HU229888B1 - Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses - Google Patents
Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses Download PDFInfo
- Publication number
- HU229888B1 HU229888B1 HU0200444A HUP0200444A HU229888B1 HU 229888 B1 HU229888 B1 HU 229888B1 HU 0200444 A HU0200444 A HU 0200444A HU P0200444 A HUP0200444 A HU P0200444A HU 229888 B1 HU229888 B1 HU 229888B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- beta
- interferon
- polymer
- composition
- activity
- Prior art date
Links
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 97
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims description 93
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims description 92
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title claims description 89
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims abstract description 123
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims abstract description 117
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 107
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 claims abstract description 43
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 40
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Substances OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 2
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011057 Breast sarcoma Diseases 0.000 claims 2
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 claims 2
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims 2
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 claims 2
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 claims 2
- RHMALYOXPBRJBG-WXHCCQJTSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[2-[[2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]- Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RHMALYOXPBRJBG-WXHCCQJTSA-N 0.000 claims 1
- FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N (e)-4-azaniumylbut-2-enoate Chemical compound NC\C=C\C(O)=O FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims 1
- 101150018634 Heph gene Proteins 0.000 claims 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 claims 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 claims 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 claims 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 abstract description 98
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 abstract description 4
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 95
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 73
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 71
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 41
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 33
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 30
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 29
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 28
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 28
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 23
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 22
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 22
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 22
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 15
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 11
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 11
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 9
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 7
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000208202 Linaceae Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 5
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 5
- 101100518501 Mus musculus Spp1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N Trp-Thr Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 5
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 4
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 4
- GGAPIOORBXHMNY-ULQDDVLXSA-N Lys-Arg-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O GGAPIOORBXHMNY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 4
- FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N Lys-Asp-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 4
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 4
- JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N Thr-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- KWTVWJPNHAOREN-IHRRRGAJSA-N Arg-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O KWTVWJPNHAOREN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- DDPXDCKYWDGZAL-BQBZGAKWSA-N Asn-Gly-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DDPXDCKYWDGZAL-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101000852865 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 2 Proteins 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 3
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 3
- 102100036718 Interferon alpha/beta receptor 2 Human genes 0.000 description 3
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 3
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WYOBRXPIZVKNMF-IRXDYDNUSA-N Tyr-Tyr-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WYOBRXPIZVKNMF-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 3
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 3
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 3
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 3
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N Asn-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- CCPHAMSKHBDMDS-UHFFFAOYSA-N Chetoseminudin B Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC1(SC)NC(=O)C(CO)(SC)N(C)C1=O CCPHAMSKHBDMDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000286779 Hansenula anomala Species 0.000 description 2
- HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N His-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101100290051 Malus domestica MALD1 gene Proteins 0.000 description 2
- SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N Met-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- VFDRDMOMHBJGKD-UFYCRDLUSA-N Phe-Tyr-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N VFDRDMOMHBJGKD-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100022025 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 5 Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- KAAPNMOKUUPKOE-SRVKXCTJSA-N Ser-Asn-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KAAPNMOKUUPKOE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PQEQXWRVHQAAKS-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CC=C(O)C=C1 PQEQXWRVHQAAKS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- YSXYEJWDHBCTDJ-DVJZZOLTSA-N Thr-Gly-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O YSXYEJWDHBCTDJ-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 2
- BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N Trihydroxypropylpterisin Natural products OCC(O)C(O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDGFPPHLXCEQRN-STECZYCISA-N Tyr-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KDGFPPHLXCEQRN-STECZYCISA-N 0.000 description 2
- ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N Tyr-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- BCOBSVIZMQXKFY-KKUMJFAQSA-N Tyr-Ser-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O BCOBSVIZMQXKFY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 235000017168 chlorine Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 2
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 2
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 2
- BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N neopterin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 2-[(1s,2s,3r,4s)-1,2,3,4,5-pentahydroxypentyl]-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C1NC(C(O)=O)CS1 JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 0.000 description 1
- FLZPKJNDZPCKJG-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-methyl-3,6-dihydro-2h-pyridin-1-yl)ethyl]guanidine;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.CC1=CCN(CCNC(N)=N)CC1 FLZPKJNDZPCKJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPSVYNDQEVZTMB-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1,3,5-trinitrobenzene;1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazocane Chemical compound CC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O.[O-][N+](=O)N1CN([N+]([O-])=O)CN([N+]([O-])=O)CN([N+]([O-])=O)C1 UPSVYNDQEVZTMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111329 ACE-1 gene Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000009881 Aega Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N Arg-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N Asn-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- RBOBTTLFPRSXKZ-BZSNNMDCSA-N Asn-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O RBOBTTLFPRSXKZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- QUCCLIXMVPIVOB-BZSNNMDCSA-N Asn-Tyr-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N QUCCLIXMVPIVOB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Asp-Ile Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101100004297 Caenorhabditis elegans bet-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100388543 Caenorhabditis elegans glt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100015199 Caenorhabditis elegans gly-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100508408 Caenorhabditis elegans ifa-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- MUZAUPFGPMMZSS-GUBZILKMSA-N Cys-Glu-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N MUZAUPFGPMMZSS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 244000182067 Fraxinus ornus Species 0.000 description 1
- 235000002917 Fraxinus ornus Nutrition 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- CBEUFCJRFNZMCU-SRVKXCTJSA-N Glu-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CBEUFCJRFNZMCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LHIPZASLKPYDPI-AVGNSLFASA-N Glu-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LHIPZASLKPYDPI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N Glu-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N His-His-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 240000001812 Hyssopus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010650 Hyssopus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N Ile-Asn-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N Ile-Leu-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- UWBDLNOCIDGPQE-GUBZILKMSA-N Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN UWBDLNOCIDGPQE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- UYNXBNHVWFNVIN-HJWJTTGWSA-N Ile-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)CC1=CC=CC=C1 UYNXBNHVWFNVIN-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 1
- 241001026509 Kata Species 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091071262 Lambda family Proteins 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KZZCOWMDDXDKSS-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KZZCOWMDDXDKSS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N Leu-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAPZLLPGGOOCRO-IHRRRGAJSA-N Met-Asn-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N UAPZLLPGGOOCRO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N Met-Leu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100189870 Mus musculus Pga5 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028400 Mutagenic effect Diseases 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100404023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 description 1
- 241000218180 Papaveraceae Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010030544 Peptidyl-Lys metalloendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000287509 Piciformes Species 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)CC1=CN=CN1 LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 239000004783 Serene Substances 0.000 description 1
- 208000031339 Split cord malformation Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033740 Tenomodulin Human genes 0.000 description 1
- 101710114852 Tenomodulin Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- IHAPJUHCZXBPHR-WZLNRYEVSA-N Thr-Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N IHAPJUHCZXBPHR-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRQCSEWEPIHLBI-JQWIXIFHSA-N Trp-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 GRQCSEWEPIHLBI-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N Tyr-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N Tyr-Gly-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N Tyr-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009933 burial Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 102000008395 cell adhesion mediator activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000001627 cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical class Cl* 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007891 compressed tablet Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 229920000547 conjugated polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229940000986 dextran 110 Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000000766 differential mobility spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010009297 diglycyl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000001856 erectile effect Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 235000015114 espresso Nutrition 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- VEWLDLAARDMXSB-UHFFFAOYSA-N ethenyl sulfate;hydron Chemical compound OS(=O)(=O)OC=C VEWLDLAARDMXSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003777 experimental drug Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Polymers 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- ZBJWWKFMHOAPNS-UHFFFAOYSA-N loretin Chemical compound C1=CN=C2C(O)=C(I)C=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 ZBJWWKFMHOAPNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010248 loretin Drugs 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- DBOAVDSSZWDGTH-UHFFFAOYSA-N n-(4-butylphenyl)-1-(4-ethoxyphenyl)methanimine Chemical compound C1=CC(CCCC)=CC=C1N=CC1=CC=C(OCC)C=C1 DBOAVDSSZWDGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000003605 opacifier Substances 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010242 retro-orbital bleeding Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 108010030159 thrombin receptor peptide 14 Proteins 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006208 topical dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000007070 tosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 201000011531 vascular cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/215—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
Description
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKED AALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEK
EDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTG
YLRN, és ahol a béta-interferon-1a egy egyetlen nem-természetesen előforduló polimerhez van kapcsolva a béta-interferon-1a N-terminális végénél, ahol a béta-interferon-1a és a polimer közötti kapcsolat egy reduktív alkilezési módszerrel létrehozható, és ahol a polimer egy polialkilén-glikol-csoportot tartalmaz.
A találmány béta-interferon-1a mutánst tartalmazó fenti kompozíciókra is vonatkozik.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti kompozíciók alkalmazásai és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények.
X
*72.27S/bZb
KmwAs AKAIJÁUL.· V X
SZÖtOAU; VAi.WS' ··*« ♦
nolipéptrdok és fehérjék alkalmazása speciális betegségek szisztémás késelésében ma már jói elfogadott az orvosi gyakorlatban. Ilyen anyagok terápiás szerepe olyan jelentős, hogy sok kutatás nagy mennyiségű, rekombináns DNS-technológiával történő szintézisükre irányult. Sok ilyen poüpeptíd endogén molekula, amely nagyon hatékony és specifikus biológiai hatásaikra nézve.
A legjelentősebb limitáló faktor ilyen fehérjénterű anyagok tervezett alkalmazhatóságára nézve parenterális beadásuk esetén az, hogy rövid idő alatt kiürülnek a testből. Ez megtörténhet proteázok métábólIzmusának eredményeként, vagy a fehérje kiürítését célzó, normál folyamatokon keresztül, például szűréssel a vesében. Ilyen anyagok orális beadása még problematikusabb, mivei a gyomorban lejátszódó proteolizísen kívül, a gyomorban lévő nagymértékben savas közeg tönkreteszi azokat, mielőtt elérnék tervezett célszövetüket. A. fehérjék említett beadási módjaival asszociált problémák jól ismertek a gyógyszeriparban, és különböző stratégiákat alkalmaznak, hogy megkíséreljék azokat megoldani.
Sok munkát közöltek, amelyben fehérjestabíUralással foglalkoznak. Különböző fehérjekonjugálási módszerek ismeretesek polimer anyagokkal, például deztránokkai, poll(vínil-pírrolidőn) o k kaI, g1í köp r ote i ne kkel, pol.i et i1én-gIi kői 1a1 va g y po 1i ami ηosavakkal. Az eredményül, kapott, konjagáit polipeptidőkről leírták.
hogy megtartották biológiai aktivitásaikat és vízoiohatőségüket pa re n t e r; á 1 i s a lka ima z á s o k e s e t é n
Az „interferonok' néven ismert peptidosaládra több klinikai '«•«ir
V munka összpontosított, valamint erőfeszítések történtek beadásuk és biológiai felszívódásuk javítására. Interferonokat különféle klinikai betegségekben teszteltek. Λ család egyik tagiá, dumán béta“interferon alkalmazása a legalaposabban ismert s/kleiczit multiplex kezelésében. A közelmúltban szabadalmaztatták Európádban és az. Egyesült Államokban rekombináns béta-interferon két formáját a betegség kezelésére, ás egyik forma a béta-interferon-la (védjegy és terméknév: &VÖNSX*,· gyártó biogen, Inc,, Cambridge, MM, melyet a továbbiakban, ^béta-ínterforon-ía -nak vagy „béta-.IFK~la -nak vagy ,,jl«IFN-la-«ak vagy „ p-IEh-Xa ~nak jelölünk, amelyek egymással felcserélhető megnevezések, A másik forma béta-interferon-lb (védjegy és terméknév: BETASERO14*’, gyártó Eeriex, Richmond, CA) , melyet a továbbiakban „béta-ínterfexon~lb'f -nak jelölünk, Az béta-rnterf eron-la-t emlős sejtekben termeltetik, természetes humán gén szekvenciájának alkalmazásával, és glikoz.iláiva van, mí.g a béta-intezférőn-Ifc-t E. coli baktériumban termeltetik, humán gén módosított szekvenciájának, alkaimazásával, amely géntechnológiai módosítással létrehozótt szubsztitúciót tartalmaz eíszteinről szeri nre: a 17, amínosav-feelyzetbeh, és nem gliköziiáit.
Régebben néhánysn közvetlenül összehasonlítottuk bétainterferon- la és foéta-ínterferon-lb relatív ín vitro hatékonyságát funkcionális vizsgálati eljárásokban, és kimutattuk, hogy a béta-interferon-la specifikus aktivitása körülbelül IQ-szer nagyobb, mint béta—interferon-· 1b specifikus aktivitása ( Run'kel et al., Eharm. Rés . 15, €41-046 (1998)). Ezeket a kisérlefeket arra terveztük, hogy azonosítsuk az aktivitások különbségeinek strakV.27S/BS
ΦΦ ΛΑ V* Χ«Φ> * Λ » X Φ Φ + * Φ Φ X * Φ * Φ ***Φ *♦»* Φ*** Φ tarális alapiét, ebben a glikozilálást tartottuk az egyetlen, ismert, termékek között fennálló strukturális különbségként, amely befolyásolja a specifikus aktivitást. A szénhidrát hatása nagyjából a szerkezetre kifejtett stabilizáló szerepében nyilvánul meg. A szénhidrát stabilizáló hatása nyilvánvalóvá vált hődenaturáoiós kísérletesből és SEC-analízrsból. A glikozílálás hiánya továbbá összhangban van az aggrsgáeió mértékének növekedésével és hödenaturációra való fokozott érzékenységeiéi. A szénhidrát enzimes eltávoiitása béta-interferon^la-ról PNSáz.....F~el a gikozilált termék jelentés mértékű kicsapódását okozta.
Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a béta-interferon·'-la és béta-interferon-ib szekvenciájában lévé konzervatív jelleg ellenére eltérő biokémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, és ennélfogva béta-intsríeron-lb-ről szerzett sok ismeret nem alkalmazható béta-interfeton^la^ra, és fordítva.
Kihasználtuk a giikoziiáit béta-interferon nem-gl ikoziiáit formákhoz viszonyított előnyeit. Konkrétan ágy, hogy kifejlesztettünk egy olyan béta-interferon-la-készitményf, amely fokozott akt ivit ássál r ende1ke ae tt béta-íntér£eron-ife-he z képes t, é s amely a peglláit fehérjék hasznos tulajdonságaival is rendelke-nett, amely általában, hatását tekintve nem vesztett aktivitásából , kon j ngáiat lan béta-lnterfei'on-la-f ormákhoz képest. Tehát, ha igy végezzük a módositást, hogy a termátok {polímer-bétainterferon-la-konjugátumok) megtartják minden biológiai aktivitásukat, vagy biológiai aktivitásaik többségét, az alábbi tulajdonságokat eredményezve; megváltozott farmakokinetika és farmakodinámia, amely megnovekedett fél-élet időhöz és változásokhoz
Ό , Z7S/&S?
«·>· <« $· ίί *>
* * « χ * * * ♦ « * ·» » X ♦ » «*?* X*** ♦ *** X vezet a szöveti eloszlásban (például hosszabb ideig képes az érrendszerben maradni) , fokozott, stabilitás oldatban, csökkent mértékű immunogenitás, védelem proteolitikus emésztés és azt követő aktivitásvesztés ellen. Ilyen formák lényegi előrehaladást jelentenek a gyógyszerészeti és orvostudományban, és szignifikánsan hoazájátalnak különböző olyan betegségek kezeléséhez, amelyben interferont hasznosan lehet alkalmazni, például szk.leróz.ls multiplexben, £ ibrózisban és más gyulladást okozó vagy sutoiraiün betegségben, rákbetegségekben, hepatitiszben és más vírusos betegségben. Különösen amiatt, hogy a béta-interferon-la hosszabb ideig képes az érrendszerben maradni, lehetővé teszi, hogy angiogenézls gátlására alkalmazzuk, és potenciálisan képes átlépni a vér-agy-gátat, Továbbá polimer-béta-interférőn-la~kon~ jugátnmok előállitásával nyert hőstabilitás előnyös béta-interferon -ia porként való kiszerelésekor, ha azt követően ágy kerül alkalmazásra, hogy inhalálással adjuk bé.
Felhasználtuk a béta-.interteron-la krisztaliográfiás szerkezetéről szerzett ismereteinket, és kifejlesztettünk egy olyan béta-interferon-la-poiimer-konjugátumot, amelyben a polimert úgy kapcsoltuk béta-interferon-ia-n lévő helyhez (helyekhez), hogy lehetővé váljon, hogy a kenj ugatom megtartsa a béta-interferonla teljes aktivitását, nem-konjogait béta-interferon-la-hoz hason irtva,
A találmány tárgya egyik vonatkozásában kon jógáit béta·· int e r f e ro η. -1 a - k omp le x, amo 1 y b e n a bé t a - in te r £ e r ο η -1 a ko v a 1 e n.s en yen kötve egy polimerhez, amely lényegi al kot'^'eszk'^t po 1 ,r a 1 k i 1 én - c s οpö t t ö t t a r ta 1 ma z.
•?Z. 2 Sí/SS
A Ar «>'« φ φ A A * * *
Φ < * Φ < * * * «φ«« φφφφ ΦV*A *
A találmány tárgya egy konkrét vonatkopásában fiziológiailag a kf í v bé fc a - in téri erőn -la- ké szi fcmén y, axw.1 y fiz i ο 1 ögi a i 1 a g a k fc ív feát a-i n ter fe ros-I a ~ t fc ar fcaImaz pö I i a 1 ki 1én-gIi ko1-cs opor fc o t tartalmazó polimerhez kapcsolva, amelyben a béta-ínterferon-la és a poiialkilén-giikoi-csoport úgy van elrendezve, hogy a készítményben lévő, fiziológiailag aktív béta-interferon™la fél-életideje megnövekszik az önálló Péta-ínterferon-la-'hoz (azaz kapcsolt polimert nem tartalmazó, nem-konjogait formához) képest.
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában, polimerhez: kap^ csőit, fizbológlailag aktív béta-ínterferon-la-t tartalmazö, béta~ínfeerferon-la~kéazítmény, amelyben a béta-interferon-la fúziós fehérje, előnyösen ímmnnogícbulint tartalmazó fúziós fehérje része. Ilyen komplexben az ^-terminális (konjugálás helye a polimerrel) és a C-terminál is (fúzió helye az Ig-résszel) szoros közelsége alapján feltételezzük, hogy a polimer-konjugálás valószínűleg Ősökként! a fúziós fehérje immunogenitását,
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában fiziológiailag aktív beta-í nterf eron-ía-kés zítmény, amely fiziológiailag aktív háfca-infcerferon-la-t tartalmaz poiialkilén-glikol-csoportét tartalmazó polimerhez kapcsolva, amelyben a béta-interferon-la és a polialkiién-glikol-csoport úgy van elrendezve, hogy a készítményben lévő, fizíolőgiaiiag aktív béta-interferon-la aktivitása fokozottabb az önálló béta-interferon-la-hez: (azaz kapósóit polimert nem tartalmazó, nem-konjogéit formához) képest.
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában ken j egált bétainfcerférőn··la-fehérja, amely mutáns béta-interferon-la-fc tartalmaz olyan műtérnek előállítása céljából, amelyek szelektíven fc* > * * * -» * * * * * « *. « * »<S ** X **·* Φ ** * * kozott antíviráiis és/vagy sntiproliferatly aktivitással rendelkeznek nem-mutáns béta-ínterferon-Ia-formákhoz viszonyítva,
A találmány tárgya egy további vonatkozásában stabil., vízben oldható, kon jógáit béta-interferon-la-komplex, amely .f iziolőgi ailag kompatibilis polietilén-glikol-esoporthoz kovalensen kapóséit,- fiziológiailag aktív béta-inberferon-la-t tartalmaz. Az ilyen komplexben a béta-xnterferon-la olyan kovalens kötéssel lehet a fiziológiailag kompatibilis polietiléh-gliko-l.^csoporthoz kapcsolva, amely labilis kovalens kötés a béta-interferon-la szabad, aminosav-osopörtjánál kialakítva, és amely labilis kovalens kötés in vívó biokémiai hidrolízissel és/vagy proteolízíssel hasítható.
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában dózisforma, amely gyógyászatilag elfogadható hordozót és stabil, vízben oldható béta--interferon-la-kompiexet tartalmaz, amelyben a béta-interferon fiziológiáilag kompatibilis po iietiién~giikolhoz van kapcsolva...
A találmány tárgyát képezik egy másik vonatkozásában kovalensen: kapcsolt béta-.interférőn-1a- kés ζitmények, például olyanok, amelyekben a fentebb leírtak szerint béta-interferon-la-t tartalmaznak diagnosztikai vagy in vivő alkalmazásokra, amelyben a béta-interferon-- la pé 1 dáu.1 díagnos z fi ka i reagens immuno lógiai vizsgálati eljárásban történő felhasználásra., vagy más diagnosztikai vagy nem in vivő alkalmazásokban történő felhasználásra. ilyen nem-terápiás alkalmazásokban a találmány szerinti komplexek nagyon hasznosan alkalmazhatők stabilizált készítményként, amely például kiszerelhető kompatibilis oldószerekben vagy más, oldat-alapú formákban, stabil készxtményformák előállítása célΌ in «* * * jóból, amelyek fokozottan rezisztensek lebontással szemben.
Béta-ínterferon-la módosítása nem-toxikus· polimerrel bizonyos előnyökkel járhat. Ha igy végestük a módosítást, a termékek (polimer-béta-interférőn-la-konjngátumok) megtartják minden biológiai aktivitásukat# vagy biológiai aktivitásaik többségét, «z alábbi tulajdonságokat eredményezve: megváltozott farmakokinetéka és £armakodinámia, amely megnővekedett íél-életidohöz és változásokhoz vezet a szöveti eloszlásban (például hosszabb ideig képes az érrendszerben maradni), fokozott stabilitás oldatban, csökkent mértékű immonogenitás, védelem proteoiítikas emésztés és azt követő aktivitásvesztés ellen; a fokozott hőstabilítás következtében hatékonyabb bétá-interferon-la·--1 tartalmazó porformához jutunk orális vagy inhalálással történő alkalmazásra.
A fentebb leírt, javított tulajdonságokkal rendelkező béta interferon--la hatékony lehet orális, aeroszoios vagy parenterális beadást alkalmazó terápiaként. Más beadási módszerrel, példáné nazálisán és franczdermálisan is be lehet adni módosított bé fc a - i n te r £ e r ο η -1 a ~ f.
A találmány tárgyát képezi egy másik vonatkozásában eljárás angíogenezis és neovaszkularizácló gátlására, amelyben beadjuk a. találmány szerinti készítmény hatásos mennyiségét. Az interferon érhálózatban való megnövekedett mennyiségének eredményeként, a találmány szerinti pegliált terméknek különösen hatékonynak keli 1aηn ie ang1ogene zi s-inhib ítorkénfc.
bem-terápiás (például di.agnoszt i kai) al ka Ima zásokban bétainterferont tartalmazó, diagnosztikai és/vagy reagensfajták' konjugálása is a találmány tárgyát képezik. Az eredményül kapott.
72.2W&S « * > <
* *· koajugált ágens rezisztens környezeti lebontó faktorokkal, például oldószer- vagy oldat-közvetített lebontási folyamatokkal szemben. A béta-ínterferőn ilyen fokozott rezisztenciájának es fokozott stabilitásának eredményeként, a hatóanyag stabilitását is jelentősen raoy lehet növelni, amely a béta-interferon-la-t tartalmazó készítmény megbízhatóságával ját együtt ugyanolyan speciális végielhasználásban, amelyben béta-ínterferon-la-t i s alkalmazunk,
A találmány szerinti megoldás más vonatkozásai, tulajdonságai és módosításai nyilvánvalóbbak lesznek az alábbi leírás és a csatolt szabadalmi igénypontok alapján.
1. ábra; Aianin-szubsztítuált béta-interférőn~ia~motánsok kötődése IFNAE2/ig~jeiú, dimet fúziós fehérjéhez, amely X. típusú i o t e r £e rοo - r ec optο 11 án c e x t r ace 1I u 1 á r í s dómé n j é f t. a r t aIma ζ za (iFNARz-ektodomén humán IgG'i konstans doméniéhez fuzionálva).
Az alanin-szubsztítúciós XFb-matánsok (Al-E) kötési affinitásait IFKAR2-receptorláncra az 1, példában (D-áirészben) leírtak szerint határoztuk meg. A hisztogxam bemutatja a kötési affinitásokat ebben a vizsgálati eljárásban, a vad típusú hís-bétaIFh-hez viszonyítva (% w.t.). A számított %w.t,-értékeket sz alábbiak szerint fejezzük ki: (vad típusú his-béta-IFb affinitása)/ mutáns béta-XFN affinitása x .1.00, Bemutatjuk az egyedi kisérletekben (n-3) kapott t.-értékeket (öj és tere kísérletből származó iz,t,-átlagokat (x) , Az A2-, ASi~, AB2- és B-mntánsok nem kötik az IFRAR2/Fc~t SOQ-szor nagyobb- koncentrációban, mint a vad típusú his-béta-lFh ECSG (*j „
Z'íís/ss »*« Φ *« Λ* V* ♦ Φ * * *
2λ á&ra; Alanín-szubsztifuált béta-ínterferon-la-mutánsok kötődése ϊ - tipusáj. sejtfelgsíni ínterferon-reeeptorkomplexekhez, eme I ve k Dau d i - Bu r ki tt - £é l e .1 í mlérna -sejt éken expressz á .1 ódn a k.
Az alanin-szubsztitücxds mu.tánso-k (Ai-B) feceptorkötő tulajdonságait BACS-alapá, sejtfelszíni receptorkötő vizsgálati eljárás alkalmazásával határoztak meg, az I. példában (D-alrészben) 1 sírta k s z e r χ n t. A h í s s t og r m bem utat j a a r ee e ρ t o r k ö t ő a f f ί n i t. á sokat ebben a vizsgálati eljárásban, a. vad típusú bís-bétá-IFNhez viszonyítva {% w.t.). Az egyes mutánsokra számított értékeket ez alábbiak szerint fejeztük ki: (vad típusú his-fcéteÍFN affinitása) / mutáns béta-IBM affinitása x löö. Bemutatjuk az egyedi kísérletekben kapott %w.t,-értékeket (Oj és több kísérletből szármázd %w . t , -átlagokat (x) .
3. ábra ; A .1 a η i π - s z ubs z t í t a á 11 be t a - ints r f erő η -1 a-ntu t á n s o k antiviráixs aktivitásai.
Az aianin-szubszfitücids mutánsok (Al-Ej sntxvíráiis aktivitásait humán A549-sejtek BMC-víruasal való fertőzésével határoztuk meg, az 1. példában (B-alrészben) leírtak szerint. A hisztogram bemutatja az aktivitásokat ebben a vizsgálati eljárásban, a vad típusú hís-béfca-lFd-hez viszonyítva (% w.t.). A kiszámított tv? vt.-értékeket az alábbiak szerint fejeztük kí: (vad típusú hís-béta-IFN koncentrációja [ 50% epe})/ mutáns bétaIFN koncentrációja í 50% epe] x iöO. Bemutatjuk több, egyedi vizsgálati eljárásban kapott %w<t.-értékeket (0) és több kísérletből származó %w«t.-átlagokat (χ),
4. ábra; Alanin-szubsztituáit béta-ínterferon-la-mu tánsek a n t i p r ο I í f e r a t i v a k t x v i t á s a i, * * **»♦
Az a isnin-szubs ztitúciós mutánsok. (Al ~E} ant íprolii erácíós aktivitásait Daudi-Birkrtt-féie üt· főma-se j teken határoztuk meg, az I. példában {t-alrészteen} leírtak szerint. A Meztögram bemutatja az aktivitásokat ebben a vizsgálati eljárásban, a vad típusé his~béta~lFb~hez viszonyítva (% u.t.). A kiszámított értékeket az alábbiak szerint fejeztük ki: (vad típusú his-bétaIFb koncentrációja (50% növekedési gátlás]}/ mutáns béta-IFE koncentrációja [50% növekedési gátlás) x 100. Bemutatjuk több, egyedi vizsgálati eljárásban kapott %w.t.-értékeket (O) és több kísérletből származó %w. t. -átlagokat (;>:).
5. ábra; Alanin-szubsztítuált béta-ínterferon-la-mutánsok relatív antiviráiis és ahtiprolífetatív aktivitásai.
összehasonlítottuk alanín~szubs.zt.itüeíős mutánsok (Al-S) relatív aktivitásait az sntivirtális (x-tengelyi és ant iptoliíerácíós (y-tengely) vizsgálati eljárásokban. Az összehasonlításban a vad típusó bis-béta-lFb-ra vonatkoztatott, átlagos százalékos
aktívi | tásóka5 | alkalmaztuk (% | u.t.., x), mt |
és 4. | ábrán. | Azok a mutánsok | amelyek es |
koordi | Pi Ρ χ P 3 P | változik mindkét | aktivitás. |
esnek. | Azok | a mutánsok (DE 1, | D, ül), áras |
ráiis | aktív) | . t á s v á 11 o z á s a a | ránytalonul |
i ci y QXau· ex ’& ·ίΛ Π A. χ ρ I. U χ .X ~~ feráoiós aktivitás változásánál, szignifikánsan eltérnek a ferde vonaltól. A szignifikancíát az alkalmazott átlagos %w.fc.-értékekhez tartozó standard deviációk alapján határoztuk mag.
S. ábra; Pegílálás helyének lokalizálása, peptid-térképezéssel .
begiIáit és módosítatlan β-interferon-la-t peptíd-térképezési
1.1 * * ·* * * * « Χ· *
X * X * *** ♦ analízisnek vetettünk alá. & mintákat endoproteináz-Lys-C-vei emésztettük, és fordított fázisú HPLC-n vizsgáitok C^-oszlop alkalmazásával. Az oszlopon előállítottunk 0~?Q% acetc-nitril-gradíenst 0,1% trifluor-scetsavban. Az oszlopról elfolyó anyagot 214 ms-ea detektáltuk. A-panel: módosítatlan β-ínterferon-ia, S-panei: pegilált β-interferon-la. & nyilak a β-ίηtérféron-la Ntermináiis endoproteináz-Lys-peptidjének <1 — 19. aminosavakat tartalmazzák) elüclós helyzetét mutatják.
7. ábra; Konjógáit és nem-konjógáit béta-ínterferon-la antivi .ra 1 i s aktív;. t a s a
Az X-tengelyen feltüntetett koncentrációkhoz tartozó, bétaInterferon-la vagy FEGiláít béta-interferon-la aktivitását antiviráiís vizsgálati eljárásban határoztuk meg, humán tüdókarcial, amelyeket enkefalomíoksr--cussal való: két napos inkubáiás sí megfestettük, a tálcákat 450 letképességére utaló abs zorbas, standard deviációkat, hibajeire r£eron-1a ~koncén trác ió,· ame 1y zott b, 50%-os cltopatikus hatás } (50% maximum OD^b , körülbelül 11 pg/ml volt, es a HEGmódosított béta-ínterferon-ia-ra az 5Ö%~os citopatikns hatás körülbelül 11 pg/ml, volt.
