KR20010103605A - 인터페론 베타-1ａ의 중합체 접합체 및 용도 - Google Patents

인터페론 베타-1ａ의 중합체 접합체 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리알킬렌 글리콜 부분을 함유하는 중합체에 커플링된 인터페론-베타-1a를 포함하는 인터페론 베타 폴리펩티드에 관한 것이다. 여기서, 인터페론-베타-1a 및 폴리알킬렌 글리콜 부분은 인터페론-베타-1a가 인터페론 베타(인터페론-베타-1b)의 또다른 치료적 형태에 비하여 향상된 활성을 갖고 비접합된 인터페론-베타-1a에 비하여 활성이 낮지 않도록 배열된다. 본 발명의 접합체는 치료적 및 비치료적, 예를 들면 진단 용도로 유용하게 사용된다.

Description

인터페론 베타-1Ａ의 중합체 접합체 및 용도{POLYMER CONJUGATES OF INTERFERON BETA-1A AND USES}
목적하는 용도를 위하여 상기 단백질 물질의 유용성을 제한하는 주된 요인은 비경구적으로 투여되는 경우 단시간내 체내로부터 제거된다는 점이다. 이것은 신장내 여과와 같이 단백질 제거를 위한 통상적 경로를 사용한 클리어란스(clearance) 또는 프로테아제에 의한 대사의 결과로서 생성될 수 있다. 단백질 투여의 상기 경로와 관련된 문제는 약학 산업에서 공지되었고, 다양한 방법이 상기 문제를 해결하기 위하여 사용되었다.
단백질을 안정화시키는 다수의 방법은 이미 공지되었다. 중합성 물질과 단백질을 접합시키는 다양한 방법이 공지되었으며, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 글리코펩티드, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리아미노산의 사용을 포함한다. 생성된 접합된폴리펩티드는 비경구 용도를 위하여 생물학적 활성 및 수용성을 보유하는 것으로 보고된다.
투여 및 생체-동화를 향상시키기 위한 임상적 작용 및 노력의 초점이 된 펩티드 족은 인터페론이다. 인터페론은 다양한 임상적 질병에서 시험되었다. 이 족의 한 일원인 인간 인터페론 베타의 용도는 다발성 경화증의 치료에서 가장 잘 수립된다. 재조합 인터페론 베타의 2가지 형태는 상기 질병의 치료에 대하여 유럽 및 미국에서 최근에 허가받았다. 제1 형태는 인터페론-베타-1a(메사추세츠, 캠브리지의 바이오겐, 인크.에서 상품명 AVONEX, mfg.로 시판)이고 본원에서 "인터페론-베타-1a" 또는 "IFN-베타-1a" 또는 "IFN-β-1a" 또는 "인터페론-β-1a"과 상호교환적으로 사용된다. 제2 형태는 인터페론-베타-1b(캘리포니아주 리치몬드 버렉스에서 상품명 BETASERON으로 시판)이고, 본원에서 "인터페론-베타-1b"이다. 인터페론 베타-1a는 천연 인간 유전자 서열을 사용한 포유동물 세포에서 생성되며 글리코실화된다. 반면 인터페론 베타-1b는 아미노산 위치 17에서 유전공학적으로 시스테인-대-세린 치환을 포함하는 개질된 인간 유전자 서열을 사용하여 E.coli 박테리아에서 제조되며, 비글리코실화된다.
기존에, 본 발명자 중의 일부는 기능적 분석에서 인터페론-베타-1a 및 인터페론 베타 1b의 상대적 시험관내 성능을 직접 비교하여 인터페론-베타-1a의 특이적 활성이 인터페론-베타-1b의 특이적 활성보다 약 10배 강하다는 것을 보여주었다 (Runkel et al., 1998, Pharma. Res. 15: 641-649). 상기 활성 차이에 대한 구조적 기초를 동정하기 위하여 설계된 연구에서부터 본 발명자는 특이적 활성에 영향을주는 생성물간의 공지된 구조적 차이 중의 하나로써 글리코실화를 동정하였다. 탄수화물의 영향은 구조를 안정화시키는 기능을 통하여 대략 현시화되었다. 탄수화물의 안정화 효과는 열변성 실험 및 SEC 분석에서 증명된다. 글리코실화의 부족은 또한 열변성에 대한 감도의 증가 및 응집 증가와 관련되어 있다. PNGase F에 의한 인터페론-베타-1a로부터 탄수화물의 효소적 제거는 탈글리코실화된 생성물의 광범위한 침전을 일으킨다.
상기 연구는 인터페론-베타-1a 및 인터페론-베타-1b간 서열이 보존되지만, 이들은 별개의 생화학적 완전체이므로, 인터페론-베타-1b에 대하여 공지된 대부분의 것이 인터페론-베타-1a에 응용될 수 없으며 또한 그 역도 마찬가지임을 나타낸다..
특정 질병의 전신 치료를 위한 폴리펩티드 및 단백질의 용도가 현재 의학 관행에서 잘 허용되고 있다. 이들 물질이 치료에서 하는 역할이 중요하므로, 재조합 DNA 기법에 의한 대량 합성을 위하여 다수의 연구가 이루어지고 있다. 상기 폴리펩티드 중 다수는 그들이 생물학적 활성을 유도하는데 있어서 특이적이고 매우 강력한 내인성 분자이다.
도1. 유형 I 인터페론 수용체 쇄의 세포외 영역을 포함하는 이량체 융합 단백질, IFNAR2/Ig(인간 IgG1 불변부에 융합된 IFNAR2 엑토도메인)에 알라닌 치환된 인터페론-베타-1a 돌연변이체의 결합
IFNAR2 수용체 쇄에 대한 알라닌 치환된 IFN 돌연변이체(A1-E)의 결합 친화성은 실시예1(서브섹션D)에 설명된 바와 같이 측정되었다. 도수분포도는 야생형 his-IFN-베타(%야생형)에 비하여 상기 분석에서의 이것의 결합 친화성을 나타낸다. %야생형 값은 (야생형 his-IFN-베타의 친화성)/돌연변이체 IFN-베타의 친화성 ×100로 계산되었다. 각 실험에 대한 %야생형(O) 및 실험 세트에 대한 평균 %야생형(X)이 나타난다. 돌연변이체 A2, AB1, AB2 및 E는 야생형 his-IFN-베타 EC 50(*) 보다 500-배 높은 농도에서 IFNAR2/Fc에 결합하지 않는다.
도2. 다우디 버킷츠 림프종 세포 상에 발현된 유형 I 인터페론 세포 표면 수용체 복합체("IFNAR1/2복합체")에 알라닌 치환된 인터페론-베타-1a 돌연변이체의 결합.알라닌 치환된 돌연변이체(A1-E)의 수용체 결합 성질은 실시예 1(서브섹션 D)에 설명된 바와 같이 FACS 기초한, 세포 표면 수용체 결합 분석을 사용하여 측정되었다. 도수분포도는 야생형 his-IFN-베타(%야생형)에 비하여 상기 분석에서 수용체 결합 친화성을 나타낸다. 각 돌연변이에 대한 %야생형은 (야생형 his-IFN-베타의 친화성)/돌연변이체 IFN-베타의 친화성 ×100 으로 계산되었다. 개별 실험에 대한 %야생형 값(O) 및 실험 세트에 대한 평균 %야생형 값이 제시된다.
도3. 알라닌 치환된 인터페론-베타-1a 돌연변이체의 항바이러스 활성
알라닌 치환 돌연변이체(A1-E)의 항바이러스 활성은 실시예1에 설명된 바와 같이 EMC 바이러스로 공격된 인간 A549 세포에서 측정되었다(서브섹션 E). 도수분포도는 야생형 his-IFN-베타(%야생형)에 비교한 상기 분석에서의 활성을 보여준다. %야생형은 (야생형 his-IFN-베타의 농도[50%cpe]/돌연변이체 IFN-베타의 농도[50% cpe] ×100로서 계산되었다. 다중 분석에 대한 %야생형 및 실험 데이터 세트에 대한 평균(X)이 나타난다.
도4. 알라닌 치환된 인터페론-베타-1a 돌연변이체의 항증식 활성
알라닌 치환 돌연변이체(A1-E)의 항증식 활성은 실시예1에 설명된 다우디 버킷츠 림프종 세포에서 측정되었다(서브섹션 E). 도수분포도는 야생형 his-IFN-베타(%야생형)에 비교하여 상기 분석에서의 활성을 보여준다. %야생형은 (야생형 his-IFN-베타의 농도[50% 성장 저해]/돌연변이체 IFN-베타의 농도[50% 성장 저해] ×100로서 계산되었다. 다중 분석에 대한 %야생형(O) 및 실험 데이터 세트에 대한 평균(X)이 나타난다.
도5. 알라닌 치환된 인터페론-베타-1a 돌연변이체의 상대적 항바이러스 및 항증식 활성
항바이러스(x축) 및 항증식(y축) 분석에서 알라닌 치환 돌연변이체(A1-E)의 상대적 활성을 비교하였다. 도3 및 도4에 제시된 평균 백분율 야생형 his-IFN-베타(%야생형(x))를 상기 비교를 위하여 사용하였다. 두 활성에서 좌표의 감소/증가를 갖는 상기 돌연변이체는 수직선 상에 떨어질 것이다. 항증식 활성에 비해 부적절한 항바이러스 활성 변화를 갖는 돌연변이체는 대각선(DE1, D, C1)에서 상당히 멀리 떨어질 것이다. 유의성은 사용된 평균 %야생형 값에 고유한 표준 편차를 고려하여 결정되었다.
도6. 펩티드 맵핑에 의한 PEG화의 부위의 정위
PEG화되고 비개질화된 인터페론-β-1a를 펩티드 맵핑 분석을 한다. 표본을 엔도프로티나제 Lys-C로 절단하고 C4컬럼 상에서 역상 HPLC를 수행하였다. 컬럼은 0.1% 트리플루오로아세트산에서 아세토니트릴의 0-70% 구배를 가지고 전개되었다. 컬럼 유출은 214 nm에서 검색되었다. 패널 a, 비개질된 인터페론-β-1a. 패널 b, PEG화된 인터페론--β-1a. 화살표는 아미노산 잔기 1-19를 함유하는 인터페론-β-1a의 N-말단 엔도프로티나제 Lys 펩티드의 용출 위치를 표시한다.
도7. 접합된 및 비접합된 인터페론-베타-1a의 항바이러스 활성
X 축상에 표시된 농도에서 인터페론-베타-1a 또는 PEG화된 인터페론-베타-1a의 활성이 뇌심근염 바이러스로 공격받은 인간 폐암(A549) 세포를 사용하여 항바이러스 분석에서 측정되었다. 2일 동안 바이러스로 항온처리한 후, 살아있는 세포를MTT로 염색하고, 플레이트를 450nm에서 판독하고, 세포 생존율을 반영하는 흡광도가 Y측 상에 나타난다. 표준 편차는 에러바로 나타난다. 50% 바이러스 치사("50% 세포변성 효과")를 제공하는 인터페론-베타-1a 또는 PEG화된 인터페론-베타-1a의 농도 가 약 11pg/ml이고 PEG화된 인터페론-베타-1a에 대한 50% 세포변성 효과가 약 11pg/ml이었다.
도8. 열 변성을 사용하여 접합체의 안정화 평가
20 mM HEPES pH 7.5, 20 mM NaCL 중의 PEG화된 인터페론-베타-1a 및 비처리된 인터페론-베타-1a 대조구를 1도/분의 고정된 비율에서 가열하였다. 변성 후 280nm에서 흡광도 변화를 검색하였다. (a) 비개질화된 인터페론-베타-1a (b) PEG화된 인터페론-베타-1a.
도9. 인터페론-베타-1a 또는 PEG화된 인터페론-베타-1a로 처리된 마우스의 혈장에서 인터페론-베타 항바이러스 활성의 측정
마우스를 PEG화된 인터페론-베타-1a(20K PEG를 함유)의 50,000 유니트 또는 인터페론-베타-1a의 50,000 유니트로 정맥내 주사한다. 상기 마우스에서 X 축 상에 표시된 바와 같이 인터페론 주사후 다양한 시간에 역-순환 채혈을 통하여 혈액을 채혈한다. 각 시간 포인트에서 3 마리 이상의 마우스를 채혈하여 혈장을 제조하고 냉동시켜, 인터페론-베타 활성을 뇌심근염 바이러스로 공격된 인간 폐 암(A549) 세포를 사용하여 항바이러스 분석에서 측정한다. 살아있는 세포를 MTT 용액으로 염색하고, 플레이트를 450nm에서 판독하여, 세포 생성률 및 인터페론-베타 활성을 반영하는 흡수율을 측정한다. 표준 커브는 상품명 AVONEX로서 인터페론-베타-1a를 사용하여 각 플레이트에대하여 생성되고 각 샘플에서 인터페론-베타 활성의 양을 측정하는 데 사용된다. 각 동물에서의 데이터가 제시된다.
도10. 히스티딘-태그된 인터페론 베타 유전자 및 이것의 단백질 생성물의 전장 DNA 서열
히스티딘-태그된 IFN-베타-1a의 전장 DNA(서열 목록 번호:1)과 단백질(서열 목록 번호;2) 서열이 나타난다. 절단된 VCAM-1 신호 서열은 히스티딘 태그(His6, 위치 4-9)의 상단 3 아미노 말단 잔기(SerGlyGly)을 남긴다. 엔테로키나제 링커 서열(AspAspAspAspLys)은 스페이서에 의하여 히스티딘 태그에서 분리된다(위치 10-12, SerSerGly). 천연 IFN-베타-1a 단백질 서열은 위치(Met18-Asn183)에 걸쳐 있다.
본 발명의 요약
본 발명자는 비글리코실화된 형태에 비하여 글리코실화된 인터페론-베타의 장점에 대하여 조사하였다. 더욱 구체적으로, 본 발명자는 인터페론-베타-1b에 비하여 활성이 증가되고 또한 융합 단백질이 아닌 인터페론-베타-1a 형태에 비교하여 일반적으로 활성의 실질적 손실이 없는 융합 단백질의 유익한 성질을 갖는 인터페론-베타-1a 조성물을 개발하였다. 따라서, 상기 방식으로 개질되어 생성물(인터페론-베타 1a 융합 단백질)이 이들의 생물학적 활성의 전부 또는 대부분을 보유한다면, 약동력학 및 약물역학(예, 장기간동안 혈관구조에 체류하는 능력)의 변형으로 인한 조직 분포의 변형 및 반감기의 증가가 발생할 것이다. 상기 제형은 약학계 및의학계에서 실질적 진보로서, 인터페론이 유용한 다양한 질병, 예를 들면, 다발성 경화증, 섬유증 및 기타 염증성 또는 자가면역 질환, 암, 간염 및 기타 바이러스 질환 및 신생혈관생성에 의하여 특성화되는 질환의 관리에 상당한 기여를 할 것이다. 특히, 장기간 혈관에 체류하는 능력에 의하여 인터페론-베타-1a의 혈관생성 억제 및 잠재적으로는 혈관-뇌 장막의 통과에 사용될 수 있다. 또한, 중합체-인터페론-베타-1a 접합체를 제조함으로써 얻는 열안정성이 흡입에 의한 연속 투여에 사용되는 분말 형태로 인터페론-베타-1a를 제형화하는 경우에 유리하다.
본 발명자는 인터페론-베타-1a의 결정학적 구조를 사용하여 접합되지 않은 인터페론-베타-1a에 비하여 인터페론-베타-1a의 완전한 활성을 보유한 접합체가 되도록 인터페론-베타-1a 위치에 중합체를 연결한 인터페론-베타-1a 중합체 접합체를 개발하였다.
본 발명의 한 양태는 접합된 인터페론-베타-1a 복합체이며, 여기서 인터페론-베타-1a는 폴리알킬렌 글리콜을 완전한 일부로서 함입하는 중합체에 공유적으로 연결된다.
특히 한 양태로서, 본 발명은 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 중합체와 커플링된 생리적으로 활성인 인터페론-베타-1a를 포함하는 생리적으로 활성인 인터페론-베타-1a 조성물에 관한 것이다. 여기서, 인터페론-베타-1a 및 폴리알킬렌 글리콜 부분은 조성물내의 생리적 활성 인터페론-베타-1a가 인터페론-베타-1a 단독(즉, 커플링된 중합체가 없는 비접합된 형태)에 비하여 향상된 반감기를 갖도록 배열된다.
본 발명의 또다른 양태는 인터페론-베타-1a가 융합 단백질, 바람직하게는 면역글로블린 융합체이며 중합체와 커플링된 생리적으로 활성인 인터페론-베타-1a를 포함하는 인터페론-베타-1a 조성물이다. 상기 복합체에서, N-말단(중합체의 접합 부위) 및 C-말단(Ig 부분과의 융합 부위)의 매우 밀접함은 중합체 접합이 융합 단백질의 면역원성을 감소시킬 것을 제시한다.
또다른 양태로, 본 발명은 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 중합체와 커플링된 생리적으로 활성인 인터페론-베타-1a를 포함하는 생리적으로 활성인 인터페론-베타-1a 조성물에 관한 것으로서, 상기 인터페론-베타-1a 및 폴리알킬렌 글리콜 부분은 조성물내 생리학적으로 활성인 인터페론-베타-1a 부분이 인터페론-베타-1b 단독(즉, 커플링된 중합체가 없는 비접합된 형태)에 비하여 향상된 활성을 갖도록배열된다.
본 발명의 또다른 구체예는 인터페론-베타-1a 부분이 인터페론-베타-1a의 비돌연변이된 형태에 비하여 선택적으로 향상된 항바이러스 및/또는 항증식 활성을 갖는 뮤테인을 제공하도록 돌연변이 된 접합된 인터페론-베타-1a 단백질이다.
본 발명은 또다른 양태로서, 생리적으로 혼화가능한 폴리에틸렌 글리콜 부분에 공유적으로 커플링된 생리적으로 활성인 인터페론-베타-1a를 포함하는 안정하고, 수용성인 접합된 인터페론-베타-1a 복합체에 관한 것이다. 상기 복합체에서 인터페론-베타-1a는 인터페론-베타-1a의 유리 아미노산 기에서 불안정한 공유 결합에 의해 생리학적으로 혼화가능한 폴리에틸렌 글리콜에 고유적으로 결합될 수 있다. 여기서, 불안정한 결합은 생화학적 가수분해 및/또는 단백질분해에 의하여 생체내절단된다.
