JP2001526540A

JP2001526540A - Ｈｇｆポリペプチド及び治療におけるその使用

Info

Publication number: JP2001526540A
Application number: JP54889698A
Authority: JP
Inventors: ゲラルディ，エルマッノ; ビルヒマイアー，ヴァルター; ハートマン，ギドー
Original assignee: インペリアルキャンサーリサーチテクノロジーリミテッド
Priority date: 1997-05-10
Filing date: 1998-05-07
Publication date: 2001-12-18
Also published as: CA2289720A1; DE69821930D1; WO1998051798A1; GB9709453D0; AU7343898A; EP0981620A1; DK0981620T3; EP0981620B1; DE69821930T2; ATE260341T1; ES2219888T3

Abstract

(57)【要約】医薬における使用のための、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターに対して結合可能である変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＧＦポリペプチド及び治療におけるその使用本発明は、ポリペプチド及び治療におけるその使用、特に治療における突然変異体肝細胞増殖因子の使用に関する。散乱因子(scatter factor:SF)としても周知である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、標的細胞における増殖、移動及び分化を誘導するポリペプチド増殖因子である。ＨＧＦは一本鎖前駆体として合成され、それが活性な二本鎖形態に蛋白分解的に切断される。ＨＧＦの活性形態は、ｃ−ｍｅｔガン遺伝子によってコードされるチロシンキナーゼレセプター（ＭＥＴ）に結合することによってその効果を仲介すると解される。野生型ＨＧＦは、多くの治療上の使用の可能性を有する。しかしながら、野生型ＨＧＦは、血漿から迅速に除去される(ｔ^1/2はおよそ４．５分)。クリアランス速度は、投与の前にヘパリンまたは他のポリアニオンにＨＧＦを複合体化することによっていくらか減少できる。 Matsumoto等（1991）Biochcm.Biophys.Res.Comm.181,691-699は、ＨＧＦ中のクリングルドメインまたはＮ末端ヘアピン構造の欠失が、関連する生物学的活性の顕著な減少を導くことを記載する。 Miau等（1996）Biochem.Biophys.Res.Comm.223,487-491は、脾臓由来間質細胞によって分泌された新規な変異体ＨＧＦの同定を記載する。 Lokker等（1994）Prot.Eng.7,895-903は、ＨＧＦのＮ末端クリングル含有ドメインの突然変異分析及び分子モデリングを記載し、ｃ−Ｍｅｔレセプターとの相互作用のために重要なアミノ酸側鎖を同定する。 Mizuno等（1994）J.Biol.Chem.269,1131-1136は、ヘアピンループまたはクリングルドメインが欠失されている突然変異体を記載する。 Schwall等（1996）J.Cell Biol.133,709-718は、ヘパリンが、ＨＧＦの切り詰めた変異体であるＨＧＦアンタゴニストＮＫ１及びＮＫ２に対するダイマー形成を誘導し、増殖活性を与えることを報告する。 Lokker等（1992）EMBO J.11,2503-2510は、ＨＧＦの各種の突然変異体を記載する。国際特許出願WO 92/05184及びWO 96/40914は、ＨＧＦの活性と意図的に拮抗するＨＧＦの切り詰めた形態に関する。国際特許出願WO 93/23541，米国特許US 5,547,856，US 5,316,921及びUS 5,58 0,963は、タンパク質溶解性切断に耐性であるＨＧＦ変異体に関する。米国特許US 5,464,815は、ヘパリン結合タンパク質の血漿半減期を伸長する方法を記載する。国際特許出願WO 96/28475は、ポリエチレングリコールを使用して修飾されたＨＧＦを記載する。本発明は、ヘパリンまたはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を結合する顕著に減少した能力を有するが、ＨＧＦレセプター（ＭＥＴ）に対する結合は可能であるＨＧＦ変異体を記載する。これらの変異体の少なくともいくつかは、ラットに投与した場合、野生型ＨＧＦよりも長いインビボでの循環半減期、及びより大きいマイトジェン活性を有する。それ故、本発明の一つの目的は、薬物生体反応及びインビボでの活性を改良するために、ヘパリン様化合物または他のポリアニオンとＨＧＦを複合体化する必要性を克服することである。本発明の変異体ＨＧＦ分子は、野生型ＨＧＦと実質的に同様な態様でＨＧＦレセプターを活性化し、またはそれらは野生型ＨＧＦのアンタゴニストとして機能し、またはいくつかの他の態様で機能する。いずれの場合でも、変異体ＨＧＦ分子は医薬において有用である。本発明の第一の態様は、医薬における使用のための、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターに結合可能である変異体肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を提供する。用語、「変異体肝細胞増殖因子」は、野生型形態から一次アミノ酸構造を変化した肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を意味する。例えば、ヒトＨＧＦの野生型形態のアミノ酸配列は、図７に示される。特定のポリペプチド、特にヒトから得たものは多型的であり、ヒトＨＧＦ配列のいくつかの天然のバリエーションが存在し、ＨＧＦがヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を結合し、ＨＧＦレセプターを結合可能であり、周知の生物学的効果を生ずることを条件に、上記ヒトＨＧＦ分子は野生型であると解されることが予測されるであろう。用語、「ＨＳＰＧを実質的に結合できない」は、変異体ＨＧＦが野生型ＨＧＦよりも顕著にＨＳＰＧを結合しないという意味を含む。もし変異体ＨＧＦが、野生型ＨＧＦよりも少なくとも１０倍ＨＳＰＧを結合しない、好ましくは少なくとも２０倍結合しない、またさらに好ましくは５０倍結合しない、最も好ましくは少なくとも１００倍結合しないのであれば好ましい。利便的に、野生型ＨＧＦ及び変異体ＨＧＦのＨＳＰＧ結合能力は、実施例１中に記載された実施例１中の細胞によって生産されるＨＳＰＧを参考として測定される。好ましくは、変異体ＨＧＦは、ヘパリンに対する減少した親和性を有する。常ではないが、典型的には、本発明の変異体ＨＧＦは、ヘパリン及びＨＳＰＧの両者を結合する減少した能力を有するであろう。利便的に、ここで開示される変異体ＨＧＦは、野生型ＨＧＦよりも顕著にヘパリンを結合しないものである。もし変異体ＨＧＦが、野生型ＨＧＦよりも少なくとも１０倍ヘパリンを結合しない、好ましくは少なくとも２０倍結合しない、またさらに好ましくは少なくとも５０倍結合しない、最も好ましくは少なくとも１００倍結合しないのであれば好ましい。利便的に、野生型ＨＧＦ及び変異体ＨＧＦのヘパリン結合活性は、実施例１に記載された方法を使用して測定される。いずれの場合にも、適切には、変異体ＨＧＦは、野生型ＨＧＦ（少なくともＨＧＦのアンタゴニストではない変異体）と実質的に同じ標的細胞に対するマイトジェン及びモートジェン(motogenic)活性を有する。好ましくは、野生型ＨＧＦまたは変異体ＨＧＦのＮＫ２断片が、ヘパリンに対する結合親和性を測定するために使用される。実施例１の方法を使用して、野生型ヒトＨＧＦは、〜１×１０^-9Ｍ（１ｎＭ）のモル解離定数（Ｋ_d）を有し、野生型ＨＧＦのＮＫ２断片は、ヘパリンについて約２．３ｎＭのモル解離定数（Ｋ_d ）を有する。ＮＫ２の天然で生ずる形態は、一次ＨＧＦ転写物の選択的スプライシングの産物であり、リーダー配列(残基１−３１)、ヘアピンループを含むＮドメイン(残基７０−９６)、クリングル１(残基１２８−２０６)、クリングル２（残基２１１−２８８）及びクリングル２の後の余分な３残基（残基２８９−２９１）をコードする。用語、「ＨＧＦレセプターに結合可能」は、変異体ＨＧＦが、実施例１で記載されるように野生型ＨＧＦと実質的に同じＨＧＦレセプター（ＭＥＴ）の可溶性形態に対する親和性を有して結合できるという意味を含む。疑義を避けるために、本発明の変異体ＨＧＦは、内因性の（または野生型）ＨＧＦによる（ａ）レセプターの活性化または（ｂ）レセプターシグナリングの阻害のいずれかを導くＨＧＦレセプターを結合可能なＨＧＦ変異体を含む。好ましくは、変異体ＨＧＦは、野生型ＨＧＦの０．１から１０倍の間の親和性を有してＨＧＦレセプターに結合する。好ましくはある場合には、ＨＧＦの変異体はＨＧＦのアンタゴニストではなく、いくつかの変異体については、ＭＥＴを含みＭＥＴに対するＨＧＦの結合に対して応答できる細胞において、ＭＥＴに対して変異体ＨＧＦを結合する効果は、ＭＥＴに対して野生型ＨＧＦを結合する効果と実質的に同様である。それ故これらの場合には、ＨＧＦのアンタゴニストではない変異体ＨＧＦの活性と、インビボでの標的細胞に対する野生型ＨＧＦの活性は実質的に同じである。さらに好ましくは、以下に記載されているように、いくつかの変異体ＨＧＦ分子はＨＧＦのアンタゴニストであるが、それでもやはりこれらは本発明の範囲に含まれる。以下に詳細に論じるように、これらのタイプの分子の全てが、医薬において有用であると解され、そのため包装された形態で準備され、医薬における使用のために提供される。本研究の前に、ヘパリンまたはＨＳＰＧを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターに対して結合できるＨＧＦの変異体は、ＨＧＦの野生型または他の変異体形態と比較して、インビボでの改良された活性を有することは示されていなかった。特に、本発明の少なくともいくつかの変異体は、野生型ＨＧＦよりも顕著に低い血清からのクリアランスを示し、本発明の少なくともいくつかの変異体ＨＰＧ分子は、野生型ＨＧＦよりも高い程度に大人の肝臓においてＤＮＡ合成を顕著に誘導する。用語、「ＨＧＦ」は、一本鎖形態、同様に二本鎖形態に蛋白分解されている形態を含む。好ましくは変異体ＨＧＦは、野生型ＨＧＦのヘアピンループ構造中の正に荷電したアミノ酸残基が、荷電を有しないまたは負に荷電したアミノ酸残基を使用して置換されている変異体ＨＧＦである。ヘアピンループ構造は、野生型ＨＧＦの残基７０から９６に渡っている。用語、「正に荷電したアミノ酸残基」は、Ａｒｇ(Ｒ)、Ｌｙｓ（Ｋ）またはＨｉｓ（Ｈ）を意味する。ヒスチジンは、生理学的なｐＨで部分的に正の荷電を有する。Ａｒｇ及びＬｙｓは、しばしば塩基性アミノ酸残基と称される。用語、「負に荷電したアミノ酸残基」は、Ｇｌｕ（Ｅ）またはＡｓｐ（Ｄ）を意味する。所定の正または負に荷電したアミノ酸残基以外の、遺伝学的コードによって直接コードされる全ての他の天然で生じるアミノ酸残基は、荷電を有さない。Ｇｌｕ及びＡｓｐは、しばしば酸性アミノ酸残基と称される。もし変異体が、ヘアピンループ構造中の正に荷電した残基が、負に荷電した残基によって置換されているものであれば、特に好ましい。従って、もしＬｙｓまたはＡｒｇまたはＨｉｓ残基が、ＧｌｕまたはＡｓｐ残基によって置換されているのであれば好ましい。もしＬｙｓまたはＡｒｇ残基が、Ｇｌｕ残基によって置換されているのであれば特に好ましい。荷電していないまたは負に荷電した残基による、正に荷電した残基の置換は、以下に記載される周知のタンパク質操作法によって容易に達成されることは予測されよう。しかしながら、ヘパリンまたはＨＳＰＧを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターを結合可能な変異体ＨＧＦ分子は、例えばタンパク質操作法によるヘアピンループ構造中の正に荷電したアミノ酸残基の欠失によって、または例えばヘアピンループ構造中の正に荷電した残基の化学的修飾によって得ることができる。タンパク質操作法は、アミノ酸残基の置換について好ましい；しかしながら、例えばシクロヘキサン-1,2-ジオンを使用したアルギニン残基の選択的な修飾を成し遂げることも可能である。好ましくはＨＧＦはヒトＨＧＦである。野生型ヒトＨＧＦのアミノ酸配列は、図７に与えられている。もし変異体ＨＧＦが、ヘアピンループ領域の正に荷電したアミノ酸残基が、負に荷電したアミノ酸残基または荷電していないアミノ酸残基によって置換された変異体ヒトＨＧＦであれば特に好ましい。しかしながら、他の哺乳動物種から得たＨＧＦか、正に荷電した残基を含む類似のヘアピンループ構造を有することは予測され、そして正に荷電したアミノ酸残基が負に荷電したアミノ酸残基または荷電していないアミノ酸残基によって置換されたこれらの非ヒトＨＧＦ分子の変異体は、上記分子がヘパリンまたはＨＳＰＧを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターを結合可能であるという条件で、本発明の範囲に含まれる。野生型ヒトＨＧＦにおいては、ヘアピンループ構造中の正に荷電したアミノ酸残基は、Ｒ７３，Ｒ７６，Ｋ７８，Ｋ８５，Ｋ９１，Ｒ９３及びＫ９４を含む。もし変異体ヒトＨＧＦが、少なくともＡｒｇ７３（Ｒ７３）が荷電していないまたは負に荷電したアミノ酸残基によって置換されているものであるならば特に好ましい。好ましくは、変異体ヒトＨＧＦは、突然変異Ａｒｇ７３Ｇ１ｕ（Ｒ７３Ｅ）またはＡｒｇ７３Ａｓｐ（Ｒ７３Ｄ）を含み、最も好ましくはＡｒｇ７３Ｇｌｕ（Ｒ７３Ｅ）を含む。もし変異体ヒトＨＧＦが、少なくともＡｒｇ７６（Ｒ７６）が荷電していないまたは負に荷電したアミノ酸残基によって置換されているものであるならばこれも特に好ましい。好ましくは、変異体ヒトＨＧＦは、突然変異Ａｒｇ７６Ｇｌｕ（Ｒ７６Ｅ）またはＡｒｇ７６Ａｓｐ（Ｒ７６Ｄ）を含み、最も好ましくはＡｒｇ７６Ｇｌｕ（Ｒ７６Ｅ）を含む。本発明の特に好ましい実施態様は、アミノ酸残基Ａｒｇ７３及びＡｒｇ７６（Ｒ７３及びＲ７６）の両者が、荷電していないまたは負に荷電したアミノ酸残基によって互いに独立に置換されている変異体ヒトＨＧＦである。Ａｒｇ７３及びＡｒｇ７６の両者が、Ｇｌｕ（Ｅ）またはＡｓｐ（Ｄ）のような負に荷電したアミノ酸残基によって置換されていることが好ましい；もし変異体ヒトＨＧＦが、アミノ酸置換Ａｒｇ７３Ｇｌｕ及びＡｒｇ７６Ｇｌｕ（Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅ）を含むのであれば特に好ましい。利便的に、Ａｒｇ７３及びＡｒｇ７６の置換に加えて、ヘアピン構造中の他の正に荷電したアミノ酸残基が、負に荷電したアミノ酸残基または荷電していないアミノ酸残基によって置換される。適切には、ヒトＨＧＦのＡｒｇ７３及びＡｒｇ７６の置換に加えて、Ａｒｇ９３（Ｒ９３）及び／またはＬｙｓ７８（Ｋ７８）が、負に荷電したアミノ酸残基または荷電していないアミノ酸残基によって置換される。好ましくは、Ａｒｇ９３（Ｒ９３）及び／またはＬｙｓ７８（Ｋ７８）がＧｌｕ（Ｅ）またはＡｓｐ（Ｄ）で置換され、最も好ましくはＧｌｕ（Ｅ）で置換される。それ故本発明の好ましい実施態様は、アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅを含む変異体ヒトＨＧＦ、並びにアミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＫ７８Ｅを含む変異体ヒトＨＧＦである。本発明の変異体ＨＧＦ分子は、上述の突然変異を含むことに加えて、該分子の生物学的活性を調節するためにさらに修飾されたＨＧＦ分子を含み、またはそれらは変異体ＨＧＦ分子の合成及び／または精製を容易にするためにさらに修飾される。