8. ábra; Xonjugátumok stabilitásának meghatározása hődenaturálássai
EEGilált béta-ínterferon-ia~t és kezeletlen foéta~interferon~la-kontrolit 10 m.M HEPES-t és 20 mM HaCÍ-t tartalmazó, pH 7,5
néma- | sejtek íAOit | b alkalmazás |
dítis | z vírussal f<r | art őstünk. A |
után | az életképes | sejteket MT? |
nm-en | leolvastuk, | és a sejtek |
ciát | az Y-tengelye | n vettük fel. |
ként | ábrázoljuk, | Az a béta- |
ros-o | s v 1 r u s p u s z t | olást erehmér |
* Φ Φ* « Φ Φ Φ* * * * Φ Φ * * *
V Ο Φ » ♦ Φ ♦ *
ΦΦ*$ ♦ ♦*« '» Φ pufferben melegítettünk 1 fok/perc sebességgel, A öenaturációt a 280 nm-en mért abszorbancia változásával követtük, (a) módosic.at.lan béta-interfaron-la, {b} PEGilált béta-lntsrferon-la.
9. ábra; Séta-interferon antiviráiis aktivitásának meghatározása béta-interferon-la-val vagy PEGilált béta-interferon-la-val kezelt egerek plazmájában.
Egereket i.v, injektáltunk farki vénájukon keresztül. SÖ.OQO egység béta-interferon-ia-vai vagy 50,000 egység (20K méretű
PEG-et tartaimazö) PEGilált béta-interferon-ia-vai. Vért vettünk az egerekből retroorbítális {szemüreg mögötti} véreztetéssei, az injektálás után különböző időpontokban, melyeket feltüntetünk az X-tengelyen. Legalább 3 egeret vérestet tünk az egyes időpontokban, plazmát preparáltunk és lefagyasztottuk asokat addig, amíg béta-interferon-aktivitást antiviráiis vizsgálati eljárásban teszteltünk, enkefalomiokardítisz-vlrussal fertőzött, A549-jeln, humán tüdőkaroinéma-sejtek alkalmazásával, léz életképes sejteket megfestettük MTT-oldattal, a tálcákat 450 nm-er; leolvastuk az abszorbancia meghatározása céljából, amely a sejtek életképességére és a béta-iaterferon-akfivitásxa utalt. Felvettünk standard görbéket minden egyes tálcára, béta-interferon-la felhasználásával, éa az egyes mintákban lévő béta-interferon-la-aktivitásmennyiség meghatározására alkalmaztuk azokat. Bemutatjuk az egyedi állatokból származó adatokat.
2Ö> ábra; Hisztidrn-toidaiékkal ellátott foéta-interferon-gén teljes DBS-szekvenciája és fehérjeternákenek szekvenciaja.
Bemutatjuk a bisztidin-tcldalékkal ellátott béta-lFN-la teljes DbS-szekvenciáját <1. számú szekvencia, SEQ ID Bö: 1} és fe72.Z7873E hérjesxekveneráját (2. szárú szekvenciái SSQ ID NO: 2). A VCAM-l-szlgnálszekveheís iehasítása után 3 amino-terminális ammosáv (SerGlyGly) marad a hisztidin-toldaléktöl (Hisg/ 4-9. helyzet) s z i n t é z x s i r á η n y a I s z embert, A z en t e r o k i n á z -1 i n ke x e z e kven e 1 át ÍAspAspAspAspLysi egy távtartó (10-12. helyzet, SerSerGly) választja el a hisztidin-toldaléktöi. A természetes bét«~:IFN-la fehérjeszekvencia elhelyezkedése KetlS-Asrd.83---pozíeíök„
XI. ábra; A klónozó stratégia és ΤΕΝ-β expressziós piazmidok vázlatos ábrázolása,
A leírásban a „kovalensen kapcsolt” kifejezés azt jelenti, bogy a specifikált csoportok direkt, kovalensen vannak egymáshoz kötve, vagy más esetben indirekt módon, kovalensen vannak egymáshoz kapcsolva egy közbenső részen vagy csoporton, például hídon, távtartón vagy kapcsoló részen vagy csoporton keresztül.
Interferon: Az „interferon (,, IEN-nek is hívják) kisméretű, faj specifikus, egyláncu polipeptid, amelyet emlős sejték termelnek különféle índukálcszexekre, például vírusokra, polipeptidekre, mítogénekre és hasonlókra adott válaszként. A találmány szerinti megoldásban legelőnyösebben alkalmazott interferon giikoziláit, barnán béta-interferon, amely a 80, (AsnSO) pozícióban van giikczilálva, és előnyösen tekombináns DNS-fechnológíákkal származtatjuk. .Ezeket az előnyös glíkozíáit béta-interferonokat „béta-ínteríeron~la~nak vagy „béta-lEN-la -rak vagy „béta interferon ia-nak vagy ,,β-inter feron-la-rak jelöljük, egymással felcserélhető módon. A „béta-interferon-ía” kifejezésen értjük annak mutánsait is (például az 1, példában leírtakat), feltéve, ha
Μ +
Λ 4 » * * * « * * * * * W * * ί*«» «ί ****** ν az ilyen mutánsok szintén g1ikosiIáitak a 80. (AsnSO) pozícióban, ismeretesek fehérjék, beleértve interferonok termeltetésére szolgáló, rekombináns DNő-módszerek. Lásd például OSP 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017 fáséi et al. ) és 4,470,461 (Kauíman) számé s z a b ada1m i i ratokát.
A találmány szerinti eljárásokban előnyösen alkalmazható béta-ínterferon-ia~poiinukieotidok különböző gerincesek vad típusú be t a -1 n t e r f e ro n - g é n s z e k ve ne 1 álba 1 s z á r m a z na k, él ön yő se n. sm 1 © s ö kből, és szakember által jól ismert módszerek alkalmazásával állít jak elő azokat, amelyek leírását lásd például az alábbi szabadalmi iratokban; USP 5,641, 656« (közzétéve 1997,. jön, 24., madárból származó, I. típusú interferon-profehér jót kódold DNS, és érett, madárbői származó, 1. típusú interferon):; 5,605,688.
(1997. febr. 2.5., kutyából és lóból számáré, rekombináns, I. típusú interferonok); 5,554, 513. (1996. szept. 10., humán bétainterferon-kA-t kódoló DNS-szekvencia); 5,541,312. (1996, jól.
30,, humán fibroblasztból származó, béta-2-ínterfaron-polipontidet ködölő DbS-szekvenola); 5,2 31.176, (1993, jól, 27,, humán leukocita interferont kódoló DNS-molekula); 5,071,761. (1991.
bee. lö,, humán limfofclasztoid LyIFN-alfa-2 és LyIFN-alfa-3 interferonok alszekvsneiáit kódoló DNS-szekvencia); 4,970,161.
(1990. nov. 13., humán gamma-interferont kódoló DNS-szekvencla); 4, 7 3 8,9 3 '1. (1968. á p r. 19., h urna n b é t a - i n t erre r ο n - gé n t t a r t a 1 ma ró DNS); 4,695,543, (1987. szept. 22,, humán alfa-intorferon ex-l-gén); és 4,456,748. (1984. jön. .2 6., különböze, természetesen előforduló leukoclfs.-rnterferőnek alszekveneráit kódoló DNS) .
Béta-interferon-la mutánsait lehet alkalmazni a találmány
72.273/36
Φ * * »
< <í * * :·> * « *4 Xíí $ «·>
ψ ff *** szerinti megoldásban. Mutációkat szokásos, szakember által ismert, irányított mutagenesis alkalmazásával hozunk létre. A találmány tárgyát képezik továbbá funkcionálisan ekvivalens bétaínterferon-la-po ..inukieotidok, amelyek funkcionál i.sa.n ekvivalens be t a - i n t e r f e r on -.1. a - ρ o 1 i pepi ide ke t kódol n a k..
Béta-interferon-Ia-t kódoló, első pciinukieotid „funkcionálisas. ekvivalens egy második, béta-rnterferon-la-t kódoló pölinukieotiddai, ha az alábbi feltételek közül legalább egyet kielégít :
(a) a ,, fűnkéi omd; san ekvivalens egy első polinukieotid, amely képes híbridizálédni standard hibridizációs körülmények között a második poiinukieotidhoz és/vagy az első pciinukieotidszekvencia degenéráli változata. Legelőnyösebben olyan mutáns interferont kódol, amely béta-interferon-la aktivitásával rendelkezik;
íb) a „funkcionálisan ekvivalens egy első polinukleotid, amely expressziöta ugyanolyan amixyosav-szekvenci.át kódol, mint amelyet a második poiinukieotid kódol.
összegezve, az „interferon kifejezésen értjük például a fentebb felsoro.it ágenseket, valamint azok funkdípnálís ekvivalenseit. A „funkcionális ekvivalens kifejezés tehát olyan bétáin térferon-la-fehérjére vagy héta-interferon-la-fehérjét kódoló polinukieotidra utal, amely ugyanolyan .
hatást, képes kifejteni az emlős reorpiensre, mint olyan interferon, amelynek vélhetően fnnkeionális ekvivalense. Szakember számára nyilvánvaló, hogy funkcionálisan ekvivalens fehérjét elő lehet állítani rekombináns technikákkal, például „funkcionálisan ' Á « x * * 4 * * <i ♦ * ír A » * «X VV *«V $·*#* í ekvivalens IMS* expresszálásávál ,· Ennek megfelelően, a találmány tárgyáé képezik olyan feéta-inter férőn-la-fehérjék, amelyeket természetesen előforduló DhS-ek kódolnak,, valamint nem természetesen előforduló DMS-ek kódolnak, amelyek ugyanezt a fehérjét kódolják, mint a természetesen előforduló DNS. A kódoló nukieotid-szekvenciák degeneráltsága következtében más polínukleotidoka.t is leket alkalmazni feéta-interferon~la kódolására. Ezek lehetnek például a fentebb leírt,· olyan teljes vagy részleges szekvenciák, amelyek különböző ködőnek szubsztitúciójával meg vannak változtatva, és ugyanazokat az arnlnosavakat kódolják a szekvenciában, így „csendes'·' változásokat hoznak rétre. Ilyen megváltoztatott szekvenciákat ezen szekvenciák ekvivalenseinek tekintjük. Például a Phe-t <F) két kódon kódolja, TTC vagy ITT, a Tyr-t <¥) TAC vagy TAT és a His-t {Hl CAC vagy CAT. Másrészt, a Trp-t (W) egyetlen kódon kódolja, IGG. Ennek megfelelően nyilvánvaló, hogy egy konkrét interferont kódoló, adott DNS-szekvencíára sok degenerált DkS-szekvencia létezik, amely azt kódolja. Ezeket a degenerált DES-szekvencíákat is ész igényeik oltalmi körbe tartozónak tekintjük.
A „fúzió kifejezésen két vagy több fehérje vagy fragmentumaik ko.lineáris kapcsolatát értjük egyedi peptidvázakon keresztül, me I y e khe 2 i .1 yen f e hé r j éke t k ő do 1 ö po i i n u k 1 e o t i d. -mo 1 e ku 1 á k géaezpresszlójával jutunk. A fehérjék vagy fragmentumaik előnyösen különböző forrásokból származnak. Tehát előnyös fúziós fehérjék béta-ínterferon-la-fehérjét vagy fragmentumot tartalmaznak kovalensen kapcsolva egy másik csoporthoz vagy molekulához, amely nem interferon. Konkrétan, a „béta-interferon-la/lg fúziós )t.2WBE ** *φ» fehérje olyan fehérje, amely találmány szerinti béta-interforon-la-molekulát vagy fragmentumát tartalmazza olyan Immg lobul in-lánc h~terminál inához kapcsolva#· amelyben az immunglobulin b-términális része helyettesítve van béta-interferon-lava 1.
A „rekombináns kifejezés a leírásban rekombináns, emlős expressziős rendszerekből származó fehérjét jelent. A legtöbb bakteriális tenyészetbén, például £. coliban a fehérjék giikán nélkül expresszálodnak, igy ezek az expressziős rendszerek nem előnyösek, élesztőben expresszált fehérje olyan olígoszsoharidstruktúrával rendelkezhet, amely eltér az emlős sejtekben expresszált struktúrától,
A „biológiailag aktív kifejezés a leírásban béta-interferon·la tulajdonságaként azt jelenti, hogy egy adott molekula elegendő aminosav-szekvenciahomolőgíát mutat a találmány előnyös megvalósítási módja szerint alkalmazott molekulával ahhoz, hogy képes legyen antáviralis aktivitást kifejteni, az 1. példában (lásd lentebb! leírt típusú, in vítro antívirálís vizsgálati eljár á s s a1 mérve.
A „terápiás készítmény kifejezésen a ieirásban olyan készítményt értünk, amely találmány szerinti fehérjéket és más, fiziológiailag kompatibilis alkotórészeket tartalmaz. A terápiás készítmény tartalmazhat segédanyagot, például vizet, ásványi sókat, hordozókat, például fehérjét.
A találmány szerint,·, molekula akkor van hatásos mennyiségben jelen, ha. ez akkora mennyiség, amely képez eredményt elérni vagy az adott kezelendő állapotra hatásokat kifejtem.
?í.278/3S
Az „amínossv kifejezés a leírásban peptid, polipeptid vagy fehér j e monomeregysége. Természetesen előforduló pepf 1 dekfoen, poiipepiídekben és fehérjékben huss ami.nosavat találtak, amelyek mindegyike L-izomer. A kifejezésen értjük az aminosav-analógokat és a fehérje-amisósavak D-izomerjelt és analógjait.
Egy „ származtatott aminesav olyan természetes vagy nemtermészetes aminosav, amelyben a normálisan előforduló oldalláne vagy végosoport kémiai reakcióval .módosítva van, ilyen módosítás lehet például gamma-karbozi.iálás, feéta-ksrboxiiáiás, szül fatáláé, szulfonálás, foszfor Hálás, amidálás, észteresités, Naeetilálás, karbobenz Hálás, tozilálás, és isis, szakember által ismert módosítás, Egv „származtatott poripeptid cd yan polípeptid, amely egy vagy több, származtatott aminosavat tartalmaz,
A „fehérjew kifejezésen értünk bármilyen olyan polimert, amely lényegében a 20 amínosav bármelyikéből áll. Bár a „poiipeptid kifejezést gyakran viszonylag nagyméretű polipeptidőkre használjuk, és a „peptid kifejezést gyakran viszonylag kisméretű poiipeptidekre használjuk, ezen kifejezések szakmai használatában átfedések és variációk vannak, A „fehérje kifejezést a leírásban p'p+. lekre, fehérjékre és poiipeptidekre használjuk, hacsak másképpen nem definiáljuk.
A „mutáns kifejezésen bármilyen változtatást értünk egy organizmus genetikai anyagán, különösen vad típusú poiinukleotids ze k ve ne i aha h 1 é t r e he ζ o 11 bá r m i 1 y e n vá 11 ο z fa t á s t {a z a z de 1 é c í ő t, srub< z tr ί noot, .Akkuiét vauy cserit' vauy vp, t spusu teher pobeu bármilyen változtatást, A „moréin kifejezést felcserélhető módon használjuk á „mutáns kifejezéssel.
72. 27S/SS
ΦΦ Φ ΦΦ χ «φ ΦΦ
Φ Φ Λ
Φ * * Φ
Φ Φ * Φ φ Φ Φ
Φ Φ X
X « * * χ ΦΦ φ χ
A „vad típus' kifejezés egy .fehérjének vagy részletének, vagy fehérjeszekveneiának vagy részletének megfelelő neon természetesen előforduló polinukleotid-szekvenciáját jelent, ahogyan normálisan, in vivő léteziκ.
A „standard hibridizációs körülmények' olyan só és hőmérsékleti körülmények, amelyek lényegében ekvivalensek 0,5 X SSC és körülbelül 5 X SSC közötti sókoncentrácioval és 65°C hőmérséklettel, hibridizációban és mosásban egyaránt. A „standard hibridizációs körülmények' kifejezés a leírásban tehát eljárásra utaló definíció, és hibridizációs körülmények tartományát jelenti. Nagymértékben sztringens körülmények lehetnek például plakkszűrő pnffer f0,2% poiivínil-pirroiídon, 0,2% Ficoil 400; 0,2% marha ssérua;-aibumin., 50 mM Tris-HCl {pH 7,5)J; 1 M NaCl; 0,1% nátríum-pircfoszfát; 1% SOS; 10% dextrán-ssulfát és 100 pg/ml denaturált, szonikált lazacsperma-DNS alkalmazásával végzett hibridizációban áS^C-on, 12-20 óra hosszáig, és mosás 75 mtí NaCi/7,5 nátrium-extrát {0,5 x SSC) /1% SDS jelenlétében 05'Con. Kismértékben sztringens körülmények lehetnek például plakkszűrő puffer, 10% dextrán-szulfát és 110 μα/ml denaturált, szonikált Xazaesperma~DNS alkalmazásával végzett hibridizációban 55°C-on, 12-20 óra hosszáig, és mosás 300 .mik NáCl/30 írtM nátriumcifrát {2, x SSC)/1% SOS jelenlétében 55;>C~on. Lásd még „Current Orotocols in Molecular Bíology', John Niley & Sons, Inc., New York, 5.3.1.-6.3.0. részek (1982).
Az „expresszíós szabályzó szekvencia” kifejezésen olyan, poiínukleotid-szekvenciát értünk, amely gének expressziéját vezérli és szabályozza, ha működőképesen van kapcsolva azokhoz a génekhez.
?2.27S,0n:
ζΠ ** ** *<<·♦ * ' 0 ν » 0 4 4 # * * 4 * * * * 4 **♦* «4 Χ« χ *·*.»: 4
A „mű ködő képe sen kapcsolt kifejezésen jelentése;: egy poiinukleotid-szekvencía {DNS, RNS) akkor van működőképesen kapcsolva egy expressziös szabályzó szekvenciához, ha az expresz-szíós szabályzó szekvencia vezérli és szabályozza a poli.nukleotid-szekvencia transzkripcióját és transzlációját. A „működőképesen kapcsolt' kifejezésen értjük azt is, hogy megfelelő start-szignál (például ATG) van az expresszáiandó polinukleotid-azekvencía előtt, és megtartja a pontos leolvasási fázist, amely lehetővé teszi a poiinekiestid-szekvencia expressziöját az expresszién szabályzó szekvencia vezérlété alatt, és a polinukioetid-szekvencia által kódolt, kívánt polipeptíd termelését.
Az „expresssiós vektor kifejezésen polinukieotídöf, például DNS-plazmidot vagy fágot (sok pás, általánosan előforduló példák közül) értünk, .amely lehetővé tesz legalább egy gén expressszióját, ha az expressziős vektort bevisszük egy gazdasejtbe. A vektor képes lehet, vagy nem lehet képes replikádéra a sejtben.
Az „izolált kifejezésen (a ,,iéxryegébéh tiszta kifejezéssel felcserélhető), ha nnkleínsavra, azaz fehérjét kódolö polinukleotid-szekvencíára alkalmazzuk, olyan P.NS- vagy DNS-poiinukieotidot, genomi polinnkleotid részét, cDNS-t vagy szintetikus polinukleotldot értünk, amely származása vagy kezelése követkéztében: (i) nem asszociált valamennyi polinukleotiddal, amellyel természetes körülmények között asszociált (például egy gazdasejtben expressziös vektorként vagy részeként van jelen); vagy (rí) olyan nnkieinsavhoz vagy más kémiai csoporthoz van kapcsolva, amelyhez természetes körülmények között, nem. kapcsolódik; vagy (iii) természetes körülmények között nem fordul elő. Az
Wbs ί» * * β » ο $
Α. ·χ /. 1 róizelált”’ kifejezésen értünk továbbá olyan po1inuk!eotid-szekvenciát, amely (í) in vitro ampli.fikálvá vad, például polimerás láncreakció (PCR) alkalmazásával; íil) kémiailag szintetizált; (iii) rekombinánsan lett előállítva klónozással; vagy (ív) tisztított, hasítással és gélen való elválasztással.
lehat a lényegében tiszta nnkiéinsav” olyan, nukleáris avat jelent, amely nincs folyamatos összefüggésben az egyik vagy mindkét nukleinsavval, amellyel normálisan folyamatos Összefüggésbed van, olyan organizmus természetes körülmények között előforduló genomiában, ahonnan a nukleínsav származik. Lényegében tiszta WS-er. értünk olyan rekombínáns PNS-t, amely hozzáadott szekvenciákat kódoló hídridgén része.
Az izolált” kifejezésen (a. „lényegében tiszta” kifejezéssel felcserélhető) , ha í oi ΐpopfiöekre alkalmazzuk, olyan pol.ipepiidet vagy részletét értünk, amely származása vagy kezelése következtében:: (í) egy gazdasejtfcen expresssiós vektor termékeként vagy részeként van jelen; vagy (ii) olyan fehérjéhez vagy más kémiai csoporthoz van kapcsolva, amelyhez természetes körülmények között nem kapcsolódik; vagy (íi.i.l természetes körülmények között nem fordul, elő. Az izolált kifejezésen értünk továbbá olyan fehérjét, amely <i} kémiailag szintetizált; vagy (ii) egy gazdasejtben lett expresszáiva és tisztítva lett asszociált fehérjéktől. A kifejezésen értünk általában olyan pol ipepfci.de t, amely el van választva olyan más fehérjéktől és nukleinsavaktől, amelyekkel természetes Körülmények kozott előfordul. A polipéntidet előnyösen elválasztják olyan anyagoktól, például antitestektől vagy gélmátrrxoktoí (poiiakrilami.dtöl) , amelyeket tiszti'0.2 * * *» Φ» ΦΧΧν » * * * < X V * * * * ff ♦ * * « * « « χ ♦ Φ * ν ** ff » basára alkalmaztunk.
A hefe.ro lóg prcmőter kifejezésen olyan promötert értünk a leírásban, amely természetes körülmények között nem társult génnel vagy tisztított nukleinsavval.
A homológ kifejezés a leírásban az azonosság kifejezés szinoniméja, és szekvencia-hasonlóságra utal két po.lipept.id, molekula között vagy kát nukleinsav kötött. Ha egy pozícionál, a két összehasonlított szekvencia közül mindkettőben ugyanaz a bázis vagy amínosav-monomer van (például, ha az egyik pozícióban, a két DNS-moiekuia mindegy!kében adenin van, vagy ha az egyik pozícióban, a két pclipeptid mindegyikében lizin van}, akkor a vizsgált molekulák ebben a pozícióban homológok. Két szekvencia közötti, százalékos fonológia mindkét szekvenciában előforduló, egyező vagy homológ helyzetek számának függvénye, elosztva az összehasonlított pozíciók számával χ 100, Például, ha a két szekvenciában 10 pozíció közül β egyezik vagy homológ, akkor a két szekvencia 60%-bán homológ. Például, a CTGACT és CAGGTT D..NSszekvenciák 50%-ban homológok (az Összes 6 helyzet közül ,3 egyezik} , Általában akkor végzünk összehasonlítást, ha két szekvencia úgy van egymás alá rendezve, hogy az maximális homolőgiát ad. Ilyen egymás alá rendezést Need.leman í J. Mól. Bioi. 43, 443453 (1370)] által leirt módszer szerint lehet végezni, kényelmesen számítógépes programok, például Aiign-program. (bhAstar, Inc,) alkalmazásával, Homológ szekvenciák azonos vagy hasonló ami nosavakát tartalmaznak, amelyben a hasonló amíhosavak konzervatív szubsztitúciók, vagy az alárendezett referencia szekvenciában lévő, megfelelő aminosavak megengedett pontmutáeiöiP , hbÖ .ZVfiZSE ben a vonatkozásban, sgy .referencia. szekvenciában lévő aminosav konzervatív szubsztitúciója' olyan szubsztitúció, amely fizikailag vagy funkcionálisan hasonló a megfelelő referencia amíhosavhoz, például hasonló mérettel, alakkal, elektromos töltéssel, kémiai tulajdonságokkal rendelkezik, beleértve kovalens vagy hidrogénhíd-kötés kialakításának képességét, vagy hasonlókat . Különösen előnyös konzervatív szubsztitúciók teljesítik azokat a követelményeket:, melyeket. Dayhoff és munkatársai [ Atlas pf Protein Seqnence and Structure, 5', Snppi.3., 22. rész, 354-352. old., hat. Siemed. Rés. Foundation, Washington, D. C. (1978)] leírtak elfogadott pontmutációra<
A poiinnkleotíd szekvencia és nukieotidszekvencia kifejezéseket szintén egymással felcserélhető módon alkalmazzuk.
Az „angiogenézls és „neovasskularízáciő kifejezések jelentése tágan vett értelemben új véredények képződése. Az angiogénezís különösen tumor helyén képződő, új véredényekre is vonatkozik.
Az „1OAR2, „IFÜARl, ,, iFNAB.1/2 olyan fehérjék jelölései, amelyekről ismeretes, hogy 1. típusú, sejtfelszíni interferonreceptor alkotórészei. Az TFhAR'2-lánc extracellulárís része (ektödoménje; önállóan képes alfa- vagy béta-interferont kötni.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában, hacsak másképpen nem. jelöljük, szokásos, szakember által ismert s-Ojtiuo^óo ... , se )ttenyésztési, molekuláris biológiai, mikrobiológiai, rekombináns DNS, fehérjekémiai és immunológiai technikákat alkalmazunk, ilyen technikák leírását megtalálhatjuk a szakrrodalomban. lásd például, Molecuiar Cíoning; A taboratory
X· * χ χ· φ Φ
Culznre of Animál Cél
Inc·. (1987);
Manna!, 2. kiadás, (szerk, Samforook, Fritsch és Maníatis), Goid Spring Harbor baboratory Press (1989); DMA. Cloaing I., és II. kötet/ (szerk. D. d. öidver) (1985); Oligonacleotid Synthesis (szerk, M. a. Gált) (1984)» Mullis és munkatársai, USP 4.683.195. számó szabadalmi írat; Kucleic Acid Hybr.id.izat ion (szerk, B. B. Hames és S. J, Higgzns) (1984); Transcription and Translation (szerk. 3. 0. Bames és S. á. Biggíns) (1934);
(szerk. R, 1, Freshney), Alán R. Líss
Immobil ized Ceiis and Enzymes IRb Press (1986); B. Perbál, A Pracfcieal Goidé to Moieealar Cioning (1984) ; Methods in Enzymelogy 154. és 155. kötet (szerk. Wu et al.),
Academic Press, New York; Gene Trahsfer Veotors tor Mammaiían
Cells (szerk. J,. fi.. Miller és Μ. P- Gálos) , Cold Spríng Harbor Lsfooratory (1987) ; Immunoebem!cal Methods in Coli and Moiecular Bioiogy (szerk. Mayer és Walker), Academic Press, London (1987); Bandfeook ef Bxperiment Imwnology, Γ-ÍV. kötet (szerk. D, K. Weir és C, C. Biackweil) (1986); Msnípulatíng the Mouse Embryc, Goid Spiny Harbor baboratory Press (1936).
Séta^interferon-la ágensként alkalmazható beteg állapot, fi-
zioiégiai állapé | éának, .sz impt | .ómáinak, vagy í |
n a k ke zel és é re, | csillapításá | ra vagy gyenge |
elemzésére vagy | d χ.agaó z i sara < | A kifejezésen |
1 n fc e r f e r ö n -1 a ~ fc | is, amely fúz | iós fehérje, pé |
- bé t a -1 n t e r f e r e n | -la fúziós íd | hérje része, me |
faionk benyújtott, 60/104,572. és 60/120,161. számú szabadalmi légélenrésekben. Fúziós fehérjék előállítása szakember számára •rr·; ss:
♦ | ..· * * . ♦« »·* * ♦» * '··'·' « v * y ·* y: * * * ; ♦ 8 * Φ X * X Φ»« «.«fc* y. |
általában jól ismert, | |
Egyedi helye (ke) fc talsii | 'V-r polimer-kapcsolásra, amelynek a Ι- |
halmazása nem szünteti meg | ο foéta-interferon-la funkcióiét. To- |
iimer-kapcsolási heiy(ek) független vizsgálatára (lásd. az
zük az cktívJa^buz es rec | :ep tor kötésbe z s zükséges csoportokat.. |
Rendelkezésre állt a humán | béta-interfsron-ia 3-dimenzios kris- |
tályszerkesete (lásd a fen· | cebb valamint az 1. példában leírta- |
kát), amely lehetővé teli | : hé t a -interferon- re c e o t o r - k ö 1 c s ö n ha- |
sitását alanin- ívacv szerin-í szubsztitúciókhoz, és
S-V »—> V.' <· ·» >«· Vv·. vV. \Λ V·· ·<«ν χ,. vi. V.K- A A -X. ·» < A V A AVA f | |
ί n fcramo 1 e ku 1 ár i s kötésekben | szerepet játszó aminosavak megtarfcá- |
sát. Tizenöt, szkennelő a) | lanin-mutáclőből álló panelt tervez- |
tünk, amelyben z-ö közötti | arninosavat cseréltünk a béta-inter- |
faron-Is-ban .lévő egyes hél | íxeh (A, b, C, Ő> S) és hurkok (Abl, |
az 1. példát,
karmaztunk emlős sejtek á' | Ital expresszált mutánsok affinitás- |
tisztítására (10. rt vz | ai amint 1. és 2. számú szekvencia a |
cIíMS- és levezetett amint | •Sáv-szekvenciákra, sorrendben) . Ezer |
mutációk funkcionális kövei | zkezményeit antiviráiis és anfciprolr- |
ferativ vizsgálati, el járást | ikban határoztuk mec. Kifejlesztettünk |
* » φ φ φ * * * * < # * * 9 * <Φ Φ <
interferon -sejtfelszíni, receptorhoz (1ENA.R1/2 sejtfelszíni receptorhoz) kötődni. Továbbá, interferont kötni képes, IFNAR2··ektodomén/íg fúziós fehérjét alkalmazó ELlSA~ra alapuló vizsgálati élj árast alkalmaztunk béta-interferon-ía illetve .T.FNA.R2 közötti felszíni kölcsönhatások feltérképezésére (lásd az 1. példában leírtakat). Ezek a mutációs analízisek azt mutatták/ hogy a béta-interferon-molekula N- és C-terminálisánál elhelyezkedő részletek nem fontosak receptorkötéshez vagy biológiai funkcióhoz.
A mutánsok további variánsai a találmány szerinti bétai π t e r f e r ο n -la- o s op o r t na k, amelye k k ü I p nőse n ha s ζ η o s a. k, a menny í - ben olyan új tulajdonságokat mutatnak, amelyeket nem találhatunk meg vad típusú béta-interferon-ía-ban (lásd az. t. példában leírtakat) . Három hatástipust azonosítottunk, amelyeket célzott mutagenezis okozott. Ezek a hatások előnyösek lehetnek interferon-drog fejlesztésében bizonyos körülmények között. A három hatástipus az alábbi: (a) a mutánsok magasabb antivirális aktivitással rendelkeznek, mint vad típusú béta-Interferen-la (például Cl-mutáns); (b) a mutánsok aktívak antivirális és antiproliferativ vizsgálati eljárásokban egyaránt, de amelyek esetén az antiproliferativ aktivitás aránytalanul alacsonyabb az antivirálís aktivitáshoz képest, vad típusú béta-ínter.feron-1a-hoz viszonyítva (például C1-, D- és DS1-mutánsok),‘ és (c) funkcionális
a n t agonisták | (például Al, | B:2, cd; |
antivirális | és antíprolífera | fciv akti |
aránytalanul | a1ácsony abbak a | recepbo |
béta-interfe | r on-1 a -h ο z v i s z or | .yítva, |
72,,.·$·£
A találmány tágan Igényeit oltalmi köre szerint, egyetlen poiimermolekulát alkalmazunk, béta-interferon-Ia-val való konjugálásra, Pár eljárhatunk úgy is, hogy egynél több polimermolekulát alkalmazunk. Azt. találtuk, hogy a találmány szerinti, konjugált. .béta-lnterferon-la-kész.ítmények hasznosak in vívó, valamint nem ín vivő alkalmazásokban. Továbbá, felismertük, hogy a konjugált polimerben más csoportokat,, részeket Vágy' más fconjugátumfajfákat lehet alkalmazni a végfelhasználásnak megfelelően. Például néhány alkalmazásban hasznos lehet a polimerhez kovalensen kapcsolni olyan funkciós csoportokat, amelyek W-lebontás vagy antioxláánsök ellen rezisztenciát, vagy más tulajdonságokat vagy jellemzőket biztosítanak a polimernek. Továbbá például néhány alkalmazásban előnyös lehet a polimert funkoionalízálni, hogy reaktív vagy keresztköthető legyen, a konjugált anyag egészére nézve különböző tulajdonságok vagy jellemzők fokozása céljából, Ennek megfelelően, a polimer tartalmazhat bármilyen olyan funkciót, ismétlődő csoportokat, láncokat vagy más alkotóelemeket, amelyek nem akadályozzák a konjugált béta-interferon-la-<es2;tvny hatckonysaoat a tervezett alkalmazásban. A találmány szerinti megoldás más céljai és előnyei nyilvánvalóbbá válnak a leírás és a csatolt szabadalmi igénypontok alapján.