또다른 양태로서, 본 발명은 생리학적으로 혼화가능한 폴리에틸렌 글리콜에 커플링된 인터페론-베타를 포함하는, 약학적으로 허용가능한 담체 및 안정하고 수용성인 인터페론-베타 1a 복합체를 포함하는 투여 형태에 관한 것이다.
또다른 양태로서, 상술된 것과 같은 공유적으로 커플링된 인터페론-베타-1a 조성물은 진단적 또는 시험관내 용도를 위하여 인터페론-베타-1a 를 사용할 것이다. 여기서, 인터페론-베타-1a는 예를 들면 기타 진단적 또는 비생체내 용도 또는 면역분석을 위한 진단 제제이다. 상기 비치료 용도에서, 본 발명의 복합체는 분해 저항성이 향상된 안정한 조성물 형태를 제공하기 위하여 혼화가능한 용매 또는 기타 용액에 기초한 제형으로 제형화될 수 있는 안정화된 조성물로서 매우 유용하게 사용될 것이다.
비독성 중합체로 인터페론-베타-1a를 개질하는 것은 특정한 이점을 제공할 것이다. 생성물(중합체-인터페론-베타-1a 접합체)이 생물학적 활성의 전부 또는 대부분을 보유하도록 개질이 이루어지면, 조직 분포의 변형 및 반감기의 증가를 일으키는 약동력학 및 약물역학의 변형(예, 장기간 혈관에서 머무르는 능력), 용액내 안정성 증가, 면역원성 감소, 단백질분해 및 활성 제거로부터 개질된 인터페론-베타-1a의 보호; 경구 또는 흡입 용도로 분말화된 인터페론-베타-1a의 더 효과적인 제형을 만드는 열안정성의 증가의 성질이 발생할 것이다.
상술된 향상된 성질을 부여하는 인터페론-베타-1a는 경구, 에어로졸, 또는 비경구 투여의 치료법으로서 효과적일 수 있다. 또한, 기타 투여 경로, 예를 들면비강, 피부통과는 개질된 인터페론-베타-1a를 사용하여 가능할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 본 발명 조성물의 유효량을 포함하는 혈관형성 및 신생혈관형성을 저해하는 방법이다. 혈관에서 인터페론의 농도 및 기간을 증가시키는 결과로서 본 발명의 PEG화된 생성물이 혈관형성 저해제로서 특히 효과적이다.
또한 비치료적(예, 진단적) 용도로, 인터페론-베타의 진단적 및/또는 제제 종의 접합이 고려된다. 생성된 접합화 제제는 용매- 또는 용액-매개된 분해 방법을 포함한, 환경적 분해 인자에 내성이 있다. 상기 내성의 향상 및 인터페론-베타-1a 안정성 증가의 결과로서, 유효 성분의 안정성이 상당히 증가될 수 있고, 동일한 특정 최종 목적을 위하여 사용되는 인터페론-베타-1a을 함유하는 조성물은 동시에 신뢰가능하다.
본 발명의 기타 양태, 특징 및 개질은 뒤따르는 개시내용 및 첨부된 청구항으로부터 더욱 완전히 명백할 것이다.
본 발명의 상세한 설명
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공유적으로 결합된"은 특정화된 부분이 가고, 스페이서 또는 연결 부분 등과 같은 개입성 부분을 통하여 서로 간접적으로 공유 결합되거나 서로 직접적으로 공유 결합되는 것을 의미한다.
인터페론- "인터페론"(또한 "IFN"으로 언급됨)은 바이러스, 폴리펩티드 미토겐 등과 같은 다양한 유도체에 노출시 반응하여 포유동물 세포에 의하여 생성된 소형의, 종-특이적, 단일 쇄 폴리펩티드이다. 본 발명에 사용된 가장 바람직한 인터페론은 재조합 DNA 기법에 의하여 바람직하게 유도되고, 잔기 80(Asn 80)에서 글리코실화된, 인간, 인터페론-베타이다. 상기 바람직한 글리코실화된 인터페론 베타는 "인터페론-베타-1a"(또는 "IFN-베타-1a" 또는 "IFN-β-1a" 또는 "인터페론 베타 1a" 또는 "인터페론-베타-1a" 또는 "인터페론-β-1a", 모두 상호교환적으로 사용됨)라고 불린다. 용어 "인터페론-베타-1a"는 Asn 80 잔기에서 글리코실화된 모든 돌연변이 형태(즉, 실시예1)를 포함하는 것으로 의도된다.
인터페론을 비롯한 단백질을 제조하기 위한 재조합 DNA 방법이 공지되었다. 예를 들면, 미국특허 제 4,399,216호, 제5,149,636호, 제5,179,017호(Axel et al) 및 제4,470,461호(Kaufman).
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 바람직한 인터페론-베타-1a 폴리뉴클레오티드는 다양한 척추동물, 바람직하게는 포유동물의 야생형 인터페론 베타 유전자 서열에서 유래하고, 미국 특허 제5,461,656호(1997. 6. 24에 발행: 조류 유형 I 인터페론 프로프로틴 및 성숙한 조류 유형 I 인터페론을 암호화하는 DNA); 미국특허 제5,605,688호(1997. 2. 25-재조합 개 및 말 유형 I 인터페론); 미국특허 제5,231,176호(1993, 7, 27, 인간 백혈구 인터페론을 암호화하는 DNA 분자); 미국특허 제5,071,761호(1991, 12, 10, 인간 림프아세포 인터페론 LyIFN-알파-2 및 LyIFN-알파-3의 하위-서열을 코딩하는 DNA 서열); 미국특허 제4,970,161호(1990, 11, 13, 인간 인터페론-감마를 암호화하는 DNA 서열); 미국특허 제4,738,931호 (1998, 4, 19; 인간 인터페론 베타 유전자를 함유하는 DNA); 미국특허 제4,695,543호(1987. 9. 22, 인간 알파-인터페론 Gx-1 유전자) 및 미국특허 제4,456,748호(1984, 6, 24, 천연 발생하는 다양한 백혈구 인터페론의 하위-서열을 암호화하는 DNA)에서 설명된 방법과 같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 획득된다.
인터페론-베타-1a의 돌연변이체는 본 발명의 범위에 따라 사용될 수 있다. 돌연변이는 당업계에 공지된 지시된 돌연변이유발법의 통상적 방법을 사용하여 개발된다. 또한, 본 발명은 기능적으로 동등한 인터페론-베타-1a 폴리펩티드를 암호화하는 기능적으로 동등한 인터페론-베타-1a 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
인터페론-베타-1a를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드가 다음의 조건 중 1 이상을 만족시키면 인터페론-베타-1a를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드와 비교할때 "기능적 균등물"이다:
(a) "기능적 균등물"은 표준 혼성화 조건하에서 제2 폴리뉴클레오티드에 혼성화되거나 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드 서열에 축퇴(degenerate)된 제1 폴리뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하게는, 이것은 인터페론-베타-1a의 (치료적) 활성을 갖는 돌연변이체 인터페론을 암호화한다;
(b) "기능적 균등물"을 발현시 제2 폴리펩티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드이다.
요약하자면, 용어 "인터페론"은 기능적 동등물 및 상술된 제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기능적 균등물"은 기능적 균등물로 간주되는 인터페론과 동일한 효과 또는 향상된 유리한 효과를 포유동물 수용체에 주는 인터페론-베타-1a 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 인터페론-베타-1a 단백질을 의미한다. 당업자에 의하여 평가되는 바와 같이,기능적으로 균등한 단백질은 예를 들면, "기능적으로 균등한 DNA"를 발현시킴 으로써 재조합 기법에 의하여 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 비천연 발생하는 DNA에 의하여 또한 천연-발생하는 DNA에 의하여 암호화되는 인터페론-베타-1a 단백질을 포함하며, 여기서 비천연 발생하는 DNA는 천연-발생하는 DNA에 의하여 암호화되는 것과 동일한 단백질을 암호화한다. 뉴클레오티드 코딩 서열의 축퇴로 인하여, 기타 폴리뉴클레오티드도 인터페론-베타-1a를 암호화하는 데 사용될 수 있다. 이것은 서열 내 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 다른 코돈을 치환함으로써 변형시켜 잠재(silent) 변형을 제조하는 상기 서열의 전부 또는 일부를 포함한다. 상기 변형된 서열은 상기 서열의 균등물로서 간주된다. 예를 들면, Phe(F)는 2개의 코돈, TTC 또는 TTT에 의하여 암호화되고, Tyr(Y)는 TAC 또는 TAT에 의하여 암호화되며, His(H)는 CAC 또는 CAT에 의하여 암호화된다. 즉, Trp(W)는 단일 코돈, TGG에 의하여 암호화된다. 따라서, 특정 인터페론을 암호화하는 주어진 DNA 서열에 있어서, 이것을 암호화할 다수의 DNA 축퇴 서열이 존재할 것으로 생각된다. 상기 축퇴 DNA 서열은 본 발명의 범위내로 간주된다.
"융합"은 각 펩티드 골격에 의한, 2 이상의 단백질 또는 이들 단편의 공-선형의 공유 연결을 의미하며, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자의 유전자 발현에 의한 것이 가장 바람직하다. 단백질 또는 이들의 단편이 서로 다른 근원에서 유래함이 바람직하다. 따라서, 바람직한 융합 단백질은 인터페론이 아닌 제2 부분에 공유적으로 연결된 인터페론-베타-1a 단백질 또는 단편을 포함한다. 구체적으로, "인터페론-베타/Ig 융합"은 본 발명의 인터페론 베타 분자(즉,인터페론-베타-1a) 또는 이들의 단편을 포함하는 단백질이다. 이것의 N-말단 또는 C-말단은 면역글로블린 쇄의 N-말단에 연결되었으며, 상기 면역글로블린의 N-말단의 일부는 인터페론 베타로 대체된다. 인터페론-베타/Ig 융합의 종은 면역글로블린 쇄의 불변부의 적어도 일부에 연결된 본 발명의 인터페론 베타 분자(예, 인터페론-베타-1a)를 포함하는 단백질인 "인터페론-베타/Fc 융합"이다. 바람직한 Fc 융합은 중쇄 면역글로블린 쇄의 C 말단 영역을 포함하는 항체의 단편에 연결된 본 발명의 인터페론 베타 분자를 포함한다.
또한, 용어 "융합 단백질"은 하기에 설명된 정제된 단백질로부터 신규하게 제조되고 인터페론 베타 단백질이 아닌 제2 부분에 단일- 또는 이종 기능성 분자를 통하여 화학적으로 연결된 인터페론 베타 단백질을 의미한다.
본원에서 사용된 "재조합"은 단백질이 재조합 포유동물 발현계로부터 유래됨을 의미한다. 대부분의 박테리아 배양액, 예컨대 E. coli에서 발현된 단백질은 글리칸이 없으므로, 상기 발현계는 바람직하지 않다. 효모에서 발현된 단백질은 포유동물 세포에서 발현된 것과 다른 올리고다당류 구조를 가질 수 있다.
인터페론-베타 1a의 특징으로서 본원에서 사용된 바와 같이, "생물학적 활성"은, 하기에 설명된 바와 같이 실시예 1에 나타난 유형의 시험관내 항바이러스 분석에서 측정된 바와 같이, 특정 분자가 항바이러스 활성이 가능한 본원에 개시된 본 발명의 구체예와 충분한 아미노산 서열 상동성을 공유함을 의미한다.
본원에 사용된 "치료적 조성물"은 본 발명의 단백질 및 기타 생리적으로 혼합가능한 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 치료적 조성물은 단백질과 같은 담체,미네랄 및 물과 같은 부형제를 포함할 것이다.
본 발명의 제제의 "유효량"은 치료되어야 하는 특정 질병에 영향을 주거나 결과를 만드는 양이다.
"아미노산"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단량체 단위이다. 모두 L-이소형이며 천연 발생하는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질에서 찾을 수 있는 20종의 아미노산이 존재한다. 또한 용어는 단백질 아미노산 및 이들의 유사체의 D-이소형 및 아미노산의 유사체를 포함한다.
"유도된" 아미노산은 화학 반응에 의하여 개질된 통상 발생하는 측쇄 또는 말단기(또는 인터페론-베타-1a의 경우에 당 부분)인 천연 또는 비천연 아미노산이다. 상기 개질은 예를 들면, 감마-카르복실화, 베타-카르복실화, PEG화(pegylation), 설페이트화, 술폰화, 포스포릴화, 아미드화, 에스테르화, N-아세틸화, 카르보네질화, 토실화 및 기타 당업계에 공지된 개질을 포함한다. "유도된 폴리펩티드"는 폴리펩티드가 글리코실화되면, 1 이상의 유도된 당 및/또는 1 이상의 유도된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다.
"단백질"은 임의의 20 아미노산을 실질적으로 구성하는 임의의 중합체이다. "폴리펩티드"는 종종 상대적으로 큰 폴리펩티드로 언급되는 반면, "펩티드"는 종종 작은 폴리펩티드로 언급되며, 이들 용어의 용도는 당업계에서 혼용되며 다양하다. 다른 지시가 없으면, 본원에서 사용된 용어 "단백질"은 펩티드, 단백질 및 폴리펩티드를 의미한다.
"돌연변이체"는 유기체의 유전 물질에서 임의의 변형, 특히 야생형 폴리뉴클레오티드 서열에서 임의의 변형(예, 결실, 치환, 부가 또는 변형) 또는 야생형 단백질에서 임의의 변형을 의미한다. 용어 "뮤테인"은 "돌연변이체"와 상호교환적으로 사용된다.
"야생형"은 통상 생체내 존재하는 단백질의 엑손의 자연발생적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이것의 일부 또는 단백질 서열 또는 이것의 일부 각각을 의미한다.
"표준 혼성화 조건"은 혼성화 및 세척을 위하여 0.5 X SSC 내지 약 5X SSC 및 65℃에 실질적으로 동등한 염 및 온도 조건을 의미한다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "표준 혼성화 조건"은 작동 정의이며 일정 범위의 혼성화 조건을 포함한다. 매우 엄격한 조건은 12 내지 20 시간 동안 65℃에서 플라크 스크린 완충액(0.2 % 폴리비닐피롤리돈, 0.2 % 피콜 400; 0.2 % 소 혈청 알부민, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5); 1M NaCl; 0.1 % 나트륨 피로포스페이트; 1 % SDS); 10 % 덱스트란 설페이트 및 100 ug/ml의 변성되고 초음파 분쇄된 연어 정자 DNA로 혼성화하고, 65℃에서 75 mM NaCl/7.5 mM 나트륨 시트레이트(0.5X SSC)/1 % SDS로 세척하는 단계를 포함한다. 낮은 엄격한 조건은 예를 들면 12 내지 20 시간 동안 55℃에서 플라크 스크린 완충액, 10 % 덱스트란 설페이트 및 110 ug/ml의 변성되고 초음파분쇄된 연어 정자 DNA로 혼성화하고, 55℃에서 300 mM NaCl/30mM 나트륨 시트레이트(2.0X SSC)/1% SDS로 세척하는 단계를 포함한다. 참조 Current Protocles in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, Sections 6.3.1-6.3.6(1989).
"발현 조절 서열"은 유전자에 작동적으로 연결되어 유전자의 발현을 조절하고 제어하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"작동적으로 연결된"은 발현 조절 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 번역을 조절하고 제어하는 경우 폴리뉴클레오티드 서열(DNA, RNA)이 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 용어 "작동적으로 연결된"은 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열의 앞에 적절한 출발 신호(예, ATG)를 갖고, 발현 조절 서열의 조절하에 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되어 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 원하는 폴리펩티드가 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함한다.
"발현 벡터"는 발현 벡터가 숙주 세포내로 도입되는 경우 1 이상의 유전자의 발현을 허용하는 DNA 플라스미드 또는 파지(기타 공통 예 중)와 같은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 백터는 세포내에서 복제될 수 있거나 또는 복제될 수 없다.
"분리형"("실질적으로 순수한"과 상호교환적으로 사용)은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 즉 폴리뉴클레오티드 서열에 적용되는 경우, 원래 또는 조작에 의하여 (i) 천연에서 결합된 폴리뉴클레오티드의 전부와 결합되지 않은(즉, 발현 벡터 또는 이외의 일부로서 숙주세포에서 존재); 또는 (ii) 천연에서 연결되는 것 이외에 기타 화학 부분 또는 핵산에 연결된; 또는 (iii) 천연에서 발생하지 않는 RNA 또는 DNA 폴리뉴클레오티드, 게놈 폴리뉴클레오티드의 일부, cDNA 또는 합성 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한 "분리형"은 폴리뉴클레오티드 서열이 (i) 예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 시험관내 증식되거나; (ii) 화학적으로 합성되거나; (iii) 클로닝에 의하여 재조합 생성되거나; 또는 (iv) 절단 및 겔 분리에 의하여 정제된 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
따라서, "실질적으로 순수한 핵산"은 핵산이 유도된 유기체의 천연 발생하는게놈에서 통상 인접하는 코딩 서열의 한쪽 또는 양쪽과 직접 인접하지 않는 핵산이다. 실질적으로 순수한 DNA는 또한 추가적 서열을 암호화하는 혼성 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
"분리형"("실질적으로 순수한"과 상호교환적으로 사용된)이 폴리펩티드에 적용되는 경우, 기원 또는 조작에 의하여 (i) 발현 벡터의 일부의 발현 생성물로서 숙주 세포에서 존재하거나; 또는 (ii) 천연에서 연결된 것 이외의 단백질 또는 기타 화학 부분에 연결되거나; 또는 (iii) 자연에서 발생하지 않는 폴리펩티드 또는 이것의 일부를 의미한다. "분리형"은 또한 (i) 화학적으로 합성된; 또는 (ii) 숙주 세포에서 발현되고 결합된 단백질로부터 분리된 단백질을 의미한다. 용어는 일반적으로 자연발생하는 기타 단백질 및 핵산에서 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 또한 이를 정제하기 위해 사용되는 항체 또는 겔 매트릭스(폴리아크릴아미드)와 같은 물질로부터 분리된다.
