PT1448772E - Método para aumentar os níveis de expressão do receptor de tnf humano - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODOS PARA AUMENTAR OS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DO RECEPTOR DE TNF HUMANO"

Antecedentes da Invenção 1. Área da Invenção A presente invenção relaciona-se com métodos para aumentar os níveis de expressão de proteína de acordo com os quais pelo menos um aminoácido numa sequência polipeptídica de aminoácidos está substituído pelo aminoácido, prolina. 2. Antecedentes A capacidade de obter um nível de expressão elevado de proteínas recombinantes segregadas em células de levedura e mamífero é frequentemente considerada dependente de proteína. Os esforços para maximizar a expressão de proteínas recombinantes focam-se frequentemente no aumento dos níveis do ARNm do gene recombinante. No entanto, o passo limitante da velocidade na expressão de determinadas proteínas não é nível de ARNm mas é, antes pelo contrário, devida a ineficiências na dobragem, adição de modificações pós-tradução e secreção das proteínas recombinantes. A combinação de mutagénese com a apresentação de proteínas na superfície de levedura é uma técnica poderosa para identificar proteínas com propriedades alteradas. Nesta técnica, as proteínas mutantes são apresentadas na superfície da célula e examinadas em relação a uma maior afinidade de ligação ou maiores níveis de expressão da proteína apresentada por FACS (triagem celular activada por 3 fluorescência). A apresentação de bibliotecas de mutantes na superfície de células de levedura foi utilizada para identificar mutantes de anticorpos de cadeia simples e receptores de células T de cadeia simples que possuem uma afinidade mais elevada para antigénios ou péptidos/MHC, respectivamente. 0 método de apresentação na superfície de levedura foi também utilizado para melhorar o nível de expressão de um receptor de células T de cadeia simples. A US 5 766 917 relaciona-se com um método de identificação e produção de uma protease capaz de clivar o receptor de TNF. Suter et al. (1995) Gene, Vol. 163, N° 2, pág. 263-266 descreve a clonagem do ADNc que codifica o receptor do factor de necrose tumoral p55 suíno.

Aksentijevich et al. (2001) Am. J. Human Genetics, Vol. 69, N° 2, pág. 301-314 descreve um receptor de TNF mutante. Zhang et al. (1992) J. Biol. Chem., Vol. 267, N° 33, pág. 24069-24075 descreve a análise mutacional dirigida para o sítio de ligação do receptor de TNF-alfa humano. Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biology, Vol. 6, N° 6, pág. 597-641 descreve a família TGF-beta.

Permanece a necessidade na técnica para identificar características estruturais ou particularidades de proteínas que permitam a expressão elevada de proteínas recombinantes, em particular de proteínas eucariotas, cuja expressão pode estar restringida devido a ineficiências na dobragem, adição de modificações pós-tradução e/ou secreção de proteínas.

Sumário da Invenção A presente invenção relaciona-se com métodos para aumentar os níveis de expressão de proteína de acordo com 4 os quais pelo menos um aminoácido numa sequência proteica de aminoácidos está substituído pelo aminoácido, prolina. A presente invenção proporciona, num aspecto, um mutante isolado de um polipéptido nativo como definido nas reivindicações. A presente invenção proporciona, noutro aspecto, um método de produção de um mutante isolado como definido nas reivindicações.

Noutros aspectos a presente invenção proporciona ácido nucleico isolado, vectores de expressão e células hospedeiras in vitro como definidos nas reivindicações. A presente invenção resolve, parcialmente, a necessidade persistente na técnica de meios para melhorar a eficiência de expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos e outras células hospedeiras. São aqui descritos métodos que ultrapassam o problema da dobragem ineficiente de polipéptidos, o qual limita a expressão de determinados polipéptidos heterólogos, e proporcionam níveis de expressão mais elevados de tais polipéptidos.

Descrição Abreviada das Figuras A Figura IA representa uma representação esquemática de uma análise citométrica de fluxo de células de levedura reveladas com um anticorpo policlonal dirigido contra TNFrED e IgG de burro anti-cabra conjugada com R-ficoeritrina. As células de levedura continham o plasmídeo pYES2 (painel da esquerda) ou o plasmídeo pYES2-TNFrED-Agg (painel da direita). 5 A Figura 1B é uma representação esquemática de uma análise citométrica de fluxo de células de levedura reveladas com hTNF-α biotinilado e avidina marcada com FITC. A levedura continha o plasmideo pYES2 (painel da esquerda) ou o plasmideo pYES2-TNFrED-Agg (painel da direita). A Figura 1C é uma representação esquemática de uma análise citométrica de fluxo bicromátrica de células de levedura que foram reveladas com hTNF-α biotinilado e avidina marcada com FITC e a anticorpo policlonal dirigido contra TNFrED e IgG de burro anti-cabra conjugada com R-ficoeritrina. As leveduras foram transformadas com uma biblioteca mutante (painel da esquerda) ou com a mesma biblioteca após três ciclos de triagem (painel da direita) . A Figura 1D é uma representação esquemática de uma análise citométrica de fluxo de células de levedura reveladas com hTNF-α biotinilado e avidina marcada com FITC. No painel da esquerda o histograma sombreado representa a levedura que expressa o TNFrED de tipo selvagem enquanto o histograma não sombreado representa o clone 11. No painel da direita o histograma sombreado representa a levedura que expressa o TNFrED de tipo selvagem enquanto o histograma não sombreado representa o clone 6. A Figura 2 é uma representação esquemática de uma análise de saturação de ligação de levedura que expressa o TNFrED de tipo selvagem (Fig 2A) , o clone mutante 6 (Fig 2B) ou 11 (Fig 2C) . Amostras em triplicado de levedura foram incubadas com concentrações crescentes de [125I]TNF- 6 α. As experiências de ligação foram repetidas duas a três vezes com resultados semelhantes. A Figura 3 é uma representação esquemática do gráfico φ-ψ dos resíduos substituídos nos clones mutantes 6 e 11 e os resíduos correspondentes presentes no TNFrED de tipo selvagem em que as regiões sombreadas são as conformações favoráveis obtidas a partir de uma análise de 136 estruturas de proteínas não homólogas a uma resolução de 1,8 Â ou superior. Quanto mais escura a cor, maior a frequência dos ângulos φ-ψ dos resíduos, e por esse motivo mas favorecida é a conformação. Os ângulos φ-ψ do resíduo correspondente nas estruturas cristalinas de TNFrED são apresentados em quadrados vermelhos (lncf.pdb, estrutura dimérica de TNFrED, 1,85 Â de resolução), losangos vermelhos (lext.pdb, estrutura dimérica de TNFrED, resolução de 2,85 Â) e triângulos vermelhos (ltnr.pdb, estrutura do complexo TNF/TNFrED, 2,85 Â de resolução). Foi utilizado o conjunto de dados de alta resolução representativo para gerar os símbolos verdes e estes símbolos representam os ângulos φ-ψ do resíduo substituído no mesmo contexto de tri-(x verdes) ou tetra-(círculos verdes) aminoácidos como o presente no TNFrED de tipo selvagem ou nos clones mutantes (ver também Quadro 4). (A).