しかしながら、これらのさらなる修飾は、主に該変異体がこの場合でもＨＳＰＧまたはヘパリンを実質的に結合することができないが、ＨＧＦレセプターに結合することはできるという変異体ＨＧＦの所定の性質を維持する。適切には、変異体ＨＧＦは、その精製を容易にする「標識」("tag")ペプチド配列を含む。典型的には、該標識は、変異体ＨＧＦの固相精製を可能にするために固定化された構成物に対する結合部位を含み、引き続き該構成物に対して変異体ＨＧＦが結合する。該標識は例えば、Ｎｉ²⁺イオンに結合するＨｉｓ_n配列（ｎ＞４）であり、またはそれは周知であるＭｙｃ−標識エピトープのようなモノクローナル抗体に対するエピトープである。他の可能性あるものは、本分野で周知である。しかしながら、もし変異体ヒトＨＧＦが、アミノ酸置換Ａｒｇ７３Ｇｌｕ及びＡｒｇ７６Ｇｌｕ（Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ）を有する野生型ＨＧＦ、またはアミノ酸置換Ａｒｇ７３Ｇｌｕ、Ａｒｇ７６Ｇｌｕ及びＡｒｇ９３Ｇｌｕ（Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ、Ｒ９３Ｅ）を有する野生型ＨＧＦ、またはアミノ酸置換Ａｒｇ７３Ｇｌｕ、Ａｒｇ７６Ｇｌｕ及びＬｙｓ７８Ｇｌｕ（Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ、Ｋ７８Ｅ）を有する野生型ＨＧＦより成るのであれば好ましい。アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅを有する変異体ヒトＨＧＦは、実施例１中でＨＰ１と称され、アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＫ７８Ｅを有する変異体ヒトＨＧＦは、実施例１中でＨＰ２と称される(図１の記号参照)。もし変異体ヒトＨＧＦが、Ｌ８０及び／またはＦ８２の突然変異を含むのであれば、それも好ましい。特に、好ましい変異体ヒトＨＧＦは、突然変異Ｌ８０Ｓ及びＦ８２Ｑを含む。アミノ酸置換Ｌ８０Ｓ及びＦ８２Ｑを有する変異体ヒトＨＧＦは、実施例１中でＨＰ４と称され、本発明の医薬における使用のための変異体ＨＧＦである。ここに記載されるような正の荷電を除去するヘアピンループ内への一つ以上の突然変異をも含む変異体ＨＧＦ内に一つ以上のこれらの突然変異を導入することは有益であると解されよう。上述の突然変異に加えて、荷電を有さないまたは負に荷電したアミノ酸残基を使用してヒトＨＧＦ分子内の他の正に荷電したアミノ酸残基を置換することは利点を有する。例えば、Ｋ９１及びＫ９４（ヘアピン構造内）及びＨ２４１，Ｒ２４２，Ｋ２４４及びＲ２４９（クリングル２ドメイン内）の一つ以上の置換を導入することは利点を有する。Ｌｙｓ８５がＧｌｕによって置換された野生型ＨＧＦより成る変異体ヒトＨＧＦ（Ｋ８５Ｅ；ＨＰ５−図１中の記号参照）は、本質的に野生型ＨＧＦと同様に挙動するために、本発明の変異体ではない。しかしながら、この突然変異は、ここで開示される他の突然変異と共に有利に含まれる。変異体ＨＧＦは好ましくは、ＭＥＴ結合能力及び細胞内にシグナルを伝達する能力に関して、野生型ＨＧＦと実質的に同じ能力を有するものである。しかしながら、変異体ＨＧＦは、野生型ＨＧＦの機能と拮抗するものであることも好ましい。野生型ＨＧＦの機能と拮抗する変異体ＨＧＦ分子は、本分野で周知である。例えば、国際特許出願WO 92/05184及びWO 96/40914は、野生型ＨＧＦの能力と特異的にまたは部分的に拮抗するＨＧＦの切り詰めた形態に関する。国際特許出願WO 93/23541及び米国特許US 5,547,856、US 5,316,921及びUS 5,580, 963は、ＨＧＦの二本鎖形態へのインビボでの変換が可能な酵素による、蛋白分解性切断に耐性である変異体ＨＧＦ分子に関する。これらの特許出願及び特許の全てが、参考として取り込まれる。それ故、もしこれらの特許出願及び特許に記載された変異体が、例えばヘパリンまたはＨＳＰＧを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターに対しては結合可能である変異体ＨＧＦを作製するさらなる突然変異をなすことによって、ここで記載される態様においてさらに修飾されるのであれば好ましい。好ましくは、ここで開示される突然変異は、米国特許US 5,316,921に記載されたもののような、ＨＧＦの二本鎖形態へのインビボでの変換が可能な酵素による蛋白分解性切断に対して耐性を与える突然変異と組み合わされる。より好ましくは、ヘアピンループ構造に関してここで開示される突然変異と組み合わされたこれらの突然変異は、野生型ヒトＨＧＦ配列のアミノ酸位置４９３，４９４，４９５及び４９６のいずれかでの、またはこれらに近接したアミノ酸改変を有するものである。それ故、野生型ＨＧＦのアンタゴニストであると解される本発明の好ましい変異体ＨＧＦ分子は、アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅ、またはＲ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＫ７８Ｅ、並びに野生型ヒトＨＧＦのアミノ酸位置４９３，４９４，４９５及び４９６のいずれか一つ以上の置換を含むものである。上記議論されているように、上述の変異体ＨＧＦ分子は医薬において有用である。本発明のさらなる態様は、第一の態様で定義された変異体ＨＧＦ及び製薬学的に許容可能な担体(carrier)を含む製薬組成物を提供する。本発明の上述の化合物、またはその製剤は、経口及び非経口（例えば皮下または筋肉内）の注射を含むいずれかの利便的な方法によって投与される。治療は、単一の投与または一定期間の複数の投与より成る。本発明の化合物を単独で投与することが可能である一方、それを一つ以上の許容可能な担体と共に製薬学的製剤として提供することが好ましい。該担体は、本発明の化合物と適合可能であるが、その受容者に対して無害であるという意味で、「許容可能」でなければならない。典型的には、該担体は、滅菌され発熱物質が含まれていない水または塩水である。該製剤は、利便的に、単位投与量形態で存在し、薬剤学の分野で周知のいずれかの方法によって調製される。上記方法は、活性成分（本発明の化合物）を、一つ以上の付属の成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般的に該製剤は、活性成分を液体の担体、または均質に分割された固体の担体、または両者と均一に及び密接に会合させ、次いで必要であれば、生産物を成型することによって調製される。経口投与に適切である本発明に従った製剤は、それぞれ所定量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤または錠剤のような分離単位として；パウダーまたは顆粒剤として；溶液、若しくは水溶液または非水溶液での懸濁液として；若しくは水中油型液体エマルションまたは油中水型液体エマルションとして提供される。活性成分は、ボーラス、舐剤またはペーストとしても提供される。錠剤は、任意に一つ以上の付属の成分と共に、圧縮または成型によって作製される。圧縮された錠剤は、任意に結合剤(例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、潤滑剤、不活性な希釈剤、防腐剤、崩壊剤(例えばデンプングリコール酸ナトリウム(sodium starch glycolate)、架橋ポビドン、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース(cross-linked sodium carboxyme thyl cellulose))、表面活性剤または分散剤と共に混合して、パウダーまたは顆粒剤のような自由に動きうる形態において、活性成分を適切な機械中で圧縮することによって調製される。成型された錠剤は、不活性な液体希釈液を使用して湿気を帯びたパウダー状化合物の混合物を、適切な機械中で成型することによって作製される。該錠剤は、任意に被膜または切り込みを入れられ、及び所望の放出プロフィールを提供する各種の割合で、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用して、その中の活性成分の遅滞または制御された放出を提供するように製剤化される。口における局所的投与のための適切な製剤は、通常ショ糖及びアラビアゴムまたはトラガカントゴムといった香味料において活性成分を含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリン、またはショ糖及びアラビアゴムのような不活性なものにおいて活性成分を含む錠剤：並びに適切な液体の担体において活性成分を含むうがい薬を含む。非経口投与のための適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び該製剤を企図された受容者の血液と等張性にする溶質を含む、水性及び非水性の滅菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含む水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。該処方は、例えば密封されたアンプル及びバイアルといった単位投与量または複数投与量の容器において提供され、使用の直前に例えば注射のための水といった滅菌された液体の担体を加えることのみを必要とする凍結乾燥(freeze-dried)（凍結乾燥(lyophilised)）条件で貯蔵される。即時の注射溶液及び懸濁液が、上述の種類の減菌パウダー、顆粒剤及び錠剤から調製される。好ましい単位投与量の製剤は、活性成分の一日の投与量または単位、毎日の投与量またはその適切な分画を含むものである。特に上述の成分に加えて、本発明の製剤は、例えば経口投与に適した製剤が香味剤を含むように、問題となる処方のタイプに関して本分野で都合がよい他の薬剤を含むと解される。可能であれば、局在化した輸送が望ましい；例えば輸送が肝臓に対して望まれる場合には、それは肝臓の動脈を介してなされる。本発明のさらなる態様は、肝細胞増殖因子またはそのアンタゴニストを使用した治療の必要のある患者、または該治療から利益を受ける患者を治療する方法を提供し、該方法は、本発明の第一の態様で定義される変異体ＨＧＦの有効量を患者に投与することを含む。遺伝子治療の進歩と共に、変異体ＨＧＦをコードする遺伝学的構築物の投与を介して、変異体ＨＧＦを投与することが可能であると解されよう。これは特に、本発明の治療方法に含まれる。野生型、及び特にここで開示されるものと区別される変異体ＨＧＦ分子の治療上の使用は、以前に記載されている。例えば、マウスにおける研究は、ＨＧＦが肝での発ガンの早期において腫瘍サプレッサーとして機能することを示唆し(San toni等（1996）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,9577-9582)、ＨＧＦはインビトロでＨｅｐＧ２、ＨＣＣ、Ｂ６／Ｆ１メラノーマ及びＫＢ扁平上皮ガン腫の増殖を阻害すると報告されている(Tajima等（1991）FEBS Lett.291,229-232)。ＨＧＦは、ラットにおいて肝線維症／肝硬変の発病及び進行を妨げ、重度の肝硬変及び機能不全によって生ずる死を完全に妨げる(EP 0 456 188及びMatsuda等（1995） J．Biochem.118,643-649)。ＨＧＦは、一次肝細胞のレトロウイルス形質導入の効率を増大する(Pages等（1996）Biochcm.Biophys.Res.Comm.222,726-731)。ＨＧＦは、７０％肝管切開されたラットにおいて肝再生を刺激する(Ishii等（ 1995）J.Biochem.117,1105-1112)。ＨＧＦは、血管平滑筋細胞増殖に対する治療薬として提案されており(Nakamura等（1995）Biochem.Biophys.Res.Comm.215,48 3-488)、及び高Ｄ−グルコースのための局所的ＨＧＦ濃度の減少は、糖尿病における内皮の傷害を誘発し、潜在的にアテローム性動脈硬化症の進行を引き起こす (Nakamura等（1997）Diabetes 46,138-142)。ＨＧＦは、インビボでの潜在的な新脈管形成因子であり(Rosen等（1993）Symp .Soc.Exp.Biol.47,227-234)、それ故傷の治癒において有用性を有する。ＨＧＦは、腸上皮浸食／潰瘍の修復を促進することが報告される(Nusrat等（1 994）J.Clin.Invest.93,2056-2065)。ＨＧＦは、放射線／化学療法の副作用を防ぐために(WO 93/08821;WO 95/25537)、頭側神経疾患に対する治療薬として(WO 9 5/07709)、軟骨疾患の治療薬として(WO 96/05855)、免疫抑制剤によって引き起こされる副作用を緩和するために(WO 95/25537)及び腎疾患に対する治療薬として(EP 0 462 549)提案されている。Matsumoto & Nakamura,Hepatocyte Growth F actor,450-474頁:Acute Renal Failure,New Concepts and thrapeutic strategi es,M.S.Goligorsky & J.H.Stein編,Churchill Livingstone,New Yorkもまた参照。これらの文献の全ては、参考としてここに取り込まれる。ＨＧＦまたはその変異体は、各種の他の疾患の治療において有用であることが報告されている。国際特許出願WO 97/09997は、ＨＧＦが嚢胞性線維症の治療において有用であることを示唆する。国際特許出願WO 97/12628は、ＨＧＦが例えば血管手術または血管形成術によって損傷または外傷を受けた血管の再構成を促進することを示唆し、及び国際特許出願WO 97/12629は、ＨＧＦが新脈管形成を促進するのに有用であることを示唆する。ＨＧＦのα断片は、ＨＧＦによるガン細胞の進行または転移する能力を特異的に阻害するアンタゴニストとして機能し (WO 97/16205参照)、一方で国際特許出願WO 96/32960において、ＨＧＦは、虚血モデルにおける細胞毒性を抑制する効果を発揮する活性成分として使用され、それ故虚血性疾患に対する予防薬及び／または治療薬として有効である。国際特許出願WO 95/29694は、ＨＧＦが、繊維症及び低コラゲナーゼ活性によって引き起こされる他の疾患を治療するためにコラーゲン加水分解を加速可能であることを示し、及び欧州特許EP 0 661995は、ＨＧＦが、肝損傷の危険を有する患者における肝損傷の確立または進行の予防において使用されることを示唆する。ＨＧＦがＭＥＴに対して結合することを妨げるＨＧＦ変異体は、腫瘍細胞転移を予防する方法において使用されると提案される(例えばEP 0 805 203参照)。さらに、国際特許出願WO 98/00543は、各種のＨＧＦレセプターアゴニストを記載し、国際特許出願WO 97/07824は、ＨＧＦ遺伝子が造伝子治療においてリポソームの使用と共に使用されることを示す。ＭＥＴを結合し、野生型ＨＧＦと実質的に同じ態様で細胞シグナルを伝達する変異体ＨＧＦ分子は、野生型ＨＧＦと同じ態様で治療上有効であると解されるが、変異体ＨＧＦ分子はＨＳＰＧまたはヘパリンを実質的に結合できない。それ故、例えば変異体ＨＧＦ分子は、より大きい組織浸透力、つまり外因性野生型ＨＧＦが効率的に到達できない（または多量の投与量を必要とする）細胞または組織区画に到達する能力を与えると解されるため、該変異体分子はインビボでより優れた効果を有すると解される。