Ezen kívánt tulajdonságok eléréséhez hasznosan alkalmazható polimereket lentebb leírunk a példaként bemutatott reakcióváziatokban. Kovalensen kötött peptideket alkalmazva, a polimert fűnk•siónálizáihatjuk, és azután kapcsoljuk a peptidíek) szabad amino* savához iaminosavalhozj, labilis kötések kialakítása céljáből.
rwsz * * * χ$<·> **»χ «
A béta~interferon-la~t legelőnyösebben a polimeren lévő terminális reaktív csoporton keresztül kon;„ga';j>, bár konjugálásokat lehet indítani a nem-terminális# reaktív csoportokról, is. Reaktív csoport©(ka)t tartalmazó polimert a leírásban „aktivált polimernek** hívunk. A reaktív csoport szelektíven képes reagálni a fehérjén lévő, szabad amino- vagy más reaktív csoporttal. Az aktíváit polimer(ek)et ágy reagálnak, hogy a kapcsolódás a bétainterferon-fa bármelyik rendelkezésre álló arainocsöportjánál megtörténhet, például -amino-csoportoknál vagy a űrinek -amínocsoport jainál. A béta-interferon-la-n lévő szabad karboxílosoporfok, alkalmasan aktíváit karbonilcsoportok, oxidált szénhidrát -csoportok és merkaptoceoportok (na rendelkezésre állnak) is felhasználhatók kapcsolódási helyként.
Bár a polimert a béta-interferon-la-molokula bármely részéhez lehet kapcsolni, polimer-kapcsolásra a legelőnyösebb hely a bétainterferon-ia M-terminálisa. Másodlagos helyiek; vannak a C-terminál.is közeiében és a cukor-csoportokon. Tehát a találmány előny Ö-s megvalósítási módjai szerint a követkésőképpen játhatunk el: (i) béta-interferon-la ^-terminálisán kapcsolt po 1 imer kon jött á t u m a i ; (i r 5 b é V. a - i. n tért e r ο n -la C -1 e r m i n á 1 í s a n k a p c ε c 11 ρ ο 1 i merkonjugátumai; (íii) cukor-részen keresztül kapcsolt polimerkon jugátumok; (iv) valamint héta-ínterferon-ia fúziós fehérjék R-, C-termínáliaon és cukortéozen keresstúl kapcsolt polimerkonjugaturnái.,
Általában körülbelül 1,0 és körülbeiül 10 stol aktivált polimert alkalmazunk egy mól fehérjére, a fehérjekonoentrációtól függően. A végsó mennyiséget az határozza meg, hogy egyensúlyban
2. .2.7 8/SS legyenek az alábbi folyamatok: a reakció maximális mértékben lejátszódjon, miközben minimalizálva legyen a termék nem-specifikus módosítása? és ugyanakkor olyan reakciókörülményeket határozunk meg, amelyek optimális aktivitást biztosítanak, miközben optimalizálva legyen a fehérje fél“életideje, na lehetséges. A biológiai aktivitásának előnyösen legalább körülbelül 50%-a, és legelőnyösebben 100%-a megmarad.
A reakciókat végrehajthatjuk biológiailag aktív anyagok inért polimerekkel való reagál tatására szolgáló:, bármilyen alkalmat módszerrel, előnyösen körülbelül pH 5-?-n, ha a reaktív csoportok az «-terminális alfa-amínocsoportján vannak. A eljárásban áltálában aktivált polimert (amely legalább egy terminális hídroxilcsoporttal rendelkezhet), és azután a fehérjét reagáltatjuk az aktivált polimerrel a kiszerelésre alkalmas, szolübíiis fehérje előállítása céljából. A fentebb leírt módosítási reakciót számos módszerrel végrehajthatjak, amely egy vagy több lépést tartalmazhat,
A fentebb említettek szerint, a találmány legelőnyösebb megvalósítási módja szerint a béta-interferon-la N-terminális végét használjuk fel a polimer kapcsolására, Rendelkezésre állnak alkalmas mödszerek N-terminálisán módosított béta-íntorférőn-la előállítására. Az egyik ilyen eljárásban például reduktív alkilálást végzünk, amelyben olyan különböző típusú primer aminoesoportok (a tíz inén .lévő epszi lon-aminoo.soporf.ok, ás «-terminál is met ioninon lévő aminocsoportokkal szemben) eltérő aktivitásait használjuk ki, a m.e 1 y e k re n de i ke zés re a 11 n a k fo é t a - i n t e r f e r ο n -1 a s z á r ma. z é k kép zésére. Regfelelő szelekciós körülmények között, béta-interf euron-la
2.2 W SZ * φ « « χ # X « # * β *4Χ lényegileg szelektív származékait lehet elérni az ^-terminálisnál, karboniicsoportot tartalmazó polimerrel. A reakciót olyan pH-η végezzük, amelyben kihasználjuk a béta-interferőn-la licinjének epsziion-aminocsopQrtjai és az ^-terminális aifa-amínocsoportja közötti pka-küiönbség előnyét. Az ilyen típusú kémiai reakció szakember számára jól ismert.
Olyan reakciót alkalmazunk, amelyben a szelektivitást alacsony pH-η (általában 5-5} végzett reakcióval tartjuk fent olyan körülmények között, ahol a PEG-aldehid-pöilmert béta-interferónia- va1 nátrium-cianoborohídrid jelenlétében reagáltatjuk. Ez PEG-béfa-interferon~la tisztítása és SDS-PAGS, MALD1 tömegspektrometria és peptrdszekzenálás/térképezés alkalmazásával végzett analízis után olyan foéta-interferon-ia-t eredményez, amelynek b- terminálisa van spécitikusan megcélozva a PEG-csoporttai.
A. béta-intetferon-la kristályszerkezetén látható, hogy az S~ es G-texz' nair.s egymáshoz közel van ;[ lásd Karpusas et. al., Proc. háti. Acad, Sói. USA 94, 1 ISI 3-11813 <1.997)1 . Tehát a bétáin te r feron-la C - témánál fsának módos .1 fásainak minimális hatás sai kell lenniük az aktivitásra. Mivel nincsen egyszerű kémiai stratégia poliaikilén-giíkol-polimer, például PEG célba juttatására a C-terminálzshoz, a legegyszerűbb géntechnológiai módosítással, például helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával létrehozni egy helyet, amelyet célpontot jelenthet a polimer számára. Például Cys beépítése egy olyan helyre, amely a C~terminálisnál vagy ahhoz közel van, lehetővé tesz specifikus módosáfást maleimid, v i n i 1 s z u 1 f o h - va g y h a 1 o ac e t át - a k t i vá 11 poli a 1 k 1 I. é n - g 1 i. k ό 1 < p él alkalmazásával . Ezeket, a származékokat a beépített dául PEG) *< ** ψχχ * * « * « cisztein. specifikus módosításaira lehet alkalmazná., mivel ezek a reagensek nagymértékben szelektívek Cys-re. Más stratégiákat is lehet alkalmazni, például megcélozható hisztídin-toldalék beépítését ( Fsncy et ai., ehess. & Bioi. 3, 551 (1996).] f vagy további giikozriációs helyek beépítését, amelyek más alternatívákat jelentenek béta-interferon-la C-terminálisának módosítására .
A béta-interieron-la glíkánja olyan helyzetben is előfordul, amely lehetővé tenne további módosításokat az aktivitás változása nélkül. Kémiai módosítás célheiveiként, cukrok rcegcélsására szolgáló módszerek jói ismertek, és ezért valószínű, hogy poiialkíién-glíkol-poiimert közvetlenül éa specifikusan lehet béta-interferon-la-n lévő, előzőleg oxidációval aktivált cukrokhoz kapcsolni. Például éld lehet állítani polietiién-giikolhidrazidot, amely viszonylag stabil hídrasönkötést képes kialakítani aldehidekkel és ketonokkal való kondenzációval. Ezt a tulajdonságát használjuk fel fehérjék módosítására, oxidált olígoszacharid-kőtéseken keresztül (lásd Andresz, H. et ai,, Ma kr omol. Chem. .17 9 > 301 (1973)], Elsősorban PEG-karbonimetilhidrazid nitrites kezelésével PEG-karboximetil-azidot lehet előállítani, amely elektrofii aktív csoportként viselkedik aminoosoportok irányában. Ezt a reakciót lehet alkalmazni polcaikilén-glifcoilal módosított fehérjék előállitására is ( lásd USP 4,101,380, és 4,179,337, számú szabadalmi iratokat] .
Korábban mar felismertük, hogy továbbá tíol-línkerrei médiáit kémia elősegítheti fehérjék keresztkőrését. Elsősorban IFA-3 és
CD4 homotipikus műi temerjóit állítottuk elő egy olyan eljárás alkalmazásával, amelyben például eláliitottunk reaktív aldehidé?.CV3£ ί
» * * Μ'ί* Χ*<
»
Λ*
két szénhldrát-csoportokon nátrium-perj ódáttál, ciszteamin-konjugátumokat kialakítva az aldehideken keresztül, és kerasaíkötéssel a oissteaminokon lévő tiolcsoportokon keresetül [ lásd Pepínsky, B. et ál., J. Bioi. Chem, 266, 18244-18249 {1991}; és Chen, L. L. efc ai,, J. Bioi. Chem. 266, 18237-18243 (1991)] .
Ezért úgy láttuk, hogy sz a típusú kémia megfelelő lehet poliaikilén-glikol-polimerekkel való módosításra is, ahol a linkért beépítjük á ca korba, és a pol iái fcilén-giikol “-polimert a linkerhez kapcsoljuk, Míg atónotiol- vagy hrdrazin-tartalmú i.ínkerek lehetővé tesznek egyetlen poiimercsopcrt hozzákapcsolását, a irnker struktúráját meg lehet ágy változtatni, hogy több polimert kapcsoljunk és/vagy meg váltott ássuk a po.lí.mér térbeli orientációját a béta-ínterieron-la-hoz képest.
A találmány gyakorlati megvalósításában 1-4 szénatomon alkílpoxialkilén-glikolök, előnyösen polietílén-glikol (PEG) poiialkilén-glíkol-csoportjai, vagy ilyen giíkólók poli- (oxi.} -alkiléngllkod.-csoportjai előnyösen beépíthetők a kérdéses polimer rendszerbe. Tehát a polimer, amelyhez a fehérjét kapcsoljuk, lehet polietiién-glikol (PEG) vagy poli-oxi-etilált poliol homopoiímerjé, féltévé, ha a polimer valamennyi esetben vízben oldható szobahőmérsékleten, Ilyen polimerek például poliaikilénoxíd-bomopolimerek, például PEG, vagy poiipropiién-glikólók, polioxietilénnel ellátott polioiok, ezek kopolimerjeí valamint ezek blokk-kopollmerjeí, feltéve, hogy a blokk-kopollmerek vízoldhatósága fenntartható. Polioxietíiáit poliol lehet például ρ o 1 χ ο x i e 1.i1 ált g 1 i c e r i η, po 1 i oxietiláit szerbit, ρ ο 1 i ο x i e t i 1 a 11 glükóz és hasonlók, A polioxretiiáit glicerinben lévő glíoerin?S . 27S/SK.
7} *«· ** <*
,. ' * * 6 A Φ * 5 * £ * « *·??« ;*»«<. íA'.» * váz ugyanolyan, mint ami természetes körülmények között előfordul, például állatokban és emberekben lévő mono-, di- és trigliceridőkben. Tehát a vonal nem szükségszerűen Idegen ágens a testben.
Ezzel párhuzamosan, poiialkilén-oxídok, dextrán, polívínilpirrolidonok, poliakriiamitíok, polivinil-aikoholok, szénhidrátalapú polimerek, és hasonlók is alkalmazhatok. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fentebb felsorolt lista ősapán, csak szemléltetés célját szolgálja, és minden olyan polimer-anyag szóba jöhet a találmány szerinti megoldásban, amely az itt leírt minőséggel rendelkezik.
A polimerrel szemben nincsen semmilyen konkrét igény molekulatömeg tekintetében, de előnyösen körülbelül 300 és 100.000 közötti molekulatömegü, előnyösebben körülbelül 10,000 és 40.000 közötti molekulatömegű polimert alkalmazunk. Ά legjobban különösen 20.000 moiekalatömegü vagy nagyobb polimer előzi meg legjobban a vese kiszűrése következtében bekövetkező fehérjeveszteséget,
Po .11 a1kilé n - g 1 i ko 1 ~s z á r ma z é ko ka a k s z ámo s e lő n y ö s te 1 a j dón s ága van a találmány szerinti megoldásban alkalmazott polimerinte r rerőn-béta-1a -kon j u gát nmío rmákban, ame1yek po1i aIkiIénglikol-származékok alábbi tulajdonságaival társultak; vísoldhatóság javulása, mig ugyanekkor nem váltanak ki antigénikus vagy immunogén választ; nagymértékű biológiai kompatibilitás; polialkiién-származékok in vivő biológiai lebontásának h’c”j,a; és könnyű kiválasztás élő szervezetekből.
Továbbá, a találmány tárgyának másik vonatkozásában, olyan, pslimer-kcmponenshez kovalensen kötött héta-interferon-la-t alz .rm:
* «χ χ * Λ 4 ·>· * * ♦:
* » ί S X * halmazunk, amelyben a konjugáció hasítható kovalens kémiai kötéseket tartalmat. Ez lehetővé testi annak időbeli szabályzását, amelyben a polimer iehásíthatö a bétá-interferon-Ia-rói. Ez a béta-interferon-ia-drog és polimer közötti kovalens kötés kémiai vagy enzimes reakcióval hasítható. A poiimer-béta-ínterferon-1atérmék elfogadható aktivitásmennyiséget megtart. Ezzel egyidejűleg, a polimerben jelenlévő polietilén-glikol lehetővé teszi, hogy a polimer-béta-interferon-la-konjugáturn vízben nagyon jól oldódik és élettartama meghosszabbodik a vérkeringésben. Ezen javított tulajdonságok .eredményeként, a találmány tárgyát képezik mind az aktív polimer-béta-ínterferon-la-fajták parenterális, aeroszolod és orális célba juttatása, valamint hidrolitikns hasítást követően, önmagában a béta-ínterferon-la biológiai hozzáférhetősége, ín vivő alkalmazásokban,
Nyilvánvaló, hogy a leírt reakcióvázlatok csak szemléltetés célját szolgáljak, és nem korlátozzák azokat a reakciókat és struktúrákat, amelyeket a béta-interferon-la módosításában alkalmazunk, példán! oldhatóság, stabilitás és a sejtmembrán parenterális és orális beadásra mutatott affinitásának elérésére. A polimer és a béta-interferon-la közötti reakciót., a legelőnyösebb, N-terminálisnál konjugált termékek előállítása céljából, sokféle reakciovázlai szerint, könnyen végrehajthatjuk, A béta-interferon-la-konjugátumok aktivitását és stabilitását számos módon lehet változtatni, különböző moiekulaméretű polimer alkalmazásával. A konjugátumok oldhatóságát a polimer-alkotórászbe épített polletiién-gli kői-fragmentum arányának és méretének változtatásával lehet módosítani.
c i-s.
·**· * φ * * « » * χ « Λ * « »®«, ί» » *
Polialkílén-glikollal származtatott polimerek egyedi tülájdonságának értékét a találmány szerinti terápiás alkalmazásokban általános biológiai kompatibilitásuk jelenti. A polimerek vízben különböző mértékben képesek oldódni, és nem toxikusát. Feltételezzük, hogy nem irnmunogének és nem antigenikusak, és nem zavarják a béta-ínterferon-Ia-csoport biológiai aktivitásait, ha a leírás szerinti körülmények között vannak konjogéivá. A vérben hosszú keringési idővel rendelkeznek, és könnyen kiválasztódnak élő s ze r ve z e t e kb óI,
Azt találtuk, hogy a találmány szerinti termékek alkalmasak bétg-interferon-ia terápiás fél-életidejének fenntartására, és például vízben vagy elfogadható folyékony közegben való feloldással lehet azokat előállítani. A beadás módja parenterális, aeroszolos vagy orális. Finom kolloid szuszpenziőkat lehet előállítani parenterális beadásra depó-hatás kialakítása céljáböí, vagy orális beadásra? mig as aeroszolom forma lehet folyékony vagy száraz Por természetű. A száraz, irofi lezett állapotban vagy oldat-formákban a találmány szerinti béta-interferon-lapolímerkonjugátumoknak jó tárolási stabilitásoknak kell lennie. A konjugáit foéta-interferon-Ia hóstabilitása előnyös por-formát kialakító eljárásokban, amelyekben dehidratáeiös lépés van. Lásd például PCT/ÖS/95/Ö6Ö08. számú szabadalmi iratban („Methods and Compositions fór Dry Powder oi Interferon»} leírtakat.
A találmány szerinti, terápiás hatású polimerkonjugátumokat bármilyen állapot vagy betegség profilaxisára vagy kezelésére lehet alkalmazni, amelyre a béta-interferon-la-alkotörész hatásos. U.Z7«/S£ *
3£ ο * * * «k * » * φ φ* «.*'** *♦*
Továbbá s találmány szerinti, polimer alapú kon j agát umok.af alkotórészek, allspetok vagy betegségek diagnózisára lehet alkalmazni biológiai rendszerekben vagy mintákban, valamint diagnosztikai célokra lehet alkalmazni nem-fízioiögiás rendszerekben.
Terápiás alkalmazásra, a találmány tárgyát képezi eljárás ilyen állapot (ok) bán vagy betegség (ek)ben szenvedő vagy ilyen állapot(ok)ra vagy betegség(ek)re látensen érzékeny állat-alany kezelésére, és ilyen kezelésre szoruló állat-alany kezelésére, amelyben ilyen állatnak beadjuk a találmány szerinti polimerkonjugátum hatásos mennyiségét, amely terápiásán hatásos az állapotra vagy betegségre. A találmány szerinti polimerkonjugátumokkái kezelt alanyok lehetnek emlős alanyok, és legelőnyösebben emberek. A leküzdendő konkrét állapottól vagy betegségtől, függően, az állat-alanyoknak a találmány szerinti polimerkonjugátumokből beadhatunk bármilyen terápiásán hatásos és biztonságos dózist, melyet szakember képes könnyén meghatározni szükségtelen kisér létezés nélkül. Az 1. típusú interferonok faj specifikus jellege („faj-gát) miatt szükség lehet olyan interferon-poiímar-konjngátumok előállítására, amelyek megfelelő fajból származó: interferonokat tartalmaznak.
A béta-interferon-ia anti-séjtöröliferativ aktivitása jói ismert. Különösen bizonyos leírás szerinti béta-ínterferon-la-pölimerkonjogátumok alkalmasak tumorok és rákbetegségek, például oszteogén szarkóma, limloma, akut ilmfömás leukémia, mell karóinéma, melanóma és nasopharyngea1 is karcinóma, valamint autoimmun állapotok, például fibrózis, iupusz és szkierőzis multiplex kezelésére. Továbbá várható, hogy a koniugátt fehérjék,
72.2 78,'S.s:
*0 ί* « * < ’ ► * * ♦ * > X 0 X « 0 * ·** ί különösen bizonyos találmány szerinti béfa-interferon-la muteinkenjtgátumok által Kifejtett aotívirálís aktivitást lehet alkalmazni virushetegségsk, például SCM- fertőzés, influenza és más légzőszerve traktust érintő fertőzések, veszettség és 'hepatitiszkezelésére. Szintén várható, hogy a béta-interferon-la, különösen a leírás szerinti kongagáit fehérjék által kifejtett nonrmodulátor aktivitásokat autoimmun és gyulladásos betegségek, például fibrósís és szklerőzis multiplex kezelésére lehet alkalmazói- Az, hogy az interferonok új véredények képződését képesek gátolni (azaz sngíogenezist és neovaszkuiarizációt képesek, gátolni), lehetővé teszi, hogy a találmány szerinti konjugálásokat angiogén betegségek, például diabetikus retinopátia, koraszülöttek retínopátíája, makuláris degeneráció, szaruhártvagraft-kilökődés, neovaszkuláris giaukőma, retrolentálís £ibropiázia, rubeőzig és Oslsr-Webber-szindröma kezelésére alkalmazzuk.
Továbbá, az interferon ántiendotél-akt1vitása már jő ideje ismert, és az interferon-hatás egy lehetséges mechanizmusa az, hogy valószínűleg zavarja az endotél-sejtaktívitást úgy, hogy gátolja angiogén faktorok tumorsejtek általi termelését vagy hatékonyságukat. Néhány vaszkulárís tumor, például hemangiémák különösen érzékenyek interferon-kezelésre. Alfa-interferon-kezelés az egyetlen dokumentáit kezelés erre a betegségre. Várható, hogy a találmány szerinti béta-interferon-la-kongugátumokkal való kezelés lényegi gyógyhatásokat nyújt fárinakoklne-tikai és farmakodinámiás szempontból, mivel a konjugátum várhatóan hosszabb ideig marad az érrendszerben, mint a nem-konjugáit interferonok, igy eredményesebb és hatékonyabb terápiához vezet anti-angiogén
72.273/8S ágensként alkalmazva. Lásd a 3. példát.
A. taláimány szer1nt i po1Ímer-héta-1nterferőn-la-kon jngá turnékat beadhatjuk úgy, ahogyan vannak, valamint gyógyászati lag elfogadható észterek, sók, és más, fiziológiailag működőképes származékuk formájában. Ilyen gyógyszerformákban a béta-interfsron-la-t előnyösen, egy vagy több, győgyászatilag él fogadható hordozóval és adott esetben bármilyen más, terápiás hatóanyaggal alkalmazzuk együtt, A hordozöknak gyógyászaülag elfogadhatónak kell lenni abban az értelemben, hogy kompatibilisek legyenek a gyógyszerformában lévő többi hatóanyaggal, és he legyenek túlzottan károsak recipiensükre. A. béta-interferon-la-t akkora mennyiségben alkalmazzuk, hogy elérjük a fentebb leírt, kívánt farmakológia! hatást, és megfelelő mennyiségben ahhoz, hogy elérjük a kívánt napi dózist.
A formák alkalmasak lehetnek parenterális valamint nemparenterális beadásra, és speciális körülmények közötti, például orális, rektális, buocalis, topikálrs, nazális, ophthaímiás, s z uhku t áη, i n t r amu s z k alár is, 1n travé ná s, t f ans z de raá1Is, int rate ká 1 is, 1 n t r ar t i k u I á r i s, i n t r aa r té r 1 á 1 is, s z u a r a c h η ο i dá 1 i s, bronchiális, iimíatikus, vagináiig és intrauterrnális beadásra. Előnyösen orális, nazális vagy parenterális beadásra alkalmas formákat alkalmazunk.
Ha a foéta-interferon-la-t folyékony oldatot tartalmazó formában alkalmazzuk, akkor a formát előnyösen orálisan vagy párén teralisán adjuk he. Ha a héta-interísron-la-t folyékony szuszpenziős formában vagy porként, bioíógiaiiag .kompatibilis hordozóformában alkalmazzuk, a formát ?rá<isa, i ' Ο ι...ό?.
72.2’mzse
«) fi *♦♦!<
, # '»· « * ” vagy bronohíáiisan adjuk he.
Ha a béta-interferon-la-t közvetlenül szilárd por formájában alkalmazzuk, á béta-ínterferon-la-t előnyösen orálisán lehet beadni. Más módszer szerint nasálisan vagy bronohiálisan lehet beadni, a por hordozógázban való porlasztásán keresztül, alkalmas porlásstókészülék alkalmazásával a por gazdiszperziöját kialakítva, amelyet a páciens· légáramlatból Lélegez be.
A találmány szerinti poiimerkonjugátumokat tartalmazó formákat alkalmas módon, dózisegységek formájára hozzuk, és elkészíthetjük azokat gyógyszerész-szakmában ismert, bármilyen eljárással. Ilyen eljárásokban általában a hatóanyagot {hatóanyagokat) összekeverjük hordozóval, amely egy vagy több, járulékos alkotórészből áll. A formákat tipikusan egységesen, ügy készítjük el, hogy a hatóanyagot {hatóanyagokat) közvet lehűl összekeverjük folyékony hordozóval, finoman eloszlatott szilárd hordozóval, vsgy mindkettővel, és azután, ha szükséges, a terméket a kívánt kiszerelési forma dótí«egységeibe formázzuk,
A találmány szerinti, orális beadásra alkalmas gyógyszerformákat előállíthatjuk diszkrét egységek formájában, például kapszulaként, ostyaként, tablettaként vagy szögletes tablettaként; amelyek mindegyike előre meghatározott mennyiségű hatóanyagot tartalmaz porként vagy granulátumként; vagy szuszpenziőként vizes folyadékban vagy nem-vizes folyadékban, például szirupként, elixirként, emulzióként vagy kanalas orvosságként.
Tablettát előállíthatunk sajtolással vagy bevonással, adott esetben egy vagy több járulékos alkotórésszel. Sajtolt tablettákat nyomással lehet előállítani, alkalmas berendezéssel, amely fZ.ZVStSK esetben a hatóanyag szabadon folyó, például por vagy granulátum.formában van, amelyet adott esetben kötőanyaggal, máilasztőszerrel, síkositószerrei, inért hígltószerrel, felületaktív ágenssel vagy maratószerrel keverünk össze. Bevont tabletták porított polímerfconjugátnmokat tartalmaznak alkalmas hordozóval, összekeverve, amelyeket alkalmas berendezésben vonnak be.
Szirupot úgy lehet előállítani, hogy a hatóanyagot cukor, például szacharóz keményített oldatához adjuk, amelyhez bármilyen kiegészítő alkotórész (eke) t is hozzáadhatunk... Ilyen kiegészítő alkotórészieké)! lehetnek ízesítőszerét, alkalmas tartósítószer, a cukrok kristályosodását késleltető ágensek ás bármilyen más alkotórész oldhatóságát növelő ágens, például polihidroxi-alkohol, például glicerin vagy- szerbit.
Parenterális beadásra szárít formák alkalmas módon a hatóanyag steril vizes preparátumát tartalmazzák, amely előnyösen a reclpiens vérével izotóniás (például fiziológiás sőoldat), Ilyen formák szuszpendáló ágenseket és töltőágenseket, vagy más, mikrorészecskékből álló rendszereket tartalmazhatnak, amelyeket úgy terveztek, hogy képesek legyenek a vegyületet a vér komponenseihez, vagy egy vagy több más szervhez célba juttatni. A formákat egy dózist tartalmazó vagy több dózist tartalmazó formákban lehet előállítani.
Orrspray-forrnak az aktív konjugátum tisztított vizes oldatait ’-ír^alru ’ak íüio^.í'' ác^nscxíkej ts „zvton’.as sge~sokk< 1 , 1 ye formákat olyan pH-ra és izotóniás állapotba állítjuk, amely kompatibilis a nazális nyálkahárfya-membránokkal,
Rektális beadásra szánt formákat kúpként lehet előállítani
72.276/3K χ * X * *
X <
>« *♦»**<
alkalmas hordóséval, például kakaővajjai, hidrogénezett zsírokkal vagy hidrogénezett zsi r-karbonsavval.,
Ophthalmiás (szembe) beadásra szánt formákat, például -stmcseppeket az orrsprayhez hasonló eljárással állítjuk elő, kivéve azt, hogy a ph-t és az izotóriás faktorokat előnyösen a szemben fennálló körülményekhez igazítjuk.
Topikális formák a találmány szerinti konjugáturnékat tartalmazzál feloldva vagy szusspendálva egy vagy több közegben, például ásványi olajban, petróleumban, políhidroxi-alkohoiokban vagy olyan más bázisban, amelyet topikális gyógyszerformákban alkalmaznak.
A fentebb említett alkotórészeken ktvul, a találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak továbbá egy vagy több járulékos alkotórészt {alkotórészeket), például hígitőszereket, puffereket, Ízesítő ágenseket, zoncsolőszerekat, felületaktív ágenseket, tölfőanyagokat, s 1 kos ítészeteké t , tartösitós2ereket (például antioxidánsökat) és hasonlókat.
Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi alkalmas polimerek biztosítása béta-infcerferon-la-oldat in vitro stabilizálására, amely előnyös, szemléltető példaként szolgái nem-terápiás alkalmazásra. A polimereket például a béta-interferon-la höstab.-.iitásának és enzimes lebontással szembeni rezisztenciájának fokozására lehet alkalmazni. A béta-interferon-la hőstabíIrtásának fokozása a. találmány szerinti konjugációs módszer alkalmazásával lehetőséget biztosít a fél-életidő, a szobahőmérsékleten vett stabilitás és a kutatási célú reagensek és reagenskészletek ha t e kon y sá gá n ak ja vi tá s ára.
72.2?6Ζ8ε ·'*>
* ,y * * *
4χγ« *♦ «
* < * ♦ .Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldást szemléltetjük, amelyekkel nem kívánjuk azt korlátozni. Nyilvánvaló, hogy különösen a leírt in vívó állatkísérleteken változtatni lehet, igy az alapvető módszerekben más módosítások és variációk is lehetségesek. Például az S. példában szakember alkalmazhat más neopterin vizsgálati eljárásokat vagy megváltoztathatja az alkalmazott főemlősök számát vagy fajtáját, A példákban végzett ilyen módosításokat és változtatásokat a igényelt oltalmi körbe és találmányi gondolatba tartozónak tekintjük.
Béta-interferon-la szerkezet/aktivitás-vi^sgálatai alanin/szerin-arubsrtá-fcúcióa mutánsok alkalmazásával: raoaptorköfeö telyek éa funkcionális dóménak analiaiss
A. Át tekintés
Alapba mutációs analízist végeztünk humán béta—interferen-lan (béta-lFN-ls) abból a célból, hogy feltérképezzük az aktivitáshoz és receptorkötéshez szükséges csoportokat. Rendelkezésre állt a humán béta-interferon-la 3-dÍztenzíős kristályszerkezete [ Karpusas, M. et a'l ., Proc. Naf 1 . Acad. Scl. USA 94, 11313-11818 (139?)], amely lehetővé tett béta-interferon-reeeptorkölcsonhatáshoz rendelkezésre álló, oldószer-hatásnak kitett csoportok azonosifását alanin- (vagy szerín-) szubcztítücíókhoz, és az intramoiekuláris kötésekben szerepet játszó aminosevak. megtartását. Tizenöt alanrn-mutáoiőbói álló panelt terveztünk, amelyben 2-3 közötti aminosuvat cseréltünk a béta-interferon-la-ban lévő egyes héiixek (A, R, C, D, E; és hurkok (ARI, AB2, AB3, CDi, .278/85:
CD2, DE1, DE2) jól elhatárolható régióiban. Hat hisztidinből álló, amino -te rmi.nái is hiszti din·- toldalékot alkalma ztunk emlős sejtek által expresszáít mutánsok afííniíástisztitására, valamint enterokináz-hasitóhelyet az amínc-termináiis meghosszabbá tás eitávolítására. Az eredményül kapott interferonokat „his-toidalékkai rendelkező béta-interferon(IFN}-ként vagy „his-béta-interferőn -ként vagy „ His;-béta-interferon -ként vagy hasonló .módon jelöljük.
