios CH2 e CH3 de lgG1 humana. 1. Criação de um gene interferon beta como um molde para mutagênese A estratégia para gerar mutantes substituídos com IFN-beta ala-nina (ou serina) era primeiro criar um gene IFN-beta modificado, que codificava a proteína do tipo selvagem porém que continha sítios de divagem únicos de enzima de restrição difusos através do gene. Os únicos sítios foram usados para trocar as sequências do tipo selvagem para duplexes de oligonucleotídeo sintéticos, que codificavam os códons mutados. Para se obter um cassete de expressão interferon-beta-1 a humano adequado para a criação de genes mutantes, o cDNA IFN-beta (GenBank acesso n° E00029) foi amplificado por PCR. Era necessário uma clonagem inicial do gene do IFN-beta no plasmídeo pMJB107, um derivado de pACYC184, ver Rose et. al. 1988, Nucleic Acids Res. 16(1) 355) para realizar mutagênese sítio-dirigi-da do gene em um plasmídeo em que havia falta de sítios de restrição específicos que seriam gerados pela mutagênese.
Os iniciadores de PCR usados para subclonar as seqüências de codificação do gene IFN-beta humano também permitiam que se introduzisse um sítio de divagem de enteroquinase a montante e em quadro com o gene IFN-beta (iniciador 5' PCR 5'TTCTCCGGAGAC GAT GAT GACAAGAT GAGCTACAACTTGCTTGGATTC CTACAAAGAAGC-3'(SEQ ID N° 3: "BET-021", e iniciador 3' PCR 5’-GCGC TCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCT GTAAGTC-3' (SEQ ID N° 4: "BET-022") e sítios de enzima de restrição de flanqueamento (BspEI e Xho I) úteis para clonagem nos sítios do plasmídeo pMJB107. O DNA resultante é denominado fragmento A da PCR.
Uma sequência de sinal eficiente proveniente da sequência de sinal (VCAM-1) de molécula-1 de adesão de célula vascular humana e uma ponta de histidina seis foram introduzidas na construção final proveniente de um segundo fragmento de DNA criado pelo pDSW247 (fragmento B). O plasmídeo pDSW247 é um derivado de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) do qual foi deletado o gene EBNA-1 e que contém a sequência de sinal VCAM-1 (VCAMss) fundida a montane e em quadro com uma ponta de histidina seis. Os iniciadores de PCR que foram usados para gerar a porção cassete VCAMss-ponta de histidina foram KID-369 (iniciador 5' PCR 5'-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3': SEQ ID N°: 5) e KID-421 iniciador (3' PCR 5'-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCC CCGGA-3': SEQ ID N°. 6) que incorporam sítios de divagem de enzima de restrição de flanqueamento (Notl e BspEI) que permitiam a excisão do fragmento B DNA.
Para criar um vetor de plasmídeo que continha a sequência de sina) VCAM-1, ponta his e gene interferon-beta realizou-se uma ligação de três vias usando-se fragmentos de DNA purificados em gel provenientes do vetor de plasmídeo pMJB107 (Notl e Xhol clivados), fragmento A de PCR (BspEI e Xhol clivados) e fragmento B (Notl e BspEI clivados). O plasmídeo ligado foi usado para transformar células de E. coli JA221 ou XL1-Blue e as colônias resistentes a ampicilina foram colhidas e testadas para inserções por análise do mapa de restrição. Foi obtido DNA maxiprep e a seqüência da inserção foi verificada por seqüenciamento de DNA. A construção resultante foi chamada pCMG260. 2. Criação de mutantes de substituição de alanina de interferon-beta humano em PCMG260 O plasmídeo pCMG260 foi usado como um molde para rodadas múltiplas de mutagênese (U.S.E. Site Directed Mutagenesis Kit (Boehringer-Mannheim), que introduziu sítios de divagem de restrição únicos em posições ao longo da seqüência de codificação de proteína de IFN-beta mas não mudou a seqüência resultante da proteína. Os plasmídeos mutageniza-dos foram usados para transformar as cepas JA221 ou XL1-Blue de E. coli e colônias recombinantes selecionadas para resistência a cloranfenicol. As colônias resistentes a cloranfenicol também foram testads para a presença do sítio de restrição de enzima único desejado por análise de mapeamento de restrição de DNA. 0 plasmídeo IFN-beta resultante, pCMG275.8, continha o conjunto completo de sítios de divagem de enzima de restrição únicos e a seqüência de DNA do gene foi verificada. A seqüência completa de DNA (SEQ ID N°. 1) do gene interferon beta de ponta his, modificado, juntamente com a seqüência de codificação da produto da reação (SEQ ID N°. 2), são fornecidas na Figura 10. O conjunto completo de mutações de substituição de alanina é representado na Tabela 1 (abaixo). Os nomes dos mutantes especificam as regiões estruturais (hélices e circuitos fechados) em que foram introduzidas as mutações. O inteiro painel de substituições de alanina (serina) resulta em mutação de 65 dos 165 aminoácidos de IFN-beta humano. O painel de mutantes foi criado partindo de pCMG275.8 por substituição de segmentos de DNA entre os únicos sítios de restrição com du-plexes oligonucleotídeo sintéticos, que continham a informação de codificação genética representada na Tabela 2 (ver a seguir). Para criar os vários plasmídeos mutantes de substituição de alanina foram ligados juntos vetor pCMG275.8 purificado por gel (clivado com a enzima de restrição apropriada, como indicado na lista a seguir para cada região estrutural IFN-beta) e duplexes de oligonucleotídeo (as seqüências de filamento de codificação são mostradas na Tabela 2). As misturas de ligação foram usadas para transformar a cepa JA221 e E. coli e colônias recombinantes selecionadas por resistência a ampicilina. As colônias resistentes a ampicilina foram testadas para a presença da inserção das mutações por seleção por sítios de enzima de restrição apropriados. Para dois mutantes (A2 e CD2), a estratégia de clonagem acarretou o uso de dois duplexes de oligonucleotídeos sintéticos (mostrados na Tabela 2), que contêm extremidades complementares pendentes para permitir que elas se liguem uma as outras e a cadeia principal do vetor-IFN-beta em uma ligação em três vias. A lista a seguir ilustra os sítios que foram usados para clonar os oligonucleotídeos mutados da Tabela 2. O esquema de clonagem (subseção B) mostra as posições destes sítios únicos sobre o gene do interferon beta. TABELA 1 Posições de mutações de substituição de alanina de HU|FN-beta 1 10 10 10 «o 50 < i.........I |........| ........j IFN-p MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKE
Al -A-AA—A—A------------------------------------------- A2 ------------------AA-AA—AA------------------------------ ABl ------------------------------AAA-AA------------------- AB2 --------------------------------------AA-A—A----------- AB3 ----------------------------------------------AAAAA-AAJ I_______helix A________11__________AE loop__________ 60 70 ao 30 100 * ‘........1 . . Λ .. IFN-β ΟΑΑ1ΤΙΥΕ^ΝΙΡΑΙΡΚ0Ο335Τ0Λ«ΝΕΤΐνΕΝΙιΙίΑΝνΥΗΩΙΝΗίίΚΤνΐίΕΕΚ BI ----------A—AS-------------------------------------- B2 ----------------------AAA------------------------------- Cl ---------------------------AS—AA—S------------------ C2 --------------------------------------A A—AA-------- CDl ------------------------------------------------------AA I______.helix B___^ j_________________________j j_CD 1( 110 »0 130 160 ISO 160 14. . . ,1 I i IFN-β DmOKl^SUfíiKRYYGRIl^íaU^SKCAWlVRVEIÍ«RKF¥ FtNRLTGYI CD2 AA-A—A—A-----------------------——— ------------------ D ------------------A-AA—A-----------— — ---------- DEI ----------------------------AA------------------------— DE2 —---------—-------------------AA-------------- CD loop_j |___helix D | |_____„helix B A linha designada IFN-beta mostra a seqüência de IF humano do tipo selvagem. São mostradas substituições com alar serina dos resíduos de IFN-beta para cada um dos mutantes e os nhos, abaixo das regiões relevantes, indicam sequências do tipo gem. As estruturas de hélices e de circuitos fechados estão inc como linhas contínuas abaixo dos mutantes. O circuito fechado D vessa o espaço entre as hélices D e E. Dois mutantes adicionais d( tituição com alanina (H93A, H97A e H121A) foram gerados e ana em ensaios antivirais para avaliar os efeitos de mutação destas his que quelam zinco no dímero da estrutura do cristal. Ambos estes tes mantinham atividade completa do tipo selvagem em ensaios an sugerindo que a formação de dímero mediada por zinco não é imp para a atividade da IFN-beta. TABELA 2 Al SEQ ID CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTACAAGC
N°: Ύ TTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC BET-053 A2 SEQ ID GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGAGGCTT
N°: 8 ^ GAATACT BET-039 SEQ ID
N°: 9 ^ GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA BET-041 AB1 SEQ ID AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGACATCC
N° : 10 ' CTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA BET-080 AB2 SEQ ID AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGCTATCCC
N°: 11' TGCAGAGATTAAGCAGCTGCA BET-082 AB3 SEQ ID AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACA N°: 12 -BET-084 SEQ ID TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA N° : 13 BET-086 BI SEQ ID CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTCAGACAA
N° : 14 GATTCATC TAGCAC TGGCTGGAA BET-110 B2 SEQ ID CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCGCTGCAG
N°: 15· CTTCATCTAGCACTGGCTGGAA BET-112 Cl SEQ ID GGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATCATCAGATAAACCATC
N°:16 x TGAAGACAGTTCTAG BET-114 C2 SEQ ID GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGATAGCACATC
N°: 17 TGGCTGCAGTTCTAG BET-092 CD1 SEQ ID CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT N°: 18 · BET-094 CD2 SEQ ID CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGA
N°: 19 GCGCGCTGCACCTGAAAAGA BET-096 SEQ ID TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTCACACTGT N°:20 BET-106 Dl SEQ ID CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATACCTG
N° : 21 GCAGCCAAGGAGTAC TCACACTGT BET-108 DEI SEQ ID CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTG
N°: 22 AAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGAT BET-116 DE2 SEQ ID CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGA N": 23 AGGCAAAGGAGTACGCTGCATGTGCCTGGACGAT BET-U8 El SF.Q ID CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAG N°: 24 BET-104 B. Construção de plasmídeos de expressão EBNA 293 Os genes IFN-beta do tipo selvagem e mutantes, fundidos à se-qüência de sinal VCAM-1, ponta his e sítio de divagem da enteroquinase, foram purificados com gel como fragmentos de restrição Notl e BamHI de 761 pares de base. Os genes purificados foram subclonados em vetor de plasmídeo pDSW247 clivado por Notl e BamHI, como representado no esquema. O plasmídeo pDSW247 é um vetor de expressão para expressão transiente de proteína em células de rim EBNA 293 humano (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ele contém o promotor precoce do gene do citomegalovírus e os elementos reguladores EBV que são necessários para expressão de gene de alto nível naquele sistema, assim como marcadores selecionáveis para E. coli (resistência à ampicilina) e células de EBNA 293 (resistência à higromicina) como observado no esquema de estratégia de clonagem (a seguir). Os plasmídeos ligados foram usados para transformar células JA221 ou XL1-Blue de E. coli e as colônias resistentes a ampicilina foram colhidas e testadas para inserções por análise do mapa de restrição. Foi obtido DNA Maxiprep e a seqüência das inserções foi verificada por se-qüenciamento de DNA. Foram usados clones positivos que apresentam as seqüências mutagenizadas desejadas para transfectar células de rim EBNA 293 humano como descrito a seguir. A estratégia global de clonagem é apresentada a seguir: Representação Esquemática de Estratégia de Clonagem de Plasmídeos de Expressão IFN-beta C. Expressão e Avaliação Quantitativa de mutantes de substituição IFN-beta-1a alanina As células EBNA 293 humanas (Invitrogen, Carlsbad, CA, Chi-ttenden, T. (1989) J. Virol. 