従って、本発明の変異体ＨＧＦ分子の少なくともいくつかの治療上の効力は、野生型ＨＧＦに対するものよりも高く、より低い副作用を引き起こす低い治療上の投与量が使用されると解される。それ故、このクラスの変異体ＨＧＦ分子は、ガンの治療薬として、ヒト肝線維症／肝硬変の治療に対するものとして、肝切除術及び肝の傷害における治療薬として、肝の遺伝子治療に対するアジュバントとして、血管平滑筋細胞増殖に対する治療において、腸の上皮浸食／潰瘍の修復を促進するものとして、新脈管形成因子として、放射線または化学療法の副作用をブロックするものとして、頭側神経疾患に対する治療薬として、軟骨疾患に対する治療薬として、免疫抑制剤によって引き起こされる副作用を緩和するものとして、腎疾患に対する治療薬として有効であると解される。これらの変異体ＨＧＦ分子はまた、慢性皮膚障害においても有用である。本発明の変異体ＨＧＦ分子は、進行または転移を予防または遅延するために、ガンの治療において有用であると解される。本発明のさらなる態様は、ＨＧＦ、またはアンタゴニストを使用した治療が必要である、またはその治療から利益を受ける患者を治療するための医薬の製造における、本発明の第一の態様に記載された変異体ＨＧＦの使用を提供する。本発明のさらなる態様は、該変異体が置換（ａ）Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅまたは（ｂ）Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅまたは（ｃ）Ｋ９１Ｅ、Ｒ９３Ｅ及びＫ９４ＥがなされたヒトＨＧＦの変異体ではないという条件で、ヘパリンまたはＨＳＰＧを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターに結合可能な変異体肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を提供する。本発明のこの態様の変異体ＨＧＦ分子が好ましいことは、本発明の第一の態様のものと同じである。本発明のさらなる態様は、該変異体が置換（ａ）Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅまたは（ｂ）Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅまたは（ｃ）Ｋ９１Ｅ、Ｒ９３Ｅ及びＫ９４ＥがなされたヒトＨＧＦの変異体ではないという条件で、ヘパリンまたはＨＳＰＧを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターに結合可能な変異体肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のこの態様のポリヌクレオチドは、例えばミスマッチしたオリゴヌクレオチドを使用した部位特異的突然変異誘発によって、またはポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって、またはデノボのポリヌクレオチド合成によって、またはいずれかの他の方法によって容易に作成可能である。上記方法は、分子生物学の分野で周知であり、該方法の少なくともいくつかは、Sambrook等(1989),Mol ecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Sp ring Harbor,New Yorkに詳細に記載される。本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供し、本発明のまたさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。該ポリヌクレオチドまたはベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、好ましくはそれはＤＮＡである。相補的粘着末端を介してベクターにＤＮＡを機能的に連結する各種の方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマートラクト(tracts)を、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡ断片に加えることができる。次いで該ベクター及びＤＮＡ断片を、組換えＤＮＡ分子を形成するために相補的ホモポリマーテール(tails) の間で水素結合によって結合する。一つ以上の制限部位を含む合成リンカーが、ベクターにＤＮＡ断片を結合する代替の方法を提供する。以前に記載されたエンドヌクレアーゼ制限切断によって生産されたＤＮＡ断片は、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、または大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを使用して処理され、該酵素はその３’−５’− エキソヌクレアーゼ活性を使用して３’一本鎖末端を生じ、そのポリメラーゼ活性を使用して一本鎖の３’末端を埋めるものである。従って、これらの活性の組み合わせは、平滑末端ＤＮＡ断片を生産する。次いで平滑末端断片は、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような平滑末端ＤＮＡ分子の接合を触媒可能な酵素の存在下で、大過剰のリンカー分子と共にインキュベーションされる。かくして該反応の生産物は、その末端にポリマー性リンカー断片を有するＤＮＡ断片である。次いでこれらのＤＮＡ断片を適切な制限酵素を使用して切断し、ＤＮＡ断片の末端と適合可能な末端を生ずる酵素を使用して切断された発現ベクターに接合される。各種の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、International Bi otechnologies Inc,New Haven,CN,USAを含む数多くの業者から商業的に入手可能である。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾するための望ましい方法は、 Saiki等（1988）Science 239,487-491に開示されたポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。この方法において、酵素学的に増幅されるＤＮＡは、増幅されたＤＮＡにそれ自体取り込まれるようになる二つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマーによって挟まれる。上記特異的プライマーは、本分野で周知の方法を使用する発現ベクター内にクローニングのため使用することができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。次いでＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、本発明の変異体ＨＧＦ（本発明の化合物を構成するポリペプチド）を生産するために適切な宿主内で発現される。それ故、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡは、発現ベクターを構築するためにここに含まれる方法を使用して適切に修飾された周知の方法に従って使用され、次いで本発明のポリペプチドの発現及び生産のために適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。上記方法は、Rutter等に対して１９８４年４月３日に発行された米国特許第4,440,859号、Weissmanに対して１９８５年７月２３日に発行された第4,530,901号、Crowlに対して１９８６年４月１５日に発行された第4,582,800号、Mark等に対して１９８７年６月３０日に発行された第4,677,063号、Goeddelに対して１９８７年７月７日に発行された第4,678,751 号、Itakura等に対して１９８７年１１月３日に発行された第4,704,362号、Murr ayに対して１９８７年１２月１日に発行された第4,710,463号、Toole,Jr.等に対して１９８８年７月１２日に発行された第4,757,006号、Goeddel等に対して１９８８年８月２３日に発行された第4,766,075号及びStalkerに対して１９８９年３月７日に発行された第4,810,648号に開示されたものを含み、これらの文献全てが参考としてここで取り込まれる。本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡは、適切な宿主内への導入のための広範囲の他のＤＮＡ配列に接合される。連結されるＤＮＡは、宿主の性質、宿主内へのＤＮＡの取り込みの方法、及びエピソーム様の維持または組込みが望ましいかどうかに依存するであろう。一般的に該ＤＮＡは、発現のための正確な配向及び正確な読み取り枠で、プラスミドのような発現ベクター内に挿入される。もし必要であれば、該ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節コントロールヌクレオチド配列に連結されるが、上記コントロールは一般的に発現ベクターにおいて利用可能である。次いで該ベクターは、標準的な方法に従って宿主内へ導入される。一般的に全ての宿主が、該ベクターによって形質転換されるわけではない。それ故、形質転換された宿主細胞を選択することが必要である。一つの選択方法は、いずれかの必要なコントロールエレメントと共に、抗生物質耐性のような形質転換された細胞において選択可能な特徴をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクター内に取り込むことを含む。代わりに、上記選択可能な特徴に対する遺伝子は、他のベクター上に存在することができ、該ベクターは所望の宿主細胞を共形質転換するために使用される。次いで、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にするここで開示される方法について当業者に周知の十分な時間で適切な条件の下で培養し、次いで該ポリペプチドを回収する。細菌(例えば大腸菌及び枯草菌)、酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae)、糸状真菌(例えばAspergillus)、植物細胞、動物細胞及び昆虫絹胞を含む多くの発現系が周知である。該ベクターは、それが他の非原核生物細胞タイプにおける発現のために使用される場合であっても、原核生物における増殖のための、ＣｏｌＥ１のような原核生物レプリコンを含む。該ベクターはまた、それを使用して形質転換された大腸菌のような細菌宿主細胞における該遺伝子の発現（転写及び翻訳）を導くことが可能な原核生物プロモーターのような適切なプロモーターを含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び生ずる転写を可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現コントロールエレメントである。例示的な細菌宿主と適合可能なプロモーター配列は典型的に、本発明のＤＮＡ断片の挿入のための都合の良い制限部位を含むプラスミドベクターを提供する。典型的な原核生物ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories(Richmond,CA USA)から入手可能なｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、並びにPharmacia,Piscaraway,NJ,USAから入手可能なｐＴｒｃ９９Ａ及びｐＫＫ２２３−３である。典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Phamlacia,Piscataway,NJ,USA から入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化遺伝子を発現するためにＳＶ４０後期プロモーターを使用し、最高レベルの発現が、ＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原生産細胞において見出される。誘導可能な哺乳動物発現ベクターの例として、Pharmaciaから入手可能なｐＭＳＧがある。このベクターは、クローン化遺伝子を発現するためにマウス乳ガンウイルス長末端繰り返しのグルココルチコイド誘導性プロモーターを使用する。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６及びｐＲＳ４１３− ４１６であり、一般的にStratagene Cloning Systems,La Jolla,CA 92037,USAから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３，ｐＲＳ４０４，ｐＲＳ４０５及びｐＲＳ４０６は、酵母組込みプラスミド(Yeast Integrating plasmids(YIp))であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３，ＴＲＰ１，ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を取り込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母動原体プラスミド(Yeast Centromere pl asmid(YCp))である。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物を使用して形質転換された宿主細胞に関する。該宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかである。細菌細胞は好ましい原核生物宿主細胞であり、典型的には例えばBethesda Research Laboratories Inc.,Bethesda,MD,USAから入手可能な大腸菌株ＤＨ５、及びRockville,MD,USAのAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手可能なＲＲ１(No ATCC 31343)のような大腸菌の株である。好ましい真核生物宿主細胞は、酵母及び哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽細胞系から得たもののような脊椎動物細胞を含む。酵母宿主細胞は、ＹＰＨ４９９，ＹＰＨ５００及びＹＰＨ５０１を含み、それらは一般的にStratagene C loning Systems,La Jolla,CA 92037,USAから入手可能である。好ましい哺乳動物宿主細胞は、ATCCからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ATCCからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨＳｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、及びATCCからＣＲＬ１６５０として入手可能なサル腎由来ＣＯＳ−１細胞を含む。本発明のＤＮＡ構築物を使用した適切な細胞宿主の形質転換は、使用されるベクターのタイプに典型的に依存した周知の方法によって達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohen等（1972）Proc.Natl.Acad.Sci.US A 69,2110及びSambrook等（1989）Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Col d Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NYを参照。