Előállítottunk különböző mutáns, his-toldaiékkal rendelkező béta-IFN expressziós plazmidokat, mutaganezis-templátként vad típusú béta-lFh-génkonstrufccíó alkalmazásával. A mufcagenezisstratégiában. először hevítsünk egyedi restrikciós enzimes hasitöheiye.ket elszórtan, a vad típusú, his-toldaiékkal rendelkező béta-IFN-génbe, azután kicseréltük a kiválasztott restrikciós helyek által elhatárolt DhS-svekveuciákat olyan szintetikus olígonukleotid-duplexekkel, amelyek az. alanín.-· ívagy szerln-j szubsztítúciós mutánsokat kódolták. Végül, a mutáns IFN-géneket olyan plazmádba szubkiónoztuk, amely emlős sej {“expressziét képes vezérelni., humán 293-vese-sejtvonalban.
Ezen mutációk funkcionális következményeit antiviráiís ás antíprolíferatív vizsgálati eljárásokban határoztuk meg. Kifejlesztettünk egy nem--radloakt.lv TFb-kötési vizsgálati, eljárást ezen mutánsok analizálására arra vonatkozóan, hogy milyen mértékben képesek Daudi-Burkítt-féle limfőmasejteken lévő, bétainterferon sejtfelszíni receptorhoz (IFfíARl/2-komplex) kötődni . Továbbá kifejlesztettünk his-béta-IFK-mutánsok és IFRAR2 közötti kölcsönhatási felszínek feltérképezésére szolgáló vizsgálati elU , X?s/i5£:
ζ:
járást, amelyben IFNAR2/lg fúziós fehérjét alkalmaztunk, amely 1FN- recept, o r fehérjét , 1FNAR2 ext. race .1.1 u.l á r í s dómén j é t t a r t a Ima z ta humán IgGl~bőí származó kapoesregiőhoz, CH2- és CB3~őcmé“ ne k hez £ u a i ο n á .1 va.
I.
múl
Béta-IFF alanin- (vagy szeren-) szubsztí uált mutánsok előállítását célzó stratégiánkban ©lőszer előállítottunk olyan módosított béta-íFN-gént, amely vad típusú fehérjét kódolt, de egyedi restrikciós enzimes hasítóhelyeket hordozott, elszórtan elhelyezve a génben. Az egyedi restrikciós helyeket használtuk fel vad típusú szekvenciák olyan szintetikus oiigcnukleotid-duplexek cseréjére, amelyek a mutáns kódosokat kódolják. Mutáns gének előál 11fására alkalmas, humán beta~XFF~1a-expres sz fós ka zetta létrehozása céljából, a béta-lFN-oDNS-t (GenSank nyilvántartási száma #£00029} PCR-ei araplifikáltuk. A béta—TFF~génf először pMJBlÖ7-plazmídba; klónoztuk ( pAClClSé származéka, lásd Bőse et. al., Fucleic Acids Rés. IS, 355 (1988)1, amelyre azért volt szükség, hogy elvégezzük a gén helyspecifikus mutagenezisét egy olyan plazmádban, amelyben nem voltak specifikus restrikciós basitőhelyek, amelyeket matagenezíssel lehetne létrehozni.
A humán héts-IFF-gén kódoló szekvenciájának szubkiónozására alkalmazott PCR-primerek azt is lehetővé tették, hogy bevigybnk e n t e r o k 1 n á z, - has i t ó h e .1 y e t a h é t a - T. FN - g é n t ö 1 s z 1 n t é z is ír á η n y a 1 szemben és azzal egy leolvasási fázisban (Sf -végi FCR-primer:
V -TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGAIGAGGIACAACTT
OTTGGATTCCTACAAAGAAGC~3# , 3. számú szekvencia (SEQ IB NO: 3): „BET-021;
72. S7S/ÍSS
5 φφ »>ν φ
X χ * <·
Φ * *
és 3Λ “Végi PCR-primer:
5' ^G€CGCTCGAG??ATC&STTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC~3' , 4. számú szekvencia (SEQ ID NO: 4: „BET-022 ? és szegélyező restrikciós enzimes hasitéheIveket (BspEl és Xhol), amelyek pHJB107-plazmíd helyeibe való klónozáshoz hasznosak. Az eredményül kapott DNS-t PCR~£r.agmentum-A- na k j e iöi tök.
Hatékony szignálszekvenciaként a végső konstrukcióba beépítettünk humán , vaszkuláris, 1«. számú sejtadhéziós molekulából (VCAM-1) származó szignálszekvenciát, és bevíttünk hat hisztidinből álló toldalékot püSW247-boI előállított, második DNSfragmentumból (B-fragmentum) , A pDSW247-pIazmid a pCEB4 (invitrogen, Carlsbad, CA) származéka, amelyből az SBNA-l-gent deletaltuk, és amely a VCAM-i-szignálszekvenoiát (VCAMss) hordó zzá hat hisztidinből álló toldalékhoz szintézisiránnyal szemben és .azzal egy bázisban fuzionálva. A VCAMss-I/hiszi,idintoldaiék-kazsttarészlet előállítására alkaImazótt PCR-primerek r 5·' -végi ?CR~primer (K1D-3Ő9) :
5f -AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT - 3” , 5 , szárná szekvencia, (SEQ ID NO: 5); és 3? -végi PCR-primer (K1D-421):
5' -CGGGAGGTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3Í , δ. számú szekvencia, (SBQ ID BG: 6), amelyekbe szegélyező restrikciós enzimes hasítóhelyek (boti és BspEI) vannak beépítve, amely lehetővé teszi a fragmentum-B-DBS kivágását.
A. VCAM-l-sz ignáiszekvenciát, his-toldalékot és béta-interferon-gént hordozó plazmidvektor előállítása. céljából, hármas ligáiást végeztük, gélen tisztított DNS-fragmentumok alkalmazásává 1, amo 1 y e k pM-.ID 1 0 7 -ρ 1 a zmi d ve k v. or hő 1 (hot I / Ahol -enzi me kke 1
72.27S/BS k·:» » * hasítva} , PCR-f ragmentnm~A-.bói (BspEl/Xhoi-onzimokkol hasítva) és fragmentura-B-ból (NőtX/BspEl'~enzimekkel hasítva) származtak. A ligáit plazmáddal JA221 vagy XLl-Blue E. coli-sejteket transzformáltunk, az ampí c i H la-rezisztens kolóniákat kivettük és inszertekré teszteltük azokat restrikciós térképezési analízissel. Maxiprop-bhS~t készítettünk, és az inszertek szekvenciáját DNS-szekvenálássai igazoltuk. Az eredményül kapott konstrukciót pCMGl60-nak neveztük.
2. Humán hééa-ínteráorcn alanin-snnbastíhöciás mutánsainak élőéi 1 í fcása bCMS^ő-őan
A pCMGz60-plazmidot alkalmaztuk teapiátként több ciklus mutagenozisben iü.S.E. Site Directed Mutagenesis Kit, Boehringer Mannheira), amellyel egyedi restrikciós hasifőhelyeket vittünk be a béta-lTN-f ehérj ét kódoló szekvencia .helyzeteibe, de amely nem változtatta meg az eredményül kapott fehérje szekvenciáját.. A mufcagenizált plazmidokkal -JA 2 2.1. vagy .XLl-ölue törzshöz tartozó E. coli-sejteket transzformáltunk, és rekombináns kolóniákat amp i c i 11 i n -r ezí s zt e n c í á r a s z e 1 e k f ái t űn k , Az ampáé ί .11 í n - re z i s.z tens kolóniákat tovább teszteltük a kívánt, egyedi restrikciós en z i me s hasitöholye k j e1eη1éfére, DBS-re strike i ó s térképe z ési analízissel. Az eredményül kapott. pCMGfif«8-jelű, béta-IFN-píazmid a teljes készlet restrikcióé enzimes hasifóheiyet tartalmazta, és igazoltuk a gon DNS-szekvenciá ját. A módosított, his- te 1 d a 1 é k ka 1 óllá t o 11, b é t a - i nt e r f e ro n -gén telj e s D Ν' S ~ s z e k v e n olaját (1. számú szekvencia}, a kódolt fehérje szekvenciájával (2. számú szekvencia) együtt megadjuk a löt ábrán.
A teljes készlet aianin-szubsztitüciős mutánst bemutatjuk az
X -X * f X
X » X' X X X X
1. táblázatban (lentebb)· A mutánsok nevei azokat a strukturális régiókat (héiixek és hurkok) határozzák meg, amelyekbe a mutációkat bevittük, A. teljes alanin- (szerin-) szubsztitúcióé panel a humán héta-lFK 167 amínosavja közül 65 mutációját eredményezte<
A mutációk panelját pCMG275.8-ból hoztuk létre úgy,, hogy kicseréltük a kiválasztott restrikciós helyek által elhatárolt DE S-sze gee os e k a t ο1yan szintet!kn s o11gonuk1eot íd~du ρ 1exekke1, amelyek a 2. táblázatban (lásd lentebb) bemutatott genetikái kódoló információkat hordozták, Különböző alanin-szubszti tüdőt tartalmazó, mutáns plazmidők előállitáss céljából, gélen tisztított OCMG2 75.8-vektort (megfelelő restrikciós enzimekkel, hasítva, melyeket lentebb feltüntetünk az egyes béta-IFN strukturális régiók esetén) és oligonukleotid-duplexekef (a kódoló szál szekvenciáját bemutatjuk a 2» táblázatban) egymáshoz ligáltunk. A ligáciős reakciókeverékkel -JA22.1 törzshöz tartozó E. coli-sejteket transzformáltunk, és rekombináns kolóniákat ampicillinrezisztenciára szelektáltunk. Az ampiciilin-rezisztens kolóniákat teszteltük a mutáns inszertek jelenlétére, megfelelő restrikciós enzimes hasítóhelyekre való szűréssel. Két mutáns esetén (Az és CD2) a kiónozó stratégiában két, szintetikus olígonukleotid-duplexet alkalmaztunk (a 2. táblázatban bemutatjuk), amelyek komplementer túlnyúló végeket hordoztak egymáshoz iJe*·'»' a béts-IFN-vektor-vázhos való lígálásuk .lehetővé tété.le céljából, hármas ligái ásba.n. Az alábbi listában feltüntet, jük azokat a hasítőhelyekst, amelyeket a 2, táblázatban léve··, mutáns oligonukieotidok klónozására alkalmaztunk. A klónozás vázlatán (Baiszekc.ió) bemutatjuk a .béta-interferon-génen lévő, említett egyedi hasi tőbeivek pozícióit.
2.273/SS ♦> Φ* χ* *♦** φ φ χ * * ·> * < Φ X 7φ » φ * φ,ΧΑΦ *>** > *·* « * p-lFNMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNB'DTPEEIKOWQFQKS
Al Α2 ΑΒΊ AB 2 AB 3
Α~“ 'A”' .......— · -- .......................A Α - ΑΑ—ΑΑ------~Α héiix;ο ?0 •ΑΆΑ-ΑΑ---------------------------,------ ~ & : Α-----“ “ ~------- -----------.................. ΑΑΑΑ Α A ΑΑ hurok--------------Η
100 β-lFh
Cl
C2
CD1
DAALT IYEMLQNI FA IFRQDS S ST GWET ϊ VENLLANVYHQINHLKTVLESKLEKE ----------------Α......AS„____---------------------------------------------------------------------r*· — — —~ «· ααα -χ. %αα ~~· »*·» rr· >*» > *“ A. Α* Α». ** ί—~·Β bélix--Ί {------------------1 pOD hurok™ ,10
120
30
140
150
D
DS1 β-IFN DFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKSYSHCAWTXVRVS.ILRNFYFXNRI,TGyLRN .eA—A a /. ~~ —~~——— .................. .............. ™ ~™ ~. ~~ .~ ~ .....· '·'·.··'·* * ~ A A A--------·**'-* :**.**:** ~··'...................~~ ~~~~~ :
—' · ------ --------- ΛΜ MA W O. ....„ AA ~ -Λ A~ AV AA W AAA ·~~ ... ... .... .AA· ααα „aa aaa
CD burok-H-D bélix-í f~ —™B h?l.x~~-----------------j
Az β-iFN-vai jelölt sorban bemutatjuk a vad típusú β-IFM szekvenciáját. A β-lFd-ban lévő aminosavak alanin- vagy szerin-szuhsz^ titúciós mutációit bemutatjuk az egyes mutánsokra, az oda vonatkozó régiók alatt húzott vonalak megfelelnek a vad típusú szekvenciának. A hélfx- és hurok-struktúrákat a mutánsok alatt, folyamatos vonallal jelöljük. A DE-hurok átíveli a D~ és S-hélixek közötti rést. Előállítottunk két további alanin-sznbsztitúciös *
XX ΦΦ φ * »*♦> Φ >
mutánst (Η93Α, Κ97Α és Η121Α), és antivírális vizsgálati eljárásokban analizáltuk esen hisztiéinek mutációjának hatásait, amelyek cinket képesek komplexální diner „kéreg-sfcrektöráhan' , Mindkét mutáns teljesen megtartotta a vad típusú aktivitást antivírális vizsgálati eljárásokban mérve, ami alapján feltételezzük, hogy a éínk-mediált dlmerképződés nem fontos a (k~IFN~ aktivitáshoz.
Al
A2
BI
B2
SEQ ID CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTAC
NO : 7 AAGCTTCXAGCAATTTTCAG.?GTCA.GAAGCTC€TGTGGC
BET-O53
SEQ ID GATCTAGCAATGGTGCCISTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGA
NO:8 GGCTTGAATACT
3ET-O39
SEQ ID GeCTCAAGGAGAGGATGAACTTTGACAlCCCTGAGGAGATTAAGOA
NO:9 GGTGCA
BET-041
ÁBl SEQ IP NO:1Ö BST-O80
ΆΒ2 SEQ 10 NO: 11
ΒΕΪ-Ο82
AD3 SEQ ID NO: 12 BET-O34
AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGGASACÁGGATGAAGTTTGA
CATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTXÖAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGC
TATCCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAAC
TTTGACA
S EQ ID T'CCCTG AGG AG ATTGCTGCAGCTGC AGGTTTCGCTGCAGCTGA
NO : 13
ΒΒΪ-Ο86
SEQ ID CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTC
NO: 14 AGACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAA
BET-110
SEQ ID CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGGTCCAGAACATCTTTGCTATTTTC
NO : I5 GCTGCAGOTTCATCTAGCACTGGCTGGAA
BET-112
W Φ Φ ♦ *» *
GGAATGGTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATGATCAGAT
AA.ACCAICTGAAGACAGT?CTAG <·φφ Φ ** -X
.·~· -·; | SEQ NO : 1 BET- | ID w 114 |
C2 | SEQ | ID |
NO: | ||
BET- | 0 92 | |
g r\o | C γ-ί Z\ | ·;· 'Λ |
é'Vi | d- íz | |
NO: 1 | s | |
BET- | 094 | |
(' ív'} V.· | SEQ | ID |
XT/’X - Ί | 9 | |
ikK/ - a | ||
f\ Φ'! ·Χ·Ϊ •O iái X ** | 096 | |
SEQ | ID | |
NO : 2 | 0 | |
BET- | 106 | |
Dl | SEQ | ID |
NO: 21 | ||
BET- | 1 08 | |
DE1 | fX *·« Y~\ | ID |
NO: | 22 | |
BET- | 116 | |
DE2 | O \·ί | ID |
NO : | 23 | |
rj ‘C’ W | 7 p | |
.tO Λ,< X | ||
El | SEQ | d. tx |
NO: 2 | 4 | |
BET- | JL 0 |
GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTGGTGGGTAATGTCGGTCATGAGA
TAGCACATCTGGCTGCAGTTCTAG eTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT
GTAG,AAGAA)4AACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGA
GCGCGCTGCACCTGAA.AAGA
TATTATGGGAGGATTCTGCATTACGTGAAGGCC.A.AGGAGTACTG
ACACTGT
CATGAGCAGTCTGCACCTGxAlVukGI^TATTATGGGGGAATTGCTGCATA
CCTGGC.AGGCAAGGAGTACTCAGAGTGT
GATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGG.ATTCTGCATTA
GCTGAAGGCCGCTGCATACTCACACT6TGCC.TGGACGAT
CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGGATTA
CCTGAAGGGAAAGGAGTACGCTGGATGIGCCTGGACGAT
CGTCAGAGGTGAAATCCTAGCAAAGTTTGCATTCATTGCAAGA
CTTACAG
A. vad típusú és mutáns IFN-béta-géneket, VCAK-I-srígnálszekve n cl áh ·ο ζ, h i s ~ t ο 1 da 1 é kh 02 és en t e r o kinéz- h a s 1t é h e 1 y h e z £ u z i o nslva, gélen 761 bázíspár méretű, Noti/BamHl restrikciós fragmentumként tisrtitottuk, A tisztított géneket Noti/Bandii-enzime k ke 1 has í tót t, p OS W2 4 7 - ρ I a z m 1 dve k t o r fo a s z u fok 1 ö n ö s t u k, me 1 y e t vázlatosan bemutatunk a 11, ábrán. A pDSW247-plazmidvektor fehérjék humán, EBNA233-jelö vesesejtökben való, tranziens expres s zálá s ár a s zolgá ló expre s s zl.ós vektor (I n vi t. regen,
Carls'bád, GA) . Citomegalovlrésből származó korai gén promóterét és SBV szabáiyzóelemeket tartalmaz, amely nagymértékű expreszsziőhoz szükséges ebben a rendszerben, valamint szelektálható markereket S. colihoz (ampiciilinrerisztenciát) és EWA293-sejtekhex (higromdcinrezisztenciát), a 11. ábrán vázlatosan bemutatott, klónozó stratégia szerint. JA221- vagy XLl-Blue E. colisejtek transzformálására alkalmazott, ligáit piazmidokat és ampiciilinrezísztens kolóniákat kivettük, és restrikciós térképezési analízisnél teszteltük insZeitekre. Előállítottunk Mazíprep-DNS-t, és az inszertek szekvenciáját DNS--szekvenaiással igazoltuk,. A kívánt, mutagenizált szekvenciákat tartalmazó, pozitív klórokat alkalmaztuk humán EBNA293-vesese jtek. transzfektálására, a lentebb leírtak szerint.
C. Béfen-JW-ta. aXaná-ö-nnuba^tltúcíós Mufcánagk ejgpxessráXása éa mennyiségi méghafcározéaa
Humán EBNA293-sejteket f Invitrogen, Carlsbad, GA; Chittenden, Te, J. Vírol. 63, 3016-3025 (1989)] szubkontinens tenyészetként, tartottunk fent 10% magzati borjúszérómmal, 2 ód glutaminnal és 250 μο/ml genetíoinnei (Life Technológiáé, Gaithershurg, Mb) kiegészített Dulbeooo-féie módosított Eagle-féle tápközegben. A pDSW247~jelű expresszíós olazmídokat tranziensen transzfektéi tűk BSNA293-sejtekbe, lipofekcamin-eljárás (SífocoZEBE, Life Technologies) alkalmazásával. A kondicionált tápközeget elkülönítettük transzfekeié után 3-4 nappal, a sejttórmeléket ieoentrifügáltuk és meghatároztuk a his-béta-IEN-koncentrácíókat ELISA alkalmazásával , φ* * * ♦ φ
Az ELISA vizsgálati eljárást úgy végeztük, hogy poliklonális, nyálban termeltetett antitestekkel (ptotein-A-n tisztított IgG, tisztított humán béta-IFM-la ellen termeltetett antitestek.) hurkoltunk 96 mérőhelyet tartalmazó BLISA-táIcákat, és ugyanezen poliklonáils, nyúlóan termeltetett IgG kiotinilált formáját alkalmaztuk szekunder reagensként, amely lehetővé tette a? interferon detektálását sztreptavidinnei-kapcsoit, tormából származó peroxidázzal {HAB; Jackson ImmunoResaearoh, W. Grove, PA) . Bétainterferon-ia-hól készült hígítási sorosatokat alkalmaztunk standard koneestr áoió-görbék előáll! kására.. Az EBBA-trans z féktáncokból származó, his-béta-lFN-t tartalmazó, kondicionált tápközegeket meghígitottuk olyan minták előállítása céljából, amelyekben a koncentráclő '10 ng/ml és 0,3 ng/ml közötti, tar töménybán van az BL1BA vizsgálat! eljárásban. Az ELISA-val meghatározott, táp közegekben lévő héta-i?N~koncen.t rációkat western-blot analízissel igazoltuk. Redukált tenyészet-feiulúszőkat és béta1 Eh-la-standardékét SDS-PAGE-nak vetettünk alá, 10-201-os gradiens gélben (Novex, San Diego, CA),, és PbVF-membrónákra blottoltuk. ImmunreaktíV csíkokat nyálban termeltetett, poliklonáiis a.nfci-bét£t“iFh“.la“antiS'sérusröa.l (#447, Biogen, Inc., egy második antí szérumot. beta-IFN-la ellen termeltettünk) detektáltunk, ezt követően tormából származó peroxidázzal (HR.P) konjugált, szamárban termeltetett anti-nyúl-IgG-vei (Jackson Immuno Re se a r ch) ke z el t u k.
D. Séta-interferon-mutánsok t béta-interferőn-mutánsok, receotérkötő tnV *·* Φ « * * » φ Φ X φ φ
Φ X ·> φΧχ> 9 «μ..:
lajdohságait két különböző kötési vizsgálati eljárásban határoztuk meg. Az egyik vizsgálati eljárásban a béta-interferon-mutánsok kötődését mértük egy fúziós fehérjéhez, lFdAR2/lg-hez, amely a húzván 1FHAH2-receptor lánc exfraeeXluiáris dómét jót tartalmazta humán IgG konstans régiójából származó részhez fuzionálva. Az IFNAR2-Fc-t kínai hörcsög petefészkéből származó sejtekben (CHO) expresozáituk és protein-A-Sepharose aífinitáskromatográfiával, tisztítottuk a gyártó {Piarcé Chem. Co., Kockford, 15, kát.#
20334} utasításai szerint, A béta-ínterfercn-mutánsok IFHARz-Fchez valő kötődését ELISA-formájó vizsgálati eljárásban mértük. 36, lapos aljú mérőhelyet tartalmazó ELISA-táicáfcaf burkoltunk egy éjszakán át 4öC-on egérben termeltetett, antí-bumán IgGl monoklonáiis antitesttel (CHÖ5-AA9, Szögen, Inc.) 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva burkoló puffezben, amely 50 mik nátriumhidrogén-karbonátot, 0,2 magnézium-fcicridőt és 0,2 mM kaleium-.kloridot tartalmazott (pH 9,6). A tálcákat kétszer mostuk
0,05% Tween-20-at tartalmazó RBS-el, és 0,5% zsírmentes tejport tartalmazó PBS-ei blokkoltuk .1 óra hosszáig, szobahőmérsékleten. Két. további mosás után az egyes mérőhelyekbe adtunk 50 μΐ, ί μ. g/mi lEARl-Fc-t, 0,5% tejport és 0,05% Twecn-20-at tartalmazó PBS-foen, és 1 óra hosszáig szobahőmérsékleten ínkubáituk., és azután a tálcákat még kétszer mostuk. A béta-isferferon-mutánsok
IEH.AR2-Fo-hez való kötődését úgy mértük, hogy hozzáadtunk 50 μ I/1e n yés z töhe1y mn t áns béta-ί nter £e rοnt kondi cί cnált iáp kö c egbon, higítási sort készítve 10% magzati borjuszérummal kiegészitett Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközegben (DMEM), és 2 óra hosszáig Ínkubáituk lC~on. A béta-lnterferon-mutáns higiZ.Z?8/8S * ** Z tásai tipikusan körülbelül 1 μΜ-tói 10 p'M-ig terjedő tartományban voltak. Mosás után a tálcákhoz kötődött béta-interferont 50 μ 1/mérőhe.ly koktél hozzáadásával detektáltuk, amely koktél nyűiben termeltetett, polikionáiís anti“intérférőn antitestet ($447) és termából származó peroxidázzal (RR?) jelölt, szamárban nercei tezett anti-nyél-antitesttét (Oackson Immuno Research) tartalmazott, és 15 percig inkubáltuk FC-on. Két mosás után hozzáadtunk HRP-szubsztrátot, és a tálcát 40C~on inkubáltuk, majd
ELISA-tálcaleolva sóban leolvastuk a 450 j»-en mért abszorbanciát. A adatokat abszorbaneiaként ábrázoltuk a mutáns bétainterferon koncentrációjának függvényében, és a mutáns béta-interferon IFNAR2~Fc-bez való kötődésének affinitását úgy határoztuk meg, hogy az adatokat egyszerű hiperbolikus kötési egyenlethez illesztettük.. Az analízis eredményeit bemutatjuk az 1. ábrán, amelyen az egyes mutánsokhoz tartozó kötési affinitást legalább három független kísérletből határoztuk meg, és azt a Hiséa.l kapcsolt, vad típusú béta-interferon-la-ra. mért érték százax-'üm *cjt? u< V .
Sgy második receptorkötési vizsgálati eljárást alkalmaztunk a béta-i n te r feron-mutánsok mindkét recept orláncot (IFNAKl és IFNAR2, amelyek együtt alkotják a béta-ínterferon-receptort) expresszáló Dandi-sej teknez való affinitásának meghatározására. Ebben a FACS-alapú vizsgálati eljárásban 1FNAR1 ellen termeltetett, £Al2-jeiű, blokkoló monokionális antitestet (Biogen, Inc,) alkalmaztunk a nem-foglalt (szabad) receptor és béta-interferonhoz kötődött receptor megkülönböztetésére. Daudi-oejbeket (20 pl, 2,5 z 10' sejt/mi) 26 mérőhelyet tartalmazó, V-aljú BLiSAv.ru.·;:
A * A ♦ <«»* vfr*. Φ
-tálcákba helyeztünk, és 1 óráig inknbáituk 4öC~on, különböző koncentráciőj ú béta-ínterferon-mutánsokkal (20 μΐ FACS-pufferben;
5% FBS, 0,1% hah'., PűS-ben; . Béta-interferon-mutánsok kívánt hígítás i sorát 0,5 μΜ-tőí lefelé 0, 5 ρΜ-ig készítettük el. Az egyes mérőhelyekre 100 ng hiotinilált, BAÍ2~jeíű, .rágcsálóból származó anti-lFKARl .fi;onoklonália antitestet (10 pl), és a tálcákat további 2 percig inkuháltuk szobahőmérsékleten, majd kétszer mostuk FACS-pufferrel (<°C)' . Azután a sejteket 30 percig inkubáltuk 4 0 C - ο n 5 0 μ I / mé r ő he 1 y, 1:2 0 0 - h,i g i t á s ú R- F h y ο o e r y t r i η ne 1 k ο n j u g á 11 sztreptavidinnel (Jackson IsvnunoResearch), kétszer mostuk FACSpufferrel, újra feiszuszpendáltuk 300 ul, 0,5%: paraformaldehidet tartalmazó FACS-pufferben, és átvittük 12x75 mm-es polisztiroicsövekbe (Falcon 2052). A. mintákat azután áramlási eltemet™ riával, FACScan berendezésen (Becten Síokinson) analizáltuk. Az adatokat átlagos fluoreszcencia-intenzrtáaként (MFC!) ábrázoltuk, a béta-interferon-mutáns koncentrációjának függvényében; a kötési affinitásokat az antitest-festődén 50%-os gátlását előidéző, mutáns béta-interferon-koncentrációjakent határoztuk, meg. Minden egyes mutánst többször tesztel tünk. A 2. ábrán bemutatjuk az egyes béta-inferíercn-mutánsokra ezzel a módszerrel meghatározott kötési affinitásokat, melyeket a ürs.-ai kapcsolt, vad típusú béta-interferon-la-ra mért érték százalékaként fejeztünk ki.
B. Séta-ínterieron-mutánsok funkcionális aktivitásának xseghatározáca
A béta-ínterieron-mntánsokat funkcionális aktivitásra is teszteltük, in vitro vizsgálata, eljárások alkalmazásúval, ame.....
iyekben antivirális aktivitást és a béta-interferon sejtpro'P.Z'íS./SS * > ♦·» « « * 4 « « * * *'*' >S »'* « »·** * * ν· liferációt gátló képességét vizsgáltuk - As. egyes? mutánsok esetén minimum hárem ántívírális vizsgálati eljárást végeztünk, egyenként három párhuzamossal , .Referenciaként Hisp-sl kapcsolt, vad t i pn s u fe © t a - ί n te r £ e re η -1 s -1 a 1 ka 1 má z t un k m i n de n e g y e s ki s ér .1 e t ben. As antívirálís vizsgálati eljárásokat ágy végeztük, hogy ASsü-jela, humán tüdőkaroinóma-sejteket (ATCC CCL 185) kezeltünk e 9 v © j s z a k á n á r., £ e 1 eső híg í t á s i s o r fe a η, mu t á n s be t a - i n tor feronnal olyan koneentrációtartományban, amely a teljes antivirális védelemtől terjedt a vírusos sejtpusztulás ellen védelmet nem .biztosító koncentrációig. A következő napon a sejteket két napig enkefalom?okardítiss (ECMV) vírussal kezeltük olyan hígításban, amely teljes sejtpnöztplást eredményesett interferon hiányában. Azután a tálcákat MTT <2,3-felszí2~metozi~4~nitro-5-sznifo-fenii) -2h~tetrszőlium~5~karboxanilid, M5655, Sigma, St. Lonis, MO) metaboiit-festékkel előhívtuk. MTT-törssóidatot preparáltunk 5 mg/ml RSS-ben, sts.ri.lre szűrtük, és ezt az oldatot 50 μΐ sejttenyészetekbe hígítottuk (100 μΐ/tenyésztohely). Ssobahőmérsékleten 30-80 percig inkuóáituk, azután az MiT/tápkösegoldatot kidobtuk, a sejteket 100 μΐ P3S-el mostuk, és végül a o et abο1i zá1 t fes te ke t 100 pl, 0 0 % - o s i.z op r opa n o 1 fe an lévő, 1,2 h hídrogén-kloriddal szoiufeilízáituk. Életképes sejtek (a festék jelenlétével azonosítottak) számát meghatároztuk 450 nm-es abszorfeancia felhasznáiásával. Az adatokat ügy analizáltuk, hogy az abszorfeancia-értékeket a béta-interferon-mutáns koncentrációjának függvényében ábrázoltuk, és as egyes mutánsok aktivitását as a koncentráció határozta meg, amelynél a sejtek 50%-a elpusztul. A 3. ábrán bemutat, jut as egyes mutánsok aktivitását, a hsau.;.'u·· $ 9 « « » * * Ο* '» ·»·**'♦ toldalékkal ellátott, vad típusú béta-interferon-ia-sa, az egyes kísérletekben mért aktivitás százalékában kifejezve.