63: 3016-3025) foram mantidas como culturas subconfluentes em meio de Eagle Modificado por Dulbecco suplementado com soro fetal bovino a 10%, glutamina 2 mM e 250 pg/ml de Geneticin (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Os plasmídeos de expressão pDSW247 foram transfectados transientemente em células EBNA 293 usando o protocolo da lipofectamina (Gibco/BRL, Life Technologies). Os meios condicionados foram colhidos 3-4 dias após a transfecção, os restos de células foram removidos por centrifugação e a concentração de his-IFN-beta foi avaliada quantitativamente por ELISA. O ensaio ELISA foi realizado usando-se anticorpos policlonais de coelho (IgG purificado com proteína A, os anticorpos foram elevados a IFN-beta-1 a humano purificado) para revestir placas de ELISA de 96 cavidades e uma forma biotinilada da mesma IgG policlonal de coelho foi usada como um reagente secundário para permitir a detecção de interferon usando-se peroxidase de raiz forte ligada a estreptavidina (HRP: Jackson Im-munoResearch, W. Grove, PA). Foi usada uma série de diluição de interfe-ron-beta-1a para gerar curvas de concentração padronizadas. O his-IFN-beta contendo meios condicionados provenientes dos transfectantes EBNA foi diluído para se obter amostras contendo meios condicionados provenientes dos transfectantes de EBNA para se obter amostras com concentrações na faixa de entre 10 ng/ml e 0,3 ng/ml no ensaio ELISA. Para confirmar as concentrações do IFN-beta em meios determinados por ELISA, foi realizada análise de western blot. Os sobrenadantes de cultura reduzida e os padrões de interferon-beta-1 a foram sujeitos a SDS-PAGE sobre géis de gradiente de 10-20% (Novex, San Diego, CA) e enxugados sobre membranas PDVF. Foram detectadas faixas imunorreativas com um anti-soro anti-interferon-beta-1a policlonal de coelho (n° 447, Biogen, Inc., um segundo anti-soro que foi elevado contra interferon-beta-1 a), seguido por tratamento com IgG anticoelho de burro ligado a HRP (Jackson ImmunoResearch). D. Avaliação dos Mutantes Interferon-beta para Ligação de Receptor As propriedades de ligação de receptor do mutantes Interferon-beta descritos em C foram avaliados usando-se dois ensaios de ligação diferentes. Um ensaio media a ligação dos mutantes de interferon-beta a uma proteína de fusão, IFNAR2/lg, que compreende o domínio extracelular da cadeia receptora FINAR2 humana fundida a parte da região constante de um IgG humana. IFNAR2-Fc foi expresso em células de ovário de hamster chinês (CHO) e purificado por cromatografia de afinida de sefarose de proteína A de acordo com as instruções do fabricante (Pierce Chem. Co., Ro-ckford, IL, catálogo n° 20334). A ligação dos mutantes de interferon-beta a IFNAR2-Fc foi medida em um ensaio de formato ELISA. Foram preparadas placas para ELISA por revestimento de placas de 96 cavidades de fundo chato durante toda a noite a 4°C com 5 μΙ/cavidade de anticorpo monoclonal lgG1 anti-humano de camundongo (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) a 10 pg/ml em tampão de revestimento (NaHCC>3 50 mM, MgCl2 0,2 mM, CaCl2 0,2 mM, pH 9,6). As placas foram lavadas duas vezes com PBS contendo Tween-20 a 0,05% e bloqueadas com leite seco sem gordura a 0,5% em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Após mais duas lavagens, foram adicionados 50 μΙ de 1 pg/ml de IFNAR2-Fc em leite a 0,5% em PBS contendo Tween-20 a 0,05% a cada cavidade e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente e as placas foram então lavadas mais duas vezes. A ligação dos mutantes de interferon-beta a IFNAR2-Fc foi medida por adição de 50 μΙ/cavidade de interferon-beta mutante em meios condicionados, diluídos em série em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% e incubação durante 2 horas a 4°C. As diluições de mutante de interferon-beta tipicamente estavam na faixa de desde aproximadamente 1 μΜ até 10 pM. Após lavagem, o interferon-beta ligado às placas foi detectado por adição de 50 μΙ/cavidade de um coquetel que consiste em uma diluição de 1:1000 de um anticorpo anti-interferon policlo-nal de coelho (n° 447) mais IgG anticoelho de burro ligado a peroxidase de raiz forte (HRP) (Jackson ImmunoResearch) e incubação durante 15 minutos a 4°C. Após duas lavagens, foi adicionado substrato HRP e a placa foi incubada a 4°C antes de ser lida sobre uma leitora de placa ELISA a uma absorbância de 450 nm. Os dados foram comparados graficamente como absorbância versus a concentração de mutante interferon-beta e a afinidade para a ligação do mutante interferon-beta a IFNAR2-Fc foi determinada adaptando-se os dados a uma equação hiperbólica simples de ligação. Os resultados destas análises são mostrados na Figura 1, em que a afinidade de ligação para cada mutante, determinou pelo menos três experimentos independentes, é expressa como uma percentagem daquela medida para o interferon-beta-1a Hisg do tipo selvagem.
Foi usado um segundo ensaio de ligação de receptor para medir a afinidade com a qual os mutantes interferon-beta se ligam a células de Daudi que expressam ambas as cadeias receptoras, IFNAR1 e IFNAR2, que juntas compreendem o receptor para interferon-beta. Este ensaio à base de FACS usou um anticorpo monoclonal bloqueador dirigido contra o domínio extracelular de IFNAR1, EA12 (Biogen, Inc.), para distinguir o receptor desocupado (livre) do receptor ao qual estava ligado o interferon-beta. Foram colocadas células de Daudi (20 μΙ a 2,5 x 10? células/ml) em placas de ELISA de fundo em "V" de 96 cavidades e incubadas durante 1 hora a 4°C com várias concentrações de mutante interferon-beta (20 μΙ em tampão FACS; FBS a 5%, NaN3 a 0,1% em PBS). As diluições em série desejáveis de mu-tantes interferon-beta estão na faixa de desde 0,5 μΜ até 0,5 pM. A cada cavidade foram adicionados 100 ng de anticorpo monoclonal Ea12 (10 μΙ) anti-IFNAR1 murino biotinilado e as placas incubadas durante uns 2 minutos adicionais à temperatura ambiente antes de serem lavadas duas vezes com tampão FACS (4°C). As células foram então incubadas durante 30 minutos a 4°C com 50 μΙ/cavidade de uma diluição de 1:200 de estreptavidina conjugada a R-Ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch), lavadas duas vezes em tampão FACS, ressuspensas em 300 μΙ de tampão FACS que contém para-formaldeído a 0,5% e transferidas para tubos de poliestireno de 12 x 75 mm (Falcon 2052). As amostras foram então analisadas por citometria de fluxo em um FACScan (Becton Dickinson). Os dados foram comparados graficamente como intensidade média de fluorescência do canal (MFCI) versus a concentração de mutante interferon-beta; as afinidades de ligação foram definidas como a concentração de mutante interferon-beta que fornece 50% de inibição da formação de mancha do anticorpo. Cada mutante foi testado diversas vezes. A Figura 2 apresenta as afinidades de ligação do receptor para cada interferon-beta mutante, determinado para este método, expresso como uma percentagem da afinidade medida para o interferon-beta-1 a Hísq do tipo selvagem em cada experimento. E. Avaliação dos Mutantes de Interferon-berta para Função Os mutantes de interferon-beta também foram testados para atividade funcional usando-se ensaios in vitro para atividade antiviral e para a capacidade do interferon-beta inibir a proliferação da célula. Realizou-se em cada mutante um mínimo de três ensaios antivirais, cada um com pontos de dados em triplicata. Foi incluído o interferon-beta-1 a Ηίβρ do tipo selvagem como uma referência em cada experimento. Os ensaios antivirais foram realizados por tratamento de células de carcinoma do pulmão humano A549 (ATCC CCL 185) durante toda a noite com diluições 2 vezes em série de interferon-beta mutante a concentrações que alcançavam a faixa de entre proteção antiviral completa e nenhuma proteção contra matança da célula viral. No dia seguinte, as células foram testadas durante dois dias com vírus de encefalomiocardite (ECMV) a uma diluição que resultava em completa matança da célula na ausência de interferon. Foram então desenvolvidas placas com o corante metabólico MTT (2,3-bis [2-metóxi-4-nitro-5-sulfo-fe-nil]-2H-tetrazólio-5-carboxianilida) (M-5655, Sigma, St. Louis, MO). Foi preparada uma solução estoque de MTT a 5 mg/ml em PBS e filtrada estéril e 50 pl desta solução foram diluídos em culturas de célula (100 μΙ por cavidade). Após a incubação à temperatura ambiente durante 30 - 60 minutos, a solução de MTT/meio foi descartada, as células foram lavadas com 100 μΙ de PBS e finalmente o corante metabolizado foi solubilizado em 10 μΙ de ácido clorídrico 1,2 N em isopropanol a 90%. Células viáveis (como evidenciado pela presença do corante) foram avaliadas quantitativamente por ab-sorbância a 450 nm. Os dados foram analisados por comparação gráfica da absorbância contra a concentração de interferon-beta mutante e a atividade de cada mutante foi definida como a concentração a qual 50% das células foram eliminadas. A Figura 3 apresenta a atividade de cada mutante expressa como uma percentagem da atividade medida para o interferon-beta-1a do tipo selvagem com ponta His em cada experimento.
Foram também avaliados os mutantes de interferon-beta para função em um ensaio antiproliferação. Células de linfoma humano de Daudi Burkitt (ATCC# CCL 213) foram semeadas a 2 x 105 células/ml em RPMI 1620 suplementado com soro fetal de bezerro 10% definido (Hyclone, Logan Utah) e L-glutamina 2 mM. Cada cavidade também continha uma dada concentração de interferon-beta mutante em um volume total final de 100 μΙ de meio por cavidade; as concentrações de interferon-beta usadas foram escolhidas para atravessar a faixa de inibição máxima de proliferação de célula de Daudi até nenhuma inibição (isto é proliferação total). Foram usados pontos em duplicata para o experimento para cada concentração de mu- tante de interferon-beta testado e um conjunto em duplicata de células não tratadas foi incluído em todos os experimentos. As células foram incubadas durante dois dias a 37°C em incubadores de CO2 a 5%, após 0 que foi adicionado 1 pCi por cavidade de timidina tritiada ((metil-3H) timidina, Amer-sham TRK758) em 50 pl de meio a cada cavidade e incubada durante mais 4 horas. As células foram colhidas usando-se uma coletador de placa LKB e a incorporação de timidina tritiada foi medida usando-se uma leitora de placa LKB beta. Foi calculada a média de valores experimentais em duplicada e determinados os desvios padrões. Os dados foram comparados graficamente como contagens médias por minuto versus a concentração de mutante interferon-beta e a atividade de cada mutante foi definida como a concentração necessária para fornecer 50% da inibição máxima de crescimento observada. Realizou-se ensaios múltiplos para cada mutante. A Figura 4 apresenta os resultados expressos como uma percentagem da atividade encontrada para 0 interferon-beta-1a do tipo selvagem de ponta his em cada experimento. F. Propriedades dos Mutantes de Interferon-Beta Descobriu-se que 0 interferon-beta-1 a do tipo selvagem de ponta histidina tem atividades nos ensaios antiviral e antiproliferação que eram cada um aproximadamente 3 vezes menores do que as atividades correspondentes encontradas para o interferon-beta-1 a do tipo selvagem sem ponta. Sendo que todos mutantes de interferon-beta A1-E contêm a se-qüência de ponta his idêntica em seus terminais N, foram determinados os efeitos das mutações sobre as propriedades da molécula por comparação das atividades destes mutantes nos ensaios antiviral, antiproliferação e de ligação com a atividade observada para 0 interferon-beta-1 a do tipo selvagem de ponta his. Agindo desse modo, supõe-se que as variações nas atividades dos mutantes A1-E, comparadas ao interferon-beta-1 a do tipo selvagem de ponta his, são qualitativamente e quantitativamente aproximadamente as mesmas que os efeitos que estas mesmas mutações teriam na ausência de da ponta his N-terminal. A suposição equivalente para construções de ponta ou de fusão de outras citocinas solúveis é comumente manti- da para ser verdadeira por praticantes da técnica de mutagênese de varredura de alanina, especialmente quanto a atividade funcional in vitro da construção de ponta ou de fusão for próxima a da citocina do tipo selvagem como é o caso aqui. Ver, por exemplo, Pearce K.H. Jr, et. al., J. Biol. Chem. 272: 20595-20602 (1997) e Jones, J.T., et. al, J. Biol. Chem. 273: 11667-11674(1998).