酵母細胞の形質転換は、Sherman等（1986）Methods In Yeast Genetics,A Laboratory Manual,Col d Spring Harbor,NYに記載されている。Beggs(1978)Nature 275,104-109の方法もまた有用である。脊椎動物細胞については、例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストランまたはリポソーム製剤といった上記細胞をトランスフェクションするのに有用な薬剤が、Stratagene Cloning SystemsまたはLife Technologie s Inc.,Gaithersburg,MD 20877,USAから入手可能である。エレクトロポレーションもまた、細胞を形質転換するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞及び脊椎動物細胞に対して本分野で周知である。例えば多くの細菌種が、Luchansky等（1988）Mol.Microbiol.2,637-646に記載された方法によって形質転換され、該文献は参考としてここに取り込まれる。最大の数の形質転換体が、２５μＦＤで６２５０Ｖ／ｃｍを使用して２．５ＸＰＥＢにおいて懸濁されたＤＮＡ−細胞混合物のエレクトロポレーションに引き続いて絶えず回収される。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換のための方法は、Becker & Gua rente(1990)Methods Enzymol.194，182に開示されている。成功した形質転換細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞は、周知の方法によって同定することができる。例えば本発明の発現構築物の導入から得られた細胞は、本発明のポリペプチドを生産するために培養することができる。細胞は集菌され、溶解され、そのＤＮＡ内容物がSouthern(1975)J.Mol.Biol.98,50 3またはBerent等（1985）Biotech.3,208によって記載された方法を使用して、該ＤＮＡの存在について調べられる。代わりに、上清中の該タンパク質の存在が、以下に記載される抗体を使用して検出される。組換えＤＮＡの存在に対する直接的なアッセイに加えて、組換えＤＮＡを該タンパク質の発現に向けることができる場合、成功した形質転換体は、周知の免疫学的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターを使用して成功して形質転換された細胞は、適切な抗原性を示すタンパク質を生産する。形質転換を受けた細胞のサンプルは回収され、適切な抗体を使用して該タンパク質に対してアッセイされる。それ故、形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明はまた、これらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質な）培養物、または栄養培地中でモノクローナル培養物から由来する培養物も企図する。もし宿主細胞が昆虫細胞であり、発現がバキュロウイルス発現であれば好ましい。もし宿主細胞が、Pichia pastorisであればそれも好ましい。変異体ＨＧＦ分子、少なくともそれをコードするポリヌクレオチドを遺伝子治療において使用することは有用であるため、本発明はまた、患者の細胞内に上記ポリヌクレオチドを導入する方法を含むと解される。本発明は、以下の実施例及び図面を参考として詳細に記載されるであろう。図１は、ＨＧＦ／ＳＦの野生型及び突然変異体形態のヘパリン結合及びＭＤＣＫ散乱活性を示す。以下の突然変異体をヘアピン構造（ＨＰ）またはクリングル２（Ｋｒ２）のそれぞれにおいて生産した：ＨＧＦ／ＳＦ：ＨＰ１：Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ、Ｒ９３Ｅ；ＨＰ２：Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ、Ｋ７８Ｅ；ＨＰ３：Ｋ９１Ｄ、Ｒ９３Ｅ、Ｋ９４Ｄ；ＨＰ４；Ｌ８０Ｓ、Ｆ８２Ｑ；ＨＰ５：Ｋ８５Ｅ；ＨＰ６：Ｄ９０Ｋ；Ｋｒ２−１：Ｈ２４１Ｓ、Ｒ２４２Ｅ、Ｋ２４４Ｅ、Ｒ２４９Ｇ及びＫｒ２−２：Ｒ２８１Ｇ、Ｗ２８２Ｇ、Ｙ２８４Ａ。ａ）ＨＧＦ／ＳＦの野生型及び突然変異形態の発現。該図は、ＨＧＦ／ＳＦｃＤＮＡを使用して一過的に形質転換され、³⁵Ｓ−システインを使用して標識されたＮｅｕｒｏ２ａ細胞の上清中に存在するタンパク質の還元条件の下でのＳＤＳケルを示す。６０ｋＤａＡ鎖及び３２／３４ｋＤａＢ鎖の移動は同一である。コントロールレーンは、ベクター単独を使用して形質転換されたＮｅｕｒｏ２ａ細胞の上清である。突然変異体ＨＰΔは、欠失された（残基６８−１００）完全なヘアピン構造を有し、それ故Ａ鎖の移動は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦと比較してわずかに増大する。ｂ）２００μｇ／ｍｌのヘパリンを使用して被膜されたウェルに対する２０ｎｇ／ｍｌの野生型または突然変異体ＨＧＦ／ＳＦタンパク質の結合。該データは、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦのパーセントとして表される。ヘアピン構造の欠失体（ＨＰΔ）は、＜５％にヘパリン結合を減少した。同様に、塩基性アミノ酸残基が変換された全ての突然変異体（ＨＰ１，ＨＰ２，ＨＰ３）は、強いヘパリン結合の減少を示した。正に荷電した表面の外の突然変異体（ＨＰ４，ＨＰ５，ＨＰ６）は、それぞれより少ない効果（ＨＰ４）を有するか、または全く効果を有さなかった(ＨＰ５及びＨＰ６)。クリングル２の表面上の正に荷電したアミノ酸の置換（Ｋｒ２−１）は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦの１８％にヘパリン結合を減少し、その一方でリシン結合ポケットの欠失体（Ｋｒ２−２）は何の効果も有さなかった。ｃ）Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞中で発現された野生型及び突然変異体ＨＧＦ／ＳＦによるＭＤＣＫコロニーの散乱。該データは、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦのパーセントとして表される。ヘアピン構造の欠失体（ＨＰΔ）は生物学的活性が破壊されたが、ヘアピン構造における正に荷電したアミノ酸の点突然変異体は、生物学的活性に対する各種の効果を有した。それ故ＨＰ１及びＨＰ２突然変異体は、ｗｔ− ＨＧＦ／ＳＦに匹敵する生物学的活性を有する一方で、突然変異体ＨＰ３の活性は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦのわずか１７％であった。クリングル２突然変異体は、生物学的活性の重大な欠損を示す（Ｋｒ２−１）または全く変化を示さない（Ｋｒ２−２）ものであった。図２は、固定化ヘパリンに対して結合するｗｔ−ＮＫ２及びＨＰ１−ＮＫ２のＢＩＡｃｏｒｅ分析を示す。パネルａは、ヘパリン表面に結合するｗｔ／ＮＫ２（１０−３００ｎＭ）（最大結合能力３４０ＲＵ）の測定グラフを重ねたものを示す。パネルｂは、ＨＰ１ −ＮＫ２（１０−３００ｎＭ）（表面能力およそ１７０ＲＵ）に対する測定グラフの一致するセットを示す。会合速度の最大の差異を可能にするために、ＨＰ１ −ＮＫ２に対して、より低い表面能力及びより長い注射時間を使用した。サンプルのパルスの最初及び最後の折れた部分は、ブランクの表面から得た曲線（示されていない）を差し引くことから由来する人工的なものであり、小さな解決できない時間誤差に起因する。パネルｃは、ｗｔ−ＮＫ２（■）及びＨＰ１−ＮＫ２（□）についての、ｋ_off対濃度（Ｃ、ｎＭ）を示し、パネルｄは、観察された速度定数Ｋ_s対濃度（Ｃ、ｎＭ）のプロットを示す。図３は、ミンク肺細胞に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の全結合を示す。９６穴プレート中のミンク肺細胞に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の全結合が示されている。ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦは、ミンク肺細胞の細胞表面に対する強い濃度依存性結合を示し(■)、それは０．１ｍｇ／ｍｌでの可溶性ヘパリンを加えることによって競合できた(▲)。対照的に、ＨＰ１の結合は、６７５ｎｇ／ｍｌまでの濃度で無視して良く(□)、ヘパリンを加えることによって影響されなかった(△)。図４は、ＭＥＴ−レセプター（ＭＥＴ−Ｆｃ）の可溶性形態に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の結合、並びにミンク肺細胞におけるＤＮＡ合成に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の効果を示す。ａ）ＭＥＴレセプター（ＭＥＴ−Ｆｃ）の可溶性形態に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ（斜線の棒グラフ）及びＨＰ１（白い棒グラフ）の結合。固定化ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦまたはＨＰ１を、２００ｎｇ／ｍｌのＭＥＴ−Ｆｃを使用してインキュベーションし、結合したＭＥＴ−Ｆｃを抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出した。ＨＰ１突然変異体の結合は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦに対するものよりわずかに低かった。ｂ）ミンク肺細胞におけるＤＮＡ合成に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ（■）及びＨＰＩ（□）の効果。１０，０００個の血清枯渇ミンク肺細胞を、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦまたはＨＰ１の示された濃度を使用してインキュベーションした。２４時間後、³Ｈ−チミジンを加え、ＤＮＡ内に取り込まれた放射性活性の量を二重のサンプルで測定した。該図は、バックグランドカウント（コントロール培地においてインキュベーションされた培養物によって取り込まれた³Ｈ−チミジン）を差し引いた後のｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦまたはＨＰ１によって誘導されたＤＮＡ合成を示す。ＨＰ１によって誘導された刺激は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦに対するものよりわずかに低かった。図５は、ミンク肺及びＭＤＣＫ細胞の形態に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の効果を示す。該図は、因子の非存在下(ａ及びｄ)、若しくは２０ｎｇ／ｍｌのｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ（ｂ及びｅ）またはＨＰ１（ｃ及びｆ）を使用した一晩のインキュベーションの後に培養されたミンク肺細胞（パネルａ、ｂ及びｃ）及びＭＤＣＫ細胞（パネルｄ、ｅ及びｆ）を比較する。コントロール培養物（ａ及びｄ）においては、細胞は典型的な上皮形態を示した。細胞分裂及び形態に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の効果は、区別できなかった。図６は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１のクリアランス、組織配置及びインビボでの活性を示す。ａ）ラット血清から得た¹²⁵Ｉ標識ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１のクリアランス曲線。６匹の大人のラットを、頸動脈中に¹²⁵Ｉ標識ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦまたはＨＰ１のそれぞれを使用して注射し、示された時間で血液サンプルを採取した。血清中に残存するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ（■）及びＨＰ１（□）の濃度（ＴＣＡ不溶性放射性活性）が、注射された全放射性活性の分画として示される。各時点について、血液中の突然変異体ＨＰ１の濃度は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦについてのものより少なくとも５倍高かった。ｂ）ラット組織における¹²⁵Ｉ標識ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の配置。注射の２時間後、２匹の動物を殺生し、潅流の後いくつかの器官（肝臓、腎臓、肺、心臓、精巣、脾臓）をホモジナイズし、ＴＣＡ不溶性放射性活性の量を測定した。組織放射性活性の濃度は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦよりもＨＰ１において２−３倍高かったが、器官配置のパターンは、二つのタンパク質で同じであった。ｃ）ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１によるマウス肝におけるＤＮＡ合成の刺激。ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１を、３日間の期間で静脈内に投与した(５回の注射に分けて全投与量は２７７．５μｇ／動物)。動物が最後の因子の投与を受けたときに、ＢｒｄＵを腹膜内に注射し(７５μｇ／体重のｇ)、１２時間後に動物を殺生した。ＢｒｄＵ標識細胞を凍結肝切片においてカウントした(少なくとも８個の異なる切片及び動物当たり全部で１２０区画)。データは４匹（ｗｔ− ＨＧＦ／ＳＦ）または３匹（ＨＰ１）の動物についての平均±ｓｄである。図７は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース受託番号Ｐ１４２１０から得たヒト肝細胞増殖因子のアミノ酸配列を示す。ＨＧＦをコードするヌクレオチド配列または上記配列に関する情報は、Seki等（1991）Gene 102,213-219;Miyazawaka 等（1989）Biochem.Biophys.Res.Comm.163,967-973;Seki等（1990）Biochem.Bio phys.Res.Comm.172,321-327;Nakamura等（1989）Nature 342,440-443;Weidner等（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,7001-7005;Yushiyama等（1991）Biochem.B iophys.R es.Comm.175,660-667;及びLokker等（1992）EMBO J.11,2503-2510に記載され、これらの文献の全てが参考としてここで取り込まれる。略語：ＥＧＦ：上皮増殖因子；ＦＧＦ：腺維芽細胞増殖因子；ＨＢ−ＥＧＦ：ヘパリン結合ＥＧＦ；ＨＧＦ／ＳＦ：肝細胞増殖因子／散乱因子；ＨＳＰＧ：ヘパリン硫酸プロテオグリカン；ＭＥＳ：2-[N-モルフォリノ]エタンスルホン酸；ＮＫ２：Ｎ末端ドメイン、クリングル１及びクリングル２に相当するＨＧＦ／ＳＦの切り詰めた変異体；ＳＰＲ；表面プラスモン共鳴；ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子。