Ser76. (B) Pro76. (C). His23. (D) Pro23. (E). Ser46. (F).

Ile46. A Figura 4 apresenta as sequências de aminoácido e polinucleótida de TNFrED. 7

Descrição Pormenorizada da Invenção A presente invenção baseia-se na constatação inesperada que a substituição de um ou mais aminoácidos pelo aminoácido prolina na sequência de aminoácidos de um polipéptido resulta em niveis de expressão mais elevados dessa proteina. Embora não se pretenda ficar limitado pela teoria, a evidência apoia a sugestão que o mecanismo bioquímico que permite níveis mais elevados de expressão se relaciona com a promoção da dobragem conformacional apropriada de uma proteína.

Através do rastreio de clones mutantes do domínio extracelular do receptor do Factor de Necrose de Tecido (TNFrED) com o sistema de apresentação em levedura nós fomos capazes de identificar mutações de TNFrED que conferiam um maior nível de expressão em levedura em comparação com o TNFrED de tipo selvagem. Um clone continha a mutação S75P e o outro clone continha as mutações H23P e S46I. Estas mutações não alteraram a afinidade do TNFrED para o TNF-α. A expressão destes mutantes em células de mamíferos produziu resultados semelhantes, sugerindo fortemente que o mecanismo através do qual as mutações aumentam a expressão é conservado entre a levedura e as células de mamíferos. 0 exame das mutações individualmente ou em combinação revelou que qualquer alteração de prolina aumentava a expressão de TNFrED enquanto a mutação S46I não tinha qualquer efeito na expressão.

Em cada clone mutante, nós demonstramos que o resíduo responsável pelos níveis mais elevados de expressão de proteína é uma substituição prolina próxima de uma cisteína envolvida numa ligação dissulfureto. Na prolina o átomo de azoto faz parte de uma ponte rígida e não é possível 8 nenhuma rotação da ligação N-C endocíclica. Deste modo as escolhas dos ângulos φ-ψ são em menor número nas substituições com prolina do que com os resíduos de histidina ou serina presentes no TNFrED de tipo selvagem (áreas a sombreado na Fig. 3) . Além disso, os ângulos φ-ψ dos resíduos de histidina ou serina presentes nas estruturas cristalinas de TNFrED estão localizados nas regiões mais favoráveis do gráfico φ-ψ de um resíduo de prolina. Estes resultados indicam que a prolina é o resíduo preferido na posição 23 ou 76 em termos da conformação da cadeia principal. Este fenómeno é mais evidente na estrutura não complexada de TNFrED com a resolução mais elevada (código pdb: 1 ext; ver os quadrados cheios a vermelho na Figura 3) . Por conseguinte, as mutações não têm qualquer vantagem na forma complexada em comparação com a forma não complexada, o que está de acordo com a nossa observação de que os mutantes não afectam a afinidade do TNFrED para o ligando. Para avaliar se existe alguma alteração do estado favorável de uma prolina para os ângulos φ-ψ dados quando são também considerados os um ou dois aminoácidos adjacentes, nós pesquisamos o conjunto de dados PDB representativo para as mesmas sequências na forma mutante e na forma de tipo selvagem. Existem mais casos de sequências mutantes do que as sequências de tipo selvagem (ver Quadro 3 e também os x verdes na Figura 3) . Estes resultados realçam ainda mais que a prolina é o resíduo preferido na posição 23 ou 76, tanto em termos da conformação da cadeia principal para esse resíduo particular como também quando são tidos em conta os resíduos circundantes e o ambiente da estrutura. A mutação S46I é uma situação diferente. Ela resulta numa região mais estreita de ângulos φ-ψ mas afasta-se da região do ângulo 9 φ-ψ preferido para uma região ligeiramente menos preferida (Fig. 3) . Assim parece não existir qualquer vantagem da mutação S46I em termos de preferência φ-ψ nessa posição. Isto é coerente com a nossa observação experimental que a presença da mutação S46I sozinha não altera significativamente o nível de expressão de TNFrED. Tomando todos os dados em conjunto, nós concluímos que a introdução dos resíduos de prolina assiste a sequência local de cada mutante na adopção de conformações observadas nas estruturas cristalinas de TNFrED fixando desse modo os resíduos de cisteína vizinhos na orientação correcta. Nós propusemos que a orientação apropriada da cisteína facilita por sua vez a formação da ligação de dissulfureto correcta e resulta num maior rendimento de moléculas dobradas correctamente. A nossa constatação que estas substituições de prolina aumentam o nível de expressão de TNFrED é coerente com esta proposta. Além do mais, as substituições de prolina podem ser alargadas a outras proteínas onde se julga que a formação de ligações dissulfureto seja um factor limitante na expressão. São aqui descritos métodos para aumentar os níveis de expressão de proteínas de acordo com os quais pelo menos um aminoácido numa sequência proteica de aminoácidos está substituído pelo aminoácido, prolina. Preferencialmente, a substituição nestes polipéptidos substituídos com prolina ocorre dentro de 15 aminoácidos, mais preferencialmente dentro de 10 aminoácidos e muito preferencialmente dentro de 5 aminoácidos de um resíduo de cisteína. São também descritos não só métodos para polipéptidos com substituições de prolina, mas também para polinucleótidos com substituições de codão em relação aos quais um codão para qualquer aminoácido, à excepção da prolina, está 10 substituído por um codão que codifica a prolina. Especificamente, os codões que codificam a prolina são CCU, CCC, CCA, CCG para o ARN e CCT, CCC, CCA, CCG para o ADN (ver Quadro 1). I. Definições:

Em geral, as palavras ou frases seguintes têm a definição indicada quando utilizadas na descrição, exemplos e reivindicações. "Proteína" deve significar qualquer polipéptido constituído por aminoácidos e possuindo uma sequência de aminoácidos única. O termo "proteína" pode ser aqui utilizado alternadamente com o termo "polipéptido". "Substituição" deve significar a introdução de um aminoácido, quer por substituição de um resíduo de aminoácido existente quer por inserção de um resíduo adicional. Na presente invenção, a substituição ou o aminoácido inserido é a prolina. "Expressão aumentada" deve significar níveis de expressão mais elevados ou maiores de proteína quando se compara os níveis de expressão de uma proteína possuindo a sua sequência original de aminoácidos com os níveis de expressão da mesma proteína possuindo uma ou mais substituições prolina.