Os dados apresentados nas Figuras 1-4 sugerem três tipos de efeitos que foram causados pela mutagênese direcionada. Estes efeitos podem ser vantajosos para desenvolvimento da droga interferon sob certas circunstâncias. Os três tipos de efeito são os seguintes: (a) mutantes com maior atividade antiviral do que aquela do interferon-beta-1 a do tipo selvagem (por exemplo mutante C1); (b) mutantes que apresentam atividade tanto em ensaios antivirais como de antiproliferação, porém para os quais a atividade antiproliferação é desproporcionalmente baixa em relação à atividade antiviral, comparado com o interferon-beta-1 a do tipo selvagem (por exemplo, mutantes C1, D e DE1); e (c) antagonistas funcionais (por exemplo, A1, B2, CD2 e DE1), que apresentam atividades antivirais e de antiproliferação que são desproporcionalmente baixas em relação à ligação do receptor, comparadas ao interferon-beta-1 a do tipo selvagem. Pode ser observado que alguns mutantes ficam em mais de uma classe. Estas classes são revistas abaixo. Embora tivéssemos caracterizado estas classes de mutantes em relação àqueles exemplos relacionados, devia ser considerado que outras mutações nestas regiões podem resultar em efeitos sobre a atividade similares ou até mesmo melhorados: a) O mutante C1 possui atividade antiviral que é aproximadamente 6 vezes maior do que aquela do interferon-beta-1 a com ponta his do tipo selvagem. Prevê-se que este mutante e outros deste tipo sejam úteis na redução da quantidade de interferon-beta que deve ser administrada para se conseguir um dado nível de efeito antiviral. É de se esperar a diminuição da quantidade de proteína administrada para reduzir a imunogenicidade da proteína e também pode reduzir os efeitos coalterais provenientes de toxici-dades à base de não mecanismo. É previsto que as mutações nesta classe sejam vantajosas em situações em que a vantagem terapêutica da administração de interferon-beta resulta de seus efeitos antivirais e onde os efeitos antiproliferativos contribuem para a toxicidade ou para efeitos colaterais in-desejados. (b) As atividades relativas (% do tipo selvagem) dos mutantes substituídos com alanina em dosagem antiviral e antiproliferativo são comparadas na Figura 5. As atividades coordenadamente variadas (isto é, as atividades antivirais e antiproliferativas que diferem pelo mesmo fator das atividades do interferon-beta-1a de ponta his do tipo selvagem) são observadas na maioria dos mutantes (aqueles que estão da linha diagonal). No entanto, diversos mutantes apresentam maiores alterações na atividade em um ensaio relativo ao outro, comparado ao interferon-beta-1 a de ponta his do tipo selvagem, como evidenciado por deslocamente da diagonal. Três de tais mutantes são apresentados na Tabela 3 a seguir. O mutante C1 apresenta atividade antiviral que é 6 vezes mais alta do que a do interferon-beta-1a de ponta his do tipo selvagem, porém sua atividade no ensaio antiprolife-ração é similar ao do tipo selvagem. O mutante C1 assim tem atividade antiviral que é melhorada por um fator de 5,2 sobre sua atividade antiprolifera-ção, em relação ao interferon-beta-1 a de ponta his do tipo selvagem. Similarmente, o mutante D apresenta 65% da atividade do tipo selvagem na dosagem antiviral, porém apenas 20% da atividade do tipo selvagem no ensaio de antiproliferação e assim tem atividade antiviral que é melhorada 3,4 vezes sobre sua atividade de antiproliferação comparado ao tipo selvagem. O mutante DE1 apresenta 26% da atividade do tipo selvagem na dosagem antiviral porém apenas 8,5% no ensaio de antiproliferação e assim tem atividade antiviral que é melhorada 3,0 vezes sobre sua atividade de antiproliferação comparado ao interferon-beta-1 a de ponta his do tipo selvagem. Quando administradas a uma concentração suficiente para se conseguir um nível desejado de atividade antiviral, estas proteínas do mutante apresentarão níveis substancialmente mais baixos de atividade antiproliferativa do que a proteína do tipo selvagem. É previsto que as mutanções nesta classe, como aquelas na classe (a), sejam vantajosas em situações em que a van- tagem terapêutica de administração de interferon-beta resulte de seus efeitos antivirais e em que os efeitos antiproliferativos contribuem para a toxicidade ou para efeitos colaterais indesejados. TABELA 3 (c) Mutantes com atividades antiviral e de antiproliferação que são inferiores em relação à ligação do receptor, comparado ao interferon-beta-1a de ponta his do tipo selvagem (ver Tabela 4 a seguir). O mutante A1 apresenta atividades antiviral e de antiproliferação que são 2,0 vezes e 1,8 vez mais altas do que aquela observada para o interferon-beta-1 a de ponta his do tipo selvagem, porém se liga ao receptor cognato em células de Dau-di com uma afinidade que é 29 vezes maior do que o do tipo selvagem. A ligação deste mutante ao receptor de IFN-beta é assim melhorada aproximadamente 15 vezes comparado às atividades antiviral e de antiproliferação da proteína. Similarmente, os mutantes B2, CD2 e DE1 apresentam melhorias de ligação em relação à atividade antiviral de 4,6-, 4,6- e 18 vezes, respectivamente e em relação à atividade de antiproliferação de 3,5-, 15- e 54 vezes. É previsto que estas proteínas sejam úteis como antagonistas funcionais da atividade de IFN-beta endógeno e possivelmente de outros interfe-rons do Tipo I endógeno, porque eles têm a capacidade de se ligar e de ocupar o receptor e ainda de gerar apenas uma pequena fração da resposta funcional nas células alvo que seriam observadas com IFN-beta do tipo selvagem. TABELA 4 G. Relação de Muteína a Estrutura Tridimensional de Interferon Embora as estruturas de cristal publicadas para uma forma não glicosilada de interferon beta murino (T. Senda, S. Saitoh e Y. Mitsui. Refi-ned Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon-beta a Resolução de 2,15 Â. J. Mol. Biol. 253: 187-207 (1995)) e para interferon-beta-2b humano (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P.P Trotta, T.L. Nagabhushan e M.R. Walter. Zinc Mediated Dimer of Human Interferon-alpha2b Revealed by X-ray Crystallography. Structure. 4: 1453-1463 (1996)) tenham fornecido modelos para a cadeia principal de polipeptídeo de interferon beta humano, recentemente foi resolvida a estrutura para interferon-beta-1a em seu estado glicosilado (M. Karpusas, M. Noite, C.B. Benton, W. Meier, W.N. Lipscomb e S.E. Goelz. The Crystal Structure of Human Interfe-ron-beta at 2.2 Á resolution. Proc. Natl. Acad. Sei., USA 94: 11813-11818 (1997)).
Os resultados de nossas análises mutacionais podem ser resumidos em relação à estrutura 3D de interferon-beta-1a (não apresentado aqui). Certas mutações criaram uma redução na atividade (2 a >5 vezes reduzida). As regiões mutadas correspondem às substituições fornecidas nas Tabelas 1 e 2. Os resíduos importantes para a atividade antiviral e de anti-proliferação estão localizados na metade inferior da molécula de interferon-beta-1a (Painel a e b). As mutações na metade superior da molécula, onde estão posicionados os terminais amino e carbóxi, não tiverem efeito sobre as atividades biológicas ou sobre a ligação do receptor.
As mutações na hélice A2, no circuito fechado AB, AB2 e na hélice E são as mais significativas em seu efeito sobre a função e resultaram em uma redução drástica tanto na atividade como na ligação do receptor à superfície da célula. Esta região (hélice A2, circuitos fechados AB & AB2 e na hélice E) corresponde ao sítio de ligação IFNAR2, pois nenhum destes mutantes ligou IFNAR/Fc em nosso ensaio.
Embora aquelas mutações que eram importantes para ligação de IFNAR2 também afetassem a ligação da célula, as propriedades de ligação da superfície da célula também são influenciadas por resíduos em outras regiões da molécula (hélice B1, hélice C2). Pode ser observado nos modelos 3-D (não apresentados aqui) que representa os efeitos dos mutantes de substituição de alanina que as regiões N-terminal, C-terminal e da hélice C glicosilada da molécula de interferon-beta-1a não ficam dentro do sítio de ligação do receptor. As mutações nestas regiões não reduziram a atividade biológica ou reduzem a ligação de receptor da superfície da célula. EXEMPLO 2: Preparação e Caracterização de lnterferon-beta-1 a Conjugado A, Preparação de interferon PEGuilado. O interferon-beta-1a não formulado (comercializado como AVO-NEX R) intermediário a granel a 250 pg/ml em fosfato de sódio 100 mM pH 7,2, NaCI 200 mM) foi diluído com um igual volume de MES 100 mM pH 5,0 e o pH foi ajustado até 5,0 com HCI. A amostra foi carregada sobre uma coluna SP-Sepharose R FF (Pharmacia, Piscataway, NJ) a 6 mg de interferon-beta-1a/ml de resina. A coluna foi lavada com fosfato de sódio 5 mM pH 5,5, NaCI 75 mM e o produto foi eluído com fosfato de sódio 30 mM pH 6,0, NaCI 600 mM. As frações de eluição foram analisadas por seus valores de absor-bância a 280 nm e a concentração de interferon nas amostras avaliadas pela absorbância usando-se um coeficiente de extinção de 1,51 para uma solução de 1 mg/ml. A uma solução de 1 mg/ml do interferon-beta-1 a proveniente do eluato SP, foi adicionado fosfato de sódio 0,5 M pH 6,0 a cianoborohidreto de sódio 50 mM (Aldrich, Milwaukee, Wl) foi adicionado a 5 mM e foi adicio- nado PEG aldeído 20K (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) a 5 mg/ml. A amostra foi incubada à temperatura ambiente durante 20 horas. O interferon PEGuilado foi purificado dos produtos da reação por etapas sequenciais de cromatografia sobre uma coluna de dimensionamento Superose R 6 FPLC (Pharmacia) com fosfato de sódio 5 mM pH 5,5, NaCI 150 mM como a fase móvel e SP-Sepharose R FF. A coluna de dimensionamento resultou em separação de linha base de interferon-beta modificado e não modificado (cromatógrafo não apresentado aqui). A reunião de eluição contendo PEG-interferon beta proveniente da filtração em gel foi diluída 1:1 com água e carregada a 2 mg de interferon beta/ml de resina sobre uma coluna de Se-pharose R. A coluna foi lavada com fosfato de sódio 5 mM pH 5,5, NaCI 75 mM e então o interferon beta PEGuilado foi eluído da coluna com fosfato de sódio 5 mM pH 5,5, NaCI 800 mM. As frações de eluição foram analisadas para teor de proteína por absorbância a 280 nm. A concentração de interferon PEGuilado é registrada em equivalentes de interferon, pois o grupamento PEG não contribuiu para a absorbância a 280 nm. B. Caracterização Bioquímica de Interferon PEGuilado.
Foram analisadas amostras para extensão de modificação por SDS-PAGE (gel não apresentado aqui). A adição de um PEG isolado resultou em um desvio na massa aparente de interferon de 20 kDa a 55 kDa que era facilmente aparente por análise. Na amostra PEGuilada não havia provas de interferon-beta-1 a não modificado nem de formas de massa mais altas resultantes da presença de grupos PEG adicionais. A presença de um PEG simples foi verificada por espectrometria de massa de MALDI. A especificidade da reação de pegilação foi avaliada por mapeamento de peptídeo. Alíquotas de 20 pg de interferon-beta-1 a PEGuilado e não modificado como um controle, em 240 μΙ de Tris HCI 200 mM pH 9,0, EDTA 1 mM foram digeridas com 1,5 pg de lisil endoproteinase proveniente de Achromobacter (Wako Bioproducts, Richmond, VA) durante 3-4 horas a 27°C. Foram adicionados 200 mg Hcl de guanidina a cada amostra e os produtos de divagem foram fracionados em uma coluna Vydac C4 (0,46 x 25 cm) que usa um gradiente de 30 minutos de 0 a 70% de acetonitrila, em TFA a 0,1% a uma va- zão de 1,4 ml/minuto. O efluente da coluna foi monitorado para absorbância a 214 nm.
Os resultados da análise são apresentados na Figura 6. Todos os peptídeos previstos da digestão com endoproteinaseLys-C de interferon-beta-1 a foram identificados por seqüenciamento de terminal N e espectro-metria de massa e destes, apenas o peptídeo que contém o terminal N de interferon (AP8) foi alterado pela modificação como evidente por seu desaparecimento do mapa. Os dados de mapeamento portanto indicam, que o grupamento PEG está especificamente ligado a este peptídeo. Os dados também indicam, que a modificação com PEG é direcionada para o terminal N da proteína, pois apenas a modificação do terminal N resultaria na perda específica deste peptídeo.