A b e t a ~ a n t e r £ e r ο η ~ 1 a - m u t á n s o k f a n k c i ó j á t ér t é k e 11 ü k an t i p r o liferáciős vizsgálati eljárásban Is. Humán, bauői-Burkitt-féle limfőmasej teket (ATGCáOChliS) széles siettünk 2 x 10'' sejt/ml sűrűségben., 10% definiált magzati borjószérómmal (Hycione, fogan, Ü'H) és 2 mM L-giutaminnal kiegészített RPMX-lü20-tápkÖzegben. Az egyes mérőhelyek adott koncentrációban béta-interferon-mutánst is tartalmaztak, mérőhelyenként összesen 100 μϊ végtérfogatú tápkos e gbe n; a z a lkai ma ζ o t1 hé t a - i n t e r f e r ο n k on ce n t r á c.i ót a.r t om á n y t úgy választottuk, hogy az a Daudi-sejtek proliferációjának maximális gátlásától terjedt a gátlást nem biztosító koncentrációig (azaz a maximális proliferációig). Kísérleti pontokként két párhuzamost alkalmaztunk a tesztelt béta-interferon-mntánsok. egyes koncentrációi esetén, és valamennyi kísérlet tartaimazött kezeletlen sejteket, két párhuzamosból álló készlettel. A sejteket két napig inkubáltuk 37®C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó inkubátorban, azután az egyes tenyésztőhelyekhez hozzáadtunk 50 μ! tápközegben 1 gCí/tenyésztőhely trilláit tímidint (metíl~JHtimidin, Amersham 1RK75S) , és további 4 őrá hosszáig inkubáltuk, A sejteket el.különítettük LKB „piate harvestez alkalmazásával, és a beépült trifiáit timidin mennyiségét megmértük fk'S bétatáic&ieelvasó alkalmazásával. A párhuzamos kísérleti eredményeket átlagoltuk, és meghatároztuk a standard deviációkat. Az adatokat átlagos beatésszám/pereként ábrázoltuk a béta-interferonmutáns koncentrációjának függvényében, és az egyes mutánsok aktivitását az a koncentráció határozta meg, amely szükséges a η:, a? «.na:
megfigyelt maximális növekedési gátlás 50%-éhoz. Az egyes mutánsokra több vizsgálati fo urast voicJuk. á 1. ír1 án o^m-t at ρ.κ az ru. a ofoare ,, vad típusú bétaintetieron-la-ra, az egyes kísér letekben mért aktivitás százalékában kifejezve,
F. Séfca-ínterjfeign mutánsok tulajdonságainak magfeatárolása Azt találtuk, hogy a h.is-stídin-toXdalékka.1 ellátott., vad típusú béta-interferon-la aktivitása antivlrális és antíproliferativ vizsgálati eljárásokban körülbelül 3-szor alacsonyabb volt, mint a toldalékot nem tartalmazó, vad típusú béta-interferon- la megfelelő aktivitásai. Hívei valamennyi Al-E béta-ínt e r f e r ο n - mu t án s a z on ö s h i s -1 ο 1 da 1 é k s z e k ve n e i á t t a r t a 1 ma z o tt b terminálisánál, a mutációknak a molekula tulajdonságaira kifejtett hatásait úgy határoztuk meg, hogy ezen mutánsok antivíralis, aitAU. ú wm; e kc< s v>/s<-u pi 'hu noaí em határozott aktivitásait összehasonlítottuk a his-toidaiékkal ellátó ft, vad típusú béta-intérférőn-la-fa megfigyelt aktivitással. így eljárta fai tételezzük, hogy az Al-k-mutánsok aktivitásainak variációi, a bis-toldaiékkal ellátott, vad típusú bétainterferon-ia-ra megfigyelt aktivitáshoz viszonyítva, kvaiitative és fcvantitatíve körülbelül ugyanolyan mértékűek, mint ugyané zen mutánsok hatásai lennének ll·-· termi né Ii s hls-toldalék, nélkül. Az ekvivalencia feltételezése toldalékkal ellátott vagy fúziós konstrukciókra más szoiubilis citokinek esetén is általánosan elfogadott tény alanin-szkennelő mutagenezist végző szakember számára, különösen akkor, ha a toldalékkai ellátott vagy fúziós konstrukció in vitro funkcionális aktivitása közel van a
,, *»«; A # » Λ * 3
A $ * | |||
v a d t ipus u ci t o kin aktiv11 ásához, | ahogyan | a jelen esetben | is. |
(Lásd például .Pearoe K. fí, jr. | e t a 1..., | J. Bioi. Chem. | 272, |
20595-20602 (1997) és Jones J, T, | e v, a i. ., | J. Bioi. Chem, | 273, |
11667-11674 (1993)1 .
Ás 1-4, ábrán bemutatott adatok alapján hárem hatastipust feltételesünk, amelyeket a célzott mutagenezis okozott. Ezeket a ha t ások e 1 őn vések lehetnek i n t er feron~drog ki tej les; z késében, hi 2onyos körülmények között. Ez a 'három hatástipus az alábbi: (a) á mutánsok magasabb antivirálie aktivitással rendelkeznek, mint ved típusú béta-interferon-la (például Cl-mutáns); (b) a mutánsok aktívak antivirálls és antiproliferativ vizsgálati eljárásokban egyaránt, de amelyek esetén az antiproliferatív aktivitás aránytalanul alacsonyabb az antivitális aktivitáshoz képest, vad típusú béca-inteiferon-ia-hoz viszonyítva (például Cl-, D- és dEl-mutáneok}; én (c) funkcionális sntagonisták (például Al, B2, CD2 és DBl), amelyek olyan antivírális és antiproliteretiv aktivitásokat mutatnak, amelyek aránytalanul alacsonyabbak a receptor kötéshez .képest, vad típusú béta-interferon-la-boz viszonyítva. Látható, begy bizonyos mutánsok több osztályba is tartozhatnak. Ezeket az osztályokat lentebb áttekintjük. Híg e z e ke t a me. t á n s~ o s z tá I y ο k a t a. f e 1 -s o r ο 11 pé Idá k vona t ko z ás ában jellemeztük, nyilvánvaló, hogy ezekben a régiókban létrehozott más mutációk is eredményezhetnek hasonló, sőt fokozottabb, aktivitásra kifejtett hatásokat.
a) A Cl-mutáns antivirálls aktivitása 6-szor nagyobb, mint his-toldalékkal ellátott, vad típusú fcéta-interferon-ia aktivitásé. időre jelezhető, hogy ez és más, ilyen típusú mutáns hasz*♦ W* X * X V X Λ
Χ· X- * * > *. * * « * · ♦ X * ♦ **» * X ***>»*« X ♦ nos aη alχaimazható adott mértékű entivízális aktivitás eléréséhez szükséges béta-interferon mennyiségének csökkentésére. A beadott fehérje, mennyiségének csökkentésétől azt várjuk, hogy csökken a fehérje immuncgenitása, és csökkenhetnek a neamechanizmus-aiapú toxicitásókból származó .mellékhatások is. Előre jelezhető, hogy ehhez az osztályhoz tartozó mutánsok clyan szituációkban alkalmazhatok előnyösen, -ahol a béta-interferon beadásának jótékony terápiás hatásait antívirális hatása eredményezi, és ahol antiproliferatív hatások hozzájárulnak toxicitásis w.oy- em >ív;nt ”éthatasoxhoz.
b; Az aianin-szabsztitűéi 1 mutánsok antivíralis és antiproliferatív vizsgálati eljárásban mért relatív aktivitásait (vad típus %-a) összahascniítottuk az S. ábrán. A legtöbb matáncban (azokban, amelyek a ferde vonalon fekszenek) azonos mértékben változtak az aktivitások (azaz az antívirális és antiprolíferabiv aktivitások ugyanolyan faktorral térnek el a vad típusú, his-toldalékkal ellátott béta-interferon~la aktivitásától) , Azonban számos mutáns az egyik vizsgálati eljárásban nagyobb mértékben változik, mint a másikban, vad típusú, histoidaiékkal ellátott béta-interferon-la-hoz viszonyítva, amit az mutat, hogy lekerülnek a ferde vonalról. Est a három mutánst bemutatjuk lentebb, a 3. táblázatban, A Cl-muzáns antívirális aktivitása kb. ú-szor magasabb, mint a vad típusú, his-toidaiékkal ellátott béta-interferon·--la aktivi tása, de ant iproiiferáoios vizsgálati eljárásban mutatott aktivitása hasonló a vad típuséhoz . A Cl-mutáns antiviralis aktivitása tehát 5fÚ-es faktorral nagyobb, mint antiproliferácíös aktivitása, vad típusú, hísΌ. 2?8/:.8S:
*
A » **** ♦*** toldalékkal ellátott béta-interferon-la-hoz: viszonyítva. Ehhez hasonlóan, a D-mutáns antiviráiis vizsgálati eljárásban & vad típus aktivitásának 65%~át mutatja, de anfiproliferációs vizsgálati eljárásban a vad típus aktivitásának csak 20%~át, tehát antiviráiis aktivitása 3,4-szer fokozottabb antíp.roliferatÍv aktivitásánál, vad típushoz viszonyítva. A Dal-001005 antiviráiis vizsgálati eljárásban a vad típus aktivitásának 26%-át mutatja, de antlprolíferáoiós vizsgálati eljárásban a vad típus aktivitásának csak 8,5%-át, tehát antiviráiis aktivitása 3,0-szór fokozottabb antiproiiferativ aktivitásánál, vad típushoz viszonyítva. Ha ezeket a mutáns fehérjéket kívánt mértékű antiviráiis aktivitás eléréséhez elegendő koncentraeroban adjuk be, lényegesen alacsonyabb antiprolíferativ aktivitást fognak mutatni, mint a vad típusú fehérje. Előre jelezhető, hogy ehhez az osztályhoz tartozó mutánsok olyan szituációkban alkalmazhatók előnyösen, ahol a béta-interferon beadásának jótékony terápiás hatásait antiviráiis hatása eredményezi, es ahol antipxoiiferatív hatások hozzájárulnak tοxicitásh oz vagy nem- kivant me 11 é k h atásokhοz .
3. táblásat
Mutáns | Antiviráiis aktivitás (AV) (vad típus %-a) | A n t i p r 01 i f e r a t í v a fct ί V i tás (AP) ived tipr.5 r-a) | A.V/A? |
Cl | S71 | 109 | 5,2 |
D: | 65 | 19 | 3,4 |
Jbi | fo | S, 5 | 3,0 |
ol A receptorkötés mértékéhez viszonyítva alacsony antiviráiis és antiproliferativ aktivitásokkal rendelkező mntánvz.evsvsz bz sok, his-toldaiékkal ellátott, vad típusé béta-intetteron~ia—hoz viszonyítva (lásd a 4. táblázatot, lentebb;, Az A!-mutáns 2,0szét nagyobb antivirális aktivitást és 1,3-szor magasabb antíprolíferatív aktivitást mutat, mint amit megfigyeltünk nistoldalékkal ellátott, vad típusú béta-interfercn-la-ra, de Daudi-sej teken. lévő, megfelelő receptorához 29-szer nagyobb mértékben kötődik, mint a vad típus. Tehát a mutáns kötődése, .bétaIFh—receptorhoz körülbelül 15-ször fokozottabb a fehérje antivíralis és antiproliferatív aktivitásaihoz képest. Ehhez hasonlóan, Bt···, CD2- és DSi-mutánsok kötődése is fokozottabb az ant.· ví ralis aktivitáshoz tépést 4,6-, 4, δ- illetve lA-szor nagyobb mértékben, sorrendben, és az antlprolíferatív aktivitáshoz képest 3,5-, 15- illetve 54-szer nagyobb mértékben, sorrendben, klóré látható, hogy ezek a fehérjék hasznosan, alkalmazhatok endogén. béta-IFb-aktívitás és valószínűleg más endogén, I. típusé interferon funkcionális antágon. istálként, mivel képesek kötődni és lefogiaini. a receptort, továbbá vad típusú béta-ÍFK esetén látható funkcionális aktivitásnak csak kis részét generáljak a célsejtekben.
Mutáns | AV aktivitás !% vb) | AP aktivitás (ί wt) | Sej tkötő aktivitás (1 bt) | Kötés/ AV | Kötés/ AP |
Al | 200 | 180 | 2900 | 1.5 | 16 |
.32 | b 1 | 9,2 | : .33 | 4, 6 | 3,5 |
CD2 | 150 | 4 6 | 090 | 4 .< 6: | lo: |
ŐSI | 26 | 3,5 | 400 | 59 |
irfíiuss & 7 * * * V Κ « « y « « r v φ * χ φ χ * « ♦ χ * * « X »« Φ X ν * <- y φ «Φ « φ
δ. hú telnek és as íatarferon háromdimenziós struktúrájának
Míg rágcsálóból származó béta-interferon nem-glíközi iáit fórmájának ΓΤ. Sanda eb al., 3. Mól. Bioi. 253, 187--207 <1995)1 és humán alf.a-interferon-2b ( R. Radbakríshnan et al., Structnre 4, 1453-1453 (1998)1 közölt kristályszerkezete modellt biztositett humán béta···Interferon poiipeptid-vázára, a közelmúltban kiderítettük bé ta-in be ráeron-la glikozílált állapotában lévő .szerkezetét ( M. Karpusas et al., Proc. Fafi. Acad. Sci. FSA IM, 118131181« (1997)1 .
Mutációs analíziseink eredményeit összegezni lehet a bétainterferon-iá háromdimenziós szerkezetének (itt nem mutatjuk be) vonatközásábán. Bizonyos mutációk az aktivitás csökkenését okozták (2-szerestol >5~ssörös csökkenést). A mutációkat tartalmazó régiók megfeleltek az 1. és 2. táblázatban megadott szubsztitúcióknak. Antivirális és antiproliferációs aktivitáshoz fontos csoportokéi·, lokalizáltunk a béta TFF-i a-molekula alsó relében (a- ás b-panel) , A molekula felső felében, alvói az amino- és karboxi-termánális van, a mutációknak nem volt hatása a biológiai. aktivitásra és a recept örköt és re..
Az á2-hélixben, ÁB-, AB 2-hurokban és S-hélixben lévő mutációknak a lógsz igeitikánsabbak az aktivitásban és a tej tfelsziní receptorkötésben egyaránt. Ex a régió (A2-hélix, A3-, AS2-hurok és F-hélix) megfelel az 1FFAR2-kötőhelynek, mivel ezen mutánsok közül egyik sem köt fFFAR/Fo-t vizsgalati el járásunkban.
Míg az IFb'AFŰ-kötéshez fontos mutációk a sejtkötésre is hatással voltak, a sejtfelszin-kötési tulajdonSágokat befolyásolni lehet a molekula más régióiban lévő (Bl-hélix, C2-hélia) asinosavakkal is. Az alanin-szubsztitűeiös mutánsok hatásait, bemutató, háromdimenziós modellekben (itt nem mutatjuk be) látható., hogy a héta-lFh-la-molekuia H-terminális, C-térmínáiís és glikozilált C~ héltx-régiója nem esik a receptorköfeő-helyre. Ezekben a régiókban a mutációk nem csökkentőnek biológiai aktivitást illetve nem csökken t i k a sejt fals zi. n i re cepcor kote s mé 11ékét.
Kongugált béta-ínterferon-la előállítása és jellemzése
A. Peöiiáifc Interferon előáll itass hem-klszerelt, nagy mennyiségben (búik''', AVQNSXé) néven) árult béta-interferőn-la~intermediert (250 ug/ml 100 mM. nátriumfoszfátot és 200 mM NaCl-t tartalmazó, pH 7,2 puffezben) meghigifcottunk azonos térfogató 100 mM MES pH 5,0 pufferrel, és a pH-t 5,0-re állítottuk HCl-ei. A mintát felvittük SP-Sepharose® FF™ -oszlopra < Pharmacia, Piscatavay, HJ) , 6 mg béta-interferonla/mi gy&snta mennyiségben. Az oszlopot 5 mM nátrium-foszfátot és 75 mM HaCI-t tartalmazó pufferrel (pH 5,5) mostuk, és a terméket 50 mM nátrium-foszfátot és 605 mM MaCi-t tartalmazó pufferrel (pH 0,0) elülitek. Az eluált frakciókat 280 nm-en mért abszorbanoiára analizáltuk, és a mintákban lévő interferon-koncentr áci óka t síégfoecsó 1 tűk az afos ζor ba η oi ábé X ? ex t inkο Ϊ ős együ 11ha t.őként 1,51-et vettünk 1 mg/ml-es oldatra.
Az SP-eiuátumfoói szárma zö, 1 mg/mi foéta-ínterfer őn-la-oldathoz hozzáadtunk 0,5 M nátrium-foszfátot. (pH 6,0) 50 mM végkoncent rációig·, nátrlum-eianoborohiőridet (Aldricb, Milwaukee, WI) 5 rluc és 20K méretű PEG-aldehidet (Oheareater Poiymers,
Huntsvi .1 le, AL) 5 mg/mi-ig. A mintát szobahőmérsékleten ínkubáltuk 20 óra hosszáig, A pegiláit interferont egymás után végzett kromatográfiás lépésekkel tisztítottuk, a reakció termékek közül, SuperoseHó FPI.C méret szerint elválasztó oszlopon (Pharmacia) , mozgó fázisként 5 mM nátrinm-foszfátot és ISO mM NaCit tartalmazó puf fért (pH 5,5) alkalmazva, és SP-SepharoseiOEF-en, A méret szerinti elválasztás eredményeként alapvonalig elválasztó ttok a. módosított és a módosítatlan béta-interferont (a kromatogrammoksi itt nem matatjuk be) . A gélszűrésből származó, PEG-béta-interferont tartalmazó, egyesített eiuátumot 1:1arányhan hígítottuk vízzel, és felvittük SP-Sepharoseíá-oszIopra 2 mg béta-interferon/mi gyanta mennyiségben. Az oszlopot 5 mM nátrium-foszfátot és 75 md NáCi-t tartalmazó pufferrei (pü 5,5) mostuk, és a pegiláit béta-interferont 5 mM nátrium-foszfátot és 800 rnM NaGl-t tartalmazó pufferrei (pH 5,5) elváltuk. Az elu&lf frakciókat fehérjetartalomra analizáltuk 280 nm-en mért abszorbanoia felhasználásával. A pegiláit interferon·4· koncentrációt interferon-ekvivaíensekben ábrázoljuk, mivel a PEG-rész nem járult hozzá a 280 nnr-en mért abszorbaseiához.
3, FEGiláif interferon biokémiai jsliamoésa
A mintákat EDS-PAGS alkalmazásával vizsgáltuk a módosítás mértékére (a gélt itt nem mutatjuk, be) nézve. Egyetlen PEG hozzáadása 20 kma-ről 55 k.Ds-ra tolja el az interferon látszólagos tömegét, amely könnyen észlelhető ebben az analízisben, A pegiláit mintában nem láttunk módosítatlan béta-interferon-La-1, nem nagyobb mo1ekuiatömegű formákat, amelyet további EEG-osnportok jelenléte eredményezhet. Egyetlen PEG ura» jeleni é t é t MALD1*** * & & * * « *
Ό 'd * » x * * * X * χ ♦ * Φ «Χ-Χ χ X fc öwg s pe k t r ome t r 1 áva 1 i g a s ο 11 u k. A pe g I 1 á l á s i r e a ke i ő spe c 1 f i ~ fását peptid-térképezéssol elemeztük. 20 pg alíkvot pepiiéit és kontrollként mödositatlan béta-lnterferon-la-fc, 240 pl, 200 mM ?ris-RCl~f, .1 raM EDTA-t tar tel mázó.· pufferben (pH. 9,0} emésztettünk 1,5 pg Achromobacterbbl származó iizll-endQpr-QteináxzsI píako Bíoprodncts, Richmond, VA), 3-4 óra hosszáig, 27eC-on. Az egyes mintákhoz hozzáadtunk 200 mg gnanidin-HCl-f, és a hasítási termékeket Vydac Cj-oszlopon 10,46 X 2 5 cm.) frakciónál tűk, 30 perces, 0,1% TFA-fean 0-70% acetonitril-gradiens, 1,4 ml/perc áramlási sebesség alkalmazásával.. Az oszlopról lefolyó anyagot
214 nm-es abszorbanoiára teszteltük.
Az analízis eredményeit bemutatjuk a 6. ábrán. A bétainterferon- la endoproteináz-Lvs-C-emésztéséböl előre várható valamennyi pepiidet azonosítót luk N-tarmínális szekvenáiással és tömegspektrométriávai, és ezek közül csak az Interferon N~ terminálisát tartalmazó peptid (&?«} volt módosítva, amit az bizonyított, hogy eltűnt a térképről< A térképezési adatok tehát azt mutatják, hogy a fSö-rész spécifikusan kapcsolódott ehhez a peptídhez. Az adatok továbbá azt mutatjak, hogy a PSG-médosí t.ás a fehérje h-terminállsét célozta, mivel csak az N-terminális módosítás eredményezhet1 a peptid specifikus eltűnését.
Ezt a következtetést továbbá alátámasztjak azok a tapasztalatok is, amelyekhez az endoproteináz Lys-Ü-emésztésböi származó, FEGilált ö-terminális peptid izolálásával jutottunk ügy, hogy a peptidet tovább emésztettük brómcránnsl (GNBr), és a mintát mátrix-támogatott lézsr-deszorpciós ionizációs, energiaforrás után késleltetett (azaz „matrix-assisteö leset desozption ionisation
A.ió/se
pest source decay'', azaz MAEDI PSD) szekveneíaanaiixísmek vetettük alá. A örömeiános emésztés sz N-termináiis peptídet tovább hasította két fragmentumra, a REG-részt tartalmazó, terminális metigninra (Ml) és SYMLLGFLQR-re (az érett béta-interferoaszekvenciában a 2-11. amínoeavak). Á szekvenciánálízzsben azonosítottuk a módosítatlan SfELLGELöR-peptidét, amely várhatóan megfelelt ezen eljárás eredményének.
A. béta-interferon-la-»inták antivirális aktivitását humán t üdö k a r c i n óm a -se j t e ke n. (AS 4 9 - se j t e ke n) be e z t e 11 ü k , eme 1 y e k e t enkefaiomiokardiiísz (EMC) vírus hatásának tettünk ki, a fentebb leírt MTT-festésf tartalmazó eljárások alkalmazásával. Röviden összefoglalva, A.549-sej tokét 24 óra hosszáig előkezel tünk bétainferférőn-la-vei vagy RBG-modosírott beta-interferon-la-val (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5,- 31,25, 50, 33,3, 22,2, 14,8, 9,5, 6,6, 4,39 pg/mi} a vírussal való fertőzés előtt. A vizsgálati eljárást minden egyes béta-interferon-la~ -koncentráciöpontnál két párhuzamossal végeztek. A standard devláolókat, hihajélként feltüntetjük a. 7. ábrán.. Az a béta-í.nterferon-la-koncentrácíö (formázott vagy nagy mennyiségű), amely 50%-os v.rruspus ztuias t eredményez (,,50%-os cítopatikus hatás) (50% maximum 00^}, körülbelül IX pg/mi volt, és a PSS-modositott béta-interíeron-la-ra az 58%-os cítopatikus tatás körülbelül 1.1 pg/mi veit. Tehát a REG-konjugálás nem változtatta meg a bétainterferon-la antivirális aktivitását. Ebben a vizsgálati eljárásban rutinszerűen azt találtuk, hogy a oeta-interferon-Xa specifikus aktivitása körülbelül 10-szer nagyobb, mint a bétaznterferon-ib specifikus aktivitása, és igy tehát a FEGilálf bé-
ta-interferőn-la szignifikánsan aktívabb, mint bármelyik bétainterferon-ló-termék.
A béta-interferon-la-t 5K mérető PEG-aldehiddel is PEGilaitűk, melyet a Pinka, Inc. (Rat.sz. 75936, Ponkonkorna, Báj cégtől szereztünk be, ugyanolyan eljárást követve, melyet a 2ÖK méretű PEG-aldehiddei való módosításra leírtunk, kivéve art, hogy a reakcióelegy 2 mg/m.1 5K méretű PEG-et tartalmazott. Az 5K méretű PSG-e'i való módosítás szintén nagymértékben specifikus az Ntermináiisra, és nem változtatta meg a beta-interferon~la antivirálís aktivitását. A PGk-adóuktumhoz hasonlóan, az SK PBG-et tartalmazó béta-interferon-la az antiviráiis vizsgálati eljárásban nem volt megkülönböztethető a módosítatlan béta-interferon-la-tói,
A PEGilálés a béta-infcarferdn-Ia-t siressk-Indukálfc
Béta-interferon, aggregáciőja karos hatással van az aktivitásra. korábban már kimutatták, hogy a giiközilálás drámai hatással van a béta-interferon-la stabilitására, a béta-interferon nemgiikozilál.t formáival szemben, és arra a következtetésre jutottak, hegy a glikoziláiás hozzájárul a béta-interferon-la magasabb specifikus aktivitásához i Púnkéi, k. et al., Pharm. Rés. 15, 641-6493 . Annak vizsgálata céljából, hogy pollaiklléngiikol-poiimerrel való konjugálás tovább stabilizálhatja-e a béta-interferont, PEGilált béta-interferon-la-t hőstresssnek. vetettünk alá az alábbiak szerint:
Hóóenaturáiás t CÁRI 3 UV-Ίátható spektrofötömé tér alkaimazá7 som
A Φ «* >» ΑΦ ΦνφΑ
Φ > Φ Λ Α Φ' Λ
Φ Φ * Λ
Φ X Φ Α *Λ Φ « φ Α φ ν >Φ«φ *
ΦΦ s áy a 1 νé ge z t ü n k, ame I yhe z 3 z ám 1tögéρp e 1 s z a bá 1 y z ο t t, t e rmo e 1 e kt romosán melegített követfcatartö volt illesztve, Béta-interferon-1«-oldatoké t 20 mM HEEES, 20 rab NaCi, pH 7,5 puff őrben efcvilibráitunk 25°C-on, 1 ml-es küvettában. Azután a küvettatártó hőmérsékletét zS°G~ről S0’3C~ra emeltük, 2öC/pero sebességgel, és a fehérje denaturácíőját a 230 nm-en mért abszorbanola folyamat ö s reg 2 í t e s é ve 1 k ö v e t.1 ti k. A ko ο p e r a t 1 v k ο n f o r m á c 1 ό v e s s t é s s e 1 járó folyamat középpontját (Tmj az olvadási, görbékből úgy kaptuk, hogy meghatároztuk azt a hőmérsékletet, ahol a mért abszorbancia pontosan azon két érték között volt, amelyeket a kooperatív konformációvesztéssel járó folyamat két szélső állapotának megfelelő oldalakon, a lineáris szakaszokból extrápolált vonalak meghatároztak.
Az analízissel kapott eredményeket bemutatjuk a 8. ábrán. Míg a nem-PEGiláit béza-interferοπ-la 50%-ban deneturálódott és aggregálödott 60*G-os átmeneti pontnál, nem tapasztaltunk aggregáiődást BEéiiáit interferon esetén, még S0fcC-náI sem. égy fugge11 en ana.1 i 2í sóén a hőst re s s 2- ké zelé st k 1 te rj esz t e t1. o k 9 5° C ~ra, sőt, még magasabb .hőmérsékletre, de igy sem tapasztaltunk aggregálődást.. Tehát, poláatilén-giikol-polimerrei történő ilyen konjugálásnak alapvető és jótékony hatása van a fehérje stabilitására. Hasonló mértékű stabilizálást tapasztaltunk 20K és 5K méretű PEG-et tartalmazó, módosított béta-interférőn-la esetén.
Béta-interferon-la antivirálís aktivitásának mérése béta-interferon-ia-val ér PE-Srléit interferon-béte-la-vel kazalt egerekből származó plazmában
* ?
Egereket (CS7B1/6) ζ.ν. injektálunk farki vénájukon keresztül 50.00 0 egység bét a-interferon-la-va3. vagy 50.000 egység, 20K méretű EEG-et tartalmazö, FEGi .iáit béta-interferőn-iá-val, vagy kontroliként egyező térfogatú foszfát-pofferrei. Vért veszünk az egerekből retrcorbitáiis (szemüreg mögötti) véreztetéssel, az injektálás után különböző, időpontokban (közvetlenül utána, 0,25, 1, 4, 24 és 98 órával utána) . Legalább 3 egeret véreztetühk az egyes időpontokban. Telje;.' vért gyűjtünk antikoaguiánst tartalmazó csövekbe, a sejteket el távol ltjuk és az eredményül kapott plazmát lefagyasztjuk a vizsgálati eljárás idejéig. Ezeket a piasmaminfákat azután antivirális vizsgálati eljárásokban teszteljük,
A plazmamintákat 1:10 arányban hígítjuk szérummentes tápközegben, és átnyomtuk fecskendőhöz csatlakoztatott, 0,2 pm-es szűrön. A hígított mintákat antivirális vizsgálati eljárásokban teszteljük. A mintákat A549-sejteket tartalmazö, 06 helyet tartalmazó szövettenyésztö tálcák kijelölt helyeibe titráljuk. Béta-interferon-la-bói standard hígításokat (lő, 6,7, 4,4, 2,9 1,3, 0,9 és 0,6 U/mJ.) és négy plazmamintát vizsgálunk minden tálcán. Fz A599~sejtekét 2 4 óra <. ' i <- *Ίγ plazmaminfákkal. EMC-virassai való fertőzés előtt, A vírussal két napig inkubálunk, az életképes sejteket megfestetjük MT'T-aláatfal (5 mg/ml foszfát-puffőrben) 1 óra hosszáig, foszfát-pufféttel mossuk, és izopropanolban lévő, 1,2 M H'Cl-el szolubiiizáijuk. A tálcákat 450 nm-en leolvassuk. Felveszünk standard görbéket az egyes tálcákra, és az egyes tesztelendő mintákban lévő b é t a-1n t e r fe rοn-1a-a kt i vi t á sme nny1s ég m eghatározásara alkalmazzak azokat, A különböző egerekből származó mintákban lévő,
*· ζ egyes íoopontokhoz tartozó aktivitásokat a 9. ábrán bemutatjuk.
A üEGiláit béta-interferon-la lassabban távozik a keringésből, ami azf mutatja, hogy a EEGiáéit minták fél-életideje sokkal hosszabb, mint a kezeletlen béta-interferon-la kontrol lé. Mig a kontroll nagyjából 1 őrs múlva kiürül, a EEGiiáit teríték jelentős részét detektáltak 43 óra elteltével, á szérumban az aktivitás kezdeti mennyiségére és a 48 óra elteltével maradt aktivitás alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a PEGilált interferon fél-életideje meghosszabbodott, a módositatlan béta-interferon-la fél-életidejéhez viszonyítva. Ebből a .kísérletből származó, másik nagyon jelentős eredmény az, hogy nagyon kevés PEGilált. forma veszett, el. az eloszlási fázisban, amit az. bizonyított, hogy hasonlóan magas aktivitás volt a G. és a 60. perc után is. Ez az adat azt mutatja, hogy a kontroli bétainterferon-la- tői eltérően, a EEGiiáit termék eloszlása nagymértékben az érrendszerre korlátozódott.
Összehasonlító fámakoMnebika és fasnsakoőínámla főemlősökben (általános eljárások)
0s s z ehas οn Ütő kísérleteket végzünk tollmer-béta-ϊnte rfe rοnla-kenlugátumokkai és natív béta-ínterferon-1a-val (nem formázott, nagy mennyiségű béta-interferőn-ia-intermodrer nátrium-foszfátot és haCi-t tart.aima.zb puf ferben, pH 7,2) főemlősökben való relatív stabilitásuk és aktivitásuk meghat arozasa óét jóból. Ezekben a ki bérletekben pol imer-bé ta-intérf erőn-1 a-kon lupa tumok farmakokinetikaját és farmakodinámiáját összehasonlítjuk a natív béta-interferon-la ugyanilyen tulajdonságaival., és el fogadható ;Z . ZSV3K ** ♦
X * <
„h. i „t következtetések kiterjeszthetők emberekre % tfy jwt »* 7 ,£*». Λ«\«λ· «5?xSvJU .>&<££ Ϊ* x4x«FW <ü£:;£, V $S>:.4& $£«£> <SS?