본원에 사용된 "이종 프로모터"는 유전자 또는 정제된 핵산과 자연적으로 결합되지 않는 프로모터이다.
본원에서 사용된 "상동(homologous)"은 용어 "동일성"과 유사어이고, 2개의 폴리펩티드, 분자간 또는 2개의 핵산간의 서열 유사성을 의미한다. 2개의 비교된 서열의 양자의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유니트에 의하여 채워지면(예컨대, 2종의 DNA 분자에서 하나의 위치가 아데닌에 의하여 채워지면, 또는 2개의 폴리펩티드 각각의 위치가 라이신에 의하여 채워지면), 각 분자는 그 위치에서 상동이다. 2 서열간의 백분율 상동성은 비교된 위치의 수에 의하여 나누어진 2 서열 X 100에 의하여 공유된 정합 또는 상동성 위치의 수의 함수이다. 예를 들면, 2 서열내 위치에서 10 중의 6이 정합되거나 상동이면, 2 서열은 60% 상동성이다. 예를 들면, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT는 50% 상동성을 공유한다(총 6개 위치 중 3이 정합). 일반적으로, 2 서열이 최대 상동성을 갖도록 정렬시켜 비교한다. 상기 정렬은 Align program(DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램에 의하여 통상적으로 수행되는 Needleman et al., J. Mol Biol. 48:443-453(1970)의 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 상동성 서열은 동일한 또는 유사한 아미노산 잔기를 공유하며, 여기서 유사한 잔기는 통상적 치환이며, 정렬된 참조 서열에 상응하는 아미노산 잔기의 "허용된 점 돌연변이"이다. 이러한 관점에서, 참고 서열 중 잔기의 "보존적 치환"은 상응하는 참고 잔기에 물리적 또는 기능적으로 유사한 상기 치환, 예를 들면 유사한 크기, 형태, 전하 및 공유 결합 또는 수소 결합과 같은 화학적 성질이다. 특히 바람직한 보존적 치환은 "허용된 점 돌연변이"를 위한 정의된 기준을 수행하는 것이다[문헌: Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978)].
용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 또한 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "신생혈관형성" 및 "혈관생성"은 넓은 의미에서 신규한 혈관의 보충을 의미한다. 특히, "혈관생성"은 또한 종양 부위에 신규한 혈관의 보충을 의미한다.
"IFNAR2", "IFNAR1", "IFNAR1/2"는 세포 표면 유형 I 인터페론 수용체를 구성하는 것으로 알려진 단백질을 의미한다. IFNAR2 쇄의 세포외 영역(엑토도메인: ectodomain) 부분은 단독으로 인터페론 알파 또는 베타에 결합할 수 있다.
본 발명의 실행은 다른 지시가 없으면 당업계에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 단백질 화학 및 면역학의 통상적 기법을 사용할 것이다. 상기 방법은 문헌에 설명된다. 참조, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II(D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucletide Synthesis, (M.J. Gait, ed), 1984; 미국특허 제4,683,195호(Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames and S.J.Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation(B.D.Hames and S.J.Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells(R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155(Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vector for Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
인터페론-베타
인터페론-베타-1a는 질병 상태, 생리적 조건, 증상 또는 병인 인자의 치료, 경감 또는 완화를 위한 제제 또는 이것의 측정 또는 진단 제제로서 사용된다. 이 용어는 또한 공출원 번호 제60/104,572호 및 제60/120,161호에서 설명된 바와 같이 면역글로블린-인터페론-베타-1a 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 일부인 인터페론-베타-1a를 의미한다. 융합 단백질의 제조는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명자는 인터페론-베타-1a의 기능을 파괴하지 않는 중합체 접착을 위한 유일한 부위를 발견하였다. 또한, 본 발명자는 중합체 접착을 위한 부위를 독립적으로 조사하기 위해 위치-지정된 돌연변이유발법을 사용하였다(실시예1 참조). 간단히, 본 발명자는 활성 및 수용체 결합에 필요한 잔기의 맵핑을 목적으로 인간 인터페론-베타-1a의 돌연변이적 분석을 수행하였다. 인간 인터페론-베타-1a의 3-D 결정 구조의 유용성(참조, Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:11813-11818)은 알라닌(또는 세린) 치환을 위하여 인터페론 베타 수용체 상호작용에 유용한 용매-노출된 잔기의 동정을 가능하게 하고, 분자내 결합에 관여하는 아미노산을 보유하게 만든다. 인터페론-베타-1a의 각 나선형(A, B, C, D, E) 및 루프(AB1, AB2, AB3, DC1, DC2, DE1, DE2)의 각 분별적 영역을 따라 2개 및 8개의 잔기 사이에 대체된 15개 알라닌 스캐닝 돌연변이의 패널이 설계되었다. 실시예1 참조.
아미노-말단 히스티딘 태그("his" 태그)가 포유동물 세포 발현된 돌연변이체의 친화성 정제를 위하여 유도되었다(서열 목록 번호:2:도1). 상기 돌연변이체의기능적 결과는 항바이러스 및 항증식 분석으로 분석하였다. 비방사능 결합 분석은 인터페론 베타 표면 세포 수용체(IFNAR1/2 세포 표면 수용체)에 대한 상기 돌연변이체의 결합을 분석하기 위하여 개발되었다. 또한, 인터페론에 결합하는 IFNAR2-엑토도메인/Fc 융합 단백질을 이용하는 ELISA-기초한 분석이 인터페론-베타-1a 및 IFNAR2 간의 표면 상호작용을 맵핑하는데 사용되었다(실시예1 참조). 상기 돌연변이적 분석은 N- 및 C- 말단이 수용체 결합 또는 생물학적 기능에 중요하지 않은 인터페론-베타 분자의 부분에 위치함을 보여주었다.
본 발명자는 표적화된 돌연변이 유발에 의하여 야기된 3가지 유형의 효과를 동정하였다. 상기 효과는 특정 환경하에서 인터페론 약물 개발에 이로울 것이다. 3가지 유형의 효과는 다음과 같다: (a) his-야생형 인터페론-베타-1a보다 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이(예, 돌연변이체 C1); (b) his-야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항바이러스 활성에 대하여 항증식 활성이 부적절하게 낮지만, 항바이러스 및 항증식 분석에서 활성을 나타내는 돌연변이(예, 돌연변이체 C1, D 및 DE1); 및 (c) his-야생형 인터페론-베타-1a에 비하여 수용체 결합에 있어서 항바이러스 및 항증식 활성이 부적절하게 낮은 기능성 길항제(예, A1, B2, CD2 및 DE1).
중합체 부분
본 발명의 범위내에서, 1 이상의 중합체 분자가 부착될 수 있다고 생각되지만, 단일 중합체 분자가 인터페론-베타 1a와 접합을 위하여 사용될 것이다. 본 발명의 접합된 인터페론-베타 1a 조성물은 생체내 및 비생체내 용도에서 유용성을 찾을 것이다. 또한, 접합성 중합체는 최종 용도 응용에 적절한 임의의 기타 기, 부분또는 기타 접합된 종을 이용할 것이다. 실시예에 의하여 몇몇 용도에서 기능성 부분을 중합체와 공유 결합하면, 중합체에 UV-내분해성, 또는 항산화성 또는 기타 성질 또는 특성을 부여하는데 유용할 것이다. 추가적 실시예로서, 일부 용도에서 중합체를 관능화시켜 활성화 또는 교차 결합가능하게하여 전체 접합된 물질의 다양한 성질 또는 특성을 향상시키는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 중합체는 의도된 목적을 위하여 접합된 인터페론-베타 1a 조성물의 효능을 방해하지 않는 관능기, 반복기, 연결 또는 기타 성분 구조를 함유할 것이다. 기타 목적 및 본 발명의 이점은 뒤따르는 개시 및 첨부된 청구항으로부터 충분히 명백할 것이다.
상기 바람직한 특성을 달성하는데 유용하게 이용될 수 있는 예시적 중합체는 예시적 반응 방법으로 하기에 설명된다. 공유적으로 연결된 펩티드 용도로 중합체는 기능화될 수 있고 펩티드의 유리 아미노산에 커플링됨으로써 불안정한 결합을 형성한다.
접합이 비말단 반응기로부터 분지될 수 있으나, 인터페론-베타-1a는 중합체상의 말단 반응기에 의하여 접합되는 것이 가장 바람직하다. 반응기를 갖는 중합체는 "활성화된 중합체"로서 본원에서 사용된다. 반응기는 단백질 상의 기타 반응기 또는 유리 아미노기와 선택적으로 반응한다. 활성화된 중합체(들)는 반응하여 라이신의 알파 아미노기 또는 엡실론 아미노기와 같은 임의의 인터페론-베타-1a 아미노기에 부착된다. 인터페론-베타-1a의 유리 카르복실기, 적절하게 활성화된 카르보닐기, 히드록실, 구아니딜, 산화된 탄수화물 부분 및 메르캅토기(이용가능하면)가 또한 부착 부위로서 이용될 수 있다.
중합체는 인터페론-베타-1a 분자 상의 어느 부위에나 부착가능하지만, 중합체 커플링을 위한 가장 바람직한 부위는 인터페론-베타-1a의 N-말단이다. 제2 부위(들)는 C-말단 또는 그 근처이며 당 부분을 통한다. 따라서, 본 발명은 가장 바람직한 구체예로서 (i) 인터페론-베타-1a의 N-말단 커플화된 중합체 접합체, (ii) 인터페론-베타-1a의 C-말단 커플링화된 중합체 접합체, (iii) 중합체 접합체의 당-커플화된 접합체, (iv) 및 인터페론-베타-1a 융합 단백질의 N-, C- 및 당-커플링화된 중합체 복합체를 고려한다.
일반적으로 단백질 1몰 당 약 1.0 내지 약 10 몰의 활성화된 중합체가 단백질의 농도에 따라 사용된다. 최종 양은 생성물의 비특이적 개질을 최소화하는 한편 반응의 범위를 최대화하는 것과 동시에 최적 활성을 유지할 화학을 정의하는 한편, 가능하면 동시에 단백질의 반감기를 최적화하는 것의 균형이다. 단백질의 생물학적 활성의 약 50% 이상을 보유하는 것이 바람직하고, 100%를 보유하는 것이 가장 바람직하다.
반응기가 N-말단의 알파 아미노기 상에 있다면 바람직하게는 약 pH 5-7에서 불활성 중합체와 생물학적 활성 물질을 반응시키기 위하여 사용되는 임의의 적절한 방법에 의하여 반응이 일어날 수 있다. 일반적으로 방법은 활성화된 중합체(적어도 하나의 말단 히드록시기를 가질 수 있는)를 제조하여 활성화된 중합체와 단백질을 반응시켜서 제형화에 적절한 가용성 단백질을 제조하는 단계를 포함한다. 상기 개질 반응은 1 또는 그 이상의 단계를 포함하는 수개의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
상술된 바와 같이, 본 발명의 가장 바람직한 구체예는 중합체에 연결된 인터페론-베타-1a의 N-말단을 사용한다. 적절한 방법은 N-말단 개질된 인터페론-베타-1a를 선택적으로 획득하는데 이용될 수 있다. 한 방법은 인터페론-베타-1a에서 유도를 위하여 사용될 수 있는 1차 아미노기의 다른 유형의 차등화된 반응성을 이용하는 환원성 알킬화 방법에 의하여 예시화된다. 적절한 선택 조건하에서, 카르복시기를 함유하는 중합체로 인터페론-베타-1a의 N-말단에서 실질적으로 선택적인 유도화가 달성될 수 있다. 반응은 인터페론-베타-1a의 N-말단 잔기의 알파 아미노기의 엡실론-아미노기 및 라이신 잔기의 엡실론 아미노기간의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH에서 수행하였다. 화학의 상기 유형은 당업자에게 공지되었다.
본 출원인은 PEG-알데히드 중합체가 소듐 시아노보로하이드라이드의 존재시 인터페론-베타-1a와 반응하는 조건하에서 낮은 pH(일반적으로 5-6)에서 반응을 수행함으로써 선택성이 유지되는 반응 방법을 사용하였다. PEG-인터페론-베타-1a의 정제 및 SDS-PAGE, MALDI 질량 분광분석 및 펩티드 서열 결정/맵핑 후, N-말단이 PEG 부분에 의하여 특이적으로 표적화된 인터페론-베타-1a가 얻어졌다.
인터페론-베타-1a의 결정 구조는 N- 및 C- 말단이 서로 가깝게 위치한다(참조 Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:11813-11818). 따라서, 인터페론-베타-1a의 C-말단의 개질은 또한 활성에 최소 효과를 미쳐야 한다. PEG와 같은 폴리아킬렌 글리콜 중합체를 C-말단에 표적화하기 위한 화학적 방법이 단순하지 않기때문에 중합체 부분을 표적화하는데 사용할 수 있는 부위를 유전공학적으로 직접 조작할 것이다. 예를 들면, C-말단의 위치 또는 근처에 Cys의 함입은 말레이미드, 비닐설폰 또는 할로아세테이트-활성화된 폴리알킬렌 글리콜(예, PEG)를 사용한 특이적 개질을 가능하게 한다. 상기 유도체는 Cys에 대한 상기 제제의 고도의 선택성에 기인하여 조작된 시스테인의 개질에 특이적으로 사용될 수 있다. 표적화될 수 있는 히스티딘 태그 또는 추가적 글리코실화 부위의 함입과 같은 기타 방법(Fancy et al., (1996) Chem. & Biol. 3:551)은 인터페론-베타-1a의 C-말단을 개질화하기 위한 기타 대체물을 대표한다.
또한 인터페론-베타-1a 상의 글리칸은 활성의 변화없이 추가적 개질을 허용하는 위치에 있다. 화학 개질을 위한 부위에 당을 표적화하는 방법은 이미 공지되었고 따라서 폴리알킬렌 글리콜 중합체를 산화를 통하여 활성화된 당에 특이적으로 직접 첨가할 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜-히드라자이드는 알데히드 및 케톤으로 축합시킴으로써 상대적으로 안정한 히드라존 연결을 형성하여 생성될 수 있다. 상기 성질은 산화된 올리고당 연결을 통한 단백질의 개질에 사용될 수 있다. 참조 Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179:301. 특히, 아질산염으로 PEG-카르복시메틸 하드라자이드를 처리하여 아미노기에 대해 반응성인 전기친화적 활성기인 PEG-카복시메틸 아자이드를 생성한다. 상기 반응은 폴리알킬렌 글리콜-개질된 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 참조. 미국특허 제4,101,380호 및 제4179,337호.
이전에 본 발명자는 티올 링커-매개된 화학적 성질이 단백질의 교차 결합을 추가로 용이하게 할 수 있음을 발견하였다. 특히, 본 발명자는 소듐 페리오다트로 탄수화물 부분 상에 반응성 알데히드를 제조하여 알데히드를 통하여 시스타민 접합체를 생성하고 시스타민 상에 티올기를 통하여 교차 결합을 유도하는 방법을 사용하여 LFA-3 및 CD4의 이종유형 다량체를 제조하였다. 참조, Pepinsky, B. et al., (1991), J. Biol. Chem., 266:18244-18249 및 Chen, L.L.et al., (1991) J.Biol.Chem., 266:18237-18243. 따라서, 본 발명자는 이러한 유형의 화학이 또한링커가 당에 함입되고 폴리알킬렌 글리콜 중합체가 링커에 부착되는 폴리알킬렌 글리콜 중합체로 개질하는 것에 적절할 것이라고 생각한다. 아미노티올 또는 히드라진을 함유하는 링커는 단일 중합체 기의 첨가를 가능하게 할 것이며, 링커의 구조가 다양할 수 있으므로 다중 중합체를 첨가하고 및/또는 인터페론-베타-1a에 대한 중합체의 공간 배향이 변한다.
본 발명의 실행에서, C1-C4 알킬 폴리알킬렌 글리콜의 폴리알킬렌 글리콜 잔기, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 상기 글리콜의 폴리(옥시)알킬렌 글리콜 잔기가 중합체 시스템에 혼입되는 것이 유리하다. 중합체가 실온에서 수용성인 모든 경우에 폴리옥시에틸렌화된 폴리올이다. 블록 공중합체의 수용성이 유지된다면, 상기 중합체에 대한 한정되지 않는 예로 폴리알킬렌 산화물 동종중합체, 예를 들면 PEG 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화된 글리콜, 이것의 공중합체 및 이것의 블록 공중합체를 포함한다. 폴리옥시에틸렌화된 폴리올의 예는 폴리옥시에틸렌화 글리세롤, 폴리옥세에틸렌화 소르비톨, 폴리옥시에틸렌화된 글루코스 등을 포함한다. 폴리에틸렌화된 글리세롤의 글리세롤 골격은 모노-, 디-, 및 트리글리세라이드로, 예를 들면 동물 및 인간에서 자연적으로 발생하는 것과 동일한 골격이다. 따라서, 상기 분지형은 몸에서 반드시 외부 제제로 간주되는 것은 아니다.
폴리알킬렌 산화물, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 탄수화물에 기초한 중합체 등에 대한 대체물이 사용될 수 있다. 당업자는 상술된 목록이 단지 예시적이고 본원에 상술된 성질을 갖는 모든 중합체가 고려됨을 인식할 것이다.
중합체는 임의의 특정 중량을 가질 필요가 없으나 약 300 내지 100,000의 분자량이 바람직하고, 10,000 내지 40,000이 가장 바람직하다. 특히, 20,000 또는 그 이상의 크기가 신장의 여과로 인한 단백질 손실을 방지하는데 최상이다.
폴리알킬렌 글리콜 유도체는 본 발명의 실행시 중합체-인터페론-베타 1a 접합체의 제형화에서 폴리알킬렌 글리콜 유도체의 다음 성질에 관련된 다수의 이로운 성질을 갖는다: 항원성 또는 면역생성 반응을 유도하지 않는 동시에 수용성 향상,고도의 생적합성, 폴리알킬렌 글리콜 유도체의 생체내 생분해성의 부재 및 생유기체에의한 분비 용이.