As provas adicionais para esta conclusão foram obtidas por isolamento do peptídeo N-terminal PEGuilado proveniente da digestão com endoproteinase-Lys-C, digerindo também com brometo de cianogênio (CNBr) e sujeitando esta amostra a ionização por dessorção com laser auxiliada por matriz após análise de seqüência da queda da fontes (MALDI PSD). A digestão com CNBr do peptídeo N-terminal irá clivar ainda mais este peptídeo em dois fragmentos, a metionina terminal (M1) que contém o grupamento PEG e SYNLLGFLQR (resíduos 2-11 na seqüência madura de interferon beta). A análise de seqüência identificou o peptídeo não modificado SYNLLGFLQR, que era o resultado previsto deste tratamento. A atividade antiviral das amostras de interferon-beta-1 a foi testada em células de carcinoma de pulmão humano (células A549) que tinham sido expostas ao vírus da encefalomiocardite (EMC) usando-se os procedimentos que envolvem a formação de cor MTT delineada acima. Em resumo, as células A549 foram pré-tratadas durante 24 horas com interferon-beta-1 a ou com interferon-beta-1 a modificado com PEG (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5, 31,25, 50, 33,3, 22,2, 14,8, 9,9, 6,6, 4,39 pg/ml) antes do teste com o vírus. O ensaio foi realizado usando-se pontos de dados em duplicata para cada concentração de interferon-beta-1 a. Os desvios padrões são apresentados como barras de erro na Figura 7. A concentração de interferon-beta-la (formulado ou a granel) que ofereceu 50% de eliminação viral (o efeito 50% citopático") (50% OD45Q máximo) era aproximadamente 11 pg/ml e 0 efeito 50% citopático para interferon-beta-1 a modificado por PEG era aproximadamente 11 pg/ml. Assim, a conjugação de PEG não alterou a atividade antiviral de interferon-beta-1 a. Neste ensaio, foi encontrado rotineiramente, que a atividade específica de interferon-beta-1 a é a-proximadamente 10 vezes maior do que a atividade específica de interferon-beta-1 b e portanto o interferon-beta-1 a PEGuilado é significativamente mais ativo do que qualquer produto interferon-beta-1 b. O interferon-beta-1 a também foi PEGuilado com um grupamento PEG-aldeído de 5 K, que foi comprado de Fluka, Inc. (N°. do Cat. 75936, Ronkonkoma, NY) esguindo 0 mesmo protocolo descrito para modificação com aldeído PEG de 20 K exceto que a reação continha 2 mg/ml do PEG de 5 K. A modificação com 0 PEG de 5 K também foi altamente específica para 0 terminal N e não alterou a atividade antiviral do interferon-beta-1 a. Como 0 aduto de 20 K, o PEG interferon-beta-1 a de 5 K não podia ser distinguido do interferon-beta-1 a não modificado na dosagem antiviral. EXEMPLO 3: A PEGilação Protege o interferon-beta-1 a de Agregação Induzida por Esforço A agregação de interferon beta tem um efeito prejudicial sobre a atividade. Anteriormente, foi descoberto que a glicosilação tem um efeito drástico sobre a estabilidade de interferon-beta-1 a versus as formas não glicosiladas de interferon beta e deduziu-se que a glicosilação contribui para a atividade específica superior de interferon-beta-1 a (Runkel L. e outros, Pharm. Res. 15: 641-649). Para investigar se a conjugação com um polímero de polialquileno glicol podia estabilizar ainda 0 interferon beta, sujeitou-se 0 interferon-beta-1 a PEGuilado a esforço térmico usando 0 seguinte protocolo: Realizou-se a desnaturação térmica usando-se um espetrofotô-metro CARY 3 UV-visível adaptado com um suporte de cubeta aquecido termoeletricamente, controlado por computador. As soluções de interferon-beta-la em HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCI 20 mM foram equilibradas a 25°C em uma cubeta de 1 ml. A temperatura do suporte da cubeta foi então elevada de 25°C até 80°C a uma taxa de 2°C/minuto e a desnaturação da proteína seguida por monitoração contínua de absorbância a 280 nm. O ponto médio do evento cooperativo que se desdobra, Tm, foi obtido pelas curvas de fusão por determinação da temperatura que a absorbância medida estava no meio do caminho entre os valores definidos por linhas extrapoladas das regiões lineares em cada lado das transições cooperativas que se desdobram.
Os resultados desta análise são apresentados na Figura 8. Enquanto o interferon-beta-1 a não PEGuilado foi desnaturado e agregado com um ponto de transição de 50% a 60°C, não houve provas de agregação do interferon PEGuilado até mesmo a 80°C. Em uma análise independente, estendeu-se o tratamento térmico de esforço até 95°C e até mesmo a esta temperatura mais elevada, não foram observadas provas de agregação. Assim, a conjugação com este polímero de polietileno glicol tem um efeito acentuado e vantajoso sobre a estabilidade da proteína. Foi observada estabilização similar com interferon-beta-1 a modificado, que contém o PEG de 20 K e de 5 K. EXEMPLO 4. Medida de atividade antiviral de interferon-beta-1 a no plasma de camundongos tratados com interferon-beta-1 a e com interferon-beta-1 a PEGuilado Camundongos (C57B1/6) são injetados i.v. através da veia da cauda com 50.000 Unidades de interferon-beta-1 a ou com 50.000 Unidades de interferon-beta-1 a PEGuilado que contém o PEG de 20 K ou um volume igual de tampão de fosfato fornecido como um controle. O sangue destes camundongos é obtido por sangramentos retro-orbitais a diferentes pontos do tempo após injeção (imediatamente, 0,25, 1, 4, 24 e 48 horas). Há pelo menos 3 camundongos sangrados em cada ponto do tempo. O sangue todo é coletado em tubos que contêm anticoagulante, as células são removidas e o plasma resultante congelado até a ocasião do ensaio. Estas amostras de plasma são então testadas em ensaios antivirais.
As amostras de plasma são diluídas 1:10 em meios isentos de soro e passadas através de um filtro de seringa de 0,2 pm. As amostras diluídas são testadas em ensaios antivirais. As amostras são tituladas em cavidades designados de uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades contendo células A549. As diluições de um interferon-beta-1a padrão (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 e 0,6 U/ml) e de quatro amostras de plasma foram dosadas em cada placa. As células A549 são pré-tratadas com amostras de plasma diluídas durante 24 horas antes do teste com vírus EMC. Após uma incubação durante dois dias com vírus, as células viáveis são coradas com uma solução de MTT (a 5 mg/ml em tampão fosfato) durante 1 hora, lavadas com tampão fosfato e solubilizadas com HCI 1,2 N em isopropanol. As cavidades foram lidos a 450 nm. São geradas curvas padrões para cada placa e usadas para determinar a quantidade de de atividade de interferon-beta-1a em cada amostra teste. A atividade nas amostras provenientes dos diferentes camundongos são utilizadas em gráficos contra os pontos de tempo na Figura 9. A perda mais lenta de interferon-beta-1 a PEGuilado da circulação como uma função do tempo indica, que a semivida da amostra PEGui-lada é muito mais longa do que aquele do controle de interferon-beta-1 a não tratado. Embora o controle ficasse amplamente claro após 4 horas, uma fração significativa do produto PEGuilado foi detectada após 48 horas. Baseado nos níveis iniciais de atividade em soro e aqueles que restam após 48 horas, deduz-se que a semivida do interferon PEGuilado é estendida quando comparada à semivida de interferon-beta-1 a não modificado. Uma segunda descoberta altamente significativa do estudo foi que muito pouco da forma PEGuilada foi perdida durante a fase de distribuição, como evidenciado pelos níveis altamente similares de atividade no tempo 0 e após 60 minutos. Os dados indicam que, diferentemente do interferon-beta-1 a de controle, a distribuição do produto PEGuilado está amplamente limitada à vas-culatura. EXEMPLO 5: Farmacocinética Comparativa e Farmacodinâmica em Prima-tas (Protocolo Geral) São conduzidos estudos comparativos com conjugados de in- terferon-beta-1 a e interferon-beta-1a nativo (como interferon-beta-1 a intermediário não formulado em fosfato de sódio e NaCI, pH 7,2) para determinar sua estabilidade relativa e atividade em primatas. Nestes estudos, a farma-cocinética e a farmacodinâmica do conjugado polímero-interferon-beta-1a em primatas são comparadas à do interferon-beta-1 a nativo e deduções razoáveis podem ser estendidas a seres humanos.
Animais e Métodos Projeto de Estudo Este é um grupo paralelo, repetir o estudo da dose para avaliar a farmacocinética e a farmacodinâmica comparativas do interferon-beta-1 a conjugado e não conjugado.
Primatas saudáveis (de preferência macacos rhesus) são usados para este estudo. Antes da dosagem, todos os animais serão avaliadas para sinais de saúde por um Lab Animal Veterinary em duas ocasiões dentro de 14 dias antes de testar a administração do artigo; uma avaliação deve ser dentrod e 24 horas antes da primeira administração do artigo teste. Apenas animais saudáveis irão receber o artigo teste. As avaliações irão incluir um exame físico geral e retiradas de sangue pré-dose para patologia clínica de base e nível de anticorpo de base a interferon-beta-1 a. Todos os animais serão pesados e as temperaturas do corpo serão registradas dentro de 24 horas antes das administrações de artigo do teste.
Doze sujeitos são alistados e distribuídos em grupos para receber 1 MU/kg de interferon-beta-1 a como um conjugado ou um não conjugado de interferon-beta-1 a, porém interferon-beta-1 a de outro modo idêntico. A administração é por vias subcutânea (SC) ou intravenosa (IV). Todos os animais devem ser tratados com interferon-beta pela primeira vez. Cada animal será dosado em daus ocasiões; as doses serão separadas de quatro semanas. O volume da dose será 1,0 mL/kg. É retirado sangue pra testagem farmacocinética a vários intervalos de tempo após cada injeção. As amostras de sangue para medidas do interferon induziam resposta biológica, marcador, neopterina de soro, também são retirados após administração da droga do estudo.
As avaliações durante o período de estudo incluem observações clínicas realizadas 30 minutos e 1 hora após a dose para sinais de toxicidade. Serão realizadas observações diárias do lado da gaiola e serão registrados aparência geral, sinais de toxicidade, desconforto e mudanças de comportamento. Os pesos do corpo e as temperaturas do corpo serão registradas a intervalos regulares durante 21 dias após a dose. Métodos de Ensaio Os níveis de interferon beta no soro são avaliados quantitativamente usando-se um bioensaio de efeito citopático (CPE). O ensaio CEP mede os níveis de atividade antiviral mediada por interferon. O nível de atividade antiviral em uma amostra reflete o número de moléculas de interferon ativo contidas naquela amostra na ocasião da retirada do sangue. Esta abordagem foi o método padrão para avaliar a farmacocinética de interferon beta. O ensaio CPE usado nos estudo habitual detecta a capacidade do interferon beta proteger as células de carcinoma do pulmão humano (A549, n°CCL-185, ATCC, Rockville, MD) de citotoxicidade em virtude de vírus da encefalomiocardite (EMC). As células são pré-incubadas durante 15 a 20 horas com amostras de soro para permitir a indução e a síntese de proteínas induzíveis por interferon que então armam uma resposta antiviral. Depois disso, o vírus EMC é adicionado e incubado durante mais umas 30 horas antes de ser feita a avaliação da citotoxicidade usando-se uma mancha com violeta cristal. Um padrão interno de interferon-beta assim como um padrão interno de conjugado PEG é testado concorrentemente com amostras sobre cada placa de dosagem. Este padrão é calibrado contra um padrão de referência de interferon de fibroblasto humano (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53). Cada placa de dosagem também inclui cavidades de controle de crescimento de célula que não contêm nem interferon beta de qualquer espécie nem EMC e as cavidades de controle de vírus contêm células e EMC mas não interferon beta. As placas de controle que contêm o padrão e as amostras também são preparadas para determinar o efeito, se houver, das amostras sobre o crescimento da célula. Estas placas são coradas sem a adição de vírus.
Amostras e padrões são testados em duplicata sobre cada uma das placas de dosagem em réplica, fornecendo quatro pontos de dados por amostra. É registrada a média geométrica da concentração das quatro repli-catas. O limite de detecção nesta dosagem é 10 unidades (U)/ml. São determinadas concentrações de neopterina no soro na unidade de farmacologia clínica usando-se ensaios comercialmente disponíveis. Métodos Farmacocinéticos e Estatísticos É usado software RstripTM (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT) para adaptar dados aos modelos farmacocinéticos. As médias geométricas das concentrações são comparadas graficamente com o tempo para cada grupo. Como os resultados da dosagem são expressos em diluições, as médias geométricas são consideradas mais apropriadas do que as médias aritméticas. Os níveis de interferon no soro são ajustados para valores básicos e as concentrações no soro não detectáveis são ajustadas a 5 U/ml, que representa a metade do limite inferior de detecção.
Para dados de infusão IV, um modelo de infusão IV de dois compartimentos é adaptado à concentração detectável do soro para cada sujeito e os dados SC são adapatados a um modelo de injeção de dois compartimentos. São calculados os parâmetros farmacocinéticos a seguir: (i) concentração observada do pico, Cmax (U/ml); (ii) área sob a curva de 0 a 48 horas, AUC usando a regra tra- pezoidal; (iii) semivida de eliminação; e, pelos dados de infusão (se for empregado IV): (iv) semivida de distribuição (h); (v) remoção (ml/h) (vi) volume de distribuição aparente, Vd (L). É usado software WinNonlin (Scientific Consulting Inc., Apex, NC) para calcular as semividas de eliminação após a injeção SC e IM.