"Aminoácido" deve significar um resíduo de aminoácido contido no grupo constituído pelos 20 aminoácidos naturais. No presente pedido, os nomes de aminoácidos são utilizados como definidos no Banco de Dados de Proteínas (PDB) (www.pdb.org), o qual se baseia na nomenclatura IUPAC 11 (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names) , Eur. J, Biochem., 138, 9-37 (1984) conjuntamente com as suas correcções no Eur . J.

Biochem., 152, 1 (1985); isto é resíduos de alanina (Ala ou A), cisteína (Cys ou C), ácido aspártico (Asp ou D) , ácido glutâmico (GLU ou E), fenilalanina (Phe ou F), glicina (Gly ou G), histidina (His ou H) , isoleucina (Ile ou I), lisina (Lys ou K), leucina (Leu ou L), metionina (Met ou M), asparagina (Asn ou S), prolina (Pro ou P), glutamina (Gin ou Q), arginina (Arg ou R) , serina (Ser ou S), treonina (Thr ou T), valina (Vai ou V), triptofano (Trp ou W) e tirosina (Tyr ou Y). "Posicionado dentro" deve significar posicionado na proximidade de um aminoácido de referência particular numa sequência de aminoácidos, em qualquer uma das direcções 3' ou 5' . "Codão" deve significar um tripleto de nucleótidos que codifica um único aminoácido. (Ver Quadro 1) "Polinucleótido" deve significar uma molécula de cadeia simples de ADN ou ARN. A terminologia utilizada para identificar as posições de substituição de aminoácidos é ilustrada como se segue: H23P indica que a posição número 23 na sequência linear de aminoácidos para uma proteína particular como se mostra na Figura 4 e SEQ ID NO: 1 está ocupada por um resíduo de histidina e que foi substituída por um resíduo de prolina. A menos que indicado de outro modo, a numeração dos resíduos de aminoácidos aqui feita é efectuada em relação à sequência de aminoácidos mostrada na Figura 4 e SEQ ID NO: 12 1 (para o Factor de Necrose de Tecido). As substituições múltiplas são indicadas com um por exemplo, H23P + S46I significa uma sequência de aminoácidos a qual compreende a substituição do resíduo de histidina na posição 23 por um resíduo de prolina e a substituição do resíduo de serina na posição 46 por um resíduo de isoleucina.

Quadro 1

0 Código Genético (ARN em Aminoácidos)* Primeira Segunda Posição Terceira Posição Posição (extremidade (extremidade 5') 3') U C A G Phe Ser Tyr Cys u Phe Ser Tyr Cys c U Leu Scr Parar (och) Parar Leu Ser Parar (airib) Trp A G Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C c Leu Pro Gin Arg A Leu (Met) Pro Gin Arg G Ile Thr Asn Scr U Ile Thr Asn Ser C A Ile Thr Lys Arg A Pfet (início) Thr Lys Arg G Vai Ala Asp Gly U Vai Ala Asp Gly C G - Vai Ala Glu Gly A Vai (Met) Ala Glu Gly G 13 Métodos para Gerar um Sistema de Expressão para Polipéptidos Substituídos com Prolina:

Os polipéptidos substituídos com prolina da presente invenção como definidos nas reivindicações podem ser produzidos por qualquer método adequado conhecido na técnica. Estes métodos incluem a construção de sequências de nucleótidos que codificam os respectivos polipéptidos substituídos com prolina e que expressam a sequência de aminoácidos num hospedeiro transfectado adequado. Os polipéptidos substituídos com prolina da presente invenção também podem ser produzidos por síntese química ou por uma combinação de síntese química e tecnologia de ADN recombinante.

Os polipéptidos substituídos com prolina da invenção como definidos nas reivindicações podem ser construídos isolando ou sintetizando uma sequência de nucleótidos que codificam a molécula parental. A sequência de nucleótidos é depois alterada de modo a conseguir a substituição do(s) resíduo(s) de aminoácido(s) relevante(s). A sequência de nucleótidos pode ser modificada por mutagénese dirigida para o sítio como nos Exemplos da presente especificação. Numa alternativa, a sequência de nucleótidos pode ser preparada por síntese química, em que os oligonucleótidos são concebidos com base na sequência de aminoácidos específicos dos polipéptidos substituídos com prolina. A sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido substituído com prolina como definido nas reivindicações é inserida num vector recombinante e ligado operacionalmente para controlar as sequências necessárias para expressão do polipéptido na célula hospedeira transfectada desejada. Um especialista na técnica pode fazer uma selecção entre estes 14 vectores, sequências de controlo da expressão e hospedeiros sem experimentação excessiva. 0 vector recombinante pode ser um vector de replicação autónoma, isto é um vector que existe como uma entidade extracromossómica, cuja replicação é independente da replicação cromossómica, por exemplo um plasmídeo. Alternativamente, o vector é um o qual, quando introduzido numa célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado em conjunto com o (s) cromossoma(s) nos quais ele foi integrado. 0 vector é preferencialmente um vector de expressão no qual a sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido da invenção está ligada operacionalmente a segmentos adicionais necessários para transcrição da sequência de nucleótidos. 0 vector é tipicamente derivado de ADN de plasmideo ou virai. Um número de vectores de expressão adequados para expressão nas células hospedeiras aqui mencionadas está comercialmente disponível ou é descrito na literatura 0 vector recombinante pode compreender ainda uma sequência de ADN que permita que o vector se replique na célula hospedeira em questão. Um exemplo de uma tal sequência (quando a célula hospedeira é uma célula de mamífero) é a origem de replicação SV40. 0 vector também pode compreender um marcador seleccionável, por exemplo um gene cujo produto complemente um defeito na célula hospedeira, tal como o gene que codifica a di-hidrofolato reductase (DHFR) ou um que confira resistência a um fármaco, por exemplo ampicilina, 15 canamicina, tetraciclina cloranfenicol, neomicina, higromicina ou metotrexato. 0 vector também pode compreender um gene amplificável, tal como DHFR, para que as células possuindo cópias múltiplas do gene amplificável e sequências de flanqueamento, incluindo o ADN do polipéptido substituído com prolina, possam ser seleccionadas em meios apropriados. 0 termo "sequências de controlo" é aqui definido para incluir todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão do polipéptido da invenção. Exemplos de sequências de controlo adequadas para dirigir a transcrição em células de mamífero incluem os promotores iniciais e tardios de SV40 e adenovírus, por exemplo o promotor tardio principal 2 de adenovírus, o promotor MT-1 (gene de metalotioneína) e o promotor inicial imediato de gene do citomegalovírus humano (CMV).