実施例１：減少したヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合、及び改良されたインビボの活性を有するＨＧＦ／ＳＦの操作された突然変異体要約ＨＧＦ／ＳＦは、哺乳動物の発生及び組織再生において重要な役割を演じる高分子量、ヘパリン結合、ポリペプチド増殖因子である。レセプターまたはヘパリン結合に関与するアミノ酸を同定するために、我々は、Ｎ末端ドメインのヘアピン構造またはクリングル２における溶媒接近残基のいくつかのクラスターが置換されている数多くのＨＧＦ／ＳＦ突然変異体を作製した。二つの突然変異体（ＨＰ１：Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ、Ｒ９３Ｅ及びＨＰ２：Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ、Ｋ７８Ｅ）は、ヘパリンに対する顕著に減少した親和性を示すが、培養物中のターゲット細胞に対するマイトジェン及びモートジェン活性を示すので、特に興味深かった。ヘパリンに対するＨＰ１の親和性は、二つのタンパク質のＮＫ２断片の結合速度から見積もった場合、野生型ＨＧＦ／ＳＦと比較して５０倍以上低かった。ＨＰ１における親和性の変化は、減少したオンレート(〜５×１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1対１．７５×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1）の結果であり、細胞表面及びマトリックスヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する減少した結合によって対比された。重要な差異が、インビボでの野生型ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の挙動において観察された：突然変異体タンパク質は、血液からの遅延したクリアランス、より高い組織濃度、及び正常な大人のネズミ肝におけるＤＮＡ合成を誘導する際に２．７倍高い活性を示した。それ故我々は、ヘパラン硫酸に対する減少した親和性の観点から、インビボでのより高い活性を示すＨＧＦ／ＳＦの突然変異体形態を作製した。これらの結果は、ＨＧＦ／ＳＦ活性におけるヘパラン硫酸プロテオグリカンの役割を強調することについての意味、及び該増殖因子の治療上の応用に対する意味を有する。ＨＧＦ／ＳＦにおけるレセプター及びヘパリン結合部位を分析するために、我々は、数多くの部位特異的ＨＧＦ／ＳＦ突然変異体をデザインするのを助ける個々のドメインの三次元モデルを生産した(２９)。アンチトロンビン（３０）及びＦＧＦ−ヘパリン複合体（３１）の入手可能なＸ線構造は、ヘパリン結合部位が、グリコサミノグリカンにおける負に荷電した残基と静電気的に接触する、主に正に荷電した残基のクラスターより成ることを示す。それ故我々は、正に荷電したアミノ酸のクラスターについてＨＧＦ／ＳＦのヘアピン構造及びクリングル２の表面を研究し、三つの上記クラスター（ヘアピン構造中に二つ及びクリングル２中に一つ）を同定し、これらの部位に特異的な突然変異を導入した。物質と方法細胞系細胞系は、ATCCから入手され、または（７）及び（３２）において以前に記載された。細胞を、３７℃、１０％ＣＯ₂で１０％胎児ウシ血清を補ったＤＭＥＭ中で周知のように培養した。ヘアピン構造及びクリングル２のインビトロ突然変異誘発６個のヒスチジン残基及び一つの停止コドンをコードする二本鎖オリゴヌクレオチド(5'-CA CAG TCA GGA CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAA GGA TCC TCT AGA GGT AC-3')を、ＨＧＦ／ＳＦｃＤＮＡの２．２ｋｂＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片のＫｐｎＩ制限部位内にクローン化した。最初の実験において、Ｃ末端ヘマグルチン標識(tag)に融合されたｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦをコードするｃＤＮＡを使用した( ２６)。ヘアピン構造またはクリングル２の点突然変異の生産のために、ＰＣＲ反応においてミスマッチプライマーをアニリングすることによって、コドン置換をｃＤＮＡ内に導入した。ＰＣＲ断片をｃＤＮＡ内にクローン化し、突然変異をシークエンシングによって確認した。この方法で生産された点突然変異が、図１の記号で掲載されている。ヘアピン構造の欠失のために、さらなるｐＳｔＩ制限部位をｎｔ３００で作製し、次いで部分的切断によって、ＨＧＦ／ＳＦのアミノ酸６８から１００をコードする断片を欠失した。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞における野生型及び突然変異体ＨＧＦ／ＳＦの一過的発現突然変異体ＨＧＦ／ＳＦ（それぞれ１０μｇ）をコードするｃＤＮＡを、記載されているようにＮｅｕｒｏ２ａ細胞内に一過的に形質導入した(２６)。免疫沈降のため、形質導入の一日後、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を２０μＣｉ／ｍｌの³⁵ Ｓ−システイン(Amersham)を使用して一晩標識し、ＨＧＦ／ＳＦを２μｇの抗ＨＧＦ／ＳＦ抗体（クローン３４）及び１００ｍｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズを使用して上清（１．５ｍｌ）から免疫沈降した。該沈降物を、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．５、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌオボアルブミン及び５ｇ／ｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用して三回洗浄し、ＳＤＳゲル電気泳動及びホスホイメージャー分析について使用した。昆虫細胞における全長ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の発現ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の大規模な生産のために、相当するｃＤＮＡを、Ｃ末端ヒスチジン標識に融合し、バキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３内でクローン化した。組換えウイルスを、２μｇの発現プラスミド及び０．５ μｇのＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ−ＤＮＡ(Pharmiingen,La Jolla,USA)の共形質導入によって生産し、プラークを精製し、増殖させ、ＳＦ９細胞の５リットルのバッチを感染させるために使用した。ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１を、ＰＢＳに対する過度の透析、及びイミダゾールの直線勾配（０．１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＭＥＳ,ｐＨ６．０中に０−０．４Ｍ）を使用したＮｉ²⁺キレートカラム(Qiagen ,Germany)上でのアフィニティークロマトグラフィー、引き続きカチオン交換クロマトグラフィー（８）の後、上清から精製した。調製物の純度は、クマシー染色ＳＤＳ−ゲルから典型的に８０−９０％であった。 P.pastorisにおけるｗｔ−ＮＫ２及びＨＰ１−ＮＫ２の発現ｗｔ−ＮＫ２またはＨＰ１−ＮＫ２をコードするｃＤＮＡを、ヒトＨＧＦ／ＳＦｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって生産し、S.cerevisiaeのα接合シグナルペプチドを有するフレーム中の融合物を作製するP.pastoris発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ(Invirtogen Inc.)内でクローン化した。ｗｔ−ＮＫ２及びＨＰ１−ＮＫ２プラスミドをコードする直線化組換えｐＰＩＣ９Ｋプラスミドを、スフェロプラスト形成によってP.PastorisのＧＳ１１５，ｈｉｓ^-株の形質転換のために使用した。形質転換されたクローンを、ｈｉｓ^-プレート上で初めに選択し、引き続きマルチコピー挿入物のためＧ４１８プレート上で選択した(３３)。選択されたクローンを、攪拌フラスコ内での組換えタンパク質の大規模発現のために使用した。培養上清を、誘導の７２時間後に回収し、該上清を遠心分離によって分画し、引き続き濾過した。ｗｔ−ＮＫ２を最初にヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ(Pharmacia)を使用し、引き続き０．０５ＭＭＥＳ、ｐＨ６．０中のＮａＣｌの勾配（０．２５−１．００Ｍ）を使用してＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓe(Pharmacia) 上でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ＨＰ１−ＮＫ２を、Ｓ −Ｓｅｐｈａｒｏse上でのイオン交換クロマトグラフィーによって直接的に精製した。ｗｔ−ＮＫ２及びＨＰ１ＮＫ２のモノマー及びダイマー種を、０．０５ＭＭＥＳ、０．２５ＭＮａＣｌ、緩衝液、ｐＨ６．０中でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム(Pharmacia)上でのサイズ溶出クロマトグラフィーによって分離した。生物学的に活性なタンパク質の収率は、５−１０ｍｇ／リットルの間であった。ヘパリン及びＭＥＴＥＬＩＳＡヘパリンＥＬＩＳＡのために、９６穴プレート(Nunc,Multisorp)を、２００μ ｌ／ウェルの高分子量ヘパリン(２００μｇ／ｍｌ、Sigma H3393)を使用してインキュベーションした。ブロッキング後、精製ＨＧＦ／ＳＦ、並びに野生型及び突然変異体ＨＧＦ／ＳＦを発現するＮｅｕｒｏ２ａ細胞の上清が、２時間インキュベーションされ、ウサギ抗標識抗体ＨＡ１１(Hiss diagnostics)または抗ＨＧＦ／ＳＦマウスモノクローナル抗体（クローン３４）のそれぞれを使用し、引き続きＨＲＰ接合二次抗体を使用してインキュベーションされることによって検出された。ＭＥＴＥＬＩＳＡのために、ＭＥＴの細胞外ドメイン、及び免疫グロブリンγ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインより成る可溶性融合タンパク質を生産し(ＧＨ、未印刷の結果）、〜８０％の均一性までプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ウェルを４℃ で一晩全長ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦまたはＨＰ１を使用して被膜し、ブロックし、ＭＥＴ−Ｉｇ融合タンパク質を２時間で加え(２００ｎｇ／ｍｌ)、引き続きヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体及びＨＲＰ接合ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体を使用してインキュベーションした。色素の発色のため、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中で０．６６ｍｇ／ｍｌのオルト−フェニルジアミンを、ＨＲＰ基質として使用した(１００μ１／ウェル)。全長ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１及びそれらのＮＫ２断片のヘパリン結合速度野生型及び突然変異体タンパク質の結合の速度分析を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置(BIAcore Ltd.,St.Albans,Herts.,UK)を使用して表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施した。１０ｍｇ／ｍｌの高分子量ヘパリン(Sigma H3393)を、室温で１時間、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０の１ｍｌ中で３倍過剰量のＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(Pierce 21336)を使用してビオチン化した。ビオチン化へパリンを、二つの２ｍｌＥｘｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム(pierce)を連続的に通過させることによってビオチンの存在しないものから分離し、ストレプタビジン被膜ＳＡセンサーチップ上での捕獲のため使用した。全ての実験を、２５℃ の操作温度で実施した。全ての流動において流動緩衝液（running buffer;ＥＢ）は、０．２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｇ／ｌＮａＮ₃、０．０５ｇ／ｌｐ２０界面活性剤(BlAcore Ltd)を含むＰＢＳであった。試験表面（フローセル２−４）からコントロールセル（フローセル１）へのヘパリンの漏出の可能性を防ぐために、表面１を、５μｌ／分の流速でＥＢ中に２５０ｎｇ／ｍｌのビオチンを２回２０μｌで注射することによってブロックした。次いで表面２を、ＥＢ中に１０ｍｌの２ｎＭのヘパリン−ビオチンを使用して５μｌ／分で被膜した。およそ２５ＲＵが、本実施例において結合した；シグナルにおけるわずかな増大が、長いヘパリン分子によるデキストランの架橋のために生じるので、低濃度で結合したヘパリンの正確な測定は不可能である。次いで該表面を、表面１と同様のビオチンを使用してブロックした。ＳＰＲ分析に対する該タンパク質サンプルの吸着または変性を防ぐために、これらを室温で３０分Heparin-Sepharose 4B(Pharmacia Biotech,S t.Albans)上で予備吸着された、０．２ｍＭＥＤＴＡ中の０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ内で周知のように希釈した。各種のタンパク質の分析のため、サンプルを１５μｌ／分で汲み上げた。該表面の再生を、水中に０．１ｇ／ｌＳＤＳの１０ μｌの連続的な"QUICKINJECT/EXTRACLEAN"、引き続き１ＭＮａＣｌの２×１０ μｌによってなした。ＥＢ中の０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡの最後の１５ｍｌを、いずれの非特異的結合部位もブロックするように注射した。自動分析流動から得たデータファイルを、ＢＩＡｃｏｒｅＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアー(BlAcore Ltd)を使用して非直線的な曲線フィット(３４)によって分析した。タンパク質濃度をＢＣＡ試薬(Pierce)によって測定し、各バッチのタンパク質の生物学的活性を、一致した特異的活性を確認するためにＭＤＣＫアッセイ（７）において確かめた。細胞生物学的アッセイＭＤＣＫ及びミンク肺細胞のコロニー散乱分析を、以前に記載されたように実施した(７)。