Para neopterina, são apresentadas as médias aritméticas pelo tempo para cada grupo, é calculada Emax, a variação máxima da linha base. Cmax, AUC e Emax são submetidos a uma análise de uma via de va-riância para comparar grupos de dosagem. Cmax e AUC são transformados logaritmicamente antes da análise; são registradas as médias geométricas. EXEMPLO 6: Avaliação Comparativa de interferon-beta-1a PEGuilado e Farmacocinética do lnterferon-beta-1a em Macacos Rhesus Materiais e Métodos lnterferon-beta-1a ou IFN-beta-1a PEGuilado foram administrados a macacos rhesus no dia 1 e de novo no dia 29 pelas vias intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) como descrito no protocolo geral do Exemplo 5. No dia 1, seis macacos receberam IFN-beta-1a (3 por via) e outros seis macacos receberam IFN-beta-1a PEGuilado (3 por via). No dia 29, as doses foram repetidas. A dose IV foi administrada como uma injeção de bolus lenta em uma veia cefálica ou safenosa. A dose SC foi administrada sob a pele no dorso após raspagem dos pelos no local da injeção. O sangue foi coletado pela via femoral a pontos de tempo especificados e deixados coagular para se obter o soro. O soro foi analisado para níveis de substâncias funcionais da droga usando-se um método validado de CPE antiviral e para níveis de nepterina e de beta2-microglobulina como medidas farmacodinâmicas de atividade. Foram calculados parâmetros farmacológicos usando-se o software WinNolin versão 2.0 (Scientific Consulting Inc., Apex, NC).
Os dados de concentração foram analisados por métodos padronizados modelo-independentes (análise não compartimental) para se obter parâmetros farmacocinéticos. A área sob a curva (AUC) foi calculada usando-se a regra trapezoidal. Foram realizadas análises estatísticas, inclusive média aritmética e desvio padrão, usando-se o software Microsoft Excel versão 5.0 (Microsoft Corp., Redmond WA). Os valores de concentração registrados como limites inferiores de avaliação quantitativa (BLQ) não foram usados na análise farmacocinética. Em conseqüência do fato de que diferentes computadores e programas de computador arredondam ou trun-cam números diferentemente, os valores em algumas tabelas (por exemplo médias, desvios padrões ou valores individuais) podem diferir ligeiramente daquelas nas outras tabelas, de dados calculados individualmente ou de dados de análise estatística. Nem a integridade nem a interpretação dos dados foi afetada por estas diferenças.
Resultados e Discussão Dentro de cada via de administração, o IFN-beta-1a PEGuilado exibiu maior biodisponibilidade (como medida pela área sob a curva de concentração de soro-tempo). Além disso, o IFN-beta-1a PEGuilado tem uma maior biodisponibilidade absoluta comparado ao IFN-beta-1a quando administrado pela via SC. Os parâmetros farmacocinéticos estão resumidos na Tabela 5. A administração de IFN-beta-1a PEGuilado tanto por via IV como SC resulta em um aumento na semivida assim como na AUC de IFN-beta-1a. TABELA 5: Média (+ Desvio Padrão) BG9418 Parâmetros Farmacocinéticos Após Administração IV ou SC (Dose 1) de 1 MU/kg de IFN-beta-1a ou de IFN-beta-1a PEGuilado a Macacos Rhesusa an = 3 Após a administração IV da primeira dose, a média (+ Desvio Padrão) do pico das concentrações de soro (Cmax) de IFN-beta-1a e de IFN-beta-1a PEGuilado foram 6400 (+ 0) e 10800 (+ 3,5) U/mL, respectiva- mente. Os valores médios de AUC (+ desvio padrão) foram 44453 {+ 799) e 34373 (+ 3601) U*h/ml, respectivamente. Após a primeira administração SC, as médias (+ Desvio Padrão) de Cmax de IFN-beta-1a e IFN-beta-1a PE-Guilado foram 277 (+ 75) e 1080 (+ 381) U/ml, respectivamente. A média (+ desvio padrão) dos valores de AUC foram 4753 (+ 3170) e 44952 (+ 1443) U*h/ml, respectivamente.
Ambos os níveis de neopterina do soro e de beta2microglobu-lina do soro foram elevados após o tratamento com IFN-beta e IFN-beta PEGuilado, indicando atividade farmacológica dos produtos às altas doses dos compostos teste usados, não havia diferença na atividade farmacológica de IFN beta-1a e de IFN beta-1a PEGuilado por qualquer via de administração (os dados não são apresentados). EXEMPLO 7: Avaliação Comparativa de lnterferon-beta-1 a PEGuilado e Farmacocinética do lnterferon-beta-1 a em Ratos Seguindo Vários Modos de Administração A finalidade deste estudo foi determinar a biodisponibilidade comparativa de interferon-beta-1 a e de interferon-beta-1 a PEGuilado por diversas vias de administração.
Materiais e Métodos: Foram usados ratos fêmeas de Lewis (a 190 gramas cada) para análises farmacocinéticas com dois ratos por via/formulação. Os ratos foram canulados na jugular e foi administrado intravenosamente, intraversadone-almente, oralmente, subcutaneamente ou intratraquealmente interferon-beta-1 a humano ou interferon-beta-1 a humano PEGuilado de 5 K ou interferon-beta-1 a humano de 20 K (em um veículo que consiste em 14 mg/ml de HSA em fosfato de sódio 50 mM, NaCI 100 mM, pH 7,2). O sangue foi processado diversas vezes durante um período de 72 horas a 0, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 75 minutos, 3 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas. O protocolo é apresentado na Tabela 6. Foi realizado o bioensaio de efeito citiopático (CPE) nas amostras de soro para detectar interferon-beta no soro. Os resultados gerados com interferon-beta-1 a não modificado e interferon-beta-1 a PEGuilado com PEG de 20 K são apresentados na Tabela 7.
Em todos os casos, a pegilação resultou em aumentos significativos em t 1/2 e AUC. TABELA 6 TABELA 7 EXEMPLO 8: Efeitos Anti-Antioaênicos de lnterferon-beta-1 a Conjugado com Polímero: Avaliação da Capacidade de lnterferon-beta-1 a PEGuilado inibir a proliferação in vitro de célula endotelial Células endoteliais venosas humanas (Cell Systems, Cat. n° 2V0-P75) e células endoteliais microvasculares dermais humanas (Celi Systems, Cat. n° 2MI-C25) são mantidas em cultura com CS-C Médium Kit (Cell Systems, Cat. n° 4Z0-500). Vinte e quatro horas antes do experimento, as células são tripsinizadas e ressuspensas em meio de dosagem, 90% de M199 e 10% de soro fetal bovino (FBS) e são ajustadas até a densidade desejada de célula. As células são então aplicadas sobre placas revestidas com gelatina com 24 ou 96 cavidades, a 12.500 células/cavidade ou 2.000 células/cavidade, respectivamente.
Após incubação durante toda a noite, o meio de dosagem é substituído por meio novo conetndo 20 ng/ml de Fator de Crescimento de Fibroblast básico recombinante humano (Becton Dickinson, Cat. n° 40060) e várias concentrações de proteínas de interferon-beta-1a conjugadas ou não conjugadas ou controle positivo (pode ser usada endostatina como um controle positivo, como podia um anticorpo a bFGF). O volume final é ajustado até 0,5 ml na placa de 24 cavidades ou 0,2 ml na placa de 96 cavidades.
Após vinte e quatro horas, as células são tripsinizadas para contagem de Coulter, congeladas para leitura por fluorescência CyQuant ou marcadas com [3H] timidina. A inibição de proliferação de célula endotelial in vitro por interferon-beta-1 a conjugado e não conjugado era comparável, indicando que a PEGilação não tinha interferido na capacidade do interferon funcionar neste ajuste.
Este ensaio in vitro testa as moléculas de interferon-beta humano da invenção para os efeitos sobre a proliferação de célula endotelial o que pode ser indicativo de efeitos antiangiogênicos in vivo. Ver 0'Reilly, M.S., T. Boehm, Y. Shing, N. Fukal, G. Vasios, W. Lane. E. Flynn, J. Birkhe-ad, B. Olsen e J. Folkman. (1997). Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogensis and Tumor Growth. Cell 88, 277-285. EXEMPLO 9: Modelo In Vivo para Testar Efeitos Antiangiogênicos e de Ne-ovascularização de lnterferon-beta-1a Conjugado Foi desenvolvida uma variedade de modelos para testar os efeitos antiangiogênicos e antijeovascularização das moléculas aqui descritas. Alguns destes modelos foram descritos nas Patentes U.S. 5.733.876 (31 de março de 1998: "Method of inhibiting angiogenesis) e 5.135.919 (4 de agosto de 1992: "Method and a pharmaceutical composition for the inhi-bition of angiogenesis"). Outros ensaios incluem o ensaio da membrana co-rioalantóica sem casca (CAM) de S, Taylor e J. Folkman; Nature, 297, 307 (1982) e R. Crum, S. Szabo e J. Folkman; Science, 230. 1375 (1985); o modelo de angiogênese do método do saco de ar dorsal do camundongo de Folkman, J. e outros; J. Exp. Med., 133, 275 (1971) e o ensaio da microbol-sa corneal do rato de Gimbrone, M.A. Jr. e outros, J. Natl. Câncer Inst. 52, 413 (1974) em que a vascularização da córnea é induzida em ratos machos adultos da variedade Sprague-Dawley (Charles River, Japão) por implante de 500 ng de pelotas de FGF básico (bovino, R & D Systems, Inc.) impregnado em EVA (copolímero de etileno-acetato de vinila) em cada córnea.
Outros métodos para testagem de interferon-beta murino PE-Guilado para efeitos antiangiogênicos em um modelo animal incluem (mas não estão limitados a) protocolos para selecionar novos agentes potenciais anticâncer como descrito no original Câncer Chemotherapy Reports, Parte 3, Vol. 3, N°. 2, Setembro de 1972 e o suplemento In Vivo Câncer Models, 1976-1982, NIH Publication N° 84-2635, Fevereiro de 1984.
Por causa das espécies barreiras de interferons do Tipo I, para avaliar a atividade aníiangiogênica de interferon-beta conjugado a polímero em modelos de roedores, são geradas preparações de interferon-beta de roedor conjugado com polímero. Tais métodos de seleção são exemplificados por um protocolo para testar os efeitos antiangiogênicos de interferon-beta murino PEGuilado sobre Carcinoma de Pulmão de Lewis implantado subcutaneamente.
Origem da Linhagem do Tumor: Surgiu espontaneamente em 1951 como um carcinoma do pul- mão em um camundongo C57BL/6.
Sumário dos Procedimentos de Teste: Um fragmento de tumor é implantado subcutaneamente na região axilar de um camundongo B6D2F1. O agente teste (isto é, um interferon PEGuilado da invenção) é administrado em várias doses, subcutaneamente (SC) ou intraversadonealmente (IP) em múltiplos da invenção após a implantação do tumor. 0 parâmetro medido é tempo de sobrevivência média. Os resultados são expressos como uma percentagem do tempo de controle de sobrevivência.
Animais: Propagação: camundongos C57BL/6.
Testagem: camundongos B6D2F1.
Peso: Os camundongos deviam estar dentro de uma faixa de peso de 3 g com um peso mínimo de 18 g para machos e 17 g para fêmeas.
Sexo: É usado sexo para todos os animais de teste e de controle em um experimento.
Fonte: Uma fonte, se possível, para todos os animais em um experimento.
Tamanho do Experimento: Dez animais por grupo de teste.
Transferência de Tumor: PROPAGAÇÃO: Fragmento: Preparar um fragmento de 2-4 mm de um tumor de doador s.c.
Tempo: Dia 13-15 Local: Implantar o fragmento s.c. na região axilar com uma puntura na região inguinal. TESTAGEM: Fragmento: Preparar um fragmento de 2-4 mm de um tumor de doador s.c.
Tempo: Dia 13-15 Local: Implantar o fragmento s.c. na região axilar com uma puntura na região inguinal.
Horário de Testagem: Dia 0: Implantar o tumor. Corridas de cultura de bactérias. Testar o composto de controle positivo em cada experimento de número par. Preparar materiais. Registrar as mortes diariamente.
Dia 1: Controle das culturas. Descarte do experimento se contaminado. Randomizar os animais. Tratar como instruído (no dia 1 e nos dias seguintes).
Dia 2: Novo controle das culturas. Descarte do experimento se contaminado.
Dia 5: Pesagem do Dia 2 e dia da avaliação da toxicidade do agente no teste inicial.
Dia 14: Controle do dia de morte precoce.
Dia 48: Controle do dia de não ingestão.
Dia 60: Acabar e avaliar o experimento. Exame dos pulmões grosseiramente para tumor.
Controle de Qualidade: Escalar o composto de controle positivo (NSC 26271 (Cytoxan a uma dose de 100 mg/kg/injeção)) em cada experimento de número par, cujo regime é intraversadoneal no Dia 1 apenas. O limite inferior para o Tes-te/Controle para o controle positivo é 140%. O tempo de sobrevivência mediano do controle não tratado aceitável é 19-35,6 dias.
Avaliação: O parâmetro medido é o tempo mediano de sobrevivência. Computar os pesos médios do corpo do animal para o Dia 1 e para o Dia 5, computar a razão de Teste/ Controle para todos os grupos teste. Os pesos médios de corpo do animal para os dias de preparação e para o dia de avaliação final são computados. A razão de Teste/ Controle é computada para todos os grupos do teste com > 65% de sobreviventes no Dia 5. Um valor razão de Teste/ Controle <86% indica toxicidade. Também pode ser usada uma excessiva diferença de variação do peso do corpo (teste menos controle) na avaliação da toxicidade.
Critérios para Atividade: Uma razão inicia! de Teste/ Controle maior do que ou igual a 140% é considerada necessária para demonstrar a atividade moderada. Um valor de razão de Teste/ Controle reprodutível maior do que ou igual a 150% é considerado atividade significativa.