또한, 본 발명의 또다른 양태는 접합체의 성질이 절단가능한 공유 화학 결합에 관련하는 중합체 성분에 공유적으로 결합된 인터페론-베타-1a를 사용하는 것이다. 이것은 중합체가 인터페론-베타-1a에서 절단되는 시간 경로 동안 조절을 가능하게 한다. 인터페론-베타-1a 약물 및 중합체 간의 상기 공유 결합은 화학적 또는 효소적 반응에 의하여 절단될 수 있다. 중합체-인터페론-베타-1a 생성물은 허용가능한 활성량을 보유한다. 동시에, 폴리에틸렌 글리콜 부분은 중합체-인터페론-베타-1a 접합체에 고도의 수용성 및 혈액 순환능의 연장을 부여하는 접합된 중합체에 존재한다. 상기 향상된 성질의 결과로서, 본 발명은 생체내 용도로 활성 중합체-인터페론-베타-1a 종 모두의 비경구, 비강 및 경구 송달 및 가수분해 절단, 인터페론 자체의 생체내 적용을 고려한다.
본원에서 설명된 반응 계획은 단지 예시의 목적으로 제공되었으며 인터페론-베타-1a의 개질에 사용되어 예를 들면 가용성, 안정성 및 비경구 및 경구 투여를 위한 세포막 친화성을 달성할 수 있는 반응 및 구조에 있어서 제한되는 것이 아니다. 가장 바람직한 N-말단 접합된 생성물을 얻기 위한 인터페론-베타 1a와 중합체의 반응은 다양한 반응 계획을 사용하여 용이하게 수행된다. 인터페론-베타-1a 접합체의 활성 및 안정성은 다양한 분자 크기의 중합체를 사용하여 여러 방식으로 다양화될 수 있다. 접합체의 가용성은 중합체 조성물에 함입된 폴리에틸렌 글리콜 단편의 조성 및 크기를 변화시킴으로써 다양화될 수 있다.
용도
본 발명의 치료적 용도를 위해 유용한 폴리알킬렌 글리콜-유도된 중합체의 독특한 성질은 일반적인 생적합성이다. 중합체는 다양한 수용성을 가지나 무독성이다. 이들은 본원에서 사용된 조건하에서 접합되는 경우 비면역원성 및 비항원성이고 인터페론-베타-1a 부분의 생물학적 활성을 저해하지 않는다. 이들은 혈액에서 장시간 순환하며 살아있는 유기체로부터 용이하게 분비된다.
본 발명의 생성물은 치료적 인터페론-베타 1a의 반감기를 유지하는데 유용한 것으로 알려졌으며, 물 또는 허용가능한 액체 배지에서 용해됨으로써 치료적 투여용으로 제조될 수 있다. 비경구, 에어로졸 또는 경구에 의하여 투여된다. 에어로졸제제가 천연에서 액체 또는 건분말일 수 있지만, 미세한 콜로이드 현탁액이 비경구 투여를 위하여 저류조 영향을 생성할 수 있도록 제조되거나 또는 경구 투여에 의하도록 제조될 것이다. 건조, 냉동건조된 상태 또는 용액 제제에서 본 발명의 인터페론-베타-1a융합은 양호한 저장 안정성을 가져야만 한다.
본 발명의 치료적 단백질은 인터페론-베타-1a 조성이 효과가 있는 임의의 질병 상태의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 생물학적 시스템 또는 표본에 구조, 조건 또는 질병 상태의 진단 및 비생리적 시스템의 진단 목적을 위하여 사용될 수 있다.
치료 용도에서, 본 발명은 상기 질병의 치료가 요구되고 상기 질병 또는 질환을 가진 또는 잠재적으로 가질 수 있는 동물 피검체를 치료하는 방법으로서, 상기 질병의 치료에 효과적인 본 발명의 융합 단백질의 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 융합 단백질에 의하여 치료되는 피검체는 포유동물 피검체이고 가장 바람직하게는 인간 피검체를 포함한다. 당업계에서 결정될 수 있는 것처럼, 부적절한 실험없이, 치료해야 할 특정 질병 또는 질환에 따라 동물 피검체에 임의의 적절한 치료적 유효량 및 안전한 용량으로 본 발명의 인터페론 베타-1a 융합 단백질을 투여하는 것이 바람직하다. 유형 I 인터페론의 종(species) 장막으로 인하여, 적절한 종에서 유래된 인터페론으로 본원에서 설명된 인터페론-융합 단백질을 제조하는 것이 필요할 것이다.
인터페론-베타의 항-세포 증식 활성이 공지되었다. 특히, 본원에서 설명된 특정 인터페론-베타-1a 융합은 골형성 육종, 림프종, 급성 림프구 백혈병, 흉부암, 흑색종 및 비인두 암과 같은 종양 및 암, 섬유종, 루푸스 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환을 치료하는데 유용하다. 또한 융합 단백질에 의하여 나타나는 항바이러스 활성, 특히 본원에서 설명된 특정 인터페론-베타-1a 뮤테인이 ECM 감염, 인플루엔자 및 기타 호흡기관 감염, 광견병 및 간염과 같은 바이러스 질환의 치료에 사용될 수 있다. 또한 본원에서 설명된 단백질에 의하여 나타나는 인터페론-베타-1a의 면역조절 활성이 섬유종, 다발성 경화증과 같은 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 신규 혈관의 형성(혈관신생 또는 신생혈관 생성)을 저해하는 인터페론의 능력으로 인해, 본 발명의 단백질이 당뇨병망막증, 미숙망막증, 남성퇴화, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 홍색증 및 오슬러-베버 증후군과 같은 혈관신생 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 인터페론의 항내피 활성이 수 시간 동안으로 알려졌고 인터페론 활동의 한 잠재적 기작이 종양 세포에 의하여 생성된 혈관생성 인자의 생성 또는 효능을 저해함으로써 내피 세포 활성을 억제할 수 있다. 일부 혈관 종양, 예컨대 혈관종은 특히 인터페론의 치료에 민감하다. 인터페론-알파로의 치료는 상기 질환에 대한 단지 문헌화된 치료이다. 접합체가 비접합된 인터페론보다 더 장시간동안 혈관에서 보유되므로 항-혈관형성제의 용도로서 더욱 효과적이고 효능있는 치료법으로 예상되기 때문에, 본 발명의 인터페론-베타-1a 융합 단백질은 치료는 약동력학 및 약물역학의 관점에서 실질적인 약학적 장점을 제공할 것으로 기대된다. 실시예 8 참조.
본 발명의 중합체-인터페론-베타-1a 융합은 단독으로 투여될 뿐 아니라 약학적으로 허용가능한 에스테르, 염 및 기타 이것의 생리적 기능 유도체의 형태로서투여될 수 있다. 상기 약물 및 의학 제제에서, 인터페론-베타-1a는 1 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(들) 및 선택적으로 임의의 기타 치료 성분과 함께 사용된다. 담체(들)은 제제의 기타 성분과 혼용된다는 관점에서 약학적으로 허용가능하며, 이것의 수용체에 부적절하게 해로운 것은 아니다. 인터페론-베타-1a는 상술한 바와 같이 원하는 약리적 효과를 달성하기에 효과적인 양 및 원하는 일일 투여량을 달성하기에 적절한 양으로 제공된다.
제형은 비경구 및 경구 투여를 위하여 적절한 것을 포함하고, 특정 투여 방식은 경구, 직장, 구강, 국부, 비강, 눈으로, 피하, 근육내, 피부투과, 포막내, 관절내, 동맥내, 지주막내, 기관지내, 림프, 질내 및 자궁내 투여를 포함한다. 경구, 비강 및 비경구 투여를 위한 제형이 바람직하다.
인터페론-베타-1a는 액체 용액을 포함하는 제형으로 사용하는 경우, 제형은 경구적으로 또는 비경구적으로 투여되는 것이 유리할 것이다. 인터페론-베타-1a는 액체 현탁액 제형 또는 생혼화성 담체 제형내 분말로서 사용되는 경우, 제형은 구강, 직장 또는 기관지로 투여되는 것이 바람직하다.
인터페론-베타-1a는 분말화된 고체의 형태로 직접 사용하는 경우, 인터페론-베타-1a는 경구로 투여되는 것이 유리할 것이다. 대안적으로, 담체 기체내 분말의 분무화를 통하여 비강 또는 기관지로 투여하여 적절한 분무 기관을 포함하는 호흡 순환으로부터 환자에 의하여 흡입되는 분말의 기체 분산을 형성한다. 본 발명의 단백질을 포함하는 제형은 단일 용량 형태로 편리하게 제시될 수 있고 약학계에서 공지된 임의의 방법에 의하여 제조될 것이다. 상기 방법은 유효성분을 1 이상의 보조성분으로 구성된 담체와 배합시키는 단계를 일반적으로 포함한다. 통상, 제형은 유효 성분이 액체 담체, 미세하게 분할된 고형 담체 또는 이들 양자와 균일하게 직접적으로 혼합시키는 단계, 또한 필요하다면 원하는 제형의 용량 형태로 생성물을 형성시키는 단계에 의하여 제조한다.
경구 투여에 적절한 본 발명의 제형은 캡슐, 정제 또는 마름모꼴 정제와 같은 분리된 단위로 제공될 수 있고, 각각은 분말 또는 과립; 또는 수용액 또는 비수용액중 현택액, 예를 들면 시럽, 에릭서제, 에멀션 또는 드라우트로서 유효 성분의 예정된 양을 포함한다.
정제는 1 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 주형에 의하여 제조될 것이다. 압축된 정제는 결합제, 붕해제, 윤활제, 불활성 희석제, 표면활성제 또는 방전제와 선택적으로 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유 유동형인 활성 화합물과 함께 적절한 기계에서 압축됨으로써 제조될 수 있다. 적절한 담체의 분말화된 중합 접합체의 혼합물로 구성된 주형화된 정제는 적절한 기계에서 주형화됨으로써 제조된다.
시럽은 임의의 보조 성분을 첨가할 수 있는 당, 예를 들면 수크로스의 농축된 수용액에 활성 화합물을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 상기 보조제는 감미료, 적절한 보존제, 당의 결정화 지연제 및 임의의 기타 성분의 용해성 증가제, 예를 들면 폴리히드록시 알코올, 예를 들면 글리세롤 또는 소르비톨을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위하여 적절한 제형은 수용체의 혈액과 등장인 활성 접합제의 살균 수성 제제(예, 생리 식염수)를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 제형은 현탁제 및 농조화제 또는 혈액 성분 또는 1 이상의 기관에 화합물을 표적화시키도록 고안된 기타 미세 입자계를 포함할 것이다. 제형은 단일용량 또는 다중용량 형태로 제공될 수 있다.
비강 분무 제형은 보존제 및 등장제와 함께 활성 접합제의 정제된 수용액을 포함한다. 상기 제형은 비강 점막과 혼화될 수 있는 pH 및 등장 상태로 조정되는 것이 바람직하다.
직장 투여를 위한 제형은 적절한 담체, 예컨대 코코아 버터, 수화된 지방 또는 수화된 지방성 카르복실산과 함께 좌약으로서 제공될 수 있다.
아이 드롭(eye drop)을 위한 안과 제형은 pH 및 등장성 요건이 눈에 적합하게 조절되는 것이 바람직한 것을 제외하고는 비강 분무와 유사한 방법에 의하여 제조될 것이다.
국부 제형은 1 이상의 매체, 에컨대 광유, 페트로륨, 폴리히드록시 알코올 또는 국부 약학 제제에 사용되는 기타 염기에서 용해되거나 현탁되는 본 발명의 접합체를 포함한다.
전술된 성분 뿐 아니라, 본 발명의 제형은 또한 희석제, 완충액, 감미제, 붕해제, 표면활성제, 농조화제, 윤활제, 보존제(항산화제 포함) 등에서 선택되는 1 이상의 보조 성분을 포함한다.
따라서, 본 발명은 치료 용도 이외의 바람직한 예시적 용도로서 용액중 인터페론-베타-1a의 시험관내 안정화를 위한 적절한 융합 단백질의 제공을 고려한다. 융합 단백질은 인터페론-베타 1a의 효소적 분해에 대한 내성을 증가시키기 위하여 사용될 수 있고, 저장기간, 실온 안정성 및 시험 시약 및 키트에 대한 강성도를 향상시키는 수단을 제공한다.
다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제공되며, 본 발명의 제한으로써 해석되어서는 안된다. 특히, 본원에서 설명된 생체내 동물 실험은 다양할 수 있으며, 기타 변형 및 기본 방법의 변이가 가능함을 이해해야 할 것이다. 예를 들면, 실시예 7에서 당업자는 기타 네오프테린 분석을 사용할 수 있으며 또는 사용된 영장류의 수 및 종류를 변경할 수 있다. 실시예에 대한 상기 변형 및 변이는 본 발명의 핵심 및 범위내로 간주될 것이다.
실시예 1: 알라닌/세린 치환 돌연변이를 사용한 인간 인터페론-베타-1a의 구조/활성 연구: 수용체 결합 부위 및 기능 영역의 분석
A. 개요
인간 인터페론-베타-1a(IFN-베타-1a)의 광범위한 돌연변이 분석은 활성 및 수용체 결합에 필요한 잔기를 맵핑하기 위한 목적으로 수행되었다. 인간 IFN-베타의 3-D 결정 구조의 유용성(Karpusas, M. et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:11813-11818)은 알라닌(또는 세린) 치환에 대하여 수용체 상호작용에 이용가능한 용매-노출된 잔기를 동정하게 하고, 분자내 결합에 관여하는 아미노산을 보유하게 한다. 15개 알라닌 치환 돌연변이 패널은 나선형(A, B, C, D, E) 및 루프(AB,CD, EF) 각각의 분별된 영역을 따라 2개 및 8개 잔기에서 대체되도록 설계되었다. 6개의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노-말단 태그가 친화성 정제를 위하여 포함되고, 엔테로키나제 링커 서열 부위가 아미노-말단 신장의 제거를 위하여 포함되었다. 생성된 인터페론은 "his 태그된-인터페론(IFN)-베타" 또는 "His6-인터페론-베타" 등으로 상호교환적으로 호칭된다.
야생형 IFN-베타 유전자 작제물을 돌연변이유발을 위한 주형으로 사용하여 다양한 돌연변이체 his-태그된-IFN-베타 발현 플라스미드를 제작하였다. 돌연변이유발 방법은 야생형 his-태그된-IFN 베타 유전자를 통하여 유일한 제한효소 절단 부위를 도입하는 단계를 제1로 포함하고, 이어서 알라닌(또는 세린) 치환 돌연변이를 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드 2본쇄로 선택된 제한 부위 사이의 독특한 DNA 서열을 대체하는 단계를 포함한다. 최종적으로, 인간 293 신장 세포주에서 포유동물 세포 발현을 지시하는 플라스미드 내로 돌연변이 IFN 유전자를 서브클론하였다.
상기 돌연변이의 기능성 결과를 항바이러스 및 항증식 분석에서 분석하였다. 인간 다우디 버킷츠 림프종 세포의 표면 수용체("IFNAR1/2 복합체")에 결합하는 돌연변이를 분석하기 위하여 비방사능 IFN 결합 분석을 개발하였다. 또한, 힌지, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 영역에 융합된 IFN 수용체 단백질 IFNAR2 세포외 영역으로 구성된 IFNAR2/Fc 융합 단백질을 이용하는 his-IFN-베타 돌연변이와 IFNAR2 간의 표면 상호작용을 맵핑하는 분석을 개발하였다.
1.돌연변이유발을 위한 주형으로서 인터페론 베타 유전자의 제조
IFN-베타 알라닌(또는 세린) 치환된 돌연변이를 제조하기 위한 한 방법은 먼저 유전자 주위에 흩어진 유일한 제한 효소 절단 부위를 보유하나 야생형 단백질을 암호화하는 개질된 IFN-베타 유전자를 제조하는 것이다. 유일한 부위는 돌연변이된 코돈을 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드 2본쇄에 대하여 야생형 서열을 교환하는데 사용되었다. 돌연변이 유전자의 생성에 적절한 인간 IFN-베타-1a 발현 카세트를 얻기 위하여, IFN-1베타 cDNA(GenBank 기탁번호 #E00029)를 PCR에 의하여 증폭시켰다. 플라스미드 pMJB107, pACYC184의 유도체내로(참조 Rose et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16(1) 355) IFN-베타 유전자의 초기 클로닝은 돌연변이유발을 통하여 생성될 수 있는 특이적 제한 효소 부위가 부족한 플라스미드 중 유전자의 부위-지정된 돌연변이유발을 수행하기 위하여 필요하였다.
인간 IFN-베타 유전자의 코딩 서열을 서브클론하는데 사용된 PCR 프라이머로 IFN-베타 유전자(5'PCR 프라이머 5'TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3'(서열 목록 번호:9:"BET-021", 및 3'PCR 프라이머 5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCY\TGTAAGTC-3'(서열 목록 번호:10:"BET-022")와 부합디는 프레임으로 그 상부에 엔테로키나제 링커 서열을 도입하고 플라스미드 pMJB107 부위내로 클로닝하는데 유용한 인접하는 제한 효소 부위(BspEI 및 XhoI)를 도입할 수 있다. 생성된 DNA는 PCR 단편 A로 언급된다.
인간 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1) 신호 서열로부터의 효과적인 신호서열 및 6개의 히스티딘 태그를 pDSW247(단편B)에서 제조된 제2 DNA 단편으로부터 최종작제물내로 도입하였다. 플라스미드 pDSW247은 EBNA-1 유전자가 결실된 pCEP4(캘리포니아주 칼스배드, 인비트로겐)의 유도체로서 6개 히스티딘 태그의 상단에서 프레임에 부합되도록 융합된 VCAM-1 신호 서열(VCAMss)을 보유한다. VCAMss-1/히스티딘 태그 카세트 부분을 생성하는데 사용되는 PCR 프라이머가 KID-369(5'PCR 프라이머 5'-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3': 서열 목록 번호:11) 및 KID 421(3'PCR 프라이머 5'-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3": 서열 목록 번호:12)이며, 이것은 단편 B DNA의 절단을 허용하는 인접하는 제한 효소 절단 부위(NotI 및 BspEI)를 함입하고 있다.