As sequências de nucleótidos da invenção que codificam os polipéptidos substituídos com prolina, quer preparados por mutagénese dirigida para o sítio, síntese, PCR ou outros métodos, podem também incluir opcionalmente a sequência de nucleótidos que codifica um péptido de sinalização. 0 péptido de sinalização está presente quando o polipéptido é para ser segregado a partir de células nas quais ele foi expressado. Este péptido de sinalização, se presente, deveria ser um reconhecido pela célula escolhida para expressão do polipéptido. 0 péptido de sinalização pode ser homólogo (por exemplo ser aquele que está normalmente associado ao polipéptido parental) ou heterólogo (isto é com origem noutra fonte que não o polipéptido parental) ao polipéptido ou pode ser homólogo 16 ou heterólogo à célula hospedeira, isto é ser um péptido de sinalização normalmente expressado a partir da célula hospedeira ou um que não seja normalmente expressado a partir da célula hospedeira.

Qualquer hospedeiro adequado, cuja origem não seja um ser humano, pode ser utilizado para produzir o polipéptido substituído com prolina da invenção, incluindo células de bactérias, fungos (incluindo leveduras), vegetais, insectos, mamíferos, ou outras células de animais ou linhagens celulares apropriadas, assim como animais transgénicos não humanos ou vegetais. Exemplos de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem linhagens celulares de ovário de hamster Chinês (CHO), (por exemplo CHO-KL; ATCC CCL-61), linhagens celulares de Macaco Verde (COS) (por exemplo COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de rato (por exemplo NSIO), linhagens celulares de Rim de Cria de Hamster (BI-EK) (por exemplo ATCC CRL-1632 ou ATCC CCL-10) e células humanas (por exemplo BEK 293 (ATCC CRL-1573)), assim como de células vegetais em cultura de tecido, Outras linhagens celulares adequadas são conhecidas na técnica e disponíveis de depositários públicos tal como o American Type Culture Collection, E.U.A.. Os métodos de introdução de ADN exógeno em células hospedeiras de mamíferos incluem transfecção mediada por fosfato de cálcio, electroporação, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossomas e vectores virais.

As células são cultivadas num meio nutriente adequado para a produção do polipéptido substituído com prolina utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultura em balão de agitação, 17 fermentação de pequena ou grande escala (incluindo fermentações em contínuo, em lote, lote de alimentação ou estado sólido) em laboratório ou fermentadores industriais realizada num meio adequado e sob condições que permitam a expressão e/ou isolamento do polipéptido substituído com prolina. A cultura ocorre num meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e azoto e sais inorgânicos, utilizando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis em fornecedores comerciais ou podem ser preparados segundo composições publicadas (por exemplo em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipéptido substituído com prolina é segregado para o meio nutriente, ele pode ser recuperado directamente a partir do meio. Se o polipéptido substituído com prolina não for segregado, ele pode ser recuperado dos lisados celulares. 0 polipéptido substituído com prolina resultante pode ser recuperado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, ele pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a centrifugação, filtração, extracção, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipéptidos substituídos com prolina podem ser purificados por uma diversidade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a cromatografia (por exemplo troca iónica, afinidade, hidrófoba, focagem cromatográfica e exclusão molecular), procedimentos electroforéticos (por exemplo focagem isoeléctrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo precipitação com sulfato de amónio), SDS-PAGE ou extracção. 18

Composição farmacêutica da invenção e sua utilização 0 polipéptido substituído com prolina como definido nas reivindicações é útil para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças, distúrbios ou patologias. 0 polipéptido substituído com prolina de acordo com a invenção é útil num método de tratamento de um mamífero, em particular um ser humano, compreendendo a administração ao mamífero necessitado daquele um tal polipéptido substituído com prolina ou uma composição farmacêutica deste.

Será evidente para o especialista na técnica que uma quantidade eficaz de um conjugado, preparação ou composição aqui descrito depende, inter alia, da doença, dose, plano de administração, se o polipéptido ou conjugado ou composição é administrado sozinho ou em conjunção com outros agentes terapêuticos, a semivida das composições no plasma, e o estado de saúde geral do doente. Tipicamente, uma dose eficaz da preparação ou composição aqui descrita é suficiente para garantir um efeito terapêutico. 0 polipéptido substituído com prolina produzido pelos métodos aqui descritos é útil para ser administrado numa composição incluindo um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. "Farmaceuticamente aceitável" significa um veículo ou excipiente que não provoca quaisquer efeitos inconvenientes nos doentes aos quais ele é administrado. Estes veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica, e o polipéptido ou conjugado da invenção pode ser formulado em composições farmacêuticas por métodos bem conhecidos (ver por exemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company 19 (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer e L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)). Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados nas composições compreendendo o polipéptido ou conjugado da invenção incluem, por exemplo, tampões, estabilizantes, conservantes, agentes isotónicos, tensioactivos não iónicos ou detergentes ("humectantes"), antioxidantes, agentes de volume ou enchimentos, quelantes e co-solventes. A composição farmacêutica do polipéptido substituído com prolina aqui descrito pode ser formulada numa diversidade de formas, incluindo líquidos, por exemplo soluções ou suspensões prontas a usar, geles, pós liofilizados, ou qualquer outra forma adequada, por exemplo pós ou cristais adequados para preparar uma solução. A forma preferida dependerá da indicação particular a ser tratada e será evidente para um especialista na técnica. A composição farmacêutica contendo o polipéptido substituído com prolina aqui descrito pode ser administrada por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, sublingual, bucal, intranasal, transdérmica, por inalação, ou de qualquer outro modo aceitável, por exemplo utilizando tecnologia PowderJect0 ou ProLease0 ou um sistema de injecção de tipo esferográfica. O modo de administração preferido dependerá da indicação particular a ser tratada e será evidente para o especialista na técnica. Em particular é vantajoso que a composição seja administrada por via subcutânea, uma vez que isto permite a auto-administração pelo doente. 20 A composição farmacêutica aqui descrita pode ser administrada conjuntamente com outros agentes terapêuticos. Estes agentes podem ser incorporados como parte da mesma composição farmacêutica ou podem ser administrados separadamente do polipéptido ou conjugado da invenção, quer concorrentemente ou segundo qualquer plano de tratamento aceitável. Além disso, o polipéptido, conjugado ou composição farmacêutica aqui descrito pode ser utilizado como um auxiliar para outras terapias.