A kísérletben párhuzamos csoportokat és ismételt dózist alkalmazunk, kenj agáit és nem-kon 3 agáit béta-inter férőn-la össsehasonIrtó fsrmakokinetítájának és farmakodínámiájának elemzésére.
Egészséges főemlősöket {előnyösen nhssns~ma.jm.okat) a1kaIma^rk a k'.·><> - .ten. A dózisok beadása előtt a laboratórium állatorvosa az összes állatot megvizsgál ja 14 napon belül két alkalommal a teszt-termék beadása előtt betegség/egészség tüneteire; egy vizsgálatot 24 órával az a teszt-termék első beadása előtt kell végezni. Csak egészséges állatok kapják ezt a tesztterméket, A kiértékelés általános orvosi vizsgálatot és a dózis beadása előtti vérvételt foglal magában a klinikai patológia alapszintjének és béta-interferon-ia-ra specifikus antitestek alapszint jenek meghatározáséi céljából. Valamennyi, állatot lemérünk. es feljegyezzük, a testhőmérsékleteket a teszt-termék beadása előtt 24 órán belül.
Tizenkét alanyt veszünk be abba a csoportba, amely I mb/kg béta-in tér férőn-la-1 kap PSG-béfa-ioterferőn-la-kon j a gá fűmként vagy nem-konjógáit állapotban, de egyébként azonos béfa-intetfercn-la-mennyiséget. A beadás szubkután (SC) vagy intravénása·· (IV) történhet. Valamennyi állat naiv béta-interferon kezelésre. Az egyes állatok két alkalommal kapnak dózist; a dózisok beadása között négy hét van. A dózisok térfogata 1,0 ml/kg.
Farmakokinetikar teszteléshez különböző időpontokban vért veszünk az injekciót követően. Vérmintákat vessünk interferon-in
dukált biológia.·, vál aszmarker, szár uti-neop térin mérésére is a kísérleti drog beadását követően.
A kísérlet ideje alatt a kiértékeléshez klinikai megfigyeléseket. végzünk 30 perccel és 1 órával a tonícitás jeleinek kialakulása után. hapenta megfigyeléseket végzünk a tartás helyén, és feljegyezzük a viselkedésbeli változásokat. Követjük a testtömegeket és a testhőmérsékleteket, a dózis beadás követő 21 napon át, szabályos időközönként„
A béta-interferon szérumban lévő mennyiségét citopatikus ha* tást vizsgáló (CEE), biológiai vizsgálati eljárással mérjük. A. CPE vizsgálati eljárásban az ínterferon-mediált antiviráiis aktivitást mérjük„ A mintában lévő antiviráiis aktivitás mértéke utal a minta által tartalmazott, aktív interferon-molekulák számára a vérvétel idején. Ezt a megközelítést alkalmazzuk standard mődszerként a béta~interferőn farmakokinetÍrójának meghatározására. A jelen kísérletben végzett CPE-eljáfásban azt vizsgáljuk, hogy az '.inzerterőn milyen mértékben képes humán tüdőkarci.nőmasej tokét (AM9, áCüh-ISö, ATCC, Eockvíile, MD) megvédeni ankét aiomíokardit i.sz~ (EMC) vírus által okozott citotozioitástöi. A. sejteket 15-20 óra hosszáig előínkubáijuk szérummintákkal, hogy lehetővé tegyük az interferon-indukáit, antiviráiis választ biztpsitó fehérjék Indukcióját és szintézisét. Ezután hozzáadunk EdC-virest, és további 30 óra hosszáig inkábóljuk, majd meghatározzuk a eitotoxioitást kristályiboiya-festéssel.
Egyidejűleg béta-interferon belső standardét valamint EEG-knnjogait. standardét tesztelünk a mintákkal, minden egyes vizsgálati ,ρ.
il * ♦s tálcán. Ezt ci standardét természetes, humán, fíbroblaszzbói származó interferon rsferancia-standarddel (WHO Secomd Inter.....
nationa! Standard fér Interferon, Humán Fibroblast, Gb-23-90233; szemben kalibráltuk. Az egyes vizsgálati tálcák sejtpóvekedesi kontroll mérőhelyeket is tartalmaznak, amelyekbe sem béta-interferont, sem EMC-t nem adunk, és virus-köntreli mérőhelyek sejteket és EMC-t tartalmaznak, de béta-interferont ízem. Olyan kontroli tálcákat is készítünk, amelyek standardét és mintákat, tartalmaznak, a minták sejtnövekedésre kifejtett hatásának (ha van) meghatározása céljából. Ezeket a tálcákat vírus hozzáadása nélkül festettük meg.
A mintákat és a standardeket két párhuzamossal teszteljük minden egyes tálcán, továbbá, két párhuzamos tálcát is Összeállítunk, így mintánként négy ponthoz jutunk. A négy párhuzamos mértani kösépérfékét mutatjuk be. A detekcios limit ebben a vizsgálati eljárásban 10 egység/ml (0/ml).
Neopterin szérumban mert koncentrációit a klinikai farmakológia! részlegben határozzuk meg, kereskebelemben rendelkezésre allé vizsgálati eljárások alkalmazásával.
Furmakokrnefiai és statisztikai módszerek
EstripTM-szóitvert (MioroMath, Inc., Halt Laké City, UT) alkalmazunk az adatok illesztésére a farmakokinetikai modellekhez.
A mér tani középárfék-konCent rációkat a z idő függvényében ábrázoljuk az egyes csoportokban. Givel a vizsgálati eljárás eredményei hígításban vannak kifejezve, a mértani középértékeket megfelelőbbnek találjuk, mint a számtani, középértékeket. A szérumban léve interferon-mennyiségeket az alapszint értékéhez igazit78/ss;
X «
juk, és a szérumban nem-detsktálható kcnoentrációt 5 U/ml-re, amely megfelel az alsó detekoios' limit felének.
A:.; IV-infúziós adatokat tekintve, két kompért mentes IV- in fúziós modellt illesztünk a szérumban. '-eto koncentrációkhoz az egyes alanyok esetés, és az SC-adatokat két kompartmentes rn-jekcíós módéi Ihez illesztjük.
Kiszámítjuk az alábbi farmakokinetikar paramétereket:
(i) megfigyelt legmagasabb koncentráció, Ck.;X (U/mi);
(ii) görbe alatti terület 0-58 óra között, AüC, trapézszabály alkalma z ásáva1;
(iái) elimináció fél-életidege; és az IV-infúriós adatokból (ha IV-t alkalmazunk):
(Ó.v) eloszlás fél-életideje (óra) ;
(v) kiürülés (ml/öra);
(vi) az eloszlás látszólagos térfogata, Vd (liter) . tünkön!in-szófivért (Scientific Consulting Inc., Apex, NC) alkalmazunk az elimináció fél-életidejének számítására SC~ és T.M-inj akció után .
deopterin esetén a számtani középértékeket mutatjuk az egyes csoportokra, az idő függvényében. Kiszámítjuk az alapvonaltól, számított maximális változást (E,.:,,.ö - C,.^, AUC és E....x... értekeket egytényezős varianoia-anaíízisnek vetjük alá a dózist kapott csoportok összehasonlítása céljából. és AUC értékeket az analízis előtt logaritmikusán transzformáljuk; a mértani középenrékeket ábrázoljuk.
«ί *« «*« « Φ0Χ* «··*·> 0 *
PBGilált béta-interferon-la ée béta-infcarferon~la farmakokinetikájának összehasonlító elemzése Rhnsus-majmokban
Anyagok és modsserek
Be é d t un k. hé t a - i n t e r £e r eη -1 a -1 va g y DKG i .1 á 11 b é t a - XFK - X a -1 rhesns-malmoknak az 1. napon, és újra a 2ü. napon, intravénásán (XV) vagy szubkután (SÜ), az 5. példában leírt általános eljárás szerint. Az 1, napon hat majom kapott béta-IEb-Xa-t (3-3 'foeadáéi módónként) és másik hat majom kapott EEG!Iáit béta-XFN-la-t (3-3 beadási módonkénti . A 29. napon a dózisokat megismételtük. .Az IV-dözist lassan felszabaduló bólnsz-inj ékeidként adtok be a fejvivőérbe vagy a „véna saphena-ba.
A SC-dózist a háton, bőr alá adtuk, mintán ieborotvártuk a.
injektálási helyet. Vért vettünk, a combcsont A. vénából megbatározott időpontokban, és hagytuk azt megái, vadno. szérum előállítása céljából. A szérumot funkcionális droganyagok mennyiségeire t e s z tel t u k va A. i dá 11 a n t í vi r á 11 s C Ρ E - e I j á rá s a I ka 1 ma z á s á v a 1, v a 1 a m ί n t s z é r um - n e op t e r i n re é s bé t a - 2 -m i k r o g 1 ofou 1 A. n - mén n y 1 s é g e k r e, az aktivitás farmakodinamiás paramétereiként. A farmakológiái paramétereket WinNonlín-szoftver (2.0-verzió) alkaImazásával számiróttok (Serestiíic Consulting Inc., Apex, NC).
A koncentráció-adatokat standa.ro, modelltől független módszen l·'·'1 r <n \ cg n'nnu . r .1 i. >>>' ' í ' ; a u\. ‘ u ~ tékái paraméterek meghatározása céljából. A görbe alatti területet (AGG) trapézszabály alkalmazásával számítottak. A statisztikai analizlseket, beleértve számtani kőzépértéket és standard deviációt, Mi crosof t Excel szoftver a A. ka A mazásával (5 . η-ver z : c) 7z. z?aaé *♦ ΦΦ φ Φ X végeztük (Microsoft Corp., Hedmont, VA> . A mérési határ alá (BLQ) eső koncentráció-értékeket nem vettük figyelembe a farmakokínefc fkai analízisben. Amiatt., hogy különböző számítógépek és számítógépes programok különféleképpen kerekítik és rövidítik a számokat, néhány táblázatban as értékek (például átlagok, standard deviációk vagy egyedi értékek) kissé eltérhetnek más táblázatokban feltüntetett értékektől, egyedileg számított adatoktól vagy a statisztikai analízis adataitól. Sem az adatok integritását, sem azok interpretálását nem befolyásolták ezek a különbségek.
Eredmények és dtsxiwzió
Mindkét beadási módszerrel a pegilált béta-IFN-ia biológiai bo zzá férbetőségé nagyobb vol fc (a szérum-koncentráció/idő-gö rbe arait' fen Ή<η( οΉ. a D-^ddl ’Ή nh , c ovoOta magasabb abszolút biológiai hozzáférhetőséggel rendelkezett, mint a béta-dbh-la, na SC módon adtok be. A farmakokinetíkai paramétereket az ö, táblázatban összegezzük, Pegilált béta-lFN-la IV és SC beadás esetén egyaránt a héta-IFd~ía fél-életidejének valamint Ade-értékének növekedését eredményezte.
*:* *« >
XXΦ « φφ XX φ » ♦Φ* φ
5, tábládat
BG9418 tárnokok! ne ti kai paraméterei 1 Mü/.k.g b-IFN-la vagy pegilált b-lFF-la Ar-esus-majmoknak való 17-vagy SC-beadását (1. d 6 z i s) k c v e t ő e n
Fo rma (beadás módja.) | bü-as | T OVkX | AFC tóóra/ml | Cl, (mL/kg) | V S 3 (mL/kg) | Ve |
3-iFF-la | 64 00 | 0,083 | 4453 | 229 | 543 | 3,2 |
(IV) | ( + 0) | HÓ) | (+799) | (+38) | (+147) | (+1,4) |
Peg i1 álfc | 1.0800 | 0, 083 | 34373 | 29 | 250 | 9, 5 |
3- 1 FF-.1 a (XV) | (+33111 | (±0) | (±3601) | uívl) | ±30; | (+2, 1) |
3-1FF~la (SCI | 277 ( + 75) | 5, 3 ( + 1,2) | 4 7.53 (43170) | f/a | F/'A | 1.0, 0 (+2,9) |
Pégi iái fc. 3-iFF-la (SC) | 1080 (±301) | 3, 3 (+1,2) | 4 z 4 8 J (45934; | F/'A | F/A | 22,0 (±3,4) |
á’n - 3
Az elsp dózis 17-foeadásat követően, a béta-IFF-la- és pegilált béta-lFF-ia-koncentrációk (Cmax) szérumban mért átlagának ( + std. dev,) csúcsa 8400 (+0) illetve '108-00 (+0) ö/ml volt, sorrendben. Az AUC-értékek átlaga 44 53 (+7 99) illetve 34373 (+3-801) (böra/mi volt, sorrendben. Az első SC-beadását követően, a béta-): FF'~1 a-rs és pegilált béta-1FF-Ca-ra vonatkozó Cmsx átlaga ( + std, dev.) 277 ±75) illetve 1080 (+38.1) 0/mi vett, sorrendben. Az AUC-értékek átlaga 4753 (+3.170) illetve 44 952 (Ó14 4 3} rj* ó r a / ro 1 vo 1 fc, s o r r e n db e n,
A szérumban mért neoprerin és béta-2-zó. kroglobuixn-meomyí ~ ségei egyaránt, megemelkedtek béta-lFF- és pegilált béts-lFF-kezeiés után, ami a termékek tarmakoiógíai aktivitását mutatja. Hagy dózisban, alkalmazva a teszt vegyüle tek.et, nem volt különbség óeta-lFF-la es pegilált béza-.IFF-la farmakológiai aktivitása ko~
,. zza/ss
Λ > « * >
:* ♦ ;tt, egyik beadási mód eseten sem (az adatokat sem mutatjuk be)
PSGrlált béta-interferon-la és béte-Interferoe-la farmakokinatikijának összehasonlító elemzése
A kísérlet célja béta-infcerfeton-la és pegilált béta-interf ere n-la fo i o1ég i a i ho 2 2áfé rhet öségén e k os s 2eha s οn1í t3 s a, néha ny beadási módot alkalmazva.
Anyagok és módszerek dóstény, i,eeis”f éle patkányokat (köruibelül 190 g tömeguek) á. 1 k a 1 ma 21 u n k fa r ma ke ki ne t i ka i anai í z .1 s e k r e, am e lyb e n. ké t ~ ké t patkányt alkalmaztunk beadási módonként és formánként. & patkány torkolati (véna jugularis) vénájába csövet szúrtunk, és beadtunk humán béta-interferon-la-t vagy 3K méretű PSG-ei pegilált, humán béta-interferon-la-t vagy 20K méretű PEG-el pegilált, humán béta -in te r;f erőn -la- t (vivöanyűgként 14 mg/mi HAS-val kiegészített, 50 rnM nátrium-foszfátot és 100 mM daCl-t tartalmazó, pH 7,2 puffért alkalmaztunk) intravénásán, íntraperitoneálísan, orálisan, szufokután vagy intratraeheáíisanVért néhányszor feldolgoztunk 72 órás időtartam alatt, 0., 5., 15., 30., 75. percben, 3., 24., 48. és 72. órában, áz eljárást bemutatjuk a 6. táblázatban. Citopatikus hatást (CPS) biológiai vizsgálati eljárás alkalma zásával mértük a szérummíszákon, béta-interferon szérumban való detektálása céljából.. A módositatla·· béta-interferon-la-val és 207 méretű PEG-el pegilált, humán béta-inter férőn-lá-vál kapott eredményeket bemutatjuk a 7. táblázatban. A pegilálás valamennyi esetoen szrgnifrkáns növekedést eredményezekt tb-fosn és AUC-foan.
®As * * «« «Φ χ♦ «»
20K POG-el pepi Iáit hIFN~p;. | PBGiiáiatlan 5ΙΓΝ-β;; | |
Intravénás | 0,5,15,30,J5 ρere, | 0,5, 15, 30,7 5 p c r c, |
3,24,48,72 óra | 3,5 óra | |
I ΐϊ fc r a p e r i fc ο n e a i i s | 0,5,15,30,75 perc, | 0,5 fI5, 3 0,7 5 per c, |
3,24,48, 72: óra | 3,5 óra | |
Orális | 0,15,30,60,90 sarc, | 0,15,30,60,90 perc, |
4,7,24,46,72 éra | 3,5,7 óra | |
Szubkufcán | 0,30, 60,90 perc, | 0,30,60,90 perc, |
4,7,24,48,72 őrá | 3,5,7,24 óra | |
Intratracheáiis | 0, 30, 60, 90 perc, | 0,30,60,90 perc, |
4,7,24,48,72 óra | 3,5,7,24 óra |
*
7. táblásat
Earmakskinetikai paraméterek béta-ínterferon~Ia (IFN) és pegíIáit béta-IFK—ia ÍIFH-PCG) patkányoknak való IV-, SC-, IP- vagy
IT-beadását követően
Forma | '“'tto.X | T •‘•w. | AUC/dóz | is | |
(beadás módja) | (ü/ml) | (éra) | (U,óra/ | mi.pg) | íóra) |
1FÓ i (IV, 20 pg dózis) | 64 0 30 | 0, 2 5 | 30 3 5 | 1,25 | |
jIFh-PEG (IV, 3 pg dózis) | 23970 | 0,08 | 47728 | 3, 49 | |
IFN (SC, 20· pg dózis) | 2403 | 1,0 0 | 4 64,4 | 0,96 | |
IFN-PBG (SC, 3 dg dózis) | 2400 | 7, 00 | 14688 | 11,9 | |
IFh (IP, 20 pg dós is) | 26000 | 1,2 5 | 4159 | 1,53 | |
TFN-PBG tIP, 3 pg dózis) | 9700 | 1 V | 52148 | 16,-2 | |
IFN (1T, 15 pg dózis) | 24 0 | 1, 5 | 70,7 | 1,29 | |
1FN-PEG •1T, 1.5 pg dózis) | 27 0 | ?,Ö | 233,3 | 0,21 |
Polimerhez béta-Interferon-Xa anti-angiogén hatásai: annak méghatárorása, bogy PPGilált béta-interferon-la milyen mértékben képes gatolna endotéi sejtproliferációt in vítro
Humán vénából szármázó, enöotéi sejteken iCell Systems, Gáti 2vö~P'?S) ás harsán dermáüs mikrövasskni árit enöotéi sejteken
0.01® «»» .« φΧ ΦΦ ΦΦ*X (Ce.ll Systems, Cet# 2MI-€2oj CS-C tápkozeg-készletben (CS-C Médium Kit, Cell Systems, Cat'i 4.. 2-100), tenyészetben fenntartunk. A kísérlet előtt 24 érával a sejteket tripsziunel kezeljük, és feiszuszpendáljuk a vizsgálati eljáráshoz alkalmazott tápközegben, azaz 90% M199~b@n és 10% magzati borjászáruimban íFBS), és beállítjuk a kívánt sejtsürűséget. A sejteket azután zselatinnal burkolt, 24 vagy 96 tenyésstőhelyet tartalmazó tálcákra szélesztjük, I2.5Ö0 sejt/méröhely Illetve 2-Ü0Ö sejt./mérőhely s r.vgben.
Egy éjszakán át inkubáljuk, majd a vizsgálati eljáráshoz alkalmazott tápkozeget .kicseréljük friss tápközegre, amely 20 ng/ml humán, rekomhináns, bázikus flöroblaszt növekedési faktort (Becton Dickínson, Cat. 4 400-60) és ku onoozö >on;cr.tv aeit gá, konjugált és nem-konjugált béta-interferon-la-fehérjót vagy pozitív kontrollt (pozitív kontrollként endosztatint lehet alkalmazni, lehet hECF-re specifikus antitest) tartalmazott. A végtérfogatot beállítjuk 0,5 ml-re a 24 tenyésztőbe ivet tartalmazó tálcákban vagy 0,2 mi-re a 96 mérőhelyet tartalmazó tálcákban.
óra elteltével a sejteket trípszinnel kezeljük Cbuiterszámláláshoz, lelagyasatjuk CyQuant f1uor es zcencia-leolvasásra, vagy ( 3iu-tim.ídlnnel jelöljük- Az endotéi sejtproiiferácíö in vítro gátlása kon jugált és nem-konjugált beta-interferon-la--val összehasonlítható mértékű volt, ami azt mutatta, ho-gy a 1FGÍIái ás nem befolyásolta az interferon működóképességét ebben a f e ’i á 11 a s b a n .
Ez az in vitro vizsgálat teszteli a találmány szerzőt:., humán bé ta-interteron-moieknlák endotéi sejtproi i féraoi óra kifejtett χχ φφ φφ** * * * * * * φ Φ * * : * * *
ΦΦ * ΦΧ** *Χ* * * hatásait, amely in vivő anti-angiogén hatásokra utalhat ( lásd tk Reiily, M.S. et al., Coll 88, 277-285 ().997)] .
Konjugált béta-in tér férőn-la anti-angiogén és neóvaszümiárizácrós hatásainak ín vivő modellje
Sokféle reodel.lt kifejlesztettek, amelyek a találmány szerinti molekulák, anti-angiogén és anti-neovaszkuiarizáciős hatásainak tesztelésére szolgálhatnak. Ezen modellek közül néhányat leírnak az ÜSP 5,773,876. (1998. március 31.) és 5,135,919. Π992. augusztus 4.) számú szabadalmi iratokban. Más vizsgálati eljárás lőhet például burokmentes korioaliantois membránt (CAM) alkalmazó vizsgálati eljárás ( S. Táyior és 6, Fclkman, Natúré 297, 307 (1932) és R. Crure et al., Science 25Ö, 1375 (1985)3 ; egér háti (dorzális) léghólyagot alkalmazó anti-angiogenezis modell f Folkrean, J. et al,, 6. Rsp. Med. 133, 275 (1.971)6 és patkányszaruhártyát alkalmazó, „mikrozseb vi asgálati eljárás ( Girebrone, M'. A. 6r. et ai., J. Ráfi. Cancer Inat. 52, 813 (1971): , amelyben szaruhártya-vaszkularisációt indukálnak ágy, hogy kifejlett, hím, Sprague-riatley törzshöz (Charles River, Gapan) tartozó patkányokba 500 ng, EVá-ban (•eti.lén.-'vinil-yacetá'tkopoiímerben) impregnált bázikus FGF~szemcséket (marhaeredetá, R&b Systems, Inc.) implantáinak az egyes szaruhártyákba.
£ G í g á 11, r á g o s .g i ρ b cd szar re a t ó b é t a - i n t e r fér ο n a n t í - a t v g i o g é n hatásainak áliatmode.l iben való tesztelésére szolgáló, más módszerek lehetnek a „Cancer Cherecfherapy Reports-foan (3, rész, 3. kötet, 2. szám, 1972. szeptember leért, ej, Potenciális rákellenes ágensek szűrésére szolgáló eljárások (a szóba jöhető eljáráZZ.2W/BZ »»»» »
y * « * β >· φ * k φ s φφ* ♦χ sok nem korlátozódnak csak erre), melyeket kiegészítettek az „In Vivő Canoer Models, '1976-1982'·' közleményben (NIH Pufcl lentien No.
4 -263 5., 19 84. £ebruár3 .
.Az 1. típusú Interferonok fajspecifikus jellege („faj-gát ) mi. a 11, po 1 Íme r. be z kon j u g á 11 hé ta -1 n te r f. erő n anti - angí egén a k t i vitásának rágcsáló-modellekben való meghatározása céljából előállítottunk polimerhez konjugált, rágcsálóból származó bétainterferont tartalmazó preparátumokat. A szűrési módszert olyan eljárással szemléltetjük, amelyben pegilált, rágcsálóból származó béta-inser leront szubkután implantált, Lewis-féíe tüdőkarcinémára kifejtett, anti-angiogén hatásai alapján tesztelünk.
lumorvonal eredete;
Spontán nőtt 1961-ben tadókarcinémaként egy C5731Z6-egérben,
A testtel járás összefoglalása; loMörfragmentumot szubkután implantálunk SDüFi-egerek hónaij-régiójába. A tesztágenst (azaz a találmány szerinti PEGilált interferont) különböző dózisokban adjuk be szubkután (SC) vagy intraperitoneálísan (IP), több napη i 2 o m . a f e' χ n ut pír i . . m.
túlélési idő. Az eredményeket a kontroll túlélési idő százalékaként fejezzük ki.
Állatok:
z apori t á s: C5 7 8L./'6-egsre k.
Tesztelés; BéDGFl-egerek.
Tömeg; Az egerek tornácé minimum 18 g hímek esetén és 17 g nőstények esetén, a 3 g.
Nem; Egy kisér lesben egyféle nemű állatokat alkalmazunk az összes tesztelésre és kontrolira.
zazzs/se
Φ ίν»
ΦΦ **** » Λ Φ
Φ ί* χ
Forrás ί Egy kísérletben az allétok egy forrásból származnak, ha van .rá lehetőség,
A kísérlet mérete;
T i z á 11 a t t e s z t c s ο ρ o r t ο n k é n t.
SZAPORÍTÁSί
Fragmentum.: 2-9 mm-es fragmentumot preparálunk s.e. donor tumor bél .
I de:; 13 ~ 15 . nap
Hely: A. fragmentumot s.. cátplántáljuk a hónalj-régióba, a lágyéki régióba irányított szúrással.
TESZTELES:
Fragmentum: 2-4 mm-es fragmentumot preparálunk s.c. donor tumorböl.
Idő: 13-13, nap
Hely: A fragmentumot s.e. impiantál jak: a hónalj-régióba, a lágyéki regióba irányított szúrással A tesz feles .menete.’
0. nap; Tumor impiantálása. Bakteriális tenyészetek, fenntartása. Pozitív kontroil-vegyületet tesztelünk minden páratlan: számú kisérletben. Anyagok preparálása. A pusztulásokat naponta feljegyezzük.
1. nap: Tenyészetek ellenőrzése. Szennyeződés esetén a kísérletet félbeszakítjak. Az állatokat véletlenszerűen rendezzük el. Utasítások szerint kezelünk (az 1. napon és a következő napokon.:.
2, nap: A tenyészeteket újra ellenőrizzük. Szennyeződés eseten kísérletet féibeszakitjük.
W aa ás
5. nap; 2. tömegmérés, és kezdődik a tesztágens toxioitásánsik eierozése.
14. nap: Korai pusztulások ellenőrzése.
48. nap: Ellenőrzés mintavétel nélkül.
60. nap: Befejezzük és kiértékeljük a kísérletet. A tüdőket szabad szemmel vizsgáljuk tumorra.
Mxnőségr ellenőrré® ;
Pozitív kontroll-vegyűletet ÍNSC 2S271, üytoxan, 100 mg/kg/injekciő dózisban) alkalmaztunk .minden páratlan számú kísérletben, melyet intraperitoneálisan adunk be csak az 1. napom Az alsó teszt/kontroll-határ 140% a pozitív kon trolira , Az elfogadható, kezeletlen, kontroll átlagos túlélési ideje 19-35,6 nap.
Értékelés;
A mért paraméter az átlagos túlélési idő. Kiszámítjuk az állatok 1. napi és S. napi átlagos testtömegeit, kiszámítjuk a teszt/kontroli-arányt valamennyi tesstcsoportra< Kiszámítjuk az állatok átlagos· testtömegeit a Mérési napon és az utolsó értékelési napon. Kiszámítjuk a teszt/kontroll-arányt valamennyi tesztcsoportra, amely az 5, napon 65%-nál nagyobb túlélést mutatott. Súá-nál kisebb értékű teszt/kontroli-arány toxicitásra utal. Túlzott .mértékű testtömeg-változás különbségét (teszt mínusz kontroli) rs alkalmazhatjuk toxroitás értékelésére,
Ar .aktivitással eremben táaís-s«tofct: követelmények;
14ö%:-nái nagyobb vagy egyenlő, kezdeti teazt/kontrcil--a.rányt tekintünk szükségesnek a mérsékelt aktivitáshoz. 150%-nál nagy o b b v a g y egye η1ő, re o rcda fcáIhat ó to s z t/kοn t rο11-a rányt tek intünk. szignifikáns aktivitásnak.
(SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE)
SEQUENCE L1ST1NG <11 0> BIOGÉN, INC.