VCAM-1 신호 서열 his 태그 및 인터페론-베타 유전자를 보유하는 플라스미드 벡터를 제조하기 위하여, 본 발명자는 플라스미드 벡터 pMJB107(NotI 및 XhoI 절단됨), PCR 단편 A(BspEI 및 XhoI 절단됨) 및 단편 B(NotI 및 BspEI 절단됨)에서 겔 정제된 DNA 단편을 사용하여 3-방식 연결을 수행하였다. 상기 연결된 플라스미드는 JA221 또는 XL1-Blue E. Coli 세포를 형질전환시키는데 사용되고, 암피실린 저항성 콜로니를 위하여 제한 맵 분석에 의하여 삽입체에 대하여 시험되었다. 맥시프렙(Maxiprep)에 의해 DNA를 다량 얻어, 삽입체 서열을 DNA 서열결정에 의하여 확인하였다. 생성된 작제물을 pCMG260이라고 한다.
2.pCMG260에서 인간 인터페론-베타의 알라닌 치환 돌연변이체의 제조
플라스미드 pCMG260은 수회의 돌연변이유발법(U.S.E. 부위 지정된 돌연변이유발 키트, 뵈링거-만하임)을 위한 주형으로 사용되었다. 상기 방법은 IFN-베타 단백질 코딩 서열을 따라 위치내에 유일한 제한 절단 부위를 도입시키나 생성된 단백질의 서열을 변화시키지 않는다. 돌연변이된 플라스미드는 E.coli의 JA221 또는 XL1-Blue를 형질전환시키는 데 사용되었고, 균주 및 재조합 콜로니는 클로람페니콜 저항성에 대하여 선택된다. 클로람페니콜 저항성 콜로니는 DNA 제한 맵핑 분석에 의하여 원하는 유일한 제한 효소 부위의 존재에 대하여 추가로 시험되었다. 유일한 제한 효소 절단 부위의 완전한 세트 및 유전자의 DNA 서열을 포함하는 생성된 IFN-베타 플라스미드, pCMG275.8가 증명되었다. 개질된 his-태그된 인터페론 베타 유전자의 전장 DNA 서열은 야생형 단백질 코딩 서열과 함께 도1에 제시된다.
알라닌 치환 돌연변이의 완전한 세트가 표1에 설명된다(다음 페이지). 돌연변이체의 이름은 돌연변이가 도입되는 구조 영역(나선형 및 루프)를 특정한다. 알라닌(세린) 치환의 완전한 패널이 인간 IFN-베타의 165개 아미노산 중의 65개의 돌연변이를 생성한다.
돌연변이의 패널은 표2(하기 참조)에 나타난 유전자 코딩 정보를 보유하는 합성 올리고뉴클레오티드 2본쇄로 유일한 제한 효소 부위 간의 DNA의 부분을 대체함으로써 pCMG275.8에서 제조되었다. 다양한 알라닌 치환 돌연변이체 플라스미드를 제조하기 위하여, 겔 정제된 pCMG275.8 벡터(적절한 제한 효소로 절단된, 각 IFN-베타 구조 영역에 대하여 아래 목록에서 지시한 바와 같음)와 올리고뉴클레오티드 2본쇄를 함께 연결하였다. 연결 혼합물이 암피실린 저항성에 대하여 선택된 재조합 콜로니 및 E.coli의 JA221 균주를 형질전환시키는데 사용되었다. 적절한 제한 효소 부위에 대한 검색에 의하여 돌연변이의 삽입의 존재에 대하여 암피실린 저항성 콜로니를 시험하였다. 2개의 돌연변이체(A2 및 CD2)에 있어서, 클로닝 전략은 상보적인 오버행 말단을 보유하여 3가지 방식 연결에서 벡터 IFN-베타 골격과 서로 연결되도록 하는 합성 올리고뉴클레오티드의 2개의 2본쇄(표2에 나타남)를 사용하는 것을 필요로 하였다. 다음의 목록은 표2에서 돌연변이된 올리고뉴클레오티드를 클론하는데 사용되는 부위를 예시한다. 클로닝 계획(서브섹션 B)은 인터페론 베타 유전자 상에 상기 유일한 부위의 위치를 나타낸다.
IFN-β지정된 선은 야생형 인간 IFN-β서열을 나타낸다. IFN-β잔기의 알라닌 또는 세린 치환은 돌연변이의 각각에 대하여 나타나고, 하기 관련 영역에서 점선은 야생형 서열을 나타낸다. 나선형 및 루프 구조는 하기 돌연변이에서 선으로 나타난다. DE 루프는 D 및 E 나선형 사이의 갭에 걸쳐있다. 2개의 추가적 알라닌 치환 돌연변이(H93A, H97A 및 H121A)가 생성되고 항바이러스 분석에서 분석되어 결정 구조 이량체에서 아연을 킬레이트하는 상기 히스티딘을 돌연변이시키는 영향을 측정한다. 이것은 아연-개질된 이량체 형성이 IFN-β활성에 대하여 중요하지 않음을 제시한다.
B.EBNA 293 발현 플라스미드의 제작
VCAM-1 신호 서열, his 태그 및 엔테로키나제 링커 서열에 융합된, 야생형 및 돌연변이 IFN-베타 유전자가 761 염기쌍 NotI 및 BamHI 제한 단편으로서 겔 정제되었다. 정제된 유전자는 pCEP4(캘리포니아, 칼스바드, 인비트로겐)의 유도체이며 NotI 및 BamHI로 절단된 플라스미드 벡터 pDSW247내로 서브클론된다. 플라스미드 pDSW247은 인간 EBNA 293 신장 세포(캘리포니아, 칼스바드, 인비트로겐)에서 단백질의 한시적 발현을 위한 발현 벡터이다. 이것은 사이토메칼로바이러스 초기 유전자 프로모터 및 이 시스템에서 고도의 유전자 발현을 위하여 필요한 EBV 조절 인자 및 E.coli(암피실린 저항성)에 대한 선택 마커 및 EBNA 293 세포(히그로마이신 저항성)를 포함한다. 연결된 플라스미드는 JA221 또는 XL1-블루 E.Coli 세포를 형질전환시키는데 사용되었고, 암피실린 저항성 콜로니를 채취하여 제한 효소 맵 분석에 의하여 삽입체에 대하여 시험되었다. 최대 제조 DNA를 제조하고 삽입체의 서열을 DNA 서열결정에 의하여 확인하였다. 원하는 돌연변이된 서열을 보여주는 양성 클론은 인간 EBNA 293 신장 세포를 형질감염시키는데 사용되었다.
전체 클로닝 및 발현 방법은 아래에 제시된다:
C.IFN-베타-1a 알라닌 치환 돌연변이체의 발현 및 정량
인간 EBNA 293 세포(캘리포니아주, 칼스바드, 인비트로겐, 키텐덴, T. (1989) J. Virol. 63; 3016-3025)는 10 % 태아 소 혈청, 2mM 글루타민 및 250 ug/ml 제네티신(메릴랜드 게터스버그, 라이프 테크놀로지)로 보충받은 둘베코스의 개질된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's media)에서 하위합류성 배양물로서 유지되었다. pDSW247 발현 플라스미드는 리포펙타민 프로토콜(라이프 테크놀로지, Gibco/BRL)을 사용하여 EBNA 293 세포내로 순간적으로 형질감염시켰다. 조건화된 배지는 형질감염 후 3-4일째에 회수하고, 세포 파편을 원심분리기에 의하여 제거하고, his-IFN-베타 농도는 ELISA에 의하여 정량화하였다.
ELISA 분석은 폴리클론 래빗 항체(프로틴 A, 정제된 Ig, 항체는 정제된 인간 IFN-베타-1a에 대하여 상승됨)을 사용하여 96-웰 ELISA 플레이트를 코우팅하고, 동일한 폴리클론 래빗 Ig의 바이오틴화된 형태를 제2 시약으로 사용하여 스트렙트아비딘-연결된 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP: Jackson ImmunoResearch. W. Grove, PA)를 사용하여 인터페론을 검색하였다. 인터페론-베타-1의 희석 시리즈(바이오겐, 인크.에서 상품명 AVONEX로 시판)을 사용하여 표준 농도 곡선을 만들었다. EBNA 형질감염체로부터 his-IFN-베타-함유 조건화된 배지를 희석하여 ELISA 분석에서 10ng/ml 내지 3.0ng/ml 범위의 농도를 갖는 샘플을 획득하였다. ELISA에 의하여 결정되는 배지내 IFN-베타의 농도를 입증하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 감소된 배양 상층액 및 IFN-베타-1a 표준은 10-20% 구배 겔(캘리포니아주 샌디에고 노벡스)상의 SDS-PAGE에 주입하고 PDVF 막위에서 블롯하였다. 면역반응성 밴드를 래빗 폴리클론 항-IFN-베타-1a 항혈청(#447, 바이오겐, 인크. IFN-베타-1a에 대하여 상승하는 제2 항혈청)으로 검색한 후, HRP-연결된 당나귀 항-래빗 IgG(펜실베니아주 더블유. 그로브, Jackson ImmunoResearch)으로 처리하였다.
D.인터페론-베타 돌연변이체의 수용체 결합 분석
2개의 다른 결합 분석을 사용하여 C에서 설명한 인터페론-베타 돌연변이의수용체 결합 성질이 분석되었다. 한 분석은 인간 IgG의 불변부의 일부에 융합된 인간 IFNAR2 수용체 쇄의 세포외 영역을 포함하는 융합 단백질, IFNAR2/Fc에 대한 인터페론-베타 돌연변이의 결합을 측정하였다. IFNAR2-Fc를 차이니즈 햄스터 난자(CHO) 세포에서 발현되고 제작자의 지시에 따른 프로틴 A 세파로스 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제되었다(Pierce Chem. Co., Pockford, IL, 카탈로그 #20334). IFNAR2-Fc에 대한 인터페론-베타 돌연변이체의 결합을 ELISA 포맷 분석에서 측정되었다. 코우팅 완충액(50 mM NaHCo3, 0.2mM MgCl2, 0.2 mM CaCl2, pH9.6) 중 10㎍/ml의 마우스 항-인간 IgG1 모노클론 항체(CDG5-AA9, Biogen, Inc.) 50 ㎕/웰로 밤새 4 ℃에서 평평한-바닥의 96 웰 플레이트를 코우팅함으로써 ELISA 플레이트를 제조하였다. 플레이트를 0.05 % 트윈-20을 포함하는 PBS로 2회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중 0.5 % 무지방 건조 우유로 차단하였다. 2회 이상의 세척 후에, 0.05 % 트윈-20을 포함하는 PBS 중 0.5 % 우유 중의 50ul의 1ug/ml IFNAR2-Fc를 각 웰에 첨가하여 실온에서 1 시간동안 항온처리한 후, 이어서 플레이트를 2회 이상 세척하였다. 10% 태아 소 혈청으로 보충된 둘베코스 개질된 이글스 배지(DMEM)에서 연속적으로 희석된 조건화된 배지 중의 50 ul/웰 돌연변이 인터페론-베타를 첨가한 후 4℃에서 2시간 동안 항온처리함으로써 IFNAR2-Fc에 대한 인터페론-베타 돌연변이의 결합을 측정하였다. 인터페론-베타 돌연변이체의 희석은 통상 약 1 uM 에서 10 pM의 범위이다. 세척 후, 플레이트에 결합된 인터페론-베타는 래빗 폴리클론 항-인터페론 항체(#447, 바이오겐, 인크.) 및 호스래디쉬 퍼옥사이드(HRP)-표지된 당나귀 항-래빗 IgG(잭슨 이뮤노리서치)의 1:1000 희석으로 구성된칵테일의 50 ul/웰을 첨가한 후 4℃에서 15분 동안 항온저리함으로써 검색하였다. 2회 세척 후, HRP 기질을 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 항온처리한 후, 450 nm의 흡착에서 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 흡착 대 돌연변이 인터페론-베타의 농도로서 데이터를 플롯하고, IFNAR2-Fc에 대한 돌연변이 인터페론-베타의 결합에 대한 친화성을 단순한 포물선 결합 식에 데이터를 맞춤으로써 측정하였다. 상기 분석의 결과는 표3에 나타나며, 3중 실험에서 결정된 각 돌연변이에 대한 결합 친화성은 His6-야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 측정된 것의 백분율로서 표현된다.
제2 수용체 결합 분석은 인터페론-베타에 대한 수용체를 함께 포함하는 IFNAR1 및 IFNAR2의 양 수용체 쇄를 발현시키는 다우디 세포에 결합된 인터페론-베타 돌연변이의 친화성을 측정하는 데 사용되었다. 상기 FACS-기초한 분석은 인터페론-베타가 결합된 수용체로부터 비어있는(유리) 수용체를 구별하기 위하여 IFNAR1의 세포외 영역에 대하여 지시된 차단성 모노클론 항체, EA12(바이오겐, 인크.)를 사용하였다. 다우디 세포(2.5×107세포/ml에서 20 ul)를 다양한 농도의 인터페론-베타 돌연변이(PBS 중 5% FBS, 0.1 % NaN3; FACS 완충액 중 20 ul)로 4℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 인터페론-베타 돌연변이의 바람직한 일련의 희석은 0.5 uM에서 0.5 pM의 범위이다. 각 웰에 바이오틴화된 뮤린 항-IFNAR1 모노클론 항체 EA12(10ul) 100 ng을 첨가한 후, 추가로 2분 동안 실온에서 플레이트를 항온처리한 후, FACS 완충액(4℃)로 2회 세척하였다. 이어서 세포는 50 ul/웰의 1:200 희석의R-피코에리트린-접합된 스트렙트아비딘(펜실베니아주 웨스트 그로브, 잭슨 이뮤노리서치)으로 4℃에서 30분 동안 항온처리하고, FACS 완충액에서 2회 세척한 후, 0.5 % 파라포름알데히드를 포함하는 300 ul FACS 완충액에 재현탁하고, 12×75 mm 폴리스티렌 튜브(팔콘 2052)내로 이전시켰다. 이어서 샘플을 FACScan(벡톤 디킨슨)상에서 플로우 시토메트리에 의하여 분석하였다. 평균 채널 형광 강도(MFCI) 대 인터페론-베타 돌연변이체의 농도로 데이터를 플롯하였다. 결합 친화성은 항체 염색을 50 % 저해하는 인터페론-베타 돌연변이의 농도로서 정의하였다. 각 돌연변이는 여러번 시험하였다. 도4는 상기 방법에 의하여 측정된 각 인터페론-베타 돌연변이에 대한 수용체 결합 친화성을 나타내며, 이것은 각 실험에서 His6-야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 측정된 친화성의 백분율로서 표현된다.
E.인터페론-베타 돌연변이체의 기능 분석
세포 증식을 저해하는 인터페론-베타의 능력 및 항바이러스 활성에 대한 시험관내 분석을 사용하여 인터페론-베타 돌연변이의 기능 활성에 대하여 시험하였다. 3개의 항바이러스 분석의 최소점, 각 3중 데이터 점은 각 돌연변이에 대하여 수행되었다. His6-야생형 인터페론-베타-1a는 매 실험에서 참고로서 포함되었다. 항바이러스 분석은 완전한 항바이러스 보호에서 바이러스 세포 사멸로부터의 비보호 사이의 범위에 걸치는 농도로 돌연변이체 인터페론-베타의 2배 연속 희석액들로 A549 인간 폐암 세포(ATCC CCL185)를 처리함으로써 수행되었다. 다음날, 인터페론의 부재시 완전한 세포 사멸을 야기하는 희석된 뇌심근염 바이러스(ECMV)로 세포를2일동안 공격하였다. 이후 플레이트를 대사 염색 MTT(2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-설포-페닐]-2H-테트라졸리움-5-카르복시아니라이드)(미주리주 세이트 루이스, 시그마, M-5655)로 현상하였다. MTT의 주용액을 PBS중 5mg/ml에서 제조하고 살균 여과 시킨 후, 상기 용액의 50 ul을 세포 배양액(웰 당 100ul)내로 희석하였다. 실온에서 30 내지 60분 동안 항온처리한 후, MTT/배지 용액을 폐기하고, 세포를 100 ul PBS로 세척하고, 최종적으로 대사된 염색약을 90% 이소프로판올 중 100 ul 1.2 N 염산으로 용해하였다. 살아있는 세포(염색약의 존재에 의하여 증명된)는 450 nm 흡광도에 의하여 정량되었다. 데이터를 농도 인터페론-베타 돌연변이에 대한 흡광도를 플롯함으로써 분석하고, 각 돌연변이의 활성도를 세포의 50%가 사멸되는 농도로서 정의하였다. 도5는 각 실험에서 his 태그된 야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 측정된 활성의 백분율로서 표현된 각 돌연변이의 활성도를 나타낸다.
인터페론-베타 돌연변이를 또한 항증식 분석에서 기능에 대하여 분석하였다. 인간 다우디 버킷츠 림프종 세포(ATCC #CCL213)를 2 mM L-글루타민 및 10% 한정된 태아 소 혈청(유타 로간 하이클론)으로 보충된 RPMI에 2×105세포/ml로 종균하였다. 또한 각 웰은 웰당 배지 100 ul의 최종 총부피 중에 주어진 농도의 인터페론-베타 돌연변이를 포함하였다. 사용된 인터페론-베타 농도는 다우디 세포 증식의 최대 저해로부터 비저해(즉, 완전 증식)까지의 범위에 걸치도록 선택되었다. 시험된 인터페론-베타 돌연변이의 각 농도에 대하여 두벌의 실험적 포인트를 사용하고, 비처리된 세포의 두벌 세트가 모든 실험에 포함되었다. 세포를 37℃의 5 % CO2항온배양기에 2일 동안 항온배양한 후, 50 ul 배지중 삼중화 티미딘((메틸-3H), 티미딘, 아머스샴 TRK758)을 웰 당 1u Ci로 각 웰에 첨가하고, 추가로 4 시간동안 항온배양하였다. 세포를 LKB 플레이트 수확기를 사용하여 수확하고, 삼중화된 티미딘의 함입을 LKB 베타 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 두벌 실험값을 평균화하고 표준 편차를 결정하였다. 데이터를 분당 평균 계수 대 인터페론-베타 돌연변이의 농도로 플롯하고, 각 돌연변이의 활성을 관찰된 최대 성장의 50%를 저해하는 데 필요한 농도로서 정의하였다. 각 돌연변이에 대한 다중 분석을 수행하였다. 도6은 각 실험에서 his 태그된 야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 발견된 활성의 백분율로서 표현되는 결과를 보여준다.