Exemplificação: Expressão Incrementada do Factor de Necrose de Tecido (TNF) O domínio extracelular do receptor p55 de TNF (TNFrED) foi submetido a mutação aleatória e as bibliotecas de mutantes de TNFrED foram apresentadas na superfície de células de levedura. Identificou-se dois clones de TNFrED mutante por triagem celular activada por fluorescência (FACS) que se expressavam duas até cinco vezes mais em levedura em comparação com o TNFrED de tipo selvagem. Num clone mutante houve uma alteração de Ser para Pro na posição 76 e no outro clone mutante houve uma alteração de His para Pro na posição 23 e uma alteração de Ser para Ile na posição 46. A presença da mutação S76P ou H23P resultou em níveis de expressão mais elevados de TNFrED em células HEK293-EBNA enquanto a mutação S46I não teve qualquer efeito na expressão. Estes resíduos substituídos não tiveram um efeito na afinidade para o TNF-α. 0 exame e análise dos resíduos substituídos nas estruturas cristalinas de TNFrED indicam que a introdução de resíduos de prolina ajuda provavelmente a sequência local dos mutantes a adoptar conformações favoráveis que fixam os resíduos de cisteína vizinhos na orientação correcta para formação de ligações de dissulfureto apropriadas. Esta 21 maior facilidade na formação de ligações de dissulfureto seleccionadas resulta em seguida num maior rendimento de moléculas dobradas correctamente tanto em células de levedura como em células de mamífero.

Exemplo de Referência 1: Expressão de TNFrED funcional na superfície de S. cerevisae 0 domínio extracelular do receptor p55 de TNF (TNFrED) foi fundido com a parte C-terminal de α-aglutinina e expressado na estirpe BJ2168 de S cerevisae (a, prcl-407, prbl-1122, pep4-3, leu2, trpl, ura3~52) utilizando o vector pYES2. A parte C-terminal de α-aglutinina está fortemente ancorada na parede celular e serve como uma armação para apresentar o TNFrED na superfície da célula. Para facilitar o transporte da proteína de fusão TNFrED-aglutinina no percurso secretor, a sequência sinalizadora do receptor de TNF foi substituída pela sequência sinalizadora de invertase da levedura. 0 gene de fusão TNFrED-aglutinina estava sob a regulação do promotor indutível GAL1. A troca da fonte de carbono da cultura de levedura de glucose para galactose resultou na indução do promotor GALl e na expressão de TNRrED-aglutinina. Numa análise citométrica de fluxo com anticorpos policlonais dirigidos contra TNFrED nós constatamos que numa cultura induzida aproximadamente 70% da levedura expressava a TNFrED-aglutinina na superfície celular (Fig. IA) . Para determinar se o TNFrED na superfície celular da levedura estava correctamente dobrado e se poderia ligar TNF-α, nós realizamos uma análise citométrica de fluxo utilizando TNF-α biotinilado como uma sonda e avidina marcada com FITC como o reagente 22 de detecção. A levedura que expressa o gene de fusão de TNFrED-aglutinina fixou mais TNF-α biotinilado do que o fez a levedura contendo o vector pYES2 (Fig. 1B). A adição de TNF-α não marcado em excesso (dados não mostrados) inverteu o desvio no histograma observado com a levedura que expressa o gene de fusão de TNFrED-aglutinina.

Exemplo 2: Selecção de clones mutantes de TNFrED com ligação aumentada para o TNF-α biotinilado.

Utilizou-se uma modificação da abordagem de mutagénese anteriormente descrita (Hermes,J.D., Parekh,S.M., Blacklow,S.C., Koster,H. & Knowles,J.R. A reliable method for random mutagenesis: the generation of mutant libraries using spiked oligodeoxyribonucleotide primers. Gene 84, 143-151 (1989)) para gerar bibliotecas mutantes aleatórias. Nesta abordagem produz-se oligonucleótidos mutantes adicionando um nível predeterminado dos nucleótidos "errados" em cada posição. 0 nível de contaminação dos nucleótidos "errados" foi ajustado para gerar uma média de dois ou três mutações pontuais aleatórias por oligonucleótido. Cada biblioteca mutante cobriu entre 40 até 105 pares de bases de TNFrED. Sequenciou-se dez clones aleatórios de cada biblioteca. O tipo e a posição das mutações eram aleatórios e constatou-se que as regiões continham o número médio antecipado de mutações. Aproximadamente 40-50% dos clones continham uma pequena delecção ou inserção, que resulta na expressão de um TNFrED truncado. Presumivelmente estas delecções ou inserções resultaram de erros incorporados durante o processo de síntese do oligonucleótido. O tamanho de cada biblioteca era entre 0,5 χ 106 e 10 χ 106 clones mutantes 23 independentes. Cada biblioteca foi transformada na estripe BJ2168 e aproximadamente 1 x 106 transformantes independentes foram seleccionados para ligação tanto ao TNF-α biotinilado como a anticorpos policlonais dirigidos contra o TNFrED. A janela do histograma de fluorescência bidimensional que foi escolhida para seleccionar a subpopulaçâo de levedura que expressa o TNFrED activo é mostrada na Fig. 1C. A subpopulaçâo de levedura seleccionada foi cultivada e novamente seleccionada com triagem bicromátrica. Após vários ciclos de triagem bicromátrica a população de levedura na janela seleccionada estava enriquecida (Fig. 1C). Após três a quatro ciclos de triagem celular, analisou-se os clones individuais examinando a ligação de TNF-α biotinilado ao TNFrED na superfície celular. Uma maioria dos clones analisados de cada biblioteca tríada pareceu ligar níveis mais elevados de TNF-α biotinilado. 0 plasmídeo de TNFrED mutante foi recuperado de cada clone de levedura e retransformado na estirpe BJ2168 e analisado em seguida por citometria de fluxo quanto à ligação de TNF-α biotinilado. A grande maioria dos clones de levedura correspondia a falsos positivos já que os plasmídeos recuperados não conferiam níveis mais elevados de ligação ao TNF-α biotinilado. Quando se analisou os clones de levedura falsos positivos na ausência de TNF-α biotinilado e avidina-FITC, constatou-se que eles estavam desviados em comparação com a estirpe BJ2168 parental. Estes clones de levedura falsos positivos são aproximadamente 30% maiores em tamanho do que a BJ2168 parental, o que é presumivelmente o que origina o desvio na absorvância de referência. No entanto foram identificados dois clones mutantes, 6 e 11, de bibliotecas diferentes que quando transformados na estirpe BJ2138 24 conferiram níveis mais elevados de ligação de TNF biotinilado e são, desse modo, positivos verdadeiros (Fig. 1D) .

Exemplo 3: Caracterização dos clones mutantes 6 e 11. A região de codificação do TNFrED nos clones mutantes 6 e 11 foi sequenciada e, como previsto, as mutações para cada clone foram encontradas apenas na região da sequência mutante para essa biblioteca específica. No clone mutante 11 existis uma mutação pontual que resulta na alteração de Ser para Pro na posição 76 e no clone mutante 6 existiam duas mutações pontuais que resultam numa alteração de His para Pro na posição 23 e uma alteração de Ser para Ile na posição 46.