Claims (12)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um interferon-beta-1a (INF-p-1a) glicosilado que compreende a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:25), acoplada a um polímero que não ocorre naturalmente na extremidade N-terminal do dito interferon-β-Ι a glicosilado, o dito polímero compreendendo um grupamento polietileno glicol (PEG); um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis; e, opcionalmente qualquer ingredientes auxiliares selecionados do grupo consistindo em dilu-entes, tampões, agentes flavorizantes, surfactantes e conservantes.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o grupamento polialquileno é acoplado ao interferon-beta por meio de um grupo selecionado de um grupò aldeído, um grupo maleimi-da, um grupo vinilsulfona, um grupo haloacetato, um grande número de resíduos de histidina, um grupo hidrazina e um grupo aminotiol.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o interferon-beta-1a (interferon-3-1a) é uma proteína de fusão interferon-beta-1a.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão interferon-beta-1 a compreende uma porção de uma molécula de imunoglobulina.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o interferon-beta-1 a está acoplado ao polímero em um sítio por meio de uma porção glicano do interferon-beta-1 a
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o polímero tem um peso molecular de desde aproximadamente 5 até 40 quilodáltons.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de interferon-beta como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um interferon-beta (INF-β) glicosilado mutante selecionado a partir do grupo que consiste em INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MAYAALGALQASSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:26), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNAACAALLAALNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:27), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRAAACAADRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:28), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRAAFAIPAEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:29), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIAAAAAFAAADAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:30), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LANIASIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:31), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFAAASSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:32), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNASIVAALLSNVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:33), o ÍNF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVAHQIAHLAAVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:34), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLAAKLAAADFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:35), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEAATAGKAMSALHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:36), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGAIAAYLAAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:37), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAAAYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:38), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYAACAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:39), o INF-β compreendendo a sequência de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEM LQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKR YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRAEILANFAFIARLTGYLRN (SEQ ID NO:40), acoplada a um polímero que não ocorre naturalmente na extremidade N- terminal do dito interferon^-1a glicosilado, o dito polímero compreendendo um grupamento polietileno glicol (PEG); um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis; e, opcionalmente qualquer ingredientes auxiliares selecionados do grupo consistindo em dilu-entes, tampões, agentes flavorizantes, surfactantes e conservantes.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o mutante de interferon-beta-1 a glicosilado é uma proteína de fusão interferon-beta-1 a
10. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão interferon-beta-1 a compreende uma porção de uma molécula de imunoglobulina.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 10.
12. Processo in vitro de prolongar a atividade do interferon-beta-1a em um sistema in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende acoplar o dito interferon-beta-1 a a uma extremidade N-terminal a uma porção de polímero que não ocorre naturalmente, o dito polímero compreendendo um grupamento polietileno glicol (PEG), para fornecer uma composição de polí-mero-interferon-beta-1a acoplado e introduzir a composição de polímero-interferon-beta acoplado ao sistema in vitro.
BRPI9915542A 1998-10-16 1999-10-15 composição compreendendo um interferon-beta-1a glicosilado, composição farmacêutica compreendendo a mesma e processo in vitro de prolongar a atividade do interferon-beta-1a em um sistema in vitro BRPI9915542C1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10457298P 1998-10-16 1998-10-16
US12016199P 1999-02-16 1999-02-16
PCT/US1999/024201 WO2000023114A2 (en) 1998-10-16 1999-10-15 Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses

Publications (4)

Publication Number Publication Date
BR9915542A BR9915542A (pt) 2001-08-14
BR9915542B1 true BR9915542B1 (pt) 2016-06-07
BR9915542B8 BR9915542B8 (pt) 2017-10-31
BRPI9915542C1 BRPI9915542C1 (pt) 2021-05-25

Family

ID=26801696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI9915542A BRPI9915542C1 (pt) 1998-10-16 1999-10-15 composição compreendendo um interferon-beta-1a glicosilado, composição farmacêutica compreendendo a mesma e processo in vitro de prolongar a atividade do interferon-beta-1a em um sistema in vitro

Country Status (30)

Country Link
US (5) US6962978B2 (pt)
EP (4) EP2260872B1 (pt)
JP (5) JP4616478B2 (pt)
KR (1) KR100630849B1 (pt)
CN (2) CN101062419B (pt)
AT (1) ATE318149T1 (pt)
AU (1) AU762616B2 (pt)
BR (1) BRPI9915542C1 (pt)
CA (1) CA2345138C (pt)
CY (2) CY1105022T1 (pt)
CZ (1) CZ299164B6 (pt)
DE (1) DE69930015T2 (pt)
DK (2) DK1656952T3 (pt)
EA (1) EA004789B9 (pt)
EE (2) EE04967B1 (pt)
ES (4) ES2257884T3 (pt)
HK (2) HK1042434B (pt)
HU (1) HU229888B1 (pt)
IL (2) IL142282A0 (pt)
IS (1) IS2926B (pt)
LT (2) LT2599503T (pt)
NO (1) NO20011860L (pt)
NZ (1) NZ510689A (pt)
PL (1) PL206536B1 (pt)
PT (2) PT1656952E (pt)
SG (2) SG2008070138A (pt)
SI (2) SI1656952T1 (pt)
SK (1) SK287918B6 (pt)
TR (1) TR200101086T2 (pt)
WO (1) WO2000023114A2 (pt)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69931507T2 (de) * 1998-10-16 2007-01-11 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Interferon-beta fusionsproteine und deren verwendungen
EP2260872B1 (en) * 1998-10-16 2017-08-30 Biogen MA Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
KR20020034181A (ko) * 1999-08-27 2002-05-08 맥시겐 에이피에스 새로운 인터페론 베타-유사 분자
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
WO2002036628A2 (en) * 2000-11-02 2002-05-10 Maxygen Aps New multimeric interferon beta polypeptides
EP2080771A3 (en) 2001-02-27 2010-01-06 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
PT2279755E (pt) * 2001-10-10 2014-06-04 Ratiopharm Gmbh Remodelação e glicoconjugação do factor de crescimento de fibroblastos (fgf)
WO2003061577A2 (en) * 2002-01-18 2003-07-31 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound
WO2004020468A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
ATE466085T1 (de) * 2002-09-09 2010-05-15 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
NZ565990A (en) * 2002-09-27 2009-10-30 Biogen Idec Inc Therapies for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy using interferon-beta
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
TWI406672B (zh) 2002-12-26 2013-09-01 Mountain View Pharmaceuticals 生物效力增進的β干擾素聚合物共軛體
BR0317752A (pt) * 2002-12-26 2005-11-22 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados poliméricos de citocinas, quimiocinas, fatores do crescimento, hormÈnios polipeptìdicos e seus antagonistas com atividade de ligação a receptores conservada
JP2006523211A (ja) 2003-03-14 2006-10-12 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 分岐水溶性ポリマーとその複合物
US20050079155A1 (en) * 2003-03-20 2005-04-14 Xencor, Inc. Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages
CA2530725A1 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 Biopolymed Inc. Biologically active material conjugated with biocompatible polymer with 1:1 complex, preparation method thereof and pharmaceutical composition comprising the same
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
EP1615945B1 (en) 2003-04-09 2011-09-28 BioGeneriX AG Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7691603B2 (en) 2003-04-09 2010-04-06 Novo Nordisk A/S Intracellular formation of peptide conjugates
CA2522989A1 (en) * 2003-05-21 2004-12-02 Ares Trading S.A. Method of chromatographic analysis of a protein solution
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
ES2452640T3 (es) 2003-08-25 2014-04-02 Toray Industries, Inc. Complejo de interferón beta
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
EP1765853B1 (en) 2004-01-08 2015-10-28 ratiopharm GmbH O-linked glycosylation of G-CSF peptides
GB2429207A (en) 2004-02-02 2007-02-21 Ambrx Inc Modified human interferon polypeptides and their uses
EP1734988A4 (en) * 2004-03-01 2009-08-05 Enzon Pharmaceuticals Inc INTERFERON BETA-polymer
WO2005112911A2 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating myelin deficiency disorders
AU2005260664A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Egen Corporation Pegylated interferon alpha-1b
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2006074467A2 (en) 2005-01-10 2006-07-13 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
EP1891231A4 (en) 2005-05-25 2011-06-22 Novo Nordisk As GLYCOPEGYLATED FACTOR IX
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
EP1937294A4 (en) * 2005-10-21 2009-11-04 Synageva Biopharma Corp GLYCOLIC AND GLYCOSYLATED THERAPEUTIC PROTEINS DERIVED FROM POULTRY
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
CA2626056A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Ares Trading S.A. Interferon in influenza
EP1971355B1 (en) 2005-12-20 2020-03-11 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
WO2007110231A2 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 Nautilus Biotech, S.A. MODIFIED INTERFERON-β (IFN-β) POLYPEPTIDES
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
EP2010222A1 (en) 2006-03-31 2009-01-07 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US8637325B2 (en) * 2009-02-16 2014-01-28 University Of Wyoming Method and apparatus for pyrolysis-induced cleavage in peptides and proteins
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
JP5570809B2 (ja) 2006-09-01 2014-08-13 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 修飾タンパク質
AU2007296843C1 (en) * 2006-09-15 2012-08-16 Creabilis Therapeutics S.P.A. Polymer conjugates of Box-A of HMGB1 and Box-A variants of HMGB1
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
WO2008074032A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
EP2111230A4 (en) * 2006-12-19 2010-11-17 Merrimack Pharmaceuticals Inc COMMON ADMINISTRATION OF ALPHA-FETOPROTEIN AND AN IMMUNOMODULATING AGENT TO TREAT MULTIPLE SCLEROSE
CA2682897C (en) 2007-04-03 2016-11-22 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
EP2076533B1 (en) 2007-05-02 2014-10-08 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
JP5933923B2 (ja) * 2007-10-09 2016-06-22 ポリテリクス リミテッド 新規な複合タンパク質及びペプチド
PL2234645T3 (pl) 2007-12-20 2012-10-31 Merck Serono Sa Preparaty interferonu-beta modyfikowanego PEG
NZ586947A (en) 2008-02-08 2012-11-30 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
CN101965200B (zh) 2008-02-27 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 缀合的因子ⅷ分子
ES2525065T3 (es) 2008-04-11 2014-12-17 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Ligadores de seroalbúmina humana y sus conjugados
CA2721870C (en) 2008-04-21 2020-12-22 Tissue Regeneration Therapeutics, Inc. Genetically modified human umbilical cord perivascular cells for prophylaxis against or treatment of biological or chemical agents
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
KR20110112301A (ko) 2008-11-18 2011-10-12 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트
GB0912485D0 (en) * 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method
US9266942B2 (en) 2009-04-30 2016-02-23 Children's Hospital & Research Center Oakland Chimeric factor H binding proteins (fHbp) and methods of use
BRPI1012951A2 (pt) * 2009-06-09 2016-07-26 Defyrus Inc "administração de interferon para profilaxia ou tratamento de infecção por patôgeno"
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
DK2459224T3 (en) 2009-07-27 2016-07-25 Baxalta GmbH Blodstørkningsproteinkonjugater
AU2010277438B2 (en) 2009-07-27 2015-08-20 Baxalta GmbH Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EP3093029A1 (en) 2009-07-27 2016-11-16 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
WO2011087810A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
CN101906213B (zh) * 2010-07-23 2012-12-05 华南理工大学 一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法
CN103068853B (zh) * 2010-08-19 2016-08-10 Peg生物制药公司 协同性生物分子-聚合物轭合物
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
NZ608630A (en) * 2010-10-01 2015-03-27 Biogen Idec Inc Interferon-beta for use as monotherapy or in combination with other cancer therapies
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
MY168902A (en) 2011-10-01 2018-12-04 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
CN104136038A (zh) 2012-02-29 2014-11-05 东丽株式会社 体腔积液抑制剂
WO2014036520A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
CA2908211C (en) 2013-03-29 2022-07-19 Glytech, Inc. Polypeptide glycosylated with sialylated sugar chain
WO2016013911A1 (ko) 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
CA3023883A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
KR102642385B1 (ko) 2017-02-06 2024-03-04 오리오니스 바이오사이언시스 엔브이 표적화된 키메라 단백질 및 이의 용도
RU2661088C1 (ru) * 2017-05-24 2018-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза
WO2019152979A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
RU2739261C1 (ru) * 2019-12-31 2020-12-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека
CA3207652A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Stephanie Cornen Cytokine anchors for nkp46-binding nk cell engager proteins
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
EP4352098A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2360794C2 (de) * 1973-12-06 1984-12-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von Peptiden
CH596313A5 (pt) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
IL47468A (en) 1975-06-12 1979-05-31 Rehovot Res Prod Process for the cross-linking of proteins using water soluble cross-linking agents
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4456748A (en) 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
WO1982002715A1 (fr) 1981-02-04 1982-08-19 Sugano Haruo Gene d'interferon (beta)humain
US4414147A (en) * 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
IT1167610B (it) 1982-01-19 1987-05-13 Cetus Corp Interfreron ibrido multiclasse, composizione farmaceutica che lo contiene e procedimento di produzione
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4695543A (en) 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8412564D0 (en) * 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
CA1302320C (en) 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
US5231176A (en) 1984-08-27 1993-07-27 Genentech, Inc. Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons
FI90990C (fi) 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0205404B1 (en) 1985-06-11 1992-07-15 Ciba-Geigy Ag Hybrid interferons
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5183746A (en) 1986-10-27 1993-02-02 Schering Aktiengesellschaft Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β-
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5004605A (en) 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847625A (en) * 1988-02-16 1989-07-11 Ford Aerospace Corporation Wideband, aperture-coupled microstrip antenna
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
JPH04502011A (ja) 1988-11-23 1992-04-09 ジェネンテク，インコーポレイテッド ポリペプチド誘導体
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
ES2199935T3 (es) 1991-03-15 2004-03-01 Amgen Inc. Pegilacion de polipeptidos.
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
AU3423293A (en) * 1991-12-19 1993-07-19 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
AU5098193A (en) 1992-09-01 1994-03-29 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5306344A (en) * 1992-12-02 1994-04-26 Edward C. Levy Company Mixture of portland cement concrete materials for freeze/thaw resistance
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5641656A (en) 1993-10-22 1997-06-24 University Of Connecticut Nucleic acids encoding avian interferon (IFN) proteins and recombinant methods using them
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
AU691225B2 (en) 1993-11-10 1998-05-14 Schering Corporation Improved interferon polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
DE69521880T2 (de) 1994-02-08 2002-01-03 Amgen Inc Orales verabreichungssystem von chemischmodifizierten proteinen g-csf
US5545723A (en) * 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
GB9415379D0 (en) * 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
AU697440B2 (en) * 1994-12-07 1998-10-08 Novozymes A/S Polypeptide with reduced allergenicity
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5747639A (en) * 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
DE69800640T2 (de) 1997-01-29 2001-07-05 Polymasc Pharmaceuticals Plc L Pegylationsverfahren
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
WO1999003887A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
ATE268609T1 (de) 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
JP4574007B2 (ja) * 1998-04-28 2010-11-04 メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム ポリオール−ｉｆｎ−ベータ複体
US6703381B1 (en) * 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
EP2260872B1 (en) * 1998-10-16 2017-08-30 Biogen MA Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
DE69931507T2 (de) * 1998-10-16 2007-01-11 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Interferon-beta fusionsproteine und deren verwendungen
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
KR20020034181A (ko) * 1999-08-27 2002-05-08 맥시겐 에이피에스 새로운 인터페론 베타-유사 분자
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US6495659B2 (en) 1999-12-22 2002-12-17 Shearwater Corporation Sterically hindered poly(ethylene glycol) alkanoic acids and derivatives thereof
US9506008B2 (en) 2013-12-23 2016-11-29 Exxonmobil Research And Engineering Company Method for improving engine fuel efficiency