F.인터페론-베타 돌연변이의 성질
히스티딘 태그된 야생형 인터페론-베타-1a는 태그되지 않은 야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 발견된 상응하는 활성보다 각각 약 3배 낮은 항바이러스 및 항증식 분석의 활성을 갖는 것으로 발견되었다. 인터페론-베타 돌연변이 A1-E 모두는 이것의 N-말단에 동일한 his 태그 서열을 갖기 때문에, 분자의 성질에 미치는 돌연변이의 효과는 his 태그된 야생형 인터페론-베타-1a에서 관찰된 활성에 대한 항바이러스, 항증식 및 결합 분석에서 상기 돌연변이체의 활성을 비교함으로써 결정되었다. 상기에서, 본 발명자는 his 태그된 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여 돌연변이 A1-E의 활성의 변이는 N-말단 his 태그의 부재시 상기 동일한 돌연변이가 갖는 효과와 정량적 및 정성적으로 동일하다고 가정한다. 기타 가용성 시토킨의 태그된 또는 융합 작제물에 대한 동등한 가정은, 특히 태그된 또는 융합 작제물의 시험관내 기능성 활성이 본원에서처럼 야생형 시토킨과 밀접한 경우 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법의 실행에 의하여 통상 사실로 지지된다. 참조, Pearce K.H.Jr, et al., J.Biol.Chem. 272:20595-20602(1997) 및 Jones J.T., et al., J. Biol. Chem. 273:11667-11674 (1998).
도3-6에 나타난 데이터는 표적화된 돌연변이유발법에 의하여 야기된 3가지 유형의 영향을 제안한다. 상기 영향은 특정 환경하에서 인터페론 약물 개발에 있어서 유리할 것이다. 3가지 유형의 영향은 다음과 같다: (a) 야생형 인터페론-베타-1a보다 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이(예, 돌연변이 C1); (b) 항바이러스 및 항증식성 분석에서 활성을 나타내지만, 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여 항바이러스 활성에 비하여 불균형적으로 낮은 항증식 활성을 갖는 돌연변이(예, 돌연변이 C1, D 및 DE1); 및 (c) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여 수용체 결합에 비하여 불균형적으로 낮은 항증식 및 항바이러스 활성을 나타내는 기능성 길항제(예, A1, B2, CD2 및 DE1). 일부 돌연변이는 1 이상의 부류에 속할 수 있다. 상기 부류는 다음과 같이 재고된다. 본 발명자는 열거된 상기 실시예에 있어서 상기 부류의 돌연변이를 특성화하는 경우, 상기 영역에서 기타 돌연변이가 활성에 있어서 유사한 또는 매우 향상된 효과를 야기할 수 있다고 평가한다:
(a) 돌연변이체 C1은 야생형 his-태그된 인터페론-베타-1a보다 약 6배 큰 항바이러스 활성을 보유한다. 상기 돌연변이 및 기타 상기 유형은 주어진 수준의 항바이러스 영향을 달성하기 위하여 투여되어야 하는 인터페론-베타의 양을 감소시키는데 유용할 것으로 예측된다. 투여되는 단백질의 양을 낮추는 것은 단백질의 면역생성원을 낮추는 것으로 예측되며, 또한 기작에 기초하지 않은 독성에 의한 부작용을 감소시킬 것이다. 인터페론-베타 투여의 치료적 이점이 항바이러스 효과로부터 야기되는 경우 및 항증식 효과가 독성 또는 원치않는 부작용을 야기하는 경우에 상기 부류의 돌연변이가 이로울 것으로 예측된다.
(b) 항바이러스 및 항증식 분석에서 알라닌 치환된 돌연변이의 상대적 활성(% 야생형)은 도7에서 비교된다. 조화적으로 변하는 활성(즉, 야생형 his 태그된-인터페론-베타-1a의 활성으로부터 동일한 인자만큼 차등화되는 항바이러스 및 항증식 활성)이 대부분의 돌연변이에서 나타난다(대각선 상에 위치함). 그러나, 일부 돌연변이는 대각선으로부터의 전이에 의하여 증명되는 바와 같이, 야생형 his 태그된 인터페론-베타-1a에 비하여, 한 분석에서의 활성이 다른 것에 비하여 더 큰 변이를 나타낸다. 3개의 상기 돌연변이는 아래와 같은 표에서 나타난다. 돌연변이 C1은 항바이러스 활성이 야생형 his 태그된 인터페론-베타-1a보다 6배 높지만, 항증식 분석에서 야생형과 유사한 활성을 나타낸다. 따라서 돌연변이 C1은 야생형 his-태그된 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성에 대하여 5.2 인자만큼 향상되는 항바이러스 활성을 갖는다. 유사하게는, 돌연변이체 D는 항바이러스 분석에서 야생형 활성의 65%을 나타내지만, 항증식 분석에서 야생형 활성의 단 20%을 나타내며, 따라서 야생형에 비하여 항증식 활성에 대하여 3.4 배 향상된 항바이러스 활성을 갖는다. 돌연변이체 DE1은 항바이러스 분석에서 야생형 활성의 26%을 나타내지만, 항증식 분석에서 야생형 활성의 8.5%만을 나타내므로, 따라서 야생형 his-태그된 인터페론-베타-1a에 비하여 항증식 활성에 대한 3.0배 향상된 항바이러스 활성을 갖는다. 원하는 수준의 항바이러스 활성을 달성하기에 충분한 농도로 투여하는 경우 상기 돌연변이 단백질은 야생형 단백질보다 실질적으로 낮은 수준의 항증식 활성을 나타낼 것이다. (a) 부류에서처럼, 상기 부류에서 돌연변이는 인터페론-베타 투여의 치료적 이점이 항바이러스 효과에서 야기되는 경우 및 항증식 효과가 독성 또는 원치않는 부작용을 야기하는 경우에 이로울 것으로 예측된다.
돌연변이 항바이러스 활성(AV)(% 야생형) 항증식(AP)활성(% 야생형) AV/AP
C1 571 109 5.2
D 65 19 3.4
DE1 26 8.5 3.0
(c) 야생형 his-태그된 인터페론-베타-1a에 비하여, 수용체 결합에 있어서 낮은 항바이러스 및 항증식 활성을 갖는 돌연변이(하기 표 참조). 돌연변이체 A1은 야생형 his 태그된 인터페론-베타-1a에서 관찰된 것보다 2.0 배 및 1.8 배 높은 항바이러스 및 항증식 활성을 나타내지만, 야생형보다 29배 높은 친화성으로 다우디 세포에 대한 동족 수용체에 결합한다. 따라서, IFN-베타 수용체에 대한 상기 돌연변이의 결합은 단백질의 항바이러스 및 항증식 활성에 비하여 약 15배 향상된다. 유사하게는, 돌연변이체 B2, CD2 및 DE1은 항바이러스 활성에 대하여 각각 4.6-, 4.6- 및 18-배의 결합 증가를 나타내며, 항증식 활성에 대하여 3.5-, 15- 및 54-배의 결합의 향상을 나타낸다. 상기 단백질은 수용체에 결합하고 차지하는 능력을 갖기 때문에 내인성 IFN-베타의 활성 및 기타 내인성 유형 I 인터페론의 가능한 활성에 대한 기능적 길항제로서 유용하다고 예측되지만, 야생형 IFN-베타와 함께 나타나는 기능적 반응의 작은 부분을 표적 세포에서 생성한다.
돌연변이 항바이러스 활성(AV)(%야생형) 항증식활성(AP)(%야생형) 세포 결합 활성(%야생형) 결합/AV 결합/AP
A1 200 180 2900 15 16
B2 7.1 9.2 33 4.6 3.5
CD2 150 46 690 4.6 15
DE1 26 8.5 460 18 54
G.인터페론의 3차 구조와 뮤테인의 관계
뮤린 인터페론 베타의 비-글리코실화된 형태[T. Senda, S.Saitoh 및 Y. Mitsuri. 2.15Å 해상도에서 재조합 뮤린 인터페론-β의 정제된 결정 구조, J. Mol. Biol. 253: 187-207 (1995)] 및 인간 인터페론 알파-2b[R. Radhakishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P.P Trotta, T.L. Nagabhushan 및 M.R. Walter. X-선 결정학에 의하여 밝혀진 인간 인터페론-α2b의 아연 매개된 이량체. Structure. 4: 1453-1463(1996)]에 대하여 출판된 결정 구조는 인간 인터페론 베타의 폴리펩티드 골격에 대한 모델을 제공하였으며, 본 발명자는 최근에 글리코실화 단계에서 인터페론-베타-1a를 위한 구조를 해석하였다[M. Karpusas, M. Nolte, C. B. Benton, W. Meier, W. N. Lipscomb, 및 S. E Goelz. 2.2Å 해상도에서 인간 인터페론-β의 결정 구조. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11813-11818(1997)].
본원의 돌연변이 분석의 결과는 인터페론-베타-1a의 3D- 구조에 관하여 요약될 수 있다(본원에서 제시되지 않음). 특정 돌연변이 잔기는 활성을 감소시킨다(2 내지 5배 이상의 감소). 돌연변이된 영역은 표1 및 2에서 주어진 치환에 상응한다.
기능에 매우 상당한 영향을 미치는 돌연변이는 활성 및 세포 표면 수용체 결합을 상당히 감소시킨다. 상기 돌연변이 중 어느 것도 본원의 분석에서 IFNAR/Fc에 결합하지 않기 때문에, 상기 영역(A2 나선형, AB&AB2 루프 및 E 나선형)은 IFNAR2 결합 영역의 돌연변이와 상응한다.
IFNAR2 결합에 중요한 상기 돌연변이는 또한 세포 결합에 영향을 주는 한편, 세포 표면 결합 성질은 또한 분자의 기타 영역(B1 나선형, C2 나선형)의 잔기에 의하여 영향을 받는다. IFN-베타-1a 분자의 N-말단, C-말단 및 글리코실화된 C 나선형 영역이 수용체 결합 부위내에 존재하지 않는다는 것은 알라닌 치환 돌연변이의 영향을 도시하는 3-D 모델에서 알 수 있다(제시되지 않음). 상기 영역에서 돌연변이는 생물학적 활성을 감소시키지 않거나 또는 세포 표면 수용체 결합을 감소시키지 않았다.
실시예2: 접합된 인터페론-베타-1a의 제조 및 특성
A. PEG화된 인터페론의 제조
100mM 인산 나트륨 pH7.2, 200 mM NaCl 중 250ug/ml의 비제형화된 인터페론-베타-1a(AVONEX 상표명으로 시판) 거대 중간체를 동일한 부피의 pH 5.0 100 mM MES 동일한 부피로 희석시키고 HCl로 pH를 5.0로 조정하였다. 표본을 SP-세파로스 ?FF 컬럼(뉴저지주 피스카타웨이, 파마시아) 상에 6 mg 인터페론-베타-1a/ml 수지로 적재하였다. 컬럼을 5mM 인산 나트륨 pH 5.5, 75mM NaCl로 세척하고, 생성물은 pH 6.0 인산나트륨 30mM, 600 mM NaCl로 용출시켰다. 280 nm에서 용출 분획의 흡광도를 분석하였고, 표본 중의 인터페론 농도는 1mg/ml 용액에 대하여 1.51의 소광 계수를 사용하여 흡광도로부터 측정되었다.
SP 용출액에서 유래한 인터페론-베타-1a 1mg/ml 용액에, 5.0 M 인산 나트륨 pH 6.0을 50 mM에 첨가하고, 나트륨 시아노보로히드라이드(위스콘신주 밀로키, 알드리치)를 5mM에 첨가하고, 20K PEG 알데히드(AL, 헌트스빌, 쉬어워터 폴리머)를 5 mg/ml에 첨가하였다. 표본을 실온에서 20 시간동안 항온배양하였다. PEG화된 인터페론은 이동상으로 5 mM 인산나트륨 pH 5.5, 150 mM NaCl 및 SP-세파로스 ?FF를 사용하여 수퍼로스 ?6 FPLC 크기 컬럼(파마시아) 상에서 연속적 크로마토그래피 단계에 의하여 반응 생성물로부터 정제시켰다. 상기 크기 컬럼은 개질 및 비개질된 인터페론 베타의 기초선 분리를 야기한다(본원에서 제시되지 않은 크로마토그래프). 겔 여과로부터 얻어진 PEG-인터페론 베타를 함유하는 용출 풀은 물과 1:1 희석시켰고 SP-세파로스 ?컬럼 상에서 2 mg 인터페론 베타/수지로 적재시켰다. 컬럼은 5 mM 인산 나트륨 pH 5.5, 75 mM NaCl로 세척하였고, PEG화된 인터페론 베타는 5mM 인산 나트륨 pH5.5, 800mM NaCl로 컬럼으로부터 용출시켰다. 280 nm에서 흡광도로 용출 분획의 단백질 함량을 분석하였다. PEG 부분이 280 nm에서 흡광도에 기여하지 않기 때문에 PEG화된 인터페론 농도가 인터페론 균등물로서 보고된다.
B. PEG화된 인터페론의 생화학적 특성
표본은 SDS-PAGE(본원에서 제시되지 않는 겔)에 의하여 개질화 정도에 대하여 분석하였다. 단일 PEG를 첨가하면 20 kDa에서 55 kDa로 인터페론의 명백한 질량 이동을 초래하여 분석에 매우 용이하다. PEG화된 표본에서 추가적 PEG기의 존재로인한 고도의 질량 형태의 증거 또는 비개질된 인터페론-베타-1a의 증거가 존재하지 않았다. 단일PEG의 존재는 MALDI 질량 분광계에 의하여 증명되었다. PEG화 반응의 특이성은 펩티드 맵핑에 의하여 측정되었다. 대조구로서, 240 uL의 200mM Tris HCl pH 9.0, 1mM EDTA 중 PEG화되고 비개질된 인터페론-베타-1a의 20 ug 분할량은 3-4 시간동안 27℃에서 아크로박테리아(버지니아주 리치몬드 아코 바이오프로덕츠)로부터 라이실 엔도프로티나제 1.5ug으로 절단시켰다. 200mg의 구아니딘 HCl을 각 표본에 첨가하고, 1.4 ml/분 유속의 0.1% TFA 중에서 0 내지 70 % 아세토니트릴 30 분 구배를 사용하여 Vydac C4컬럼(0.46×25 cm) 상에서 절단 생성물을 단편화시켰다. 214mm에서 컬럼 용출물의 흡광도를 모니터하였다.
분석의 결과는 도6에 나타난다. 인터페론-베타-1a의 엔도프로티나제 Lys-C 절단에서 예측되는 모든 펩티드는 N-말단 서열 결정 및 질량 분광분석에 의하여 동정되었고, 이들 중 인터페론(AP8)의 N-말단을 함유하는 펩티드만이 맵에서 그것의 소실로 인하여 증명되는 바와 같이 개질에 의하여 변형되었다. 따라서 맵핑 데이터상기 PEG부분이 상기 펩티드에 특이적으로 부착됨을 나타낸다. 또한, 상기 데이터는 N-말단 개질이 상기 펩티드를 특이적으로 손실시키시 때문에 PEG 부분이 단백질의 N-말단에 표적화됨을 나타낸다.
본 결론을 위한 추가적 증거는 엔도프로티나제 Lys-C 절단으로부터 PEG 화된 N-말단 펩티드의 분리, 시아노겐 브로마이드(CNBr)을 사용한 추가적 펩티드의 절단 및 표본의 매트릭스-조력된 레이저 탈착 이온화 포스트 소스 붕괴(MALDI PSD) 서열 분석에 의하여 획득되었다. N-말단 펩티드의 CNBr 절단은 상기 펩티드를 2개의 단편, 즉, 말단 메티오닌(M1)을 함유하는 PEG 부분 및 SYNLLGFLQR(성숙한 인터페론 베타 서열에서 잔기 2-11)으로 추가 절단할 것이다. 서열 분석은 상기 처리의 예측된 결과인 비개질된 펩티드 SYNLLGFLQR을 동정하였다.
인터페론-베타-1a 표본의 항바이러스 활성은 뇌심근염(EMC) 바이러스에 노출되었던 인간 폐암 세포(A549 세포)에 대하여 상술된 MTT 염색을 포함하는 방법을 사용하여 시험하였다. 간단히, A549 세포는 바이러스로 공격하기 전에 인터페론-베타-1a 또는 PEG-개질된 인터페론-베타-1a(4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62.5, 31.25, 50, 33.3, 22.2, 14.8, 9.9, 6.6, 4.39 pg/ml)로 24시간동안 예비처리하였다. 분석은 각 인터페론-베타-1a 농도에 대한 2중 데이터 포인트를 사용하여 수행되었다. 표준 편차는 도7의 에러바로서 표시된다. 50% 바이러스 치사("50% 세포변성 효과")(50% 최대 OD450)를 제공하는 인터페론-베타-1a의 농도(제형화 또는 거대)는 약 11pg/ml이고, PEG 개질된 인터페론-베타-1a의 50% 세포변성 효과는 약 11pg/ml이었다. 따라서, PEG 접합은 인터페론-베타-1a의 항바이러스 활성을 변형시키지 않았다. 본 분석에서 본 출원인은 인터페론-베타-1a의 특이적 활성이 인터페론-베타-1b의 특이적 활성보다 약 10배 크며 따라서 PEG화된 인터페론-베타-1a가 임의의 인터페론-베타-1b 생성물보다 활성이 상당히 크다는 것을 발견하였다.
또한 인터페론-베타-1a는 Fluka, Inc(뉴욕주 론콘코마 Cat No. 75936)에서 구입한 5K PEG-알데히드 부분을 PEG화시켰는데, 5K PEG 2mg/ml를 함유한 반응을 제외하고는 20 K PEG 알데히드를 사용한 개질에 대하여 설명된 동일한 프로토콜을 따랐다. 5K PEG를 사용한 개질은 또한 N-말단에 대하여 매우 특이적이었고,인터페론-베타-1a의 항바이러스 활성을 변형시키지 않았다. 20K 부가물처럼, 5K PEG 인터페론-베타-1a는 항바이러스 분석에서 비개질된 인터페론-베타-1a와 구별되지 않았다.