Para determinar se as mutações aumentam a ligação de TNF biotinilado através de uma maior expressão de TNFrED ou através de um aumento na afinidade de TNFrED para TNF, nós realizamos uma experiência de saturação de ligação em levedura que expressa o clone mutante 6 ou 11. A análise das experiências de saturação da ligação (Fig. 2) indicou que a levedura que expressa o clone mutante 6 ou 11 exprime níveis mais elevados de TNFrED funcional do que o TNFrED de tipo selvagem e que a presença destas mutações não afecta a afinidade de TNFrED para o TNF-α. 0 número aproximado de receptores/célula para a levedura que expressa o clone mutante 6, clone mutante 11 e TNFrED de tipo selvagem foi de 3930, 1490, 740, respectivamente.

Exemplo 4: Expressão de TNFrEDs mutantes em células de mamífero. 25 A seguir, determinou-se se as caracteristicas dos clones mutantes derivados de levedura são semelhantes em células de mamífero. Para este fim nós construímos um vector de expressão mamífero contendo a sequência de sinalização da hormona de crescimento humana fundida na extremidade amino com a sequência que codifica o TNFrED maduro. Nós constatamos anteriormente que a sequência de sinalização da hormona de crescimento humana é mais eficiente para induzir a secreção de TNFrED do que a sequência sinalizadora nativa. Utilizou-se mutagénese dirigida para o sítio para incorporar cada mutação presente nos clones mutantes 6 e 11, quer individualmente quer em várias combinações. Os mutantes de TNFrED foram transitoriamente expressados em células HEK293-EBNA e a quantidade de TNRrED segregado foi quantificada com uma ELISA específica para o TNFrED. Os resultados (Quadro 2) indicaram que qualquer uma das mutações, H23P ou S7 6P, aumentava o nível de expressão de TNFrED. Além disso, o aumento relativo na expressão é semelhante ao que é observado quando estes mutantes são expressados em levedura (Fig. 2) . A mutação S46I sozinha não alterou o nível de expressão de TNFrED (Quadro 2) . Os efeitos destas mutações não parecem ser aditivos já que a presença de H23P e S76P na mesma construção não aumentou o nível de TNFrED segregado em comparação com o encontrado na H23P sozinha.

Mediu-se também a cinética da ligação do TNF aos vários mutantes de TNFrED por ressonância de plasmão de superfície num instrumento BIAcore. Os resultados no Quadro 2 não indicam nenhuma diferença entre os TNFrEDs de tipo selvagem e mutante testados quanto à ligação ao TNF-a. Como indicado no Protocolo Experimental, nós utilizamos condições suaves de regeneração e recolhemos tipicamente 26 30-40 ciclos de dados em cada superfície. Nós determinamos as médias dos resultados obtidos em três superfícies diferentes para se obter as médias (e os intervalos de confiança a 95%) de parâmetros para o controlo. O erro principal introduzido por este modo de aquisição de dados é um aumento na variância de parâmetros ajustados para controlos quando os dados são acumulados de superfícies diferentes e ensaios diferentes (ver resultado para TNFrED purificado no Quadro 3). Não obstante, os dados são suficientemente bons para detectar uma alteração de 15% no kon, uma alteração de 33% no koff, de ambos. Isto é evidenciado nos resultados que nós apresentamos para os dados do controlo negativo e do HBS (soro fisiológico tamponado com Hepes) colhidos após terem sido adquiridos 27 e 36 ciclos nas respectivas superfícies. Isto foi feito para ilustrar o pior cenário uma vez que não poderia ter sido medida ligação ao TNF-α quando estes "ligandos" (controlo negativo, meio condicionado e HBS) foram testados no início do ensaio. O resíduo de uma acumulação de 36 ciclos de vários receptores parcialmente desnaturados de proteínas TNF demonstra uma cinética impressionantemente diferente do controlo intacto, tipo selvagem ou qualquer receptor mutante de TNF. Coerentemente com as nossas observações nos estudos de expressão em levedura, a presença das mutações H23P, S76P ou S46I não alteraram a afinidade de TNFrED para o TNF-a. 27

Quadro 2. Transfecção Transitória de células HEK293-EBNA com TNFrED de tipo selvagem e mutantes de TNFrED ADN ng/ml de TNFrED N° de vezes relativamente ao tipo selvagem tipo selvagem 239 ± 5,0 - H23P 724 ± 40 3 S46I 190 ± 19 CO O S76P 361 ± 21 1,5 H23P, S46I 614 ± 54 2,6 H23P, S76P 7112 ± 33 3 H23P, S46I, S76P 704 ± 26 2,9

Transfectou-se transitoriamente células HEK293-EBNA com ADN de plasmideo. 48 h após transfecção colheu-se o meio condicionado e quantificou-se a quantidade de TNFrED com um ELISA. A quantidade de TNFrED é a média de quatro placas ± o desvio padrão. Esta experiência foi repetida três vezes obtendo-se resultados semelhantes. Mostra-se uma única experiência representativa.

Quadro 3. Cinética de Ligação e Afinidade para o TNF de

mutantes de TNF-rED

Amostra kjnXlO6 lís1 kcífXlO 3 s3 1¾ x 10-9 M IW KJ i TNFrED tipo selvagem 2,0 0,8 0.4 88,9 7,2 H23P 1,9 0,9 0,5 88,5 7,6 S46I 1,9 0,9 0,5 85,4 7,0 S76P 2,0 1,1 0,6 90,3 4,7 H23P + S46I 1,9 1,2 0,6 84,2 3,9 H23P + S76P 1,9 1,2 0,6 86 4,9 H23P + S76P + S46I 1,8 1,0 0,6 82 4,7 Controlo negativo 1,3 2,0 1,6 25,1 0,9 HBS 1,3 1,9 1,5 24,2 0,8 TNFrED purificado Média±I.C.95% 2,0 ± 0,3 0,9 ± 0,3 0,5 ± 0,1 77,5 ± 3 28

Cada TNFrED e amostra de controlo listada foi analisado a sete concentrações diferentes de TNF-α (ver Protocolo Experimental). Para um nivel de sete dados kon, k0ff e Rmax foram ajustados globalmente utilizando um modelo que incorpora o desvio da linha de base. 0 controlo negativo (meio condicionado) e o controlo com HBS mostraram valores de Kd de ~l,5nM devido às condições suaves de regeneração utilizadas (ver Protocolo Experimental) . Nestas condições, nós notamos de modo rotineiro um movimento ascendente de 0,5-1,0 RU/ciclo independente do analito no valor absoluto da linha de base de ponto R (dados não mostrados). Nós suspeitamos que este resultado foi devido a pequenas quantidades de TNFrED parcialmente desnaturado e TNFrED mutante que subsistiu após cada tratamento de regeneração e em relação ao qual foi verificado que não dependia da natureza do mutante (dados não mostrados). Analisados antes de um ensaio de recolha de dados de 27-36 ciclos, os controlos negativos não mostraram nenhuma ligação ao TNF-a:

Exemplo 5: Análise das localizações de resíduos substituídos nas estruturas cristalinas de TNFrED