ＤＮＡ合成の測定のため、ミンク肺細胞を２４穴プレート中に５，０００−１０，０００細胞／ウェルの密度で植菌し、４８時間ＤＭＥＭ中でインキュベーションすることによって血清を枯渇させた。次いで各種の濃度のＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１を加え、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で２４時間インキュベーションを継続し、³Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を加えた後１６時間最終のインキュベーションをなした。５％ＴＣＡ中に不溶性の放射性活性を、０．２ＭＮａＯＨ中で可溶化した後シンチレーションカウントによって測定した。ミンク肺細胞に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の全結合ミンク肺細胞を、２４穴プレート中で密集させて成育させた。培地を使用した２回の洗浄の後、細胞を３０分４℃でインキュベーションした。次いでＰＢＳにおけるＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の一連の希釈物を該細胞に加え、４℃でさらに１５分インキュベーションした。非結合因子をＰＢＳを使用した３回の洗浄によって除去し、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを使用して固定した。さらなる２回の洗浄後、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１と同じ態様で反応するマウス抗ＨＧＦ／ＳＦモノクローナル抗体（クローン３４）を使用してインキュベーションし、引き続きＦＩＴＣ接合抗マウスＩｇＧを使用してインキュベーションした。ラットにおけるｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１のクリアランス及び組織配置１０μｇの精製ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１を、Biotez,Berlin,GermanyによるIod ogen(Pierce)を使用した固相法によってヨウ素化した。反応の後、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを加え、遊離ヨウ素を、３０ｋＤａをカットオフしたCentrisat濾過装置(Sartorius)上での複数の濾過によって除去した。特異的な活性を計算したところ、ＨＧＦ／ＳＦについて１．８５ＭＢｑ／ｍｇ、ＨＰ１について１．９５ＭＢｑ／ｍｇであった。ヨウ素化前後の該タンパク質の生物学的活性を、ＭＤＣＫ細胞を使用した移動度アッセイにおいて比較して測定したところ、ヨウ素化の後で８０％であった。大人のラット（グループ当たり３匹）に麻酔をかけ、頸動脈内にカテーテルを挿入し、０．２ｍｌの¹²⁵Ｉ−ＨＧＦ／ＳＦの単一の静脈内へのボーラス注射を与えた(動物当たりＨＧＦ／ＳＦについて０．４５ＭＢｑ、ＨＰ１について０．３８ＭＢｑ)。１，３，５，７，１０及び６０分、２時間及び２０時間後、２００μｌの血液のサンプルを、カテーテルを介して採取した。血液を凝固させ、４℃で５分１０，０００ｇで遠心分離した。各サンプルについて１００μｌを等量のＰＢＳを使用して希釈し、２ｍｌの氷冷１０％ＴＣＡを加えた。氷上で３０分後、サンプルを遠心分離し、計数の前に５％ＴＣＡを使用して沈降物を洗浄した。組織放射性活性の測定のために、¹²⁵Ｉ標識ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦまたはＨＰ１の注射の２時間後で動物を殺生し、ＰＢＳを使用して灌流した。器官を取り出し、計量し、ホモジナイズし、放射性活性を沈降可能なＴＣＡの量を測定した。大人の肝臓におけるＤＮＡ合成に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の効果肝細胞におけるＤＮＡ合成を誘導する野生型ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の能力を、組換えタンパク質の静脈内投与及びＢｒｄＵを使用した細胞標識に引き続き測定した。略記すると、メスの動物（６−８週齢；体重１９．５から２６．９ｇ）を、３日間尾の静脈にＰＢＳ、野生型ＨＧＦ／ＳＦまたはＨＰ１のそれぞれ（５５．５μｇ／投与量）を使用して一日二度注射した。因子の最後の注射時に、各動物はＢｒｄＵ（７５μｇ／体重のｇ）を腹膜内に注射して受け取り、１２時間後に動物を殺生し、肝臓を切断し、凍結切片を調製した。切片を７０％エタノールで固定し(５分)、３７℃で１０分２．４ＭＨＣｌを使用して処理し、ＢｒｄＵを取り込んだ核を、抗ＢｒｄＵ抗体(Sigma，１：４００)を使用し、引き続きペルオキシダーゼ接合抗マウスＩｇＧ(Jackson Laboratories，１：５００)を使用して染色した。結果ＨＧＦ／ＳＦのヘアピン構造及びクリングル２突然変異体ＨＧＦ／ＳＦのＮ末端ドメインは、ＨＧＦ／ＳＦホモローグＨＧＦ１／ＭＳＰ及びプラスミノーケンで保存されている４個のシステイン残基を含む。プラスミノーゲンに対する研究（３５）は、このドメインが二つのジスルフィド結合によって安定化されたヘアピン構造を形成することを示した。ＨＧＦ／ＳＦのヘアピン構造の三次元モデルは、ＨＧＦ１／ＭＳＰ及びプラスミノーゲンの相当するモデルには存在しないいくつかの正に荷電した残基の存在を示唆した(２９)。ＨＧＦ／ＳＦのヘアピン構造の６個の異なる点突然変異体を構築し(ＨＰ１からＨＰ６)、その中で全部で１０個のアミノ酸残基が置換された。該ストラテジーは、正の残基を負に、負の残基を正に、疎水性残基を極性に変える突然変異を含んだ (突然変異体に配列については図１の記号参照)。これらの点突然変異体の能力を、野生型（ｗｔ−）ＨＧＦ／ＳＦ、及び全ヘアピン構造（アミノ酸６８から１００）が欠失された突然変異体であるＨＰΔのものと比較した。さらに、クリングル２の二つの複数突然変異体を構築した：突然変異体Ｋｒ２−１においては、クリングルの表面上の４つの正の残基のクラスター（Ｈ２４１，Ｒ２４２，Ｋ２４４及びＲ２４９）が、突然変異された；突然変異体Ｋｒ２−２においては、三つの残基が突然変異され(Ｒ２８１，Ｗ２８２及びＹ２８４)、該残基はプラスミノーゲンクリングル４で存在するものと同様にクリングル２の表面で疎水性ポケットを形成していると予測された(２９)。最初の研究については、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞系において一過的形質導入によって突然変異体を発現させ(図１ａ)、ヘパリン結合（図１ｂ）及び生物学的活性（図１ｃ）について特徴付けした。ＨＰＤで予測されたように、ヘアピン構造を欠失した突然変異体は、ヘパリン結合及び生物学的活性の両者を示さなかった。点突然変異体は、三つの異なる群に分けられた：第１群（ＨＰ１，ＨＰ２及びＨＰ４）は、正常なシグナリング活性を示すが、非常に減少した（ＨＰ１及びＨＰ２）または減少した（ＨＰ４）ヘパリン結合を示した。第２群（ＨＰ３）は、シグナリング及びヘパリン結合の両者において過度の欠損を示し、第３群（ＨＰ５及びＨＰ６）は、本質的に野生型ＨＧＦ／ＳＦと同様の挙動を示した(図１ｂ及びｃ)。第一のクリングル２突然変異体、Ｋｒ２−１は、ヘパリン結合及び生物学的活性の過度の減少を示す一方で、第二の突然変異体、Ｋｒ２−２は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦと区別できないものであった(図１ｂ及びｃ)。これらの結果から、我々は、ヘアピン構造における正に荷電した残基の第一のクラスター（Ｒ７３，Ｒ７６）は、ヘパリンと関与するがＭＥＴ結合とは関与せず、残基Ｒ２８１，Ｗ２８２及びＹ２８４はいずれとも関与しないと結論付けることができる。正に荷電した残基の二つのその他のクラスター、ヘアピン構造中のもの（Ｋ９１及びＫ９４）及びクリングル２中のもの（Ｈ２４１，Ｒ２４２，Ｋ２４及びＲ２４９）は、ＭＥＴおよびヘパリン結合の両者に関与するであろう。ヘパリンに対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ、ＨＰ１及びそのＮＫ２断片の結合速度全長ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１（著しく減少したヘパリン結合を示すが正常の生物学的活性を示す二つの突然変異体の一つ）を、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によってヘパリンに対する結合の速度を分析するために昆虫細胞中で発現した。これらの実験は、ＨＰ１の結合速度における重要な差異を明らかにした。ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ（４から３０ｎＭ）のヘパリンに対する結合は、〜１×１０^-3ｓ^-1の単一の一次解離速度定数（Ｋ_off）を表した。会合の間の結合の量は、〜１×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1の会合速度定数（Ｋ_on）で単一部位モデルに適合可能であり、〜１×１０^-9Ｍのモル解離定数（Ｋ_d）を示した。ＨＰ１（４から８０ｎＭ）は、顕著に減少したヘパリン結合を示した(データは示していない)。しかしながら我々は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦとＨＰ１の間で観察された差異は、二つのタンパク質のダイマーまたはオリゴマー形態の存在によって影響されており、その点はサイズ排除カラムからの低い回収のために確立することはできないものと考えた。それ故我々は、メチロトローフな酵母(methylotropic yeast)P.pastoris において、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１のＮＫ２断片を発現し(すなわちヘパリン結合に関与することが示されている全てのドメイン、Mizuno等,1994)、さらなる速度分析のためにそれらを使用した。P.pastoris培養物の上清から精製されたｗｔ−ＮＫ２及びＨＰ１−ＮＫ２は、Superdex-75カラム上で容易に分離可能であるＮＫ２モノマー及びダイマーの混合物より成り、ヘパリンに対する結合速度をbona fideモノマー種を使用して確立することができた。ｗｔ−ＮＫ２（図２ａ）及びＨＰ１−ＮＫ２（図２ｂ）のヘパリンに対する結合の測定グラフを重ねたものは、ヘパリン結合における主要な差異を確認した。ｗｔ−ＮＫ２については、解離曲線はより高い濃度でより遅れ、見かけのｋ_off 値は１から４×１０^-3ｓ^-1の間で変化した(図２ｃ、■)。対照的に、ＨＰ１−ＮＫ２の解離は(図２ｂ)、６−７×１０^-3ｓ^-1の見かけのｋ_off値に濃度と共に上昇した(図２ｃ、□)。ｗｔ−ＮＫ２の会合相の分析は(図２ａ)、複雑な速度を示した。単一のクラスの結合部位を仮定し、最早期（最速）の相から得たデータを合わせると、観察された会合速度定数（”Ｋ_s”）対３００ｎＭまでの濃度に対するＣのブロットは直線を与え(ｒ²＝０．９９７)、その直線から我々は、１．７５×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1のｋ_onを計算した(図２ｄ、▲)。結合のより遅い段階では、顕著に遅い会合を有する第二の相が認められたが、二つのクラスの結合部位に基づくフィットモデルの試みは不適切であった。４×１０^-3ｓ^-1のｋ_offに対する最速の値及び１．７５×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1のｋ_onに対する値、２．３ｎＭのＫ_d値を、ｗｔ−ＮＫ２に対して計算した。ＨＰ１−ＮＫ２について、結合の早期の相の分析（単一のクラスの結合部位の存在を仮定して）は、Ｋ_s対Ｃプロットから〜５×１０⁴Ｍ^-1Ｓ^-1のｋ_on値を与えた(図２ｄ、□)。この数値は、ｗｔ−ＮＫ２のものよりも〜３５倍低かった。ｋ_off に対する６×１０^-3ｓ^-1の値を合わせると(図２ｃ、□)、１２０ｎＭのＫ_dがＨＰ１−ＮＫ２について計算された。それ故、ＨＰ１−ＮＫ２の結合親和性は、ｗｔ−ＮＫ２に対するものより５０倍低い。ＨＳＰＧ及びＭＥＴに対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の結合、並びにインビトロでの標的細胞に対する二つのタンパク質の活性細胞表面及びマトリックスヘパラン硫酸に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の結合を、ガン腫系ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ並びにミンク肺細胞を含むいくつかの細胞系において調べた。後者は、大量のＨＧＦ／ＳＦ及びその切り詰めた形態ＮＫ１及びＮＫ２をＨＳＰＧを介して結合することが最近示されている(３６)。免疫蛍光によると、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ及びミンク肺細胞に対するＨＰ１の全結合が、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦに対するものより顕著に低かった(データは示されていない)。これらの結果は、定量的固相アッセイによって確認及び拡張され、ミンク肺細胞に対する全長ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１の結合を説明する代表的な実験が図３に示されている。ミンク肺細胞に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦの全結合は、１０から６７５ｎｇ／ｍｌに安定して増大する一方、ＨＰ１の結合は、同じ範囲の濃度に対してほとんど測定できなかった。外因性ヘパリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）は、該細胞に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦの結合に対して効率的に競合し、ＨＰ１のものよりわずかにだけ高いレベルにそれを減少した。これは、細胞結合ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦの量はＨＳＰＧと関連し、ＨＰ１は上記分子に結合しないことを確認する。ヘパリン及び細胞会合性ＨＳＰＧに対するＨＰ１の減少した結合と著しく対照的に、ＭＥＴレセプターの可溶性形態に対するＨＰ１の結合、及びミンク肺細胞におけるＤＮＡ合成の刺激を誘導する能力は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦに対するものよりわずかにのみ低かった(それぞれ図４ａ及び４ｂ)。同様な結果は、マウスケラチノサイト系ＭＫでも得られた(データは示していない)。同様に、ミンク肺細胞及びＭＤＣＫ細胞の解離及び散乱を誘導するＨＰ１の能力は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦと区別できなかった(図５におけるパネルｂ対ｃ、及びｅ対ｆを比較)。それ故、ヘパリン及びＨＳＰＧに対する結合親和性の顕著な減少にも関わらず、標的細胞に対するＤＮＡ合成及び細胞移動を誘導するＨＰ１突然変異体の能力は、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦと区別できなかった。ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１のインビボの活性我々は、インビトロでの該因子の挙動に対するＨＰ１突然変異体の効果を調べた。このために、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１を、¹²⁵−Ｉを使用して標識し、大人のラットの頸動脈に注射した。次いで、血清及びいくつかの器官における二つのタンパク質の濃度を、ＴＣＡ−不溶性放射性活性の形態において測定した。図６ａは、血清からのｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦ及びＨＰ１に対するクリアランス曲線を示す。以前の研究と一致して(２３，３７，３８)、我々は循環からのｗｔ− ＨＧＦ／ＳＦの迅速なクリアランスを観察した(最初の１５分間で＞９８％)。ＨＰ１のクリアランスは顕著により遅く、試験した全ての時点で血漿におけるＨＰ１の濃度は、注射後２０時間までｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦよりも５−１０倍高かった (図６ａ)。血清からのＨＰ１のより遅いクリアランスは、肝臓、腎臓、肺、心臓、精巣及び脾臓を含むいくつかの器官における突然変異因子の増大した量と関連した(図６ｂ)。異なる器官の間のＨＰ１突然変異体及びｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦの相対的な配置は同じであったが、ＨＰ１の濃度はｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦよりも２−３倍高かった(図６ｂ)。次に、大人の肝臓においてＤＮＡ合成を誘導するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦの能力を、二つのタンパク質の静脈内注射の後に調べた。予期したように、因子の非存在下では、ＤＮＡ合成は非常に低いが、それはＨＧＦ／ＳＦまたはＨＰ１のそれぞれの投与の後に顕著に増大した(図６ｃ)。しかしながら、ＨＰ１による刺激は、血清及び肝臓における該因子の増大した濃度と一致して(図６ａ及び６ｂ)、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦに対するものより２．７倍高かった(図６ｃ)。諭考ＨＧＦ／ＳＦのヘパリン及びレセプター結合部位以前の研究は、ＨＧＦ／ＳＦのＮ末端ドメインのヘアピン構造が、ヘパリン（２４）及びレセプター結合（２５−２８）の両者について重要であることを示した。本研究において、我々は、ＨＧＦ／ＳＦのヘパリン及びレセプター結合部位をタンパク質操作によって分離することができ、顕著に減少したヘパリン結合を有するＨＧＦ／ＳＦの突然変異形態が、インビボで優れた生物学的活性を有することを示す。ＨＰ１及びＨＰ２突然変異体の両者が、ヘパリンに対して顕著に減少した親和性を有するが、培養物中の標的細胞上のｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦに匹敵する生物学的活性を有することを考慮して、我々は、共通の突然変異（Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅ）が、ヘパリン結合に重要であることを示唆し、その結論はＲ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅの二重突然変異の予備的特徴によって支持される。対照的に、ヘアピン構造中の正に荷電した残基の第二のクラスター(Ｋ９１，Ｋ９３及びＫ９４)、またはクリングル２中の正に荷電した残基の別のクラスター（Ｈ２４１，Ｒ２４２，Ｋ２４４及びＲ２４９）の置換は、標的細胞におけるヘパリン結合及びＨＧＦ／ＳＦシグナリングの両者を破壊した。我々は、ＨＧＦ／ＳＦのＮ末端ドメインのアラニンスキャニング突然変異誘発（３９）が、ＭＥＴ結合及びシグナリングに対する必須のヘアピン構造中の残基を同定しなかったことに気づく。これは、ヘアピン構造中の近傍残基の複数の置換（我々が導入したもののような）が、測定可能な変化を得るために必要であるからだろう。ヘパリン結合活性の程度は、Lokker等（３９）には報告されなかった。ヘパリンに対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦおよびＮＫ２断片の結合速度我々のデータは、全長ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦが高い親和性（Ｋ_d＝〜１ｎＭ）を有してヘパリンを結合することを示す。この数値は、限外濾過による結合及び遊離³⁵Ｓヘパリンの分離に引き続く、³⁵Ｓヘパリンに対する全長ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦの結合を測定した別の研究から得た０．６ｎＭの値に匹敵する(２３)。測定された速度が、ヘパリンとモノマー性タンパク質種の相互作用に起因することを確認するために(そしてかくしてＨＰ１突然変異体に対する正確な速度を確立するために)、我々はP.pastorisにおいて発現されたモノマー性ＮＫ２断片に依存した。ｗｔ−ＮＫ２の解離速度は、タンパク質の最高濃度での見かけのｋ_off値に対する顕著な効果を明らかにし、ヘパリンに対するＮＫ２の共同的な結合を示唆した( データは示されていない)。飽和点またはその近くでの結合の化学量論の分析は、１６ｋＤａのヘパリン当たりおよそ４個のｗｔ−ＮＫ２分子を示す。低ヘパリン表面に対するｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦについてのより特定的でない概算は、ヘパリン分子当たり３．５分子のＨＧＦ／ＳＦの値を提供した。これらの値は、ＮＫ２及びＨＧＦ／ＳＦのヘパリン結合部位が、〜１４個の単糖類単位を包含することを示唆し、その値は、１２−１４単位のヘパラン硫酸断片がＨＧＦ／ＳＦに対する高親和性結合にために必要とされることを報告した、Lyon等（４０）の発見と一致する。ヘパリンに対する全長ＨＧＦ／ＳＦのモル解離定数（Ｋ_d＝１ｎＭ）は、同じ実験条件の下で酸性ＦＧＦとヘパリンの相互作用について得られた５０ｎＭの値と匹敵する(４１)。ＨＧＦ／ＳＦ及びＦＧＦのオンレートは同じであり(それぞれ１．７５対１．０×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1)、親和性における差異はオフレートに寄与する(ＨＧＦ／ＳＦ及びＦＧＦについて１×１０^-3ｓ^-1対６×１０^-2ｓ^-1)。ＨＰ１のヘパリンに対する減少した親和性は、オンレートを減少することによって達成され(図２ｄ)、該結果は会合速度に対する静電気的相互作用の顕在化した役割と一致する(４２)。ＨＧＦ／ＳＦ及びＦＧＦ系におけるヘパラン硫酸に対する異なる役割ＨＰ１突然変異体は、ＨＧＦ／ＳＦ活性におけるヘパリン結合の役割に関する多くの知見を提供している。ＨＧＦ／ＳＦは、ＨＳＰＧを結合する多くの増殖因子の一つであるか、増殖因子活性におけるヘパラン硫酸の役割は、ＦＧＦの場合を除いて一般的に明らかではない。ＦＧＦと共に、三つの構成成分（リガンド、レセプター及びヘパラン硫酸）がシグナリングのために必要であるという証拠が存在する。この結論は、精製構成成分を使用した形質導入実験（２，３）及び生化学的研究によって支持される(４３)。おそらくＨＳＰＧは、ＦＧＦをダイマー化し、それによってレセプターダイマー形成及びシグナリングを促進する（４４）ことによって機能し、その説明は最近のＦＧＦ−ヘパリン複合体の構造と一致する(３１)。我々の結果は、ＨＧＦ／ＳＦ系におけるＨＳＰＧに対する異なる役割を示す。別の研究は、ヘパリンが培養物中の細胞上のＨＧＦ／ＳＦ及びＮＫ１及びＮＫ２断片の活性を増大することを示唆するが(３６)、我々は、ＨＰ１突然変異体のレセプター結合及び生物学的活性が、ヘパリン結合における＞５０倍の欠損にも関わらず、ｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦとは本質的に区別できないことを見出す。しかしながら我々の結果は、ＨＳＰＧに結合するＨＧＦ／ＳＦの生理学的機能の疑問を生ずる。ここに存在するインビボのデータは、組織においてＨＧＦ／ＳＦの中和及び分解を促進するＨＳＰＧの役割を示唆する(図６ａ及び６ｂ)。それ故ＨＳＰＧは、インビボでＨＧＦ／ＳＦをクリアランスする手段を表す。実際に、肝臓におけるＨＰ１の増大したＤＮＡ合成活性（図６ｃ）と組織における因子の増大した濃度（図６ｂ）の間には緊密な相関関係が存在する。ＨＳＰＧの他の考え得る役割を推測することは可能である。例えば、ＨＳＰＧは、胚形成の間、「モルフォゲン勾配(morphogen gradient)」の確立に必要とされるような、選択された細胞または組織区画に対するＨＧＦ／ＳＦの局在化を助けているかもしれない（４５，４６）。本方法の例は形成中の四肢であり、そこでは芽において筋原性前駆細胞の移動がＨＧＦ／ＳＦ及びＭＥＴに必須に依存していることが周知である(４７)。インビボでのヘパリン欠陥ＨＧＦ／ＳＦ突然変異体の応用ＨＧＦ／ＳＦの潜在的な治療上の応用については最近かなり興味が持たれており、いくつかの研究がインビボでの該増殖因子の薬物生体反応学の疑問に向けられている。これらの研究の結果は、ＨＧＦ／ＳＦが循環から非常に迅速にクリアランスされ(２３，３７，３８)、血漿中の該増殖因子の半減期が、ヘパリン（２３）またはデキストラン硫酸のような他のポリアニオンと該増殖因子を複合体化することによって伸長可能であることを示した(４８)。デキストラン硫酸と複合体として融合したＨＧＦ／ＳＦはまた、大人の動物における肝細胞増殖を誘導する際に顕著により高い活性を有した(４８)。我々の研究は、ＨＰ１突然変異体のようなＨＧＦ／ＳＦの操作された形態について、等しいまたは優れた結果を得ることが可能であることを示す。該突然変異体は、循環においてより長い残余時間 (図６ａ)、より大きい組織濃度を有し(図６ｂ)、大人の肝臓におけるＤＮＡ合成を誘導する際にｗｔ−ＨＧＦ／ＳＦよりも活性である(図６ｃ)。それ故、それは、薬物生体反応学及び活性を改良するために、ヘパリン様化合物とＨＧＦ／ＳＦを複合体化する必要性を克服する。ポリペプチド増殖因子が、特異的な膜レセプターを介して標的細胞に対する効果を発揮することは十分に確立されている（１）が、これらのタンパク質の多くがまた、細胞表面及びマトリックスプロテオグリカン、特にヘパラン硫酸タイプのもの（ＨＳＰＧ）を結合することが数年で明らかになっている。この二重相互作用の生物学的重要性は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の場合で良く理解されている。ＦＧＦレセプターを発現するが、膜結合ヘパラン硫酸を欠いている細胞は、ＦＧＦシグナリングに対する本質的な共レセプターとしてヘパラン硫酸を含んでいる塩基性ＦＧＦ（２，３）に応答しない。上皮増殖因子（ＥＧＦ）−関連するポリペプチドアンフィレグリン(amphiregulin)（４）及びヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）(５)、同様に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）(６)のいくつかのスプライシング変異体もまた、活性のために細胞結合ヘパラン硫酸を必要とするが、これらの系におけるＨＳＰＧの役割は十分に理解されていない。肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）（７−１２）は、他のものとは区別され、血液プロテイナーゼ前駆体プラスミノーゲンのものと関連するドメイン構造を有する、高分子量ポリペプチド増殖因子である。プラスミノーゲンと同様に、ＨＧＦ／ＳＦは、不活性な一本鎖ポリペプチドとして生産され、それが二本鎖種に蛋白分解的に変換される(１３−１５)。二本鎖ＨＧＦ／ＳＦは、ｃ−Ｍｅｔ原ガン遺伝子によってコードされる特異的膜チロシンキナーゼレセプターを介して、標的細胞において増殖、移動及び分化を誘導する(１６，１７)。ＨＧＦ／ＳＦは、ナノモル以下の範囲のＫ_dを有してＭＥＴレセプターに強固に結合する( １８，１9)。ＨＧＦ／ＳＦはまた、ヘパリンを結合する(２０，２１)。これは、ＭＥＴレセプターの可溶性形態に対する結合親和性に影響するとは解されないが、標的細胞上でのレセプターリン酸化およびマイトジェン活性を増大する(２２) 。ＨＧＦ／ＳＦ−ヘパリン複合体はまた、持続した血漿濃度を示し、インビボでの肝のクリアランスを減少する(２３)。ＨＧＦ／ＳＦの分子構造は、レセプター及びヘパリン結合に対して応答性のドメインの同定を容易にした。Ｎ末端ドメイン（プラスミノーゲンの活性ペプチドと相同なドメイン）のヘアピン構造の欠失、またはクリングル２の欠失は、ヘパリンに対する減少した見かけの親和性を有する突然変異体を導く(２４)。対照的に、クリングル１，３，４またはプロテイナーゼドメインのそれぞれの欠失は、ほとんどまたは全く影響を有さない(２４)。それ故、ＨＧＦ／ＳＦのヘパリン結合部位は、Ｎ末端ドメインのヘアピン構造及びクリングル２内に含まれると解される。しかしながら、同じドメインが、ＭＥＴ結合及びシグナリングについて必須である(２５−２８)。実施例２：変異体ＨＧＦを使用した治療ウイルス感染または化学品／薬剤傷害のそれぞれのために急性肝疾患を有する患者が、該疾患の急性期を通じて１−１００μｇ／ｋｇの投与量で、生理食塩水における毎日の静脈内の注射により、変異体ＨＧＦを使用して治療される。該疾患の発達は、αフェトプロテイン、γ−グロブリン、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ及びγ −ＧＴの血漿濃度を測定することによってモニターされる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月８日（１９９９．６．８）【補正内容】請求の範囲１．医薬における使用のための、野生型ＨＧＦのヘアピンループ構造中の正に荷電したアミノ酸残基が、負の荷電を有するアミノ酸残基を使用して置換されていることを特徴とする、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターに対して結合可能である変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２．医薬における使用のための、少なくともアミノ酸残基Ｒ７３が、負の荷電を有するアミノ酸残基によって置換されていることを特徴とする、請求項１記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。３．医薬における使用のための、少なくともアミノ酸残基Ｒ７６が、負の荷電を有するアミノ酸残基によって置換されていることを特徴とする、請求項１または２記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。４．医薬における使用のための、アミノ酸残基Ｒ７３及びＲ７６の両者が、負の荷電を有するアミノ酸残基を使用して独立に置換されていることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか一項記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。５．医薬における使用のための、アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。６．医薬における使用のための、アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。７．