실시에 3: PEG화는 응력 유도된 응집에서 인터페론-베타-1a를 보호
인터페론 베타의 응집은 활성에 대하여 해로운 효과를 갖는다. 이전에, 본 발명자는 글리코실화가 인터페론-베타-1a의 비글리코실화된 형태에 비하여 인터페론-베타-1a에 미치는 상당한 효과를 보여주고, 글리코실화가 인터페론-베타-1a의 높은 특이적 활성에 기여함을 추론하였다(Runkel L. et al, Pharm. Res. 15:641-649). 폴리알킬렌 글리콜 중합체와의 접합체가 추가로 인터페론 베타를 안정화시키는지에 대한 조사를 위하여, 본 발명자는 다음의 프로토콜을 사용하여 PEG화된 인터페론-베타-1a를 열 압박시켰다:
컴퓨터 제어, 열전기적으로 가열된 크벳 홀더를 구비한 CARY 3UV-가시광선 분광분석기를 사용하여 열변성을 수행하였다. 20 mM HEPES pH7.5, 20mM NaCl 중 인터페론-베타-1a의 용액은 1 ml 크벳내 25℃에서 평형화되었다. 크벳 홀더의 온도는 2℃/분의 속도로 25℃에서 80℃로 급격히 상승시켜 단백질을 변성시킨 후 280 nm에서 흡광도를 계속적으로 모니터하였다. 대등한 펼침 중간점, Tm은 측정된 흡광도가 대등한 펼침 전이의 한쪽면에 선형 부분으로부터 추론된 선에 의하여 정의된 값간의 중간방식인 온도 측정에 의하여 융해 곡선으로부터 얻어졌다.
상기 분석의 결과는 도8에 나타났다. 비-PEG화된 인터페론-베타-1a가 변성되고 60℃에서 전이의 50% 포인트로 응집되었다. 80℃에서도 PEG화된 인터페론의 응집이 증명되지 않는다. 독립적 분석에서, 본 출원인은 95℃ 및 그 이상의 온도에서로 열응집 처리를 신장하였다. 따라서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 중합체의 접합은 단백질의 안정성에 상당히 이로운 영향을 미친다. 유사한 안정성은 개질된 인터페론-베타-1a 함유한 20 K 및 5K PEG로 나타났다.
실시예 4: 인터페론-베타1a 및 PEG화된 인터페론-베타-1a로 처리된 마우스의 혈장에서 인터페론-베타-1a 항바이러스 활성의 측정
마우스(C57/B16)에 50,000 유니트의 인터페론-베타-1a 또는 20K PEG를 함유하는 50,000 유니트의 PEG화된 인터페론-베타-1a 또는 대조구로서 동일 부피의 인산염 완충액을 꼬리 정맥을 통하여 정맥내 주사한다. 혈액은 다른 시간 포인트(즉시, 0.25, 1, 4, 24 및 48 시간)에서 역-순환 채혈을 통하여 샘플을 얻는다. 시간 포인트 당 3마리 이상의 마우스가 있다. 전 혈액은 항응고제를 함유하는 관으로 수집하고, 세포를 제거하여 생성된 혈장을 분석 시점까지 냉동시킨다. 그 후, 이들 혈장 표본으로 항-바이러스 분석 실험을 행한다. 혈장 표본을 무혈청 분석 배지로 1:10 희석하고, 2.0 um 주사 여과기를 통과시켰다.
희석된 표본으로 항바이러스 분석 실험을 행한다. 표본은 A549 세포를 포함하는 96 웰 조직 배양액 플레이트의 지정된 웰내로 적정시킨다. 표준 인터페론-베타-1a(10, 6.7, 4.4, 2.9, 1.3, 0.9, 및 0.6 U/ml) 및 4개 표본을 모든 플레이트 상에 전개시킨다. A549 세포는 EMC 바이러스로 공격하기 전에 24 시간동안 희석된 혈장 표본으로 예비처리한다. 바이러스로 2일 항온처리한 후, 살아있는 세포를 1시간 동안 MTT(인산염 완충액중 5mg/ml)의 용액으로 염색하고, 인산염 완충액으로 세척하고, 이소프로판올 중 1.2N HCl으로 가용화한다. 웰을 450 nm에서 판독하였다. 표준 곡선은 각 플레이트에 대하여 생성되고 각 표본에서 인터페론-베타-1a 활성의 양을 측정하는데 사용되었다. 다른 마우스로부터 얻은 표본의 활성은 도9에서 시간 포인트에 대하여 도시된다.
시간의 함수로서 순환시 PEG화된 인터페론-베타-1a의 손실이 더 느릴수록 PEG화된 표본의 반감기가 개질되지 않은 인터페론-베타-1a 대조구보다 더 길어진다는 것을 나타낸다. 대조구는 4시간 후에 대개 명백했지만, PEG화된 생성물의 상당한 분획은 48시간 후에 검색되었다. 혈청내 활성의 최초 수준 및 48시간 후에 지속되는 활성 수준에 기초하여 본 발명자는 비개질된 인터페론-베타-1a의 반감기에 비교한때, PEG화된 인터페론의 반감기의 연장을 추론한다. 연구로부터 발견된 제2 사항은 0분 및 60분 시간포인트에서 활성이 유사하게 높았던 점에 의하여 증명된 바와 같이, PEG화된 형태의 극소량이 분배 단계동안 소실된다는 점이다. 상기 데이터는 대조구 인터페론-베타-1a와는 달리, PEG화 생성물이 거의 혈관류에 제한되어 분포함을 시사한다.
실시예 5: 영장류에서 비교 약동력학 및 약물역학
비교 연구는 인터페론-베타 1a 융합체 및 고유의 인터페론-베타 1a(pH7.2, 200 mM NaCl, 100 mM 인산 나트륨 중의 비제형화된 거대한 중간체 AVONEX 상품명인 인터페론-베타-1a)로 수행되며 영장류에서 이것의 상대적 안정성 및 활성을 측정한다. 상기 연구에서, 영장류에서 인터페론-베타-1a 융합체의 약동력학 및 약물역학이 고유의 인터페론-베타 1a에 비교되고 인간에게 합리적으로 유추될 수 있다.
동물 및 방법
연구 설계
본 연구는 인터페론-베타-1a 융합 단백질 및 비융합 인터페론-베타-1a의 비교 약동력학 및 약물역학을 평가하는 병렬군, 반복 투여 연구이다.
건강한 영장류(바람직하게는 붉은털 원숭이)를 본 연구에 사용한다. 투여전, 모든 동물은 시험 품목 투여 이전 14일 이내에 2회 실험실 동물 수의사에 의하여 건강 상태에 대하여 평가받을 것이다: 건강한 동물만이 시험 품목을 투여받을 것이다. 기초 임상 병리학 및 인터페론-베타-1a에 대한 기초 항체 수준을 위하여 투여전 채혈하고 일반적인 건강을 진단할 것이다. 모든 동물은 체중을 측정하고 시험 품목 투여 전 24 시간 이내에 체온을 기록할 것이다.
12마리 피검체를 등록하고, 융합여부를 제외하고는 동일한, 융합되거나 또는 비융합된 인터페론-베타-1a로서 1 MU/kg의 인터페론-베타-1a를 투여받는 3마리의 군으로 할당한다. 피하(SC) 또는 정맥(IV) 경로로 투여한다. 6마리 숫컷 동물은 IV 경로(3/처리)에 의하여 시험 품목을 투여받을 것이고, 또다른 6마리 숫컷 동물은 SC 경로(3/처리)에 의하여 시험 품목을 투여받을 것이다. 모든 동물은 인터페론-베타 처리를 받은 적이 없어야 한다. 각 동물은 2회 투여받을 것이고, 투여는 4주로 분리될 것이다. 투여 부피는 1.0ml/kg일 것이다.
약동력학 시험을 위하여 각 주사후 0, 0.083, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 및 96 시간에 채혈한다. 인터페론 유도된 생물학적 반응 마커, 혈청 네오프테린의 측정을 위한 혈액 표본은 연구 약물의 투여 후 0, 24, 48, 72,96, 168, 336, 504 시간에 채혈한다.
연구 기간 동안의 평가는 독성의 신호를 위한 투여 후 30분 및 1시간 후 수행된 임상적 관찰을 포함한다. 매일 우리옆 관찰을 하고, 일반적 외관, 독성 신호, 불안 및 행동의 변화를 기록할 것이다. 투여 후 21일동안 규칙적 간격으로 체중 및 체온을 기록할 것이다.
분석 방법
세포변성 효과(CPE) 생검을 사용하여 혈청내 인터페론 베타의 수준을 정량한다. CPE 분석은 인터페론-매개된 항바이러스 활성의 수준을 측정한다. 표본에서 항바이러스 활성의 수준은 혈액을 채취한 때 표본에 함유된 활성 인터페론의 분자 수를 반영한다. 상기 접근법은 인터페론 베타의 약동력학을 측정하는 표준방법이다. 본 연구에서 사용된 CPE 분석은 뇌막심근염(EMC) 바이러스에 기인한 세포독성으로부터 인간 폐암 세포(A549, #CCL-185, 기탁번호, 미주리 록빌)을 보호하는 인터페론 베타의 능력을 검출한다. 세포는 혈청 표본과 15 내지 20 시간동안 예비항온처리하여 인터페론 유도된 단백질의 유도 및 합성을 가능하게 하여 항바이러스 반응에 이른다. 이후 EMC 바이러스를 첨가하여 추가로 30시간 동안 항온처리하고, 결정 바이올렛 염색을 사용하여 세포독성을 측정하였다. 내부 인터페론 베타 표준 및 인터페론-베타-Ig 내부 표준이 각 분석 플레이트에서 표본과 함께 시험된다. 상기 표준은 인간 섬유아세포 인터페론 참고 표준에 대하여 보정화된다(WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53). 또한 각 분석 플레이트는 EMC 또는 임의의 종류의 인터페론을 포함하지 않는 세포 성장대조구 웰을 포함하고, 바이러스 대조구 웰은 세포 및 EMC를 포함하나 인터페론 베타를 포함하지 않는다. 표준 및 표본을 포함하는 대조구 플레이트는 세포 성장에 대한 표본의 효과를 결정하기 위하여 제조된다. 상기 플레이트는 바이러스 첨가없이 염색된다.
표준 및 표본은 각각의 2 복제 분석 플레이트에 대하여 한벌로 시험되며, 표본 당 4개 데이터 포인트를 산출한다. 4 복제의 기하학적 평균 농도가 보고된다. 본 분석에서 검출 한계는 10 유니트(U)/ml이다.
네오프테린의 혈청 농도는 시판되는 분석을 사용하여 임상적 약물학적 단위에서 측정된다.
약물동력학 및 통계적 방법
Rstrip TM 소프트웨어(유타주 솔트레이크 시티, 마이크로매스, 인크.)가 약물동력학 모델에 데이터를 조정하는데 사용된다. 기하학적 평균 농도는 각 군에 대하여 시간에 의하여 플롯된다. 분석 결과가 희석되어 표현되므로, 기하학적 평균이 산술적 평균보다 더 적절한 것으로 고려된다. 혈청 인터페론 수준이 기초값에 대하여 조정되고, 검출불가능한 혈청 농도는 검출의 하한치의 반을 나타내는 5 U/ml로 고정된다.
IV 융합 데이터에 있어서, 2 구획 IV 융합 모델은 각 피검체에 대한 검출가능한 혈청 농도로 조정하고, SC 데이터는 2 구획 주입 모델로 조정한다.
다음의 약물동력학 매개변수를 산출한다:
(i) 관찰된 피크 농도, C최대(U/ml);
(ii) 0 내지 48 시간의 곡선 이하 면적, 사다리꼴 법칙을 사용한 AUC;
(iii) 제거 반감기;
및 , IV 주입 데이터로부터(만일IV가 사용되면):
(iv) 분배 반감기(h);
(v) 제거율(ml/h)
(vi) 분배의 겉보기 부피, Vd(L).
윈논린(노스 캐롤리나주 아펙스, 버젼 1.0, 사이언티픽 컨설팅 인크.) 소프트웨어는 SC 및 IM 주사후 제거 반감기를 계산하는데 사용된다.
네오프테린에 있어서, 시간에 의한 산술적 평균이 각 군에 대하여 제시된다. E최대는 기초로부터의 최대 변화값이 계산된다. C최대, AUC 및 E최대는 변이의 일방 분석을 수행하여 투여 군을 비교한다. C최대및 AUC는 분석전에 지수적으로 전환된다: 기하학적 평균이 보고된다.
실시예 6: 붉은 털 원숭이에서 PEG화된 인터페론 베타-1a 및 인터페론-베타-1a 약운동학의 평가
재료 및 방법
실시예5의 일반 프로토콜에 설명된 바와 같이 인터페론-베타-1a 또는 PEG화된 IFN 베타-1a를 정맥내 또는 피하내로 1일 및 29일에 붉은털 원숭이에 투여하였다. 1일에, 6마리의 원숭이는 IFN 베타-1a(경로당 3마리)를 투여받고, 또 다른 6마리의 원숭이는 PEG화된 INF 베타-1a(경로당 3마리)를 투여받았다. 29일에 투여를반복하였다. IV 투여를 두부 또는 복재 정맥으로 저속 환괴형 주사로 투여하였다. 주사 부위를 면도한 후 후방 피부 아래에 SC 투여를 하였다. 특정 시간 포인트에 대퇴골 정맥을 통하여 혈액을 채취하고 응고시켜 혈청을 얻었다. 유효한 항바이러스 CPE 방법을 사용하여 기능적 약물 물질의 수준에 대하여 또한 활성의 약물운동학 측정으로서 베타2-마이크로블린 수준 및 혈청 네오프테린에 대하여 혈청을 분석하였다. 약학적 매개변수는 윈논린 2.0 소프트웨어(노스 캐롤리나주 아펙스의 사이어티픽 컨설팅 인크.)를 사용하여 계산하였다.
표준 모델-독립 방법(비구역적 분석)에 의하여 농도 데이터를 분석하여 약물역학적 매개변수를 얻었다. 곡선 아래 면적(AUC)는 트라페조이드 법칙을 사용하여 계산하였다. 산술적 평균 및 표준 편차를 포함한 통계적 분석은 마이크로소프트 엑셀 버전 5.0 소프트웨어(WA 레드몬드의 마이크로스프트 코프.)를 사용하여 수행되었다. 정량의 하한치(BLQ)로서 보고된 농도값은 약물동력학 분석에서 사용되지 않았다. 다양한 컴퓨터 및 컴퓨터 프로그램이 다양하게 숫자를 반올림하고 삭제한다는 사실에 기인하여, 일부 표의 값(예, 평균값, 표준 편차 또는 각 수치)이 각각 계산된 데이터 또는 표준화된 분석 데이터에서 기타 표의 것과 약간 다를 수 있다. 데이터의 통합성 또는 해석이 상기 차이에 의하여 영향을 받지 않았다.
결과 및 검토
투여의 각 회에서, PEG화된 IFN-베타-1a는 더 높은 생체유용성을 나타냈다(혈청 농도-시간 곡선 아래의 면적에 의하여 측정됨). 또한 SC 경로에 의하여 투여한 경우, PEG화된 IFN-베타-1a는 IFN-베타-1a에 비하여 높은 절대 생체유용성을 갖는다. 본 발명자는 표5에 약물역학 매개변수를 요약하였다. IV 및 SC 경로에 의한 PEG화된 IFN-베타-1a의 투여는 IFN-베타-1a의 AUC 및 반감기를 증가시킨다.
붉은털 원숭이에 1 MU/kg의 IFNb-1a 또는 PEG화된 IFN B-1a의 IV 또는 SC(용량 1) 투여에 따른 평균(±표준 편차) BG9418 약물역학 매개변수
제형(투여 경로) C최내 T최대 AUCU*시간/mL CL(ml/kg) Vss(mL/kg) T1/2
IFN B-1a(정맥내) 6400(±0) 0.083(±0) 4453(±799) 229(±38) 543(±147) 3.2(±1.4)
PEG화된 IFN-b-1a(정맥내) 10800(±3811) 0.083(±0) 34373(±3601) 22(±3) 250(±30) 9.5(±2.1)
IFN B-1a(피하내) 277(±75) 5.3(±1.2) 4753(±3170) N/A N/A 10.0(±2.9)
PEG화된 IFN B-1a(피하내) 1080(±381) 3.3(±1.2) 42283(±5934) N/A N/A 22.0(±3.4)
*n=3
제1 용량의 IV 투여 후, IFN 베타-1a 및 PEG화된 IFN 베타-1a의 평균(±표준 편차) 피크 혈청 농도(C최대)는 각각 6400(±0) 및 10800(±3.5)U/mL 이었다. 평균(±표준 편차) AUC 값은 각각 4453(±799) 및 34373(±3601) U*시간/mL이었다. 제1 피하 투여 후, IFN 베타-1a 및 PEG화된 IFN 베타-1a의 평균(±표준편차) C최대는 각각 277(±75) 및 1080(±381) U/mL이었다. 평균(±표준편차) AUC 값은 각각 4753(±3170) 및 44952(±1443) U*시/mL이었다.
혈청 네오트페린 및 혈청 베타2마이크로글로블린 수준 모두 IFN-베타 및 PEG화된 IFN-베타로 처리후 상승되며, 이것은 생성물의 약물학적 활성을 표시한다. 사용된 시험 화합물의 고용량에서, 투여 경로에 의한 IFN 베타-1a 및 PEG화된 IFN 베타-1a의 약물학적 활성은 차이가 없었다(데이터 제시되지 않음).
실시예7: 다양한 방식의 투여 후 래트에서 PEG화된 인터페론-베타-1a 및 인터페론-베타-1a 약물운동학의 비교 평가
상기 연구의 목적은 다양한 경로의 투여에 의한 인터페론-베타-1a 및 PEG화된 인터페론 베타-1a의 생체유용성을 비교하는 것이다.