As substituições de prolina no clone mutante 6 e 11 são adjacentes aos resíduos de cisteína (cisteínas 22 e 77) envolvidos nas ligações de dissulfureto. Para analisar se existe uma potencial função estrutural dos resíduos mutantes, nós tabulamos as preferências conformacionais dos resíduos de prolina, serina, histidina e isoleucina nas estruturas cristalinas de TNFrED (códigos pdb: lext, lncf e ltnr) e em geral nas estruturas proteicas. Uma vez que a 29 conformação de polipéptidos é controlada pelos ângulos φ-ψ dos resíduos, nós representamos graficamente a distribuição φ-ψ dos resíduos no conjunto de dados de estruturas proteicas não homólogas e de alta resolução. Como se mostra na Figura 3, a distribuição φ-ψ de um resíduo de prolina está mais restringida do que a de outros resíduos, e a distribuição φ-ψ de um resíduo de serina é maior do que a de um resíduo de isoleucina. Especificamente, a relação de tamanho das distribuições da serina em relação à prolina é de 2,5, da histidina em relação à prolina é de 1,8, e da serina em relação à isoleucina é de 1,4. Além disso, os ângulos φ-ψ de S76 e de H23 nas estruturas cristalinas de TNFrED (marcas cheias a vermelho) sobrepõem preferencialmente a região favorecida do gráfico φ-ψ da prolina em comparação com a região favorecida dos gráficos φ-ψ para a serina ou histidina. Esta preferência é ligeiramente mais acentuada nas estruturas cristalinas do próprio TNFrED (código pdb: lext; resolução 1,85 A [quadrados vermelhos], ou lncf; resolução 2,85 A [losangos vermelhos]) do que na estrutura cristalina do complexo de TNF/TNFrED (código pdb: ltnr; resolução 2,85 A [triângulos vermelhos]) . Pelo contrário, os ângulos φ-ψ da Ser46 nas estruturas cristalinas de TNFrED estão localizadas numa região ligeiramente mais favorecida no gráfico φ-ψ da serina em comparação com a encontrada na isoleucina, apesar da região fortemente favorecida de qualquer resíduo não se sobrepor significativamente à distribuição retirada das estruturas cristalinas.

Para avaliar o efeito de resíduos adjacentes na escolha das preferências φ-ψ pelo resíduo substituído, nós 30 analisamos os ângulos φ-ψ no conjunto representativo do banco de dados pdb contendo os mesmos fragmentos tri- (x verdes) ou tetra- (círculos verdes) péptidos como aqueles no clone 6, clone 11 ou TNFrED de tipo selvagem. Como se mostra na Figura 3 e enumera no Quadro 4 existem mais casos de resíduos de prolina nos quais os ângulos φ-ψ são semelhantes aos de H23 ou S76 nas estruturas cristalinas de TNFrED do que existem de resíduos de histidina ou serina com ângulos φ-ψ semelhantes aos de H23 ou S76. Os dados são coerentes com os ângulos φ-ψ de S46 nas estruturas cristalinas de TNFrED sendo ligeiramente mais favorecidos para um resíduo de serina do que para uma isoleucina.

Quadro 4. Lista de estruturas cristalinas contendo a mesma sequência de tri- ou tetra-aminoácidos que as presentes no TNFrED de tipo selvagem ou clones mutantes

Resíduo Sequência circundante Código pdb contendo a sequência Relação semelhante/diferente Φ-Ψ diferente(a) Φ-ψ semelhante<a) Ser76 no tipo selvagem Ser-Ser- Cys (b) larb, lnxb, 2pia, 3ebx, lbgc, lfrr ltml, 4cha 2/6 Ile-Ser-Ser-Cys ou Ser-Ser-Cys-Thr Nenhum Nenhum Pro76 no clone 6 Ser-Pro-Cys 2tgi 2ctc, ltfg 2/1 Ile-Ser-Pro-Cys ou Ser-Pro-Cys-Thr Nenhum Nenhum His23 no tipo selvagem Cys-His-Lys 3cy3 Nenhum 0/1 Lys-Cys-His-Lys ou Cys-His-Lys- Gli Nenhum Nenhum 31 31 Resíduo Sequência circundante Código pdb contendo a sequência Relação semelhanbe/diferenbe φ-ψ diferente(a) Φ-Ψ semelhante(a) Pro23 no clone 11 Cys-Pro-Lys ltgx (2 localizações) ltgs, 3sic, 8can 3/2 Lys-Cys-Pro- Lys Nenhum 8can 1/0 Cys-Pro-Lys- Gly Nenhum ltgx 1/0 Ser46 no tipo selvagem Glu-Ser-Gly lfha (2 localizações), Imam, 2had, 2tmd, 3gbp lads, lbtc, lfba, lhil, liga, 3il8, Inar, lptx, lttb, 4fxn, lovb, 2pia 12/6 Cxlu-Ser-Gly- Ser lovb Nenhum 0/1 Cys-Glu-Ser- Gly 2pia Nenhum 0/1 Ile46 no clone 11 Glu-Ile-Gly 4/3 Cys-Glu -Ile-Gly ou Glu-Ile-Gli-Ser Nenhum Nenhum (a). Os critérios para ângulos φ-ψ semelhantes é que o ângulo φ-ψ do resíduo objecto esteja dentro de 15 graus dos ângulos φ-ψ presentes no resíduo correspondente de qualquer uma das estruturas cristalinas de TNFrED. (b). Os resíduos a negrito são os resíduos substituídos no clone mutante ou o resíduo presente no TNFrED de tipo selvagem.

Protocolos Experimentais Utilizados nos Exemplos

Plasmídeos. A fusão TNFrED-aglutinina foi construída ligando a sequência de sinalização do gene da invertase à sequência de hTNFrED que codifica os resíduos 12 até 172 a qual foi depois fundida à parte C-terminal do gene da a-aglutinina que codifica os resíduos 330 até 650 (1, 27) . Entre o TNFrED e o gene da α-aglutinina estava uma sequência que codifica o grupo de ligação flexível GQPAAAPA. Este grupo de ligação é semelhante à sequência de marcações entre 32 domínios nas imunoglobulinas. 0 gene de fusão TNFrED-aglutinina foi subclonado no vector pYES2 (Invitrogen Corp.) para produzir pYES2-TNFrEDAgg para expressão na levedura. A sequência de codificação de hTNFrED desde o resíduo 12 até ao resíduo 172 foi subclonada em pCMV, um vector de expressão mamífero, para gerar pCMV-TNFrED. No pCMV-TNRrED a sequência de sinalização da hormona de crescimento humana está fundida a montante da sequência de hTNFrED. A expressão de hTNFrED no pCMV é regulada pela região promotora inicial imediata do citomegalovírus (CMV) humano. A jusante do hTNFrED encontra-se o sinal de poliadenilação da hormona de crescimento humana, o pCMV-TNFrED contendo a mutação S46I ou S76P foi gerado subclonando a região apropriada dos clones mutantes 6 e 11, respectivamente. 0 pCMV-TNFrED contendo a mutação H23P foi gerado utilizando a técnica de PVR de vector completo (6) . As combinações das mutações de TNFrED (H23P+S46I, H23P+S76P, H23P+S46I+S76P) foram conseguidas subclonando as regiões apropriadas. A sequência da região de codificação de todas as construções foi verificada com o estojo de sequenciação finalizador de ciclo Thermo Sequenase marcado radioactivamente (Amersham Pharmacia Biotech).