Pép 1 n s k y, Bl a k e Renkclf Latira Brickelm&ler, Margót Whítty,· Adrián N o c h rn a n, Pa u la <120> Roiymer Conjagates of Interferon Béta-la and üses <13Ö> A065SGT <140> PCT/O399/24201 <141> I999-I0-I5 <150> 00/104,572 <15i> 1993-10-16 <150> 60/120,161 <151> 1999-02-16 <160> 29 <17 0> FastSSQ fór Windows Version 4.0 <2)0> 1 <211> 549 <212> DMA <213> marino <400> 1 tccgggggcc atcatcatca teat.oar.agc tccggagacg atgatgacaa gatgagctac 60 aacttgcttg gattcctsca aag&agcagc aattttcagt gtcagaagct ectgtggcaa 120
ΛρΡ.ρμ g? 'g'ct osag grem, tcoa i tt,ca<ra Mccclhj ISO attaagcagc tgcagcagtt ccagaaggag gacgccgcat tgaccatcta tgagatgctc 240 cagaacatct ttgctatttt cagacaagat tcatctagca ctggctggaa tgagactatt 300 •gttgagaacc tcctggctaa tgtctatcat cagataaacc atctgaagac agtcctggaa 360 gaaaaactgg agaaagaaga tttcaccagg ggaaaactca tgagcagtct gcacctgaaa 420 agatattatg ggaggatzct gcattacctg aaggocaagg agtacagtca ctgsgcctgg 400 accatagtea gagtggaaat cctaaggaac tttt.actt.ca ttaa.oa.gact tacaggttac 540 otccgaaac 54 9
<210> | ?· xl |
<211> | 133 |
<212> | IRT |
<213> | maríné |
•4 4 0<> | .••s <- |
Ser Gly Gly His His Fis His His His Ser Ser Gly Asp Asp Asp Arc
5 19 15'
Ό.U'rSUsr
Lys Mát Gin Gye | Ser Gin 35 | Tyr 20 Lys | Asn len | Len Trp | Gly Gin 40 | Éle zi? Len | Len Asn | Gin Gly | Arg Arg | .-s : ser Leu 4 5 | Ser 30 Gin | Asn Tyr | Phe Gys | ||
Len | Len | ||||||||||||||
Len | Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | He | Pro | Gin | Gin | 1 le | Lys | Gin | Len |
50 | 55 | 50 | |||||||||||||
Gin | Gin | Phe | Gin | Lys | Gin | Asp | Alá | A r a | Len | Thr | He | Tyr | Gin | Met. | Len |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Gin | Asn | He | Phe | A la | 1 re | Phe | Arg | Gin | Asn | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp |
83 | 90 | 95 | |||||||||||||
Asn | Gin | Thr | He | Vai | Gin | Asn | Len | Leu | Alá | Asn | Vai. | Tyr | Kis | Gin | He |
löö | 105 | 110 | |||||||||||||
Asn | Hús | Len | Lys | Thr | Vai | ..:£r | Gin | Gin | Lys | Len | Gin | Lys | Gin | Asp | Phe |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Thr | A r g | Gly | Lys | Len | Met | Ser | Ser | Len | Kis | 1.05.2 | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly |
I 30 | 135 | He | |||||||||||||
Arg | He | Len | His | Tyr | Len | Lys | Al a | Lys | Gin | Tyr | Ser | His | Cys | Alá | Trp |
14 5 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Thr | He | Vai. | Arg | Vai | Gin | He | Len | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | He | Asn | Arg |
165 | 170 | 17 5 | |||||||||||||
Len | Thr | oly | Tyr | Len | Arg | Asn | |||||||||
180 |
<210> 3 <211> 60 <212> DMA <213> humán <4 00> 3 ttctceggag acgatgatga saagatgagc taosacttgs ttggattcet acaaagaagc <21O> 4 <211> 39 <212> GM A <213> humán <400> 4 cccgctcgag ftatcagttt cggaggfaac cfcgtaagto <210> '3 <2H> 35 <212> DMA <213> humán <4 00> 3 agcttccggg ggccatcatc atoar.catca facet <21.0> 6 <235 <2l2> DMA <213> humán “2 .<:§ÁS;5'
Λ « X V* * ν * « « * * ♦ χ ♦ X * * χ Χ· < 4 Ο Ο> 6 ceggagetat gatgatgatg atgatggpoc cegga 35
<210 7 | |
<210 < 2 llnOI O | 87 DO humán |
oo | 7 |
ceggagecga tgatgacaag atggcttacg ccgcfettgg agecctacaa gcttetagca 60 attttcagtg tcagaagctc cigtcgc 87 <210> 8 <210 00 <212> DNA <213> humán <9ÖO> 8 gatctagcaa tgcigcctgv. gctgccctcc fggctgccit gaatgggagg cttgaatacc 60 <210 9 <210 52 <21O DO <213> humán < 4 0 0> 9 gcctcaagga eaggatgaac tttgacatcc ctgaggagat fcaagcagctg ca
< 2.1Ό· 10 <210 7 6 < 210 IMA < 213> humán |
<WO 10 |
aatfcgaatgg gagggctgea gcttgcgctg eagacaggat gaactCtgae afcnectgagg |
agafctaagca gctgca |
<210 11 <210 76 <212> O < 213> humán <9 00 11 aattgaatqg gaggctfcgaa tactgcntua aggacagggc tctatttgct atccetgcag agat.taagoa gotgca *« ΦΦ »Χ ΦΧ*Φ Φ X φ Φ Φ Φ ί X Φ Φ
X Φ * Φ **Φ φφ*ν «
<210 | 12 |
<211> | 51 |
<2.Í2> | DMA |
<21 3> | humán |
< 4 0 0> | 1.2 |
aattgaatgg gaggcttgaa tactgcceea aggacaggat gaactttgac |
<210 | 13 |
<2.1i> | 4 3 |
<212> | DMA |
<213> | humán |
<3 00 | 13 |
tccctgagga gattgctgca gctgcagctt tcgctgcagc tga |
<210> <211> <212> <213> | 14 7 8 DMA humán |
<400> | 14 |
cgccgcgttg accatctatg agatgctcgc atc tagc act ggcfcggaa taacatcgot agoattttca gacaagattc <21.0> .15 <211> 78 <212> DMA <2X3> humán <400 15 cgeegcatfg accatetatg agatgctcea gaacatcttt gctatttfcg ctgcagctec atctaccuct ggctggaa
<21u> | 16 |
<210 | 7 2 |
<212> | DMA |
<213> | humán |
<4 0 0 | 16 |
ggaatgcttc aattgttgct gcactcctga gcaatgteta tcatcagata aaccatctga agacagetcf ag
<210 | 17 |
<210 | í 2 |
<212> | DMA |
<210 | humán |
CCCTS/Ss'
<4Q0> 17 ggaaigagac cattgttgag aaactcctgg ctnsf.gt.cgc tcutcagata gcacsfcctgg c tgcagt t ct ag | 60 72 |
<210> 18 | |
<211> 44 | |
<212> | |
<213> humán | |
<4 0 0> 18 | |
ctagatgcaa aactggcfcgc agctgattte accaggggaa aact | 44 |
<21ö> 19 | |
<211> 68 | |
<212> DNA | |
<213> hűm cm | |
<400> 19 | |
ctagaagaaa nactggagaa ngangcagct accgctggaa aagcaatgag cgcgctgcac | íxf) |
ctgaaaaga | 69 |
<210> 20 | |
<211> oi | |
<212> DMA | |
<213> numaft | |
<430> 20 | |
tattatggga ggattctgca ttacctgaag gccaaggagf actcacactg t | 51 |
<210> 21 | |
<211> 183 | |
<212> DMA. | |
<213> humán | |
<400> 2.1 | |
catgagcagc ctgcacotga aaagavatva t.qgggcaatt gctgcatacc tggcagccaa | 60 |
ggagtactca cactgtcatg agcagtetgc accv.gaaaag atattatggg aggattetgc | 120 |
afctacctgaa ggccgctgca tactcacact gtgcctgcac gat | 16 3 |
<210> 22 | |
<211> 37 | |
< 212> DMA | |
<22 3u humán | |
<400> 22 | |
catgagczgv ctgcacctga aaagavatta fcgggaggatf ct.gcatv.acc vgasqgcaaa | 60 |
ggactacgct guatgtgcct ugacgat | íí |
'? S - Ki· ® * »«* X <210> 23 <211> 50 <2Ι2> DMA <2.13> humán <400> 23 cgteagagct gaaatcctag eaaactxtgc attcattgea agacttacag <210> 24 <211> 166 <212> PPT <213> humán
<480> 24 | |||||||||||||||
Műt | Ser | Tyr | Ami | Len | Len | Giy | Phe | Len | Gin | Arg | Ser- | Ser | Asn | Phe | Gin |
1 | 5 | 18 | 1: 5 | ||||||||||||
Cys | Gin | Lys | Len | Leu | Trp | Gin | len | Asn | Giy | Arg | Le u | Glu | Ty< | Cys | Len |
·;· n | 25 | 30 | |||||||||||||
Lys | Asp | Arc | Me t | Asn | Phe | Asp | lle | Pro | G .i. u | Giu | lle | lys | Gin | Le u | Gin |
35 | 4 0 | 45 | |||||||||||||
Gin | Phe | G1 n | Lys | Giu | Asp | Alá | Alá | len | Thr | ile | · Z · | Gin | Mst | Len | Gin |
80 | 55 | 60 | |||||||||||||
Asn | 11 e | Phe | Alá | He | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Se | Thr | Giy | Trp | As n |
65 | 70 | 75 | 30 | ||||||||||||
Glu | Thr | Iie | 7a 1 | Gin | Asn | Len | Ara | Asn | Val | Tyr | HiS | Gin | Iie | Asn | |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
His | Leu | Lys | Th r | Val | len | Glu | Glu | Lys | len | Glu | Lys | Glu | Asn | Phe | Thr |
1 OO | 105 | 110 | |||||||||||||
Arg | Giy | Alá | Lee | Met | Ser | Ser | len | His | Len | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Giy | Arg |
115 | 120: | 125 | |||||||||||||
Iie | Lee | HiS | Tyr | len | lys | A.le | Lys | Glu | Tyr | Ser | His | Cys | Alá | Trp | Thr |
130' | 135 | 140 | |||||||||||||
I le | 7a 1 | Arg | 7 a 1 | <; } ·; s 7hi V | Iie | Let | Arg | Asn | Phe | Tyr | Arg | lle | Asn | Arg | leu |
145 | 150 | lls | 160 | ||||||||||||
Thr | oly | Tyr | Len | Arq | Asn | ||||||||||
1 ¢5 |
<210> 25 <211> 166 <212> PÉT <213> humán | |||||||||||||
<400> 25 Get Ara Tyr | Alá | Alá | gén | Giy | Alá | Leu | Gin | Alá | S e r | Ser | Asn | Phe | Gin |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||
Cys Gin Lys | Len | leu | Trp | Gin | leu | Asn | Giy | Arg | Leu | Gin | Tyr | Cys | Leu |
20 | 38 | ||||||||||||
Lys Asp Arg | Mer | Asn | Phe | Asp | I le | Pro | G la | Gin | lle | Lys | Gin | Leu | Gin |
Db | 40 | 45 | |||||||||||
Sin Phe: Gin | Lys | GI u | Asp | : A.1 U: 55 Ara | Alá | Leu | Thr | Iie | lyr | Giu | Let | Leu | a |
Asn .He AIóí | Ser | 11 e | Phe | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | G i. y | Trp | Asn |
70 73 80
9 3 | ♦ > » w 9 « « 9 e> » | ** XX *X*f X 9 9 W X Λ X X « Xr » X X « 9 9 «* X > | |||||||||||||
Gin | Thr | He | 7 a .1 | Gin | Asa | Len | Len | .Alá | Asn 0 A | Val | Tyr | K 1 s | Gin | He 05 Alá | Asn |
Kis | Les | Lys | Thr | C’x.5 Val | :.. es | Gl« | Gin | Lys | .3 V Len | Gin | nys | GTS | Aia | Thr | |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
x%ía | Gly | Al a | Al a | Met | Ser | Alá | Leu | Kis | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
He | Leu | Kis | Tyr | Les | Lys | Alá | Lys | Gin | Tyr | Ser | Kis | Cys | A.:. S | Trp | Thr |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
lle | Val | Arg | Val | Gin | He | Les | Arg | .Asn | Phe | Tyr | Arg | He | Asn | Arg | Len |
145 | 150 | »* e | 160 | ||||||||||||
Thr | Gly | Tyr | Les | Ara | Asn | ||||||||||
165 |
<210> 26 | |||||||||||||
<211> 166 | |||||||||||||
<212> PRT | |||||||||||||
<213> humán | |||||||||||||
<4 00> 26 | |||||||||||||
Met Ser Tyr | Asn | Les | Les | Gly | P'ne | Les | Glh | Arg | Ser | Ser | Asn | Aia | Al a |
1 | 5 | 10 | '1 5 | ||||||||||
Cys Alá .Aia | Len | Les | Aia | Aia | Len | Asn | Gly | Arg | Len | Gin | Tyr | Cys | Les |
20 | 25 | 30 | |||||||||||
Lys Asp Arg | Met | Asn | The | Asp | He | Pro | Gl s | Gin | 1 le | Lys | Gin | Len | Gin |
35 | 40 | 45 | |||||||||||
Gin Phe Gin | Lys | Gin | Asp | Aia | A1 a | Len | Thr | He | Tvr | Gin | Met | Len | Gin |
50 | 55 | 60 | |||||||||||
Asn He The | Aia | He | Phe | Aia | Alá | Ara | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||
Gin Thr He | Var | Gin | Asn | Len | Les | Aia. | Asn | Val | Tyr | Hrs | Gin | He | Asn |
35 | 90 | 95 | |||||||||||
Kis Len Lys | Thr | Val | Len | Gin | η» In | Lys | Len | Gin | Lys | Gin | Asp | Phe | Thr |
1.0 0 | 105 | 110 | |||||||||||
Arg Gly Aia | Les | Met | Ser | Ser | Len | Kis | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Aia |
H5 | 120 | 125 | |||||||||||
1 ._·? Ara Au e. | Tyr | Len | Al a. | A.i a | Lys | G .1 u | Tyr | Ser | Kis | Cys | Al a. | Trp | Thr |
130 | 135 | 140 | |||||||||||
lie 7a1 Arg | Val | Gin | lle | Les | Arg | A s n | Phe | Tyr | Arg | lle | Asn | Arg | Len |
o | 150 | 155 | 160 | ||||||||||
Thr Gly Tyr | Leu | Arg | Asn | ||||||||||
165 |
<21ö> | 27 | ||||||||||
<2H> | 166 | ||||||||||
< <; i .<;> | PRT | ||||||||||
<213> | humán | ||||||||||
< 4 0 ö> | 27 | ||||||||||
Met Ser Tyr Am | n Len | Leu | Gly Phe | Len | Gin | Arg | Ser | Se .h | Asn | Phe Gin | |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||
Cy s Gi | íi .gVö i. j ísí < | n Leu | Trp | Gin Len | Asn | Gly | Arg | Aia | Aia | Ara | Cys Aia |
20 | 25 | 30 |
X
Alá G .1 Λ | Asp Phe 50 | Λ '< *O X κ X | Mel Ly s | Δ <' r: Glu | Phe Asp | lie 4 0 Alá | Pro Leu | U 2. u Thr | Glu lie | lie Tyr 60 | Lys 4 5 Glu | Gin Met | Leu Leu | Gin Gin | |
Asp | A r a 5 5 | ||||||||||||||
Asn | r ie | Phe | Als | lie | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | ASfi |
65 | 70 | 7:5 | 30 | ||||||||||||
A la | Ser | He | Vei | ai s | Alá | Les | Leu | Ser | Asn | Vei | Tyr | His | G1 rí | He | Asn. |
35 | 90 | 95 | |||||||||||||
His | Len | Lys | Thr | Vei | Leu | Glu | Glu | Lys | Len | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr |
100 | 16 5 | 110 | |||||||||||||
Arg | Gly | Ara | Leu | Get | Ser | Ser | Lee | H i S | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ile | Leu | His | Tyr | Lee | Lys | Ara | Alá | Alá | Tyr | Ser | His | Gys | Ara | Trp | Thr |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ize | Vei | Arg | Val | Glu | He | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Arg | r re | Asn | Arg | Leu |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Thr | Gly | Tyr | Lee | Arg | Asa | ||||||||||
165 |
<210> <2.11> <212> <213> | 28 166 PRT humán |
<4 0 0> | 28 |
Get 1 | Ser Tyr | Asn | Leu 5 | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin 10 | Arg | Sex | Ser | Asn | Phe 15 | Gin | |
cys | Glu | Lys | Leu 20 Alá | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn ·-> e | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr re | Gys | Leu |
Lys | Asp | Arg | Ara | Phe | Alá | lie | Fre | Alá | Glu | lie | Lys | Gin | Leu | Gin | |
35 | 4 0 | 4 5 | |||||||||||||
Glu | Phs: | Gin | Lys | Glu | Asp | AI a | A la | Leu | Thr | He | Tyr | Glu | Met | Leu | Gr n |
50 | f :· | 60 | |||||||||||||
Asn | 1 le | Phe | Alá | He | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
65 | 7 0 | 75 | 80 | ||||||||||||
Glu | Thr | lie | Val | Gr u | Asn | Leu | Leu | Alá | Asn | Val | Alá | H1 s | Gin | II e | Ara |
8 5 | 90 | 95 | |||||||||||||
Hi s | Len | Ara | Alá | Val | Len | Gin | Glu | Lys | Leu | Gin | Lys | Gin | Asp | Phe | Thr |
100 | 10 5 | 110 | |||||||||||||
Arg | Sly | z. .1 a | Leu | Get | Ser | Ser | Leu | His | Len | Lys | Arg | Tyr | Tyr | G1 y | Arg |
115 | 120: | 12 5 | |||||||||||||
•Lie | Leu | hXS | Tyr | Leu | Lys | Ara | Lys | G1 u | Tyr | Alá | Alá | Gys | Alá | Trp | Thr |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
1.1 e | Val | Arg | Val | Gin | Ile | Lén | Arg | Asn | Phe | Tyr | Arg | ile | Asn | Arg | Leu |
145 | ISA | 155 | I6G | ||||||||||||
Thr | Gly | Tyr | Leu | Arg | Asn | ||||||||||
165 |
<21 0> 29 <211> 167 <212> PPT <213> humán
72.2OU2EK.
»» *
<400> 29
Me r. | Ser | Tyr | Asn Len Let Gly | Phe Let Gin Arg Ser | Ser | Asn | Phe Glt | ||||||||
1 | s | 10 | 15 | ||||||||||||
Cys | Gin | Lys | Let | Lee | Trp | Gin | Let | Asn | Oly | Arg | Let | Glt | Tyr | Gys | Let |
20 | 2 5 | 30 | |||||||||||||
Lys | Asp | Arg | Mer | Asn | The | Asp | lle | P re | G lt | Glt | lle | Alá | Ara | Ara | Aia |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
A.l>a | Phe | Alá | Alá | Alá | Asp | Ai a | Aia | Let | Thr | lle | Tyr | Glt | Met | Len | aiin |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
A s n | lle | Phe | Alá | lle | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
G Ív | Thr | lle | Val | G 1 a | Ase | Len | Let | Alá | Asn | Val | Alá | Tyr | Ris | Gin | Alá |
8 5 | 90 | 95 | |||||||||||||
Asn | Ris | Alá | Lys | Thr | Alá | Let | Alá | A1 a | Lys | Let | Aia | Alá | Alá | Asp | Phe |
100 | 10 5 | 110 | |||||||||||||
Thr | A tg | Gly | Air | Lee | Mer | Ser | Sér | Leu | Hle | Let | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly |
11 5 | 120 | 125 | |||||||||||||
Arg | lle | Let | Mis | Tyr | Let | Lys | Alá | Lys | Glt | Tvr | Ser | Ris | Cys | Alá | Trp |
130 | 135 | 1 4 0 | |||||||||||||
Thr | lle | Vei | Arg | Alá | Glt | lle | Let | Alá. | Asn | Phe | Alá | Arg | lle | Alá | Arg |
14 5 | 150 | 155 | 100 | ||||||||||||
Löü | Thr | G .1 y | Tyr | Let | Arg | Ast | |||||||||
165 |
Claims (22)
1. Sgy kompozíció, amely bé ta-letér fér on-la-t vagy egy fúziós fehérjét tartalmaz, amely a béta-interferon-la~t tartalmazza, ahol a béta-interf erőn-la az alábbi aminosav-szekvenciából áll:
MSWLérGFLbh-SSbFQCbKtr^QbMGSLBiCSKDRMiSFPIPSSlKQLQQFQKSb AAG:'iYEkLQN7FAlFPipSSSTGöbEGiVENI,t:AbVYHQTbHLKTVÍ,SEKtSK EGFiRGKAAFSLnLKRYYGRlLHYLKAKSYSHCAGTiVRVElLRhFYriNRLiG YLRR, és ahol a béta ·· interferon.·· ia egy egyetlen nem-természetesen előforduló polimerhez van kapcsolva a béta-interferon-1 a. M-terminál is végénél, ahol a béta-interxeron-la és a polimer közötti kapcsolat egy reduktív alkílezésl módszerrel létrehozható, és ahol a polimer egy polialkilén-giikol-csoportot tartalmaz..
2- Az 1. igénypont szerinti kompozíció, amelyben a fúziós fehérje egy immunglobulin molekula egy részét tartalmazza,
3. Az I.. vagy 2t igénypont szerinti kompozíció, amelyben a polimer molekulatömege körülbelül S - 40 kiiodalton,
4. Gyógyszerkészítmény, amely az 1-3. igenyponGm ru.muJyuke szerinti kompozíciót tartalmazza.
5. Az 1-3., igénypontok bármelyike szerinti kompozíció alkalmazása gyógys zer kés z i tmény előáll í fására
6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kompozíció alkalmazása egy gyógyszerkészítmény előáll 1 fására tumorok és rákok, autoimmun állapotok, vírusos betegségek vagy analógén betegségek kezelésére.
7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben, a tumorok és rákok a következőkből álló csoportból kerülnek kiválasztásra: oszteocén szarkóma, limfőma, akut. iimfőmás leukémia, mellszarkőma, melanóma vagy nazofaringeáiis karcinöma.
8. A. 5.. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az autoimmun, állapotok a. fibrézis, iupusz és szklerózis multiplex esopor;; aból keröinak kivalásztásza.
9. A 5. igénypont szerInci alkalmazás, amelyben a vírusos betegségek a kővetkezőkből álló csoportból kerülnek, kiválasztásra: EGF fertőzés, influenza, légzési traktus vírusos £ er t ö z é s e i , v es z e 11 s é g é s h epa t i t. i s z ,
191 A 5.. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben as angiogenikus betegségek a kővetkezőkből álló csoportból kerülnek kiválasztásra: diabetikus refinopátia, koraszülöttek retinppáfiája, makuláris degeneráció, szazubártyagraft-kilökődés, neovasokuláris giaukoma, retrolentáiis fibropiázia, rmbeözis és Os 1 er ·· robber ~ s z in dráma,
11, Sgy kompozíció, amely tartalmaz egy béta-interferon-la mutánst vagy egy fúziós fehérjét, amely tartalmazza a bétainterferon-1a mutánst, ahol a béta-inferferon-ia mutáns egy alábbi aminosav-szekvenciából áll:
í i ) MAYAAbGAbÓASSFFQCQFbLbGLMGbLSYClbDEbFFnX FFSXRQbQQFGYED
AALXXYSibQb'FAXFRfkbSSTGb.dFrTVüiu,ivüiVYHQilGiI.KTVX.FFKI.<ERFDF?R ΟΑΕΥ8ΕηΗΕΚΕΥΥΟη1όΗΥ1ΥΑΚΕΥ5ΗΟΑ«ΤΐνΕνΕΧΑΰΕΈΥΕ · YFGXGYLRb, fi i ΐ YSYYL LGFLQRS SNAkGAAI.EAAblbRLS YCLKDRfbF Di PESIKQLQQFQKED
AAbTiyFYLGDXFAlFRQDSSSTGYFEXXVSKLLAFVXKQ · γνηκ::?νLSEKI.EXSDFTR f iί X > MSYNLDGFLQS.SSGEQCQKLLWQLPGEAAACAADkbbFDXPFS1KQ1QQFQKED AAlGf:YEbXQNlFAiFF.QoSőSYGbKEirVSbiá:ARVYHQXGHEKTVLEEXX.ERFDFTR αΚΛ,ΥοΧηΗΑ\ΗΥΥΟΡΧ.1ΗΥΑΕΑΚΕΥ8ΗΟΑ·<Τ1ΥηνΕΧΕΑΝΕΥΓΙΥΕΑΤΟΥΕΰΥ, fb bSYMbbGFndESSbFQCbkniáígikiGFLEYCLEDRAAFAlPAEiKQLQQFQSSD AAbYIYSMLQbXFAXFRQOR^SSXGbbEYIVFbbbAFVYHQidHAETVbFEKLSKEDFYE GRlbSSLRzbRYYGFILHYbKAFSYSüCAbTIVFVEILRDFYFIFF.EYGxbFf , i V). bS Ybbl G F DOH S SNFQCQK ilbO LbG RLE Y C bKDRMbFD I ΡΕΕΙ AAAAAF klfb
AAi.iYbEEbQNXFAlFHfbSSSYGYbSYIVEFLLAbyYH'QXFHEKibLEFRLERSDFTR GKLMGS EübFE. YYGRIi;H YbRAKBYEFCAbT IWVE lEEbFYF IERLTG Y bab, ívj.) MSYEEEGFEyESGFFQCOFELFQEFGRESYCEFÖEFFFniPEFIKQEQQRQFED AAETIYEFEANIASIFEgESGSTGFNETIVEFEEAFYYHQYFHEFWEESREEFEDFTE GEEMGEEEEYEYYGEIGEYEKAFEYSEeAWTIVRVEYEENEYFINBETGYlRF,
Ali) EEyFEEGFLQESSEPQCOFEEvQLFGEEFYCLKDEFFFDlPSEIKQLGQFQREE
IGlEYIYEFLQNlFAIFBlASSSTGFFSYlVSFEEAYVYHOIFHEFTYEFSKLEKEDFrR
GFÍ.F4G3Eí-)LKRYYGRlLHYi.,}-;AAEySHCAEBlYRSILPFFYFlNRl.1TGYEEN; íVili/ FSYEELGFIIRGGGFQCQIFLIQLNGRLSYCEFDRMFFDIΡΕΕΙKQEQQFQFED A All IYBFEQMI FAI FRQDGS FvGFEASI VAALESF'VYHQ IFKLKTVLEEK1 IXEDFTR GKAAISLH1VEY YGEILHYEKAKFYFHCAYTI VRVEIEREFYF1 Y?G,TGYLRF., (Axj FSiFLLlFlOHSSFFQCOKLLFQlFGRlFYGLKDFFFFDlFFEIFQLQQFQKFD
AAEYIYSFIOEIFAIFEQESSSTGFESTTVEFEEAG'VAHQIAHEAAVEEEKESEEDETR GR EFS FLHLFRYYGRIL EYEKAKFY SHC AY/T1VRVE1ERE F YFI NR. ETGYL EF,
W FFyFiAGPLQRFSFFQCQFElAYiEIBRLFYCEKDRMYPDIPESiFQEQCl'QEED
AAGYIYEMLGFIFAIRRQREESYGMFF:ri-VFNElANVYRQINRLFYVLAAKLAAADETR GYEM S SEEEFR Y YGRIEH YEKAREYSHC AWY1VE E1 EPF'FYF IF EETGY EKG, (Xi) RSYFRRGFEQRSSHFQCQKEX^QLNGREEYeLKDEFFFDIPEFIEQEQQFQFSD
AAI..T 1YEMEQNI FAI FRQDS SSTGWNETIVEFEE AFVYHQ INHEXTVLBEKEEK EAAYA GRAI1SA1íREFRYYGRILHYEKAESYFHCAFT1VRVEIEPYIFYF'I.NRI.1’GYT.;F.FE (xi i ) MSYFEFGPLGRSFFFQCGKEEYQEFGREEYCEKDEFFFDIPERIFQl^gFQKFD AA:.AYYERL.OYIFArFRQDSSSTG(F<FYiVERlLANVYHQlFHEX:}?VLFFFLEKFDFYR GFLFSGEHERRYYGAIAAYEAAKEYSHCAFYIVRVEILRFFYFIFRETGYEFF , (viii) FFYGLEGFEQRGEFFQCQFLEGQLGGRESyGEKDRM7FFT ΡΕΕΙKQEQQFQKED ΑΑΕΥΊΥΕΜΕδΕΙΕΑΙΡΑ0Ε£33ΤΟΥΝΕΤΐνΕΕΕΕΑΕνΥΕ0ΙΝΗΕΥΥΥΕΕΕΥΕΕΚΕΕΕΥΡ (xi v ) MGYNELGFEQRGSNFQCOFIXWEFGRLFYGEKDRFFFDIPERIKgiígQFQREE
AAEFIY'EHLQinFAlFEQESSSTGOETIVEFlAAYVYHQIFHEFTYEFEREEKSDFFR
ΕΕΕΕΕΕνΗΕΚΕΥΥΟΕτΕΗΥΕΚΑΚΕΥΑΑαΑΕ’ΤίνχΥΕΣΕΕΕΕΙΙΥΝΕΕΤΕΥΕΕΕ, (XV) MSYFEEGFEgESSFFQCgFi I^QEBIEEFYCLKDRFFFDIPSEIFQEQQFQRRE
AP1:TIVEFEÍ1EIFAIFE.CY.:1.SSYGvGB;TIVPYT;.Y,ANIIHQINHEFTVLEFKLEKEDF'TR
0ΚηΜ30ηΗηΚηΥ¥ΟΚΐ0ΗνΑΚΑΚΕΥΰΗ0Α7ίϊΐνΚΑΕζ.ηΑΕΡΑΕΙΑΑοΤ07ΕΑΕ:, és ahol a. béta-interferon-la mutáns egy egyetlen xiem-terméssetesen elöforöniö polimerhez van kapcsolva a béta-interferon--la mutáns A·· terminálisánál, ahol a béta-interferob-la mutáns és a polimer körötti kapcsolat egy reduktív alkilezési módszerrel létrehozható, és ahol a polimer tartalmaz egy políalkilén-glikol· csoportot,
12. A 11. igénypont szerinti kompozíció, amelyben a fúziós fehérje egy immunglobulin molekula egy részét tartalmazza.
13. Egy gyógyszerkészítmény, amely a 11-12. igénypontok b mi-'ou'' v’u.nti knuvxrio; u.nalfrrza
14. Egy in vitro eljárás béta-int er férőn?- la aktivitásának prolongálására egy in vitro rendszerben, amely tartalmazza a bé t a - ί n t e r f e r on -1 a k ap c s ο 1 á s á t az 11-t e rm i n.á 1 i s v égéné 1 e gy egyetlen nem-természetesei; előforduló polimer-csoporthoz egy reduktív alkilezési módszer segítségével, hogy egy kapcsolt polimer-béta-rnterforon-la kompozíciót kapjunk, ás a kapcsolt ρο1ímer-bé ta-ίn f er £erοη-1a kompo zi c i ó hevez e tésé t az 1 η νí t r o rendszerbe, ahol a nem-természetesen előforduló polimer-csoport egy polialkiién-glikol-csoportot tartalmaz.
15. Sgy nem-természetesen előforduló polimer-csoport alkalmazása az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti kapcsolt polimerbéta-interferon-la kompozíció nyerésére egy gyógyszerkészítmény elöálirtásához, ahol a nem-természetesen előforduló polimercsoport egy políalkilén-glíkol-csoporcot tartalmaz .
lo. A. 3. igénypont szerinti, kompozíció alkalmazása, gyógyszerkészítmény elcállitására angiogenezis gátlására egy alanyban.
17. Az 1-2., 11, vagy 12. igénypontok bármelyike szerzet!
kompozíció, amelyben a polimer pozietílén-gl iko.l.
18. Az 1-2., 11,, 12. vagy 17. Igénypontok bármelyike szerinti, kompozíció, amelyben a polimer molekulatömege 10 Ott és 4ö OQö halton közötti.
13 · Á 18, igénypont szerinti kompozíció. amelyben a polimer molekula-tömege 2)0 000 dőlteim
20. Áz 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kompozíció tumorok és rakok., autoimmun állapotok., vírusos betegségek vagy angiogén betegségek kezelésében történő alkalmazásra.
21. A kompozíció a 2ö. igénypont szerinti alkalmazásra, amelyben a tumorok és rákok a következőkből álló csoportból, kerülnek kiválasztásra: oszteogén szarkámé, l.imfóma, akut iimt óriás leukémia, mell·-· szar kőma, melanóma vagy nazof aringeál is karcinőre.
21. A kompoztlciő a 20. igénypont szerinti alkalmazásra, amelyben az autoimmun állapotok a fibrózislupusz és szklerözis multiplex csoportjából kerülnek kiválasztásra.
23. A kompozíció a 20. igénypont szerinti alkalmazásra, amelyben a vírusos betegségek a következőkből álló csoportból kerülnek kiválasztásra: á'· f> d<;\~ influenza, a légzési traktus vírusos fertőzései, veszettség és hepatitisz,
24, A kompozíció a 20. igénypont szerinti alkalmazásra, amelyben az angiogén betegségek a következőkből álló csoportból kerülnek kiválasztásra; diabetikus retínopátia, koraszülöttek r et inopá t i á j a , maku 1 ár is degenerá ci ó, s za r uhá r r y a g r a f t - ki 1 ö ko dés , necvaszkulárzs gíaukőma, rétrolentális fibropiázia, rubeözis és Osier-kebber-szlndrőrsa.
25. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti szklerózis multiplex kezelésében történő alkalmazásra
26. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazása gyógyszerkész1imént el oá11ítárára múltip1ex kézelés ére.
kompozíció kompozíció szklerózis «€ vb.
A mégha. t a 1 ma z o 11:
?
. „.Az n -ö'3 1 o?. zmarooé . WWltiiAvki '
SZÓK SzatsSíáaö ügy vök Ovo 55 y-tgsw .Uisoss,· Zttzz eeot. smsrtm<g2· kz-íök
1/9 mega η A sál Λ PIÁUL SZOLGÁLÓ VÁLTOZAT ro ro
-o .>·«*£ff ·&** ”4 'ST a. φ xs
Ό 5 ro
F 1 yx* ; xÍ^.<^nyX'MÍy^yis^XB^<y>y>iwy*.-«3
Áí A2 AÖ1 A82 ABS Sí 82 Cl C2 CDI CD2 S DBA DE2 H n ~ 5 4 3 4 4 5 4 5 3 3 2 3 3 3 3
Ö3 >JS
JSeg •Ő3
U.
c so>
s>^>
Q.