医薬における使用のための、アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＫ７８Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。８．医薬における使用のための、アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅを有するヒトＨＧＦより成る変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。９．医薬における使用のための、アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅを有するヒトＨＧＦより成る変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１０．医薬における使用のための、アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＫ７８Ｅを有するヒトＨＧＦより成る変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１１．医薬における使用のための、野生型ＨＧＦの機能と拮抗する、請求項１ないし１０のいずれか一項記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１２．医薬における使用のための、該変異体ＨＧＦが、二本鎖形態へのＨＧＦのインビボでの変換が可能な酵素による蛋白分解的な切断に対して、該変異体ＨＧＦに耐性を与える突然変異をさらに含むことを特徴とする、請求項１１記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１３．野生型ヒトＨＧＦのアミノ酸４９３，４９４，４９５及び４９６のいずれかで、またはその近傍で、アミノ酸改変を有する、請求項１２記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１４．請求項１ないし１３のいずれかに記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、及び製薬学的に許容可能なキャリアーを含む製薬組成物。１５．請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の変異体ＨＧＦの有効量を患者に投与することを含むことを特徴とする、肝細胞増殖因子またはそのアンタゴニストを使用して治療の必要のある患者を治療する方法。１６．該患者がガンを有することを特徴とする請求項１５記載の方法。１７．ＨＧＦまたはそのアンタゴニストを使用して治療の必要のある患者を治療するための医薬の製造における、請求項１ないし１０のいずれか一項記載の変異体肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の使用。１８．該患者がガンを有することを特徴とする請求項１７記載の使用。１９．該変異体ＨＧＦが、置換（ａ）Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅまたは（ｂ）Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅまたは（ｃ）Ｋ９１Ｅ、Ｒ９３Ｅ及びＫ９４ＥがなされているヒトＨＧＦの変異体ではないという条件で、野生型ＨＧＦのヘアピンループ構造中の正に荷電したアミノ酸残基が、負の荷電を有するアミノ酸残基を使用して置換されていることを特徴とする変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２０．少なくともアミノ酸残基Ｒ７３が、負の荷電を有するアミノ酸残基によって置換されていることを特徴とする、請求項１９記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２１．少なくともアミノ酸残基Ｒ７６が、負の荷電を有するアミノ酸残基によって置換されていることを特徴とする、請求項１９記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２２．アミノ酸残基Ｒ７３及びＲ７６の両者が、負の荷電を有するアミノ酸残基を使用して独立に置換されていることを特徴とする、請求項１９ないし２１のいずれか一項記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２３．アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＫ７８Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２４．野生型ＨＧＦの機能と拮抗する、請求項１９記載の変異体肝細胞増殖因子 (ＨＧＦ)。２５．該変異体ＨＧＦが、二本鎖形態へのＨＧＦのインビボでの変換が可能な酵素による蛋白分解的な切断に対して、該変異体ＨＧＦに耐性を与える突然変異をさらに含むことを特徴とする、請求項２４記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ) 。２６．野生型ヒトＨＧＦのアミノ酸４９３，４９４，４９５及び４９６のいずれかで、またはその近傍で、アミノ酸改変を有する、請求項２５記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２７．請求項１９ないし２４のいずれか一項記載の変異体肝細胞増殖因子をコードするポリヌクレオチド。２８．請求項２７記載のポリヌクレオチドを含むベクター。２９．請求項２７または２８記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞。３０．請求項２９記載の細胞を培養すること、及びそこから変異体ＨＧＦを単離することを含むことを特徴とする、変異体肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を生産する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/475 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ハートマン，ギドーイギリス国ケンブリッジＣＢ１３ＳＥランガムロード 24

Claims

【特許請求の範囲】１．医薬における使用のための、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターに対して結合可能である変異体肝細胞増殖因子( ＨＧＦ)。２．医薬における使用のための、野生型ＨＧＦのヘアピンループ構造中の正に荷電したアミノ酸残基が、荷電を有しないまたは負の荷電を有するアミノ酸残基を使用して置換されていることを特徴とする、請求項１記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。３．医薬における使用のための、少なくともアミノ酸残基Ｒ７３が、荷電を有しないまたは負の荷電を有するアミノ酸残基によって置換されていることを特徴とする、請求項１または２記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。４．医薬における使用のための、少なくともアミノ酸残基Ｒ７６が、荷電を有しないまたは負の荷電を有するアミノ酸残基によって置換されていることを特徴とする、請求項１または２記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。５．医薬における使用のための、アミノ酸残基Ｒ７３及びＲ７６の両者が、荷電を有しないまたは負の荷電を有するアミノ酸残基を使用して独立に置換されていることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一項記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。６．医薬における使用のための、アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。７．医薬における使用のための、アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。８．医薬における使用のための、アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＫ７８Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。９．医薬における使用のための、アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅを有するヒトＨＧＦより成る変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１０．医薬における使用のための、アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅを有するヒトＨＧＦより成る変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１１．医薬における使用のための、アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＫ７８Ｅを有するヒトＨＧＦより成る変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１２．医薬における使用のための、野生型ＨＧＦの機能と拮抗する、請求項１記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１３．医薬における使用のための、該変異体ＨＧＦが、二本鎖形態へのＨＧＦのインビボでの変換が可能な酵素による蛋白分解的な切断に対して、該変異体ＨＧＦに耐性を与える突然変異をさらに含むことを特徴とする、請求項１２記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１４．野生型ヒトＨＧＦのアミノ酸４９３，４９４，４９５及び４９６のいずれかで、またはその近傍で、アミノ酸改変を有する、請求項１３記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。１５．請求項１ないし１４のいずれかに記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、及び製薬学的に許容可能なキャリアーを含む製薬組成物。１６．請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の変異体ＨＧＦの有効量を患者に投与することを含むことを特徴とする、肝細胞増殖因子またはそのアンタゴニストを使用して治療の必要のある患者を治療する方法。１７．該患者がガンを有することを特徴とする請求項１６記載の方法。１８．ＨＧＦまたはそのアンタゴニストを使用して治療の必要のある患者を治療するための医薬の製造における、請求項１ないし１０のいずれか一項記載の変異体肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の使用。１９．該患者がガンを有することを特徴とする請求項１８記載の使用。２０．該変異体ＨＧＦが、置換（ａ）Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅまたは（ｂ）Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅまたは（ｃ）Ｋ９１Ｅ、Ｒ９３Ｅ及びＫ９４ＥがなされているヒトＨＧＦの変異体ではないという条件で、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを実質的に結合できないが、ＨＧＦレセプターに対して結合可能である変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２１．野生型ＨＧＦのヘピンループ構造中の正に荷電したアミノ酸残基が、荷電を有しないまたは負の荷電を有するアミノ酸残基によって置換されていることを特徴とする、請求項２０記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２２．少なくともアミノ酸残基Ｒ７３が、荷電を有しないまたは負の荷電を有するアミノ酸残基によって置換されていることを特徴とする、請求項２０または２１記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２３．少なくともアミノ酸残基Ｒ７６が、荷電を有しないまたは負の荷電を有するアミノ酸残基によって置換されていることを特徴とする、請求項２０または２１記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２４．アミノ酸残基Ｒ７３及びＲ７６の両者が、荷電を有しないまたは負の荷電を有するアミノ酸残基を使用して独立に置換されていることを特徴とする、請求項２０ないし２３のいずれか一項記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２５．アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子 (ＨＧＦ)。２６．アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２７．アミノ酸残基置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＫ７８Ｅを含む変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２８．アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ及びＲ７６Ｅを有するヒトＨＧＦより成る変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。２９．アミノ酸置換Ｒ７３Ｅ、Ｒ７６Ｅ及びＲ９３Ｅを有するヒトＨＧＦより成る変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。３０．野生型ＨＧＦの機能と拮抗する、請求項２０記載の変異体肝細胞増殖因子 (ＨＧＦ)。３１．該変異体ＨＧＦが、二本鎖形態へのＨＧＦのインビボでの変換が可能な酵素による蛋白分解的な切断に対して、該変異体ＨＧＦに耐性を与える突然変異をさらに含むことを特徴とする、請求項３０記載の変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ) 。３２．野生型ヒトＨＧＦのアミノ酸４９３，４９４，４９５及び４９６のいずれかで、またはその近傍で、アミノ酸改変を有する、請求項３１記載の変異体ヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。３３．請求項２０ないし３０のいずれか一項記載の変異体肝細胞増殖因子をコードするポリヌクレオチド。３４．請求項３３記載のポリヌクレオチドを含むベクター。３５．請求項３３または３４記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞。３６．請求項３５記載の細胞を培養すること、及びそこから変異体ＨＧＦを単離することを含むことを特徴とする、変異体肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を生産する方法。３７．ここで開示されるいずれかの新規な変異体肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)。