Also Published As

Publication number Publication date
AU1446500A (en) 2000-05-08
US20150011732A1 (en) 2015-01-08
WO2000023114A9 (en) 2001-07-05
US20090104150A1 (en) 2009-04-23
CY1105022T1 (el) 2010-03-03
CZ299164B6 (cs) 2008-05-07
CN101062419B (zh) 2016-06-29
SI1121156T1 (sl) 2006-08-31
US7446173B2 (en) 2008-11-04
EP2599503A3 (en) 2013-07-24
ES2630278T3 (es) 2017-08-21
SI1656952T1 (sl) 2014-04-30
ES2447772T3 (es) 2014-03-12
JP4616478B2 (ja) 2011-01-19
ES2653589T3 (es) 2018-02-07
EP2599503A2 (en) 2013-06-05
ES2257884T3 (es) 2006-08-01
EE05201B1 (et) 2009-08-17
EP2599503B1 (en) 2017-05-17
AU762616B2 (en) 2003-07-03
NO20011860D0 (no) 2001-04-11
CZ20011329A3 (cs) 2001-09-12
DK1656952T3 (da) 2014-01-20
EP2260872B1 (en) 2017-08-30
EA004789B1 (ru) 2004-08-26
EP2260872A3 (en) 2011-04-27
LTPA2017030I1 (lt) 2017-10-25
BRPI9915542C1 (pt) 2021-05-25
BR9915542A (pt) 2001-08-14
CA2345138C (en) 2009-12-15
DE69930015D1 (de) 2006-04-27
EE200700058A (et) 2008-02-15
CY1115125T1 (el) 2016-12-14
HK1042434B (zh) 2008-01-25
JP2011026329A (ja) 2011-02-10
BR9915542B8 (pt) 2017-10-31
LT2599503T (lt) 2017-06-26
IS2926B (is) 2015-09-15
TR200101086T2 (tr) 2001-08-21
WO2000023114A2 (en) 2000-04-27
IL142282A (en) 2007-03-08
NZ510689A (en) 2003-07-25
EP1121156B1 (en) 2006-02-22
HK1089393A1 (en) 2006-12-01
US20070098688A1 (en) 2007-05-03
KR100630849B1 (ko) 2006-10-04
US20030021765A1 (en) 2003-01-30
US9314534B2 (en) 2016-04-19
PL206536B1 (pl) 2010-08-31
HU229888B1 (en) 2014-11-28
HUP0200444A2 (en) 2002-06-29
JP5863865B2 (ja) 2016-02-17
PT1121156E (pt) 2006-05-31
US6962978B2 (en) 2005-11-08
LTC2599503I2 (lt) 2019-06-25
JP2002527491A (ja) 2002-08-27
SG2008070138A (en) 2017-08-30
IS5913A (is) 2001-03-30
WO2000023114A3 (en) 2000-09-28
EE04967B1 (et) 2008-02-15
KR20010103605A (ko) 2001-11-23
US20160250340A1 (en) 2016-09-01
JP5396358B2 (ja) 2014-01-22
EP1656952A2 (en) 2006-05-17
EA004789B9 (ru) 2017-05-31
CN1323225A (zh) 2001-11-21
ATE318149T1 (de) 2006-03-15
EA200100446A1 (ru) 2001-10-22
EP2260872A2 (en) 2010-12-15
EP1121156A2 (en) 2001-08-08
JP2007063283A (ja) 2007-03-15
PL347968A1 (en) 2002-04-22
CA2345138A1 (en) 2000-04-27
PT1656952E (pt) 2014-02-21
SK287918B6 (sk) 2012-03-02
SG110047A1 (en) 2005-04-28
DK1121156T3 (da) 2006-06-06
JP2014129420A (ja) 2014-07-10
CN101062419A (zh) 2007-10-31
JP2011093937A (ja) 2011-05-12
IL142282A0 (en) 2002-03-10
EP1656952B1 (en) 2013-12-18
NO20011860L (no) 2001-06-15
DE69930015T2 (de) 2006-10-12
EP1656952A3 (en) 2006-11-29
SK5062001A3 (en) 2002-01-07
EE200100220A (et) 2002-06-17
HK1042434A1 (en) 2002-08-16
CN1329082C (zh) 2007-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR9915542B1 (pt) composição compreendendo um interferon-beta-1a glicosilado, composição farmacêutica compreendendo a mesma e processo in vitro de prolongar a atividade do interferon-beta-1a em um sistema in vitro.
EP1121382B9 (en) Interferon-beta fusion proteins and uses
JP2002527491A5 (pt)
MXPA01003791A (es) Conjugados polimericos de interferon beta - 1a y usos de los mismos

Legal Events

Date Code Title Description
B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: BIOGEN IDEC MA, INC. (US)

Free format text: ALTERADO DE: BIOGEN, INC.

B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: BIOGEN IDEC MA INC. (US)

Free format text: ALTERADO DE: BIOGEN IDEC MA, INC.

B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B07B Technical examination (opinion): publication cancelled [chapter 7.2 patent gazette]

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO DO DESPACHO 7.1 DA RPI 1999 DE 28/04/2009, POR INCORRECAO NO PARECER.

B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/06/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B25I Requirement for requested change of headquarter
B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]
B25D Requested change of name of applicant approved
B25G Requested change of headquarter approved
B15K Others concerning applications: alteration of classification

Ipc: A61K 38/21 (2006.01), A61K 47/59 (2017.0

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 15/10/1999 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

B21A Patent or certificate of addition expired [chapter 21.1 patent gazette]

Free format text: PATENTE EXTINTA EM 15/10/2019