»*MÍ (a® U
SÖ <s ,^~s.
ZZ
ÍQ «3
Í*»S
Q>
«3 cs sx
Ό w <ESS v„ i*». τί£Γ £X >
ύς-vf c
<: cm o cet oe2 e , 5__ o í ACyc<l«i«^*,^»yx«<eya‘W»^XwA,ii^iiin<ii>y)ewMJMW<i»y<ie«i<y«ie»iMywywwyy^t^ao»»cywit'Íy .igQwayMww^iwM^S^wW^tfwwwiwwWYftt
Aí A2 ASl A82 AS3 83 82 Cl C2 n = s,
Anííprohferativ aktivitás
AníMráhs aktivitás (vad típus %-a) / Α,φιφΛ*. Αφ,.’ί Φ.,'λΐ « φ.
*»»/ βΕ ~ö— béta- i F M~ 1 a PEG-béta-lFN-1; kontrol!
Hőhíérséktet (°C) is de
2-d
SS —
Antiviráhs SáKtrvilíás <E~/rr&t>
oo «u θ/Ζ
8/1
1 TCC«S«€ ATCATCATCA YCATCATACC TCCGSASACS AWGACAA GATGAGCTAC AGGCCCCCSG TAGTACTACT ÁGTASTATCG ASSCCYaSC TACTACTGTT CTACTCGATG
1 >$er 61 y Gi y Η IsHlsHisHi sHI^HHSer SerGfyAepA spAspAspky sAfetSerTyr
SX MCTTGCTTG &ATT££TACA AASAAGCASC AATTTTCÁST GTCAGAAGCT CCTGTGGCAA TTSAACGAAC CTAAGSATGT TTCTTCSTCC TTAAAAGTCA CACTCTTCGA GSACACCGTT
21 1-AsRkmikeúG lyRwkeuGt nArgSerSer ^«RseGInC ysGInLysks uteuTrpGIn
121 TTSAATGSCA SSCTTOATA CTSCCTCAAS GAÍASGAYGA ACTTTSACAY CCCTGASSAC AAOTACCCT CCGAACTTAT SACSGACTTC CTGTCHACY TSAAACTSTA GSGACTCXTC
41 >L®uA$nG§yA rgkeoGloTy rOyskeutys
ISI ATTAASCAGC TSCAGCAGTT CCASAASGAG TAATTCGTCS ACSTCGTCAA GSTCTTCCTC
Sl M Í«Lys6fnk euGInGInRh «GlntysGIu
241 CASAACATCT TTSCTATYTT CAGACAASAT GFCTTCTAGA AACGATAAAA STCTGTTCTA
SX AGfnAsmi 1 eP twÁl&HePh eArgSInAsp
3@1 OTSASAACC TCCTSGCTAA TGTCTATCAT CAACTCTTSG ASGACCGATT ACAGATA6TA
101 > WI Gl uAsnL euteuAI &As e WI Tyr Hl §
361 GAAAAACTSG AGAÁASAÁGA TTYCACCASG CTTTTTGACC TCTTTCTTCT AAASiaCTCC
121 ^-Gl ukyekeuG I ukysGI uAs gPbeThrAr g
421 AGATATTATG GGAGSATTCT GCATTACCTG TCTATAATAC CCTCCTAASA C6TAAT6CAC
141 PAr gTyr Tyr G I yAr g I1 eke uHI sTyr teu
481 ACCATAGTCA GAGTSGAAAT CCTAAGGAAC TCCTATCAGT CTCACCTTTA C6ATTCCTTC
161 >Thr II eW1 A rgVsIGIull ekeuArgAsn
541 CTCCGAAAC
SASCCTTTG ISI >LeuAr gÁsn
As pAr gMe tA s nPhe&s ρ f I eFr ©Gl gGI u
6Αε6εεδ€ΑΤ TSÁCCATtTA TSAGATSCTC CTGCSSCGTA ACTSGTASAT ACTtTACGAS AspAI &A1 ak euTbr 11 «Ty r Gl
TCATCTAGCA CYGGCTGSAA: TGAGACTATT ÁSTAWCGT GACCGACCTT ACTCTGATAA Ser Ser Ser T brGíyTrgAs nGluTbrHe
CASATAAACC ATCT6AA6AC ASTCCTGGAA stctatytcs tagaotctg tcaggacctt GínlleAsbH IskeutysTb rWtLéoStö
GGAAAACTCA TGAGCAGTCT 6CACCT6AAA CCTTTT6A6T AkTCGTCAGA CGTGGACTTT GlykyskmA) etSerSerLe uHI sLeutys
AASSCCAAGS ACTACAGTCA CT6TGCCTG6 TTCCGSTTCC TCATSTCAGT 6ACACG6ACC LysAf akysG I wTyr Ser Hl sCysAI sTr p
TTTIAOTCA TTAACAGACT TACAGGTTAC AAAATCAACT AATTGTCTGA AT6TCCAATG PheTyrPhel leAsnArgke uTbrGlyTyr
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10457298P | 1998-10-16 | 1998-10-16 | |
US12016199P | 1999-02-16 | 1999-02-16 | |
PCT/US1999/024201 WO2000023114A2 (en) | 1998-10-16 | 1999-10-15 | Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUP0200444A2 HUP0200444A2 (en) | 2002-06-29 |
HU229888B1 true HU229888B1 (en) | 2014-11-28 |
Family
ID=26801696
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU0200444A HU229888B1 (en) | 1998-10-16 | 1999-10-15 | Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses |
Country Status (30)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6962978B2 (hu) |
EP (4) | EP2260872B1 (hu) |
JP (5) | JP4616478B2 (hu) |
KR (1) | KR100630849B1 (hu) |
CN (2) | CN101062419B (hu) |
AT (1) | ATE318149T1 (hu) |
AU (1) | AU762616B2 (hu) |
BR (1) | BRPI9915542C1 (hu) |
CA (1) | CA2345138C (hu) |
CY (2) | CY1105022T1 (hu) |
CZ (1) | CZ299164B6 (hu) |
DE (1) | DE69930015T2 (hu) |
DK (2) | DK1656952T3 (hu) |
EA (1) | EA004789B9 (hu) |
EE (2) | EE04967B1 (hu) |
ES (4) | ES2257884T3 (hu) |
HK (2) | HK1042434B (hu) |
HU (1) | HU229888B1 (hu) |
IL (2) | IL142282A0 (hu) |
IS (1) | IS2926B (hu) |
LT (2) | LT2599503T (hu) |
NO (1) | NO20011860L (hu) |
NZ (1) | NZ510689A (hu) |
PL (1) | PL206536B1 (hu) |
PT (2) | PT1656952E (hu) |
SG (2) | SG2008070138A (hu) |
SI (2) | SI1656952T1 (hu) |
SK (1) | SK287918B6 (hu) |
TR (1) | TR200101086T2 (hu) |
WO (1) | WO2000023114A2 (hu) |
Families Citing this family (103)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69931507T2 (de) * | 1998-10-16 | 2007-01-11 | Biogen Idec Ma Inc., Cambridge | Interferon-beta fusionsproteine und deren verwendungen |
EP2260872B1 (en) * | 1998-10-16 | 2017-08-30 | Biogen MA Inc. | Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof |
US7431921B2 (en) | 2000-04-14 | 2008-10-07 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules |
US6531122B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
KR20020034181A (ko) * | 1999-08-27 | 2002-05-08 | 맥시겐 에이피에스 | 새로운 인터페론 베타-유사 분자 |
US7144574B2 (en) | 1999-08-27 | 2006-12-05 | Maxygen Aps | Interferon β variants and conjugates |
US20030211094A1 (en) | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
WO2002036628A2 (en) * | 2000-11-02 | 2002-05-10 | Maxygen Aps | New multimeric interferon beta polypeptides |
EP2080771A3 (en) | 2001-02-27 | 2010-01-06 | Maxygen Aps | New interferon beta-like molecules |
US6887462B2 (en) * | 2001-04-09 | 2005-05-03 | Chiron Corporation | HSA-free formulations of interferon-beta |
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7696163B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
PT2279755E (pt) * | 2001-10-10 | 2014-06-04 | Ratiopharm Gmbh | Remodelação e glicoconjugação do factor de crescimento de fibroblastos (fgf) |
WO2003061577A2 (en) * | 2002-01-18 | 2003-07-31 | Biogen Idec Ma Inc. | Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound |
WO2004020468A2 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules for treatment of cancer |
ATE466085T1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-05-15 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
NZ565990A (en) * | 2002-09-27 | 2009-10-30 | Biogen Idec Inc | Therapies for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy using interferon-beta |
US8129330B2 (en) | 2002-09-30 | 2012-03-06 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
US20040062748A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
TWI406672B (zh) | 2002-12-26 | 2013-09-01 | Mountain View Pharmaceuticals | 生物效力增進的β干擾素聚合物共軛體 |
BR0317752A (pt) * | 2002-12-26 | 2005-11-22 | Mountain View Pharmaceuticals | Conjugados poliméricos de citocinas, quimiocinas, fatores do crescimento, hormÈnios polipeptìdicos e seus antagonistas com atividade de ligação a receptores conservada |
JP2006523211A (ja) | 2003-03-14 | 2006-10-12 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 分岐水溶性ポリマーとその複合物 |
US20050079155A1 (en) * | 2003-03-20 | 2005-04-14 | Xencor, Inc. | Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages |
CA2530725A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-10-07 | Biopolymed Inc. | Biologically active material conjugated with biocompatible polymer with 1:1 complex, preparation method thereof and pharmaceutical composition comprising the same |
US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
EP1615945B1 (en) | 2003-04-09 | 2011-09-28 | BioGeneriX AG | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7691603B2 (en) | 2003-04-09 | 2010-04-06 | Novo Nordisk A/S | Intracellular formation of peptide conjugates |
CA2522989A1 (en) * | 2003-05-21 | 2004-12-02 | Ares Trading S.A. | Method of chromatographic analysis of a protein solution |
US9005625B2 (en) | 2003-07-25 | 2015-04-14 | Novo Nordisk A/S | Antibody toxin conjugates |
ES2452640T3 (es) | 2003-08-25 | 2014-04-02 | Toray Industries, Inc. | Complejo de interferón beta |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
EP1765853B1 (en) | 2004-01-08 | 2015-10-28 | ratiopharm GmbH | O-linked glycosylation of G-CSF peptides |
GB2429207A (en) | 2004-02-02 | 2007-02-21 | Ambrx Inc | Modified human interferon polypeptides and their uses |
EP1734988A4 (en) * | 2004-03-01 | 2009-08-05 | Enzon Pharmaceuticals Inc | INTERFERON BETA-polymer |
WO2005112911A2 (en) * | 2004-05-21 | 2005-12-01 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for treating myelin deficiency disorders |
AU2005260664A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Egen Corporation | Pegylated interferon alpha-1b |
WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
US8268967B2 (en) | 2004-09-10 | 2012-09-18 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated interferon α |
EP3061461A1 (en) | 2004-10-29 | 2016-08-31 | ratiopharm GmbH | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
WO2006074467A2 (en) | 2005-01-10 | 2006-07-13 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
EP1871795A4 (en) | 2005-04-08 | 2010-03-31 | Biogenerix Ag | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE |
EP1891231A4 (en) | 2005-05-25 | 2011-06-22 | Novo Nordisk As | GLYCOPEGYLATED FACTOR IX |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
EP1937294A4 (en) * | 2005-10-21 | 2009-11-04 | Synageva Biopharma Corp | GLYCOLIC AND GLYCOSYLATED THERAPEUTIC PROTEINS DERIVED FROM POULTRY |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
CA2626056A1 (en) * | 2005-11-18 | 2007-05-24 | Ares Trading S.A. | Interferon in influenza |
EP1971355B1 (en) | 2005-12-20 | 2020-03-11 | Duke University | Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties |
CN100475270C (zh) * | 2006-01-20 | 2009-04-08 | 清华大学 | 一种治疗肿瘤的药物及其应用 |
WO2007110231A2 (en) * | 2006-03-28 | 2007-10-04 | Nautilus Biotech, S.A. | MODIFIED INTERFERON-β (IFN-β) POLYPEPTIDES |
US7645860B2 (en) | 2006-03-31 | 2010-01-12 | Baxter Healthcare S.A. | Factor VIII polymer conjugates |
US7982010B2 (en) | 2006-03-31 | 2011-07-19 | Baxter International Inc. | Factor VIII polymer conjugates |
US7985839B2 (en) | 2006-03-31 | 2011-07-26 | Baxter International Inc. | Factor VIII polymer conjugates |
EP2010222A1 (en) | 2006-03-31 | 2009-01-07 | Baxter International Inc. | Pegylated factor viii |
US8637325B2 (en) * | 2009-02-16 | 2014-01-28 | University Of Wyoming | Method and apparatus for pyrolysis-induced cleavage in peptides and proteins |
CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
JP5570809B2 (ja) | 2006-09-01 | 2014-08-13 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 修飾タンパク質 |
AU2007296843C1 (en) * | 2006-09-15 | 2012-08-16 | Creabilis Therapeutics S.P.A. | Polymer conjugates of Box-A of HMGB1 and Box-A variants of HMGB1 |
EP2054521A4 (en) | 2006-10-03 | 2012-12-19 | Novo Nordisk As | METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES |
WO2008074032A1 (en) | 2006-12-15 | 2008-06-19 | Baxter International Inc. | Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life |
EP2111230A4 (en) * | 2006-12-19 | 2010-11-17 | Merrimack Pharmaceuticals Inc | COMMON ADMINISTRATION OF ALPHA-FETOPROTEIN AND AN IMMUNOMODULATING AGENT TO TREAT MULTIPLE SCLEROSE |
CA2682897C (en) | 2007-04-03 | 2016-11-22 | Biogenerix Ag | Methods of treatment using glycopegylated g-csf |
EP2076533B1 (en) | 2007-05-02 | 2014-10-08 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
JP5933923B2 (ja) * | 2007-10-09 | 2016-06-22 | ポリテリクス リミテッド | 新規な複合タンパク質及びペプチド |
PL2234645T3 (pl) | 2007-12-20 | 2012-10-31 | Merck Serono Sa | Preparaty interferonu-beta modyfikowanego PEG |
NZ586947A (en) | 2008-02-08 | 2012-11-30 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
CN101965200B (zh) | 2008-02-27 | 2013-06-19 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 缀合的因子ⅷ分子 |
ES2525065T3 (es) | 2008-04-11 | 2014-12-17 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Ligadores de seroalbúmina humana y sus conjugados |
CA2721870C (en) | 2008-04-21 | 2020-12-22 | Tissue Regeneration Therapeutics, Inc. | Genetically modified human umbilical cord perivascular cells for prophylaxis against or treatment of biological or chemical agents |
US10138283B2 (en) | 2008-07-23 | 2018-11-27 | Ambrx, Inc. | Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses |
KR20110112301A (ko) | 2008-11-18 | 2011-10-12 | 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. | 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트 |
GB0912485D0 (en) * | 2009-07-17 | 2009-08-26 | Polytherics Ltd | Improved conjugation method |
US9266942B2 (en) | 2009-04-30 | 2016-02-23 | Children's Hospital & Research Center Oakland | Chimeric factor H binding proteins (fHbp) and methods of use |
BRPI1012951A2 (pt) * | 2009-06-09 | 2016-07-26 | Defyrus Inc | "administração de interferon para profilaxia ou tratamento de infecção por patôgeno" |
US8809501B2 (en) | 2009-07-27 | 2014-08-19 | Baxter International Inc. | Nucleophilic catalysts for oxime linkage |
DK2459224T3 (en) | 2009-07-27 | 2016-07-25 | Baxalta GmbH | Blodstørkningsproteinkonjugater |
AU2010277438B2 (en) | 2009-07-27 | 2015-08-20 | Baxalta GmbH | Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins |
US8642737B2 (en) | 2010-07-26 | 2014-02-04 | Baxter International Inc. | Nucleophilic catalysts for oxime linkage |
EP3093029A1 (en) | 2009-07-27 | 2016-11-16 | Baxalta GmbH | Blood coagulation protein conjugates |
WO2011087810A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-07-21 | Ambrx, Inc. | Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses |
MX349301B (es) | 2009-12-21 | 2017-07-21 | Ambrx Inc | Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos. |
CN101906213B (zh) * | 2010-07-23 | 2012-12-05 | 华南理工大学 | 一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法 |
CN103068853B (zh) * | 2010-08-19 | 2016-08-10 | Peg生物制药公司 | 协同性生物分子-聚合物轭合物 |
TWI480288B (zh) | 2010-09-23 | 2015-04-11 | Lilly Co Eli | 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物 |
NZ608630A (en) * | 2010-10-01 | 2015-03-27 | Biogen Idec Inc | Interferon-beta for use as monotherapy or in combination with other cancer therapies |
CA2822591C (en) | 2010-12-22 | 2020-12-29 | Baxter International Inc. | Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein |
MY168902A (en) | 2011-10-01 | 2018-12-04 | Glytech Inc | Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same |
CN104136038A (zh) | 2012-02-29 | 2014-11-05 | 东丽株式会社 | 体腔积液抑制剂 |
WO2014036520A1 (en) | 2012-08-30 | 2014-03-06 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapies comprising anti-erbb3 agents |
CA2908211C (en) | 2013-03-29 | 2022-07-19 | Glytech, Inc. | Polypeptide glycosylated with sialylated sugar chain |
WO2016013911A1 (ko) | 2014-07-24 | 2016-01-28 | 에이비온 주식회사 | 페길화된 인터페론 -베타 변이체 |
CA3023883A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | Orionis Biosciences Nv | Targeted mutant interferon-beta and uses thereof |
KR102642385B1 (ko) | 2017-02-06 | 2024-03-04 | 오리오니스 바이오사이언시스 엔브이 | 표적화된 키메라 단백질 및 이의 용도 |
RU2661088C1 (ru) * | 2017-05-24 | 2018-07-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза |
WO2019152979A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | Orionis Biosciences, Inc. | Fibroblast binding agents and use thereof |
RU2739261C1 (ru) * | 2019-12-31 | 2020-12-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека |
CA3207652A1 (en) | 2021-03-26 | 2022-09-29 | Stephanie Cornen | Cytokine anchors for nkp46-binding nk cell engager proteins |
WO2022258678A1 (en) | 2021-06-09 | 2022-12-15 | Innate Pharma | Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a |
EP4352098A1 (en) | 2021-06-09 | 2024-04-17 | Innate Pharma | Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a |
WO2022258691A1 (en) | 2021-06-09 | 2022-12-15 | Innate Pharma | Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a |
Family Cites Families (94)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
DE2360794C2 (de) * | 1973-12-06 | 1984-12-06 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von Peptiden |
CH596313A5 (hu) * | 1975-05-30 | 1978-03-15 | Battelle Memorial Institute | |
IL47468A (en) | 1975-06-12 | 1979-05-31 | Rehovot Res Prod | Process for the cross-linking of proteins using water soluble cross-linking agents |
US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US5179017A (en) | 1980-02-25 | 1993-01-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4456748A (en) | 1981-02-23 | 1984-06-26 | Genentech, Inc. | Hybrid human leukocyte interferons |
WO1982002715A1 (fr) | 1981-02-04 | 1982-08-19 | Sugano Haruo | Gene d'interferon (beta)humain |
US4414147A (en) * | 1981-04-17 | 1983-11-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons |
IT1167610B (it) | 1982-01-19 | 1987-05-13 | Cetus Corp | Interfreron ibrido multiclasse, composizione farmaceutica che lo contiene e procedimento di produzione |
US5149636A (en) | 1982-03-15 | 1992-09-22 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products |
US4695543A (en) | 1982-03-23 | 1987-09-22 | Bristol-Myers Company | Alpha Interferon GX-1 |
US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
US4609546A (en) | 1982-06-24 | 1986-09-02 | Japan Chemical Research Co., Ltd. | Long-acting composition |
US4470461A (en) | 1982-09-30 | 1984-09-11 | Phillips Petroleum Company | Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes |
US4588585A (en) * | 1982-10-19 | 1986-05-13 | Cetus Corporation | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins |
GB8334102D0 (en) | 1983-12-21 | 1984-02-01 | Searle & Co | Interferons with cysteine pattern |
EP0154316B1 (en) | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
GB8412564D0 (en) * | 1984-05-17 | 1984-06-20 | Searle & Co | Structure and properties |
CA1302320C (en) | 1984-06-11 | 1992-06-02 | Hideo Niwa | Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells |
US5231176A (en) | 1984-08-27 | 1993-07-27 | Genentech, Inc. | Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons |
FI90990C (fi) | 1984-12-18 | 1994-04-25 | Boehringer Ingelheim Int | Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
EP0205404B1 (en) | 1985-06-11 | 1992-07-15 | Ciba-Geigy Ag | Hybrid interferons |
DE3676670D1 (de) * | 1985-06-26 | 1991-02-07 | Cetus Corp | Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung. |
US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US4917888A (en) | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US4935233A (en) | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
JP2514950B2 (ja) | 1986-03-10 | 1996-07-10 | エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー | 化学修飾蛋白質,その製造法および中間体 |
JPS63152393A (ja) | 1986-07-03 | 1988-06-24 | Takeda Chem Ind Ltd | グリコシル誘導体 |
US5183746A (en) | 1986-10-27 | 1993-02-02 | Schering Aktiengesellschaft | Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β- |
US4894226A (en) | 1986-11-14 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation |
US5004605A (en) | 1987-12-10 | 1991-04-02 | Cetus Corporation | Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon |
US4904584A (en) | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
US5135919A (en) | 1988-01-19 | 1992-08-04 | Children's Medical Center Corporation | Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis |
US4847325A (en) | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
US4847625A (en) * | 1988-02-16 | 1989-07-11 | Ford Aerospace Corporation | Wideband, aperture-coupled microstrip antenna |
CA1340810C (en) | 1988-03-31 | 1999-11-02 | Motoo Yamasaki | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
GB8824591D0 (en) | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Fractionation process |
JPH04502011A (ja) | 1988-11-23 | 1992-04-09 | ジェネンテク,インコーポレイテッド | ポリペプチド誘導体 |
CA2006596C (en) | 1988-12-22 | 2000-09-05 | Rika Ishikawa | Chemically-modified g-csf |
US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
US5166322A (en) * | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
US5286637A (en) | 1989-08-07 | 1994-02-15 | Debiopharm, S.A. | Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same |
JPH04218000A (ja) | 1990-02-13 | 1992-08-07 | Kirin Amgen Inc | 修飾ポリペプチド |
US5252714A (en) | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
ES2199935T3 (es) | 1991-03-15 | 2004-03-01 | Amgen Inc. | Pegilacion de polipeptidos. |
US5595732A (en) | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
WO1993000109A1 (en) | 1991-06-28 | 1993-01-07 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response using growth hormone |
US5281698A (en) | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
AU3423293A (en) * | 1991-12-19 | 1993-07-19 | Baylor College Of Medicine | Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression |
ZA933926B (en) * | 1992-06-17 | 1994-01-03 | Amgen Inc | Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules |
US5382657A (en) | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
AU5098193A (en) | 1992-09-01 | 1994-03-29 | Berlex Laboratories, Inc. | Glycolation of glycosylated macromolecules |
US5306344A (en) * | 1992-12-02 | 1994-04-26 | Edward C. Levy Company | Mixture of portland cement concrete materials for freeze/thaw resistance |
US5298410A (en) | 1993-02-25 | 1994-03-29 | Sterling Winthrop Inc. | Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life |
US5359030A (en) | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
US5681811A (en) | 1993-05-10 | 1997-10-28 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
US5874075A (en) | 1993-10-06 | 1999-02-23 | Amgen Inc. | Stable protein: phospholipid compositions and methods |
US5641656A (en) | 1993-10-22 | 1997-06-24 | University Of Connecticut | Nucleic acids encoding avian interferon (IFN) proteins and recombinant methods using them |
US5605976A (en) | 1995-05-15 | 1997-02-25 | Enzon, Inc. | Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids |
US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
AU691225B2 (en) | 1993-11-10 | 1998-05-14 | Schering Corporation | Improved interferon polymer conjugates |
US5951974A (en) | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
DE69521880T2 (de) | 1994-02-08 | 2002-01-03 | Amgen Inc | Orales verabreichungssystem von chemischmodifizierten proteinen g-csf |
US5545723A (en) * | 1994-03-15 | 1996-08-13 | Biogen Inc. | Muteins of IFN-β |
US5639725A (en) | 1994-04-26 | 1997-06-17 | Children's Hospital Medical Center Corp. | Angiostatin protein |
GB9415379D0 (en) * | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
US5738846A (en) | 1994-11-10 | 1998-04-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates and process for preparing the same |
AU697440B2 (en) * | 1994-12-07 | 1998-10-08 | Novozymes A/S | Polypeptide with reduced allergenicity |
US5672662A (en) * | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
US5702717A (en) | 1995-10-25 | 1997-12-30 | Macromed, Inc. | Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers |
US5908621A (en) | 1995-11-02 | 1999-06-01 | Schering Corporation | Polyethylene glycol modified interferon therapy |
US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
US5747639A (en) * | 1996-03-06 | 1998-05-05 | Amgen Boulder Inc. | Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols |
DE69800640T2 (de) | 1997-01-29 | 2001-07-05 | Polymasc Pharmaceuticals Plc L | Pegylationsverfahren |
US5990237A (en) | 1997-05-21 | 1999-11-23 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines |
WO1999003887A1 (en) | 1997-07-14 | 1999-01-28 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins |
US6180095B1 (en) | 1997-12-17 | 2001-01-30 | Enzon, Inc. | Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents |
US5985263A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
US5981709A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-09 | Enzon, Inc. | α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same |
US5965119A (en) | 1997-12-30 | 1999-10-12 | Enzon, Inc. | Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents |
ATE268609T1 (de) | 1998-03-12 | 2004-06-15 | Nektar Therapeutics Al Corp | Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen |
JP4574007B2 (ja) * | 1998-04-28 | 2010-11-04 | メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム | ポリオール−ifn−ベータ複体 |
US6703381B1 (en) * | 1998-08-14 | 2004-03-09 | Nobex Corporation | Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier |
EP2260872B1 (en) * | 1998-10-16 | 2017-08-30 | Biogen MA Inc. | Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof |
DE69931507T2 (de) * | 1998-10-16 | 2007-01-11 | Biogen Idec Ma Inc., Cambridge | Interferon-beta fusionsproteine und deren verwendungen |
US6531122B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
KR20020034181A (ko) * | 1999-08-27 | 2002-05-08 | 맥시겐 에이피에스 | 새로운 인터페론 베타-유사 분자 |
US7144574B2 (en) | 1999-08-27 | 2006-12-05 | Maxygen Aps | Interferon β variants and conjugates |
US6495659B2 (en) | 1999-12-22 | 2002-12-17 | Shearwater Corporation | Sterically hindered poly(ethylene glycol) alkanoic acids and derivatives thereof |
US9506008B2 (en) | 2013-12-23 | 2016-11-29 | Exxonmobil Research And Engineering Company | Method for improving engine fuel efficiency |
-
1999
- 1999-10-15 EP EP10182477.9A patent/EP2260872B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 EA EA200100446A patent/EA004789B9/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 CZ CZ20011329A patent/CZ299164B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 EP EP99970609A patent/EP1121156B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 ES ES99970609T patent/ES2257884T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 ES ES06003415.4T patent/ES2447772T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 LT LTEP12198907.3T patent/LT2599503T/lt unknown
- 1999-10-15 SG SG2008070138A patent/SG2008070138A/en unknown
- 1999-10-15 ES ES12198907.3T patent/ES2630278T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 IL IL14228299A patent/IL142282A0/xx active IP Right Grant
- 1999-10-15 PT PT60034154T patent/PT1656952E/pt unknown
- 1999-10-15 EP EP12198907.3A patent/EP2599503B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 AT AT99970609T patent/ATE318149T1/de active
- 1999-10-15 KR KR1020017004800A patent/KR100630849B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 1999-10-15 ES ES10182477.9T patent/ES2653589T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 SI SI9931074T patent/SI1656952T1/sl unknown
- 1999-10-15 TR TR2001/01086T patent/TR200101086T2/xx unknown
- 1999-10-15 PT PT99970609T patent/PT1121156E/pt unknown
- 1999-10-15 SK SK506-2001A patent/SK287918B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 EP EP06003415.4A patent/EP1656952B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 HU HU0200444A patent/HU229888B1/hu unknown
- 1999-10-15 DK DK06003415.4T patent/DK1656952T3/da active
- 1999-10-15 AU AU14465/00A patent/AU762616B2/en active Active
- 1999-10-15 BR BRPI9915542A patent/BRPI9915542C1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 EE EEP200100220A patent/EE04967B1/xx unknown
- 1999-10-15 DE DE69930015T patent/DE69930015T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 SG SG200302608A patent/SG110047A1/en unknown
- 1999-10-15 CN CN200710112119.8A patent/CN101062419B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 EE EEP200700058A patent/EE05201B1/xx unknown
- 1999-10-15 WO PCT/US1999/024201 patent/WO2000023114A2/en active IP Right Grant
- 1999-10-15 JP JP2000576887A patent/JP4616478B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 NZ NZ510689A patent/NZ510689A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 PL PL347968A patent/PL206536B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 CA CA002345138A patent/CA2345138C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 DK DK99970609T patent/DK1121156T3/da active
- 1999-10-15 SI SI9930890T patent/SI1121156T1/sl unknown
- 1999-10-15 CN CNB998122025A patent/CN1329082C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-27 IL IL142282A patent/IL142282A/en active Protection Beyond IP Right Term
- 2001-03-30 IS IS5913A patent/IS2926B/is unknown
- 2001-04-11 NO NO20011860A patent/NO20011860L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-04-11 US US09/832,658 patent/US6962978B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-05-21 HK HK02103771.7A patent/HK1042434B/zh not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-03-16 US US10/802,540 patent/US7446173B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-05-02 CY CY20061100568T patent/CY1105022T1/el unknown
- 2006-10-12 JP JP2006279334A patent/JP2007063283A/ja active Pending
- 2006-10-16 HK HK06111314.0A patent/HK1089393A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-03-20 US US12/077,605 patent/US20090104150A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-09-14 JP JP2010206172A patent/JP5396358B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-02-10 JP JP2011027941A patent/JP2011093937A/ja not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-08-16 US US13/587,242 patent/US9314534B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-03-14 CY CY20141100207T patent/CY1115125T1/el unknown
- 2014-03-26 JP JP2014064230A patent/JP5863865B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-04-18 US US15/131,233 patent/US20160250340A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-10-05 LT LTPA2017030C patent/LTC2599503I2/lt unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU229888B1 (en) | Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses | |
JP2002527491A5 (hu) | ||
TWI375716B (en) | Recombinant human interferon-like proteins | |
EP1717246B1 (en) | Tnf antagonists and tnf inhibitors comprising the same as the active ingredient | |
WO2011050709A1 (zh) | 白细胞介素-1受体拮抗剂用于制备预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤的药物的用途 | |
CA2477577A1 (en) | Interferon beta-like molecules for treatment of stroke | |
KR20060034286A (ko) | 개량된 재조합 인간 인터페론-베타-1b 폴리펩티드 | |
MXPA01003791A (es) | Conjugados polimericos de interferon beta - 1a y usos de los mismos |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HC9A | Change of name, address |
Owner name: BIOGEN IDEC MA INC., US Free format text: FORMER OWNER(S): BIOGEN INC., US |