재료 및 방법:
본 발명자는 제형당 경로마다 2마리 래트로 약물동력학 분석을 위한 암컷 루이스 래트(각 190 그람)를 사용하였다. 래트는 경부 배관시키고 인간 인터페론 베타-1a 또는 5K PEG화된 인간 인터페론 베타-1a, 또는 20K 인간 인터페론 베타-1a(pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM 인산나트륨 중 14mg/mL HSA로 구성된 담체내)를 정맥내, 복강내, 경구, 피하내 또는 기관내 투여하였다. 혈액을 72 시간에 걸쳐 0분, 5 분, 15분, 30분, 75분, 3시간, 24시간, 48시간 및 72시간에서 수회 가공하였다.프로토콜은 표6에 제시되었다. 세포변성 효과(CPE) 생검법은 혈청에서 인터페론-베타를 검색하기 위해 혈청 표본 상에서 수행되었다. 비개질된 인터페론 베타-1a 및 20 K PEG로 PEG화된 인터페론 베타-1a로 생성된 결과는 표7에 제시되었다. 모든 경우에, PEG화는 t1/2 및 AUC에서 상당한 증가를 야기하였다.
래트에서 인터페론 베타-1a(IFN) 및 PEG화된 IFN-베타 1a(IFN-PEG)의 정맥내, 피하, 복강 또는 기관내 투여 후 약물역학 매개변수
제형(투여 경로) C최대(U/mL) T최대(시) AUC/투여(U시)/(mL ug) T1/2(시)
IFN(정맥내, 20ug 투여) 64000 0.25 3035 1.25
IFN-PEG(정맥내, 3ug 투여) 23970 0.08 47728 8.44
IFN(피하, 20 ug 투여) 2400 1.00 464.4 0.96
UFN-PEG(피하, 3ug 투여) 2400 7.00 14688 11.9
IFN(복강내, 20ug 투여) 26000 1.25 4159 1.53
IFN-PEG(복강내, 3ug 투여) 9700 1.25 52148 16.2
IFN(기관내, 15ug 투여) 240 1.5 70.7 1.29
IFN-PEG(기관내, 15ug 투여) 270 7.0 233.5 6.21
실시예8: 중합체-접합된 인터페론 베타-1a의 항혈관형성 효과:
시험관내 내피 세포 증식을 저해하는 PEG화된 인터페론-베타-1a의 능력 측정
인간 정맥 내피 세포(Cell Systems, Cat. #2V0-p75) 및 인간 피부 미세혈관 내피 세포(Cell Systems, Cat. #2M1-C25)는 CS-C 배지 키트(Cell Systems, Cat. #4Z0-500)와 함께 배양액에서 유지된다. 실험전 24시간에 세포를 트립신 처리하고 분석 배지, 90% M199 및 10% 태아 소 혈청(FBS)에서 재현탁하고, 원하는 세포 밀도로 조정한다. 이어서 세포는 각각 12,500 세포/웰 또는 2,000 세포/웰로 겔라틴-코우팅된 24 또는 96 웰 플레이트 상에서 플레이트한다.
밤새 항온배양 후, 분석 배지는 인간 재조합 기초 섬유아세포 성장 인자(벡톤 디킨슨, Cat. #40060) 및 융합 및 비융합 인터페론-베타-1a 단백질 또는 양성 대조구(엔도스타틴은 bFGF에 대한 항체일 수 있듯이 양성 대조구로서 사용될 수 있음)의 다양한 농도를 함유하는 신선한 배지로 대체한다. 최종 부피를 96 웰 플레이트 중 0.2 ml 또는 24 웰 플레이트중 0.5 ml로 조정한다.
72 시간 후에, 세포를 코울터 계수를 위하여 트립신화하고, 시콴트(CyQuant) 형광 판독을 위해 냉동하거나 또는 [3H]티미딘으로 표지한다.
상기 시험관내 분석은 본 발명의 인간 인터페론-베타 분자가 내피 세포 증식에 미치는 영향을 시험하는 것으로, 이것은 생체내 항-혈관형성을 시사할 수 있다. 참조 O'Reilly, M.S., T. Boehm, Y.Shing, N. Fukal, G. Vasios, W.Lane, E. Flynn, J.Birkhead, B.Olsen, 및 J. Folkman. (1997). 엔도스테인: 혈관신행 및 종양 성장의 내인성 저해제. Cell 88, 277-285.
실시예9: 인터페론-베타-1a/Ig 융합의 항-혈관형성 및 신생혈관형성 영향을 시험하는 생체내 모델
다양한 모델이 본원에서 설명된 분자의 항-혈관형성 및 항-신생혈관형성에 미치는 영향에 대하여 시험하기 위하여 개발되었다. 상기 모델 중의 일부는 미국 특허 제5,733,876호(1998. 3. 31:"혈관형성의 저해 방법") 및 제5,135,919호(1992. 8. 4:"혈관형성의 저해를 위한 약학 조성물 및 방법")에서 설명되었다. 기타 분석은 외피가 없는 융모요막(CAM) 분석[S. Taylor and J. Folkman; Nature, 297, 307(1982) 및 R. Crum. S. Szabo and J. Folkman; Science. 230. 1375(1985)]; 마우스 척추 에어 삭 방법 항혈관형성 모델[Folkman, J. et al.; J. Exp. Med., 133, 275(1971)] 및, 500ng의 기초 FGF(소, R&D 시스템, 인크.)를 이식하고, 각 각막에서 EVA(에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체) 펠렛에 함침함으로써 스프라그-다울리 균주(Charles River, 일본)의 성숙한 숫컷 래트에서 유도되는 각막 혈관형성에서 래트 각막 미세포켓 분석[Gimbrone, M.A. Jr. et al., J. Natl. Cancer Inst. 52, 413(1974)]을 포함한다.
동물 모델에서 항-혈관형성 영향에 대한 인터페론-베타/Ig 융합을 시험하는 기타 방법은 초기 암 화학요법 리포트[Cancer Chemotherapy Report, Part 3, Vol.3, No.2, 1972, 9] 및 생체내 암 모델에서 보충[the supplement In Vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH 공개번호 84-2635, 1984, 2]에서 설명된 바와 같은 신규한 잠재적 항암제를 검색하기 위한 프로토콜을 포함한다(그러나, 이에 제한되지 않음). 유형 I 인터페론의 종 장막 때문에 설치류 모델에서 인터페론-베타 융합의 항-혈관형성의 활성을 측정하기 위하여, 설치류 인터페론-베타/Ig 융합 제제가 제조된다. 상기 검색 방법은 피하적으로 이식된 루이스 폐암(Lewis Lung Carcinoma)에 대한 뮤린 인터페론-베타/Ig 융합의 항-혈관형성 영향을 시험하는 프로토콜에 의하여 예시된다.
종양주의 기원:
C57BL/6 마우스에서 폐암으로서 1951에 자연 발생.
시험 과정의 요약:
종양 단편을 B6D2F1 마우스의 보조 영역에 피하적으로 이식한다. 시험 제제(즉, 본 발명의 PEG화된 단백질)를 종양 이식 후 수일에 다양한 투여, 피하(SC) 또는 복강(IP)내 투여한다. 측정된 매개변수는 평균 생존 시간이다. 결과는 대조구 생존 시간의 백분율로서 표현된다.
동물:
번식: C57BL/6 마우스
시험: B6D2F1 마우스
중량: 마우스는 숫컷에서 18gm및 암컷에서는 17gm의 최소 중량과 3gm 중량 범위내여야 한다.
성별: 일회 실험에서 모든 시험 및 대조구 동물에 대하여 한 성별만이 사용된다.
근원: 한 실험에서 모든 동물은 가능하면 한 근원이다.
실험 규모:
시험 군 당 10 마리 동물
종양 전이:
번식:
단편: 피하 공여 종양의 2-4 mm 단편을 준비
시간: 13-15일
부위: 서혜 영역에 구멍을 갖는 액생 영역에 단편을 피하적으로 이식.
시험:
단편: 피하 공여 종양의 2-4 mm 단편을 준비.
시간: 13-15일
부위: 서혜 영역에 구멍을 갖는 액생 영역에 단편을 피하적으로 이식.
시험 계획:
0일: 종양 이식. 박테리아 배양액 전개. 모든 홀수번 실험에서 양성 대조구 화합물을 시험. 재료 준비. 치사율 매일 기록.
1일: 배양액 체크. 오염되었으면 실험 폐기. 동물 무작위 선택. 지시대로 처리(1일 및 후속일들).
2일: 배양액 다시 체크. 오염되었으면 실험 폐기.
5일: 초기 시험 제제 독성 평가일 및 2일에 중량 측정.
14일: 대조군 초기 치사일.
48일: 대조군 비흡입일.
60일: 실험을 끝내고 평가. 종양에 대하여 폐를 대략 검토.
정성적 조절:
모든 홀수번 실험에서 양성 대조구 화합물(NSC 26271(100mg/kg/주사의 용량인 시톡산))을 계획. 본 요법은 1일에만 복강으로 투여한다. 양성 대조구에 대한 시험/대조구 하한치는 140%이다. 허용가능한 비처리된 대조구 평균 생존 시간은 19-35.6 일이다.
평가:
측정된 매개변수는 평균 생존 시간, 1일 및 5일에 있어서 평균 동물 체중을 계산하고, 모든 시험 군에 대하여 시험/대조구 비율을 계산한다. 시작일 및 최종평가 일에 대한 평균 동물 체중이 계산된다. 시험/대조구 비율이 5일에서 65% 이상 생존을 갖는 모든 시험 군에 대하여 계산된다. 시험/대조구 비율이 86% 이하이면 독성을 의미한다. 또한 과도한 체중 변화 차이(시험 마이너스 대조구)는 독성을 평가하는데 사용될 수 있다.
활성에 대한 기준:
140%이거나 이상인 초기 시험/대조구 비율은 중간 활성을 나타내는데 필요한 것으로 생각된다. 150%이거나 이상인 재생가능한 시험/대조구 비율값은 상당한 활성으로 생각된다.

Claims (40)

  1. 폴리알킬렌 글리콜 부분을 함유하는 자연발생하지 않는 중합체에 커플링된 글리코실화된 인터페론-베타를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 부분은 알데히드기, 말레이미드기, 비닐설폰기, 할로아세테이트기, 다수의 히스티딘 잔기, 히드라진기 및 아미노티올기로 구성된 군에서 선택된 기에 의하여 인터페론-베타에 커플링되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 글리코실화된 인터페론-베타는 인터페론-베타-1a이고 항바이러스 분석 측정에서 인터페론-베타-1b보타 더 활성인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 인터페론 베타-1a는 항바이러스 분석 측정에서 중합체가 없는 인터페론-베타-1a의 0.5 내지 1배의 성능을 보유하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인터페론-베타는 인터페론-베타-1a 융합 단백질인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a 융합 단백질은 면역글로블린 분자의 일부를 포함하는 조성물.
  7. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 인터페론 베타는 (a) 항바이러스 활성이 바이러스 유도성 세포 용균에 의하여 측정될때, 야생형 인터페론 베타 1a보다 더 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이 성질; (b) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성보다 항바이러스 활성이 높은 돌연변이 성질; (c) 인터페론 수용체에 결합하지만, 야생형 인터페론에 비교할때, 수용체 결합 활성에 비하여 더 낮은 항바이러스 활성 및 더 낮은 항증식 활성을 갖는 돌연변이 성질 중에서 1 이상의 성질을 갖는 돌연변이 인터페론 베타인 조성물.
  8. 생리학적으로 활성인 인터페론-베타 조성물 중의 생리학적 활성 인터페론-베타 1a가 항바이러스 분석 측정에서 생리학적 활성 인터페론-베타 1b에 비하여 향상된 활성을 갖도록 생리학적 활성 인터페론-베타 1a 및 폴리알킬렌 글리콜 부분이 배열된, 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 중합체에 커플링된 생리학적 활성 인터페론-베타 1a를 포함하는 생리학적 활성 인터페론-베타 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a는 인터페론-베타-1a의 N-말단 위치에서 중합체에 커플링된 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a는 인터페론-베타-1a의 C-말단 위치 또는 그 근처에서 중합체에 커플링된 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a는 인터페론-베타-1a의 글리칸 부분에 의하여 중합체에 커플링되는 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a는 인터페론-베타-1a 융합 단백질인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a 융합 단백질은 면역글로블린 분자의 일부를 포함하는 조성물.
  14. 제8항 또는 제12항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a는 (a) 항바이러스 활성이 바이러스 유도성 세포 용균에 의하여 측정될때, 야생형 인터페론 베타 1a보다 더 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이 성질; (b) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성보다 항바이러스 활성이 높은 돌연변이 성질; (c) 인터페론 수용체에 결합하지만, 야생형 인터페론에 비교되는 경우 수용체 결합 활성에 비하여 더 낮은 항바이러스 활성 및 더 낮은 항증식 활성을 갖는 돌연변이 성질 중에서 1 이상의 성질을 갖는 돌연변이 인터페론 베타-1a인 조성물.
  15. 생리학적 활성 인터페론-베타 조성물 중의 생리학적 활성 인터페론-베타가 항바이러스 분석 측정에서 폴리알킬렌 글리콜 부분이 없는 생리학적 활성인터페론-베타에 비하여 실질적으로 유사한 활성을 갖도록 생리학적 활성 인터페론-베타 및 폴리알킬렌 글리콜 부분이 배열된, 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 중합체에 N-말단 커플링된 생리학적 활성 글리코실화 인터페론-베타를 포함하는 생리학적 활성 인터페론-베타 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 인터페론-베타는 인터페론-베타의 N-말단 위치에서 중합체에 커플링되는 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 인터페론-베타는 인터페론-베타의 C-말단 위치 또는 그 근처에서 중합체에 커플링되는 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 인터페론-베타는 인터페론-베타 상의 글리칸 부분에 의하여 중합체에 커플링되는 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 상기 인터페론-베타는 인터페론 베타 융합 단백질이 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 인터페론 베타 융합 단백질은 면역글로블린 분자의 일부를 포함하는 조성물.
  21. 제15항 또는 제19항에 있어서, 상기 글리코실화된 인터페론 베타는 (a) 항바이러스 활성이 바이러스 유도성 세포 용균에 의하여 측정될때, 야생형 인터페론 베타 1a보다 더 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이 성질; (b) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성보다 항바이러스 활성이 높은 돌연변이 성질; (c) 인터페론 수용체에 결합하지만, 야생형 인터페론 베타-1a에 비교되는 경우 수용체 결합 활성에 비하여 더 낮은 항바이러스 활성 및 더 낮은 항증식 활성을 갖는 돌연변이 성질 중에서 1 이상의 성질을 갖는 돌연변이 인터페론 베타인 조성물.
  22. 생화학적 가수분해 및/또는 단백질분해에 의하여 절단될 수 있는 불안정 결합에 의하여 폴리에틸렌 글리콜 부분에 커플링화된 인터페론-베타 1a를 포함하는 안정한 수용성의 접합된 인터페론-베타 1a 복합체.
  23. 제1항, 제15항 또는 제22항에 있어서, 중합체가 약 5 내지 약 40 킬로달톤의 분자량을 갖는 인터페론-베타 조성물.
  24. 제23항의 인터페론-베타 조성물을 포함하는 약학 조성물.
  25. 폴리에틸렌 글리콜 부분에 커플링화된 인터페론-베타 1a를 포함하는 인터페론-베타 1a 조성물의 유효량을 피검체에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 피검체의 잠재적 또는 발전된 질병을 유효한 인터페론-베타-1a로 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 인터페론-베타-1a가 인터페론-베타-1a의 N-말단의 위치에서 중합체에 커플링화되는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 인터페론-베타-1a가 인터페론-베타-1a의 C-말단의 위치 또는 그 근처에서 중합체에 커플링화되는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 인터페론-베타 1a가 인터페론-베타-1a 상의 글리칸 부분에 의하여 중합체에 커플링화되는 방법.
  29. 제25항에 있어서, 인터페론-베타 1a가 인터페론-베타-1a 융합 단백질인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 인터페론-베타-1a 융합 단백질은 면역글로블린 분자의 일부를 포함하는 방법.
  31. 제25항 또는 제29항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a가 (a) 항바이러스 활성이 바이러스 유도성 세포 용균에 의하여 측정될때, 야생형 인터페론 베타 1a보다 더 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이 성질; (b) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성보다 항바이러스 활성이 높은 돌연변이 성질; (c) 인터페론 수용체에 결합하지만, 야생형 인터페론-베타-1a에 비교되는 경우 수용체 결합 활성에 비하여 더 낮은 항바이러스 활성 및 더 낮은 항증식 활성을 갖는 돌연변이 성질 중에서 1 이상의 성질을 갖는 돌연변이 인터페론 베타-1a인 방법.
  32. 인터페론-베타 1a를 자연발생하지 않는 중합체 부분에 커플링시켜 커플링화 중합체-인터페론-베타 1a 조성물을 생성하는 단계 및 생체내 또는 시험관내 시스템으로 커플링된 중합체-인터페론-베타 조성물을 도입하는 단계를 포함하는 시험관내 또는 생체내 시스템에서 인터페론-베타-1a의 활성을 연장시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a가 인터페론-베타-1a의 N-말단 부위에서 중합체에 커플링되는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a가 인터페론-베타-1a의 C-말단 또는 그 근처의 부위에서 중합체에 커플링되는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a가 인터페론-베타-1a 상의 글리칸 부위에 의하여 중합체에 커플링되는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a가 인터페론-베타-1a 융합 단백질인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 인터페론-베타-1a 융합 단백질이 면역글로블린 분자의 일부를 포함하는 방법.
  38. 제32항 또는 제36항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a가 (a) 항바이러스 활성이 바이러스 유도성 세포 용균에 의하여 측정될때, 야생형 인터페론 베타 1a보다 더 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이 성질; (b) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성보다 항바이러스 활성이 높은 돌연변이 성질; (c) 인터페론 수용체에 결합하지만, 야생형 인터페론에 비교되는 경우 수용체 결합 활성에 비하여 더 낮은 항바이러스 활성 및 더 낮은 항증식 활성을 갖는 돌연변이 성질 중에서 1 이상의 성질을 갖는 돌연변이 인터페론-베타-1a인 방법.
  39. 제32항에 있어서, 상기 중합체가 폴리알킬렌 글리콜인 방법.
  40. 피검체에 제23항의 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 피검체에 혈관형성을 저해하는 방법.
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