Expressão de TNFrED na superfície de células de levedura. Transformou-se a estirpe BJ2168 de saccharomyces cerevisiae (a, prcI-407, prbI-1122, pep4-3, leu2, trpl, ura3-52; Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, CA) com pYES2 ou pYES2-TNFrED-Agg utilizando o método de acetato de lítio anteriormente descrito (Gietz,R.D., Schiestl,R.H., Wilterns,A.R. & Woods, R.A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. 33

Yeast. 11, 355-360, 1995). Multiplicou-se as células de levedura transformadas dum dia para o outro em meio Ura fortificado com 2% de glucose a 30°C sob agitação. Induziu-se a expressão multiplicando a levedura transformada dum dia para o outro a 30°C sob agitação em meio Ura contendo 2% de galactose e 1% de rafinose. Colheu-se as células por centrifugação a 16.060 x g durante 2 min, lavando duas vezes com soro fisiológico de Dulbecco tamponado com fosfato (PBS) (Gibco/BRL) e diluindo as células até 4 χ 106 células/ml. Incubou-se 4 χ 105 células (100 ul) com hTNF-a biotinilado (50 nM ou 10 nM) ou anticorpos de cabra anti-sTNF RI humano (0,7 ug/ml, R&D Systems) ou ambos durante 1 h à temperatura ambiente num volume final de 140 ul. O hTNF-α (Protein Purification group, Serono Reproductive Biology Institute) foi biotinilado com o estojo EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation (Pierce Corp.). Após a incubação, centrifugou-se as células a 16.060 x g durante 2 min e ressuspendeu-se em 140 ul de PBS gelado contendo 0,1 % de albumina de soro de bovino (BSA). Adicionou-se avidina marcada com FITC (2,2 ug/ml, Jackson ImmunoResearch) ou IgG de burro anti-cabra conjugada com R-Ficoeritrina (2,2 ug/ml, Jackson ImmunoResearch) ou ambos às células num volume total de 180 ul e incubou-se a 4°C durante 45 min. Centrifugou-se as células a 16.060 x g durante 2 min, lavou-se uma vez com tampão IX RDF1 gelado (R&D Systems), ressuspendeu-se em -400 ul de tampão IX RDFl e analisou-se num Becton Dickinson FACSort. A taxa de eventos foi ajustada a aproximadamente 150 células/s e colheu-se um total of 10.000 células por análise. A população de levedura foi controlada segundo a dispersão de luz (tamanho) para evitar a análise de células aglomeradas. 34

Produção e selecção de bibliotecas mutantes aleatórias:

Introduziu-se cinco sitios únicos de reconhecimento pela endonuclease de restrição na região de codificação de TNFrED por mutagénese silenciosa utilizando o Sistema de Mutagénese Dirigida in vitro GeneEditor (Promega Corp.). Este passo foi realizado para dividir o TNFrED em 6 regiões com entre 40 até 105 bp. Cinco das seis regiões foram submetidas separadamente a uma modificação de um método de mutagénese aleatória anteriormente descrito.

Abreviadamente, gerou-se oligonucleótidos compridos (Midland Certified Reagent Company) cobrindo uma região de TNFrED flanqueado por sitios únicos de reconhecimento pela endonuclease de restrição que contêm uma quantidade predeterminada dos fosforamiditos "errados" em cada posição. A quantidade de fosforamiditos "errados" adicionada foi ajustada para gerar uma média de duas ou três mutações por oligonucleótido. Utilizou-se iniciadores a flanquear o oligonucleótido comprido mutante numa reacção em cadeia da polimerase para amplificar o ADN em cassetes para cada região de TNFrED. Digeriu-se as regiões de ADN mutadas aleatoriamente com as endonucleases de restrição apropriadas e ligou-se à construção pYES2-TNFrED-Agg. As reacções de ligação para cada biblioteca mutante foram transformadas em células ultracompetentes XLIO-Gold (Stratagene Corp.) utilizando uma proporção de 1 ul de mistura de ligação por 70 ul de células competentes seguindo o protocolo do fabricante. Após a transformação, juntou-se 20 misturas de transformação de cada biblioteca mutante e multiplicou-se dum dia para o outro a 37°C em 500 ml de meio NZY contendo 50 ug/ml de ampicilina. Sequenciou-se dez clones aleatórios de cada biblioteca mutante utilizando o estojo de sequenciação finalizador de ciclo 35 marcado radioactivamente Thermo Sequenase (Amersham Pharmacia Biotech). Transformou-se aproximadamente 5,0 ug de ADN de cada biblioteca aleatória em dez alíquotas (1 x 109 células/aliquota) de células BJ2168 utilizando o método de transformação de acetato de litio. Multiplicou-se as células durante 24-30 h a 30°C sob agitação. Multiplicou-se aproximadamente 1 x 108 células a 30 °C com meio Ura contendo 2% de galactose e 1% de rafinose para a indução de expressão. Para cada experiência FACS, marcou-se 4 x 106 células como descrito acima utilizando hTNF-α biotinilado a uma concentração final de 50 nM para a biblioteca mutante contendo o clone mutante 6 ou 10 nM para as outras bibliotecas mutantes. Adicionou-se anticorpos de cabra anti-sTNF RI humano juntamente com FITC-avidina e IgG anti-cabra conjugada com R-ficoeritrina. Escolheu-se um total de 1,2 x 107 células para cada biblioteca. A FACS foi realizada numa Becton Dickinson FACsort com uma taxa de eventos <2000 células/s. O primeiro ciclo de selecçâo foi realizado no modo de exclusão e a selecçâo subsequente foi efectuada no modo de célula simples. Aplicou-se as células colhidas em meio de selecçâo com glucose e aplicou-se numa placa 1/100 do volume para calcular o número efectivo de células. As células seleccionadas foram novamente multiplicadas a 30°C e induzidas em seguida em meio de selecçâo com galactose e rafinose para o ciclo de selecçâo seguinte. Cada biblioteca foi seleccionada um total de três a quatro vezes. Colheu-se aproximadamente 0,08%-0,4% de células no primeiro ciclo, e 0,01%-0,2% nos ciclos seguintes. As células colhidas no último ciclo de selecçâo foram aplicadas em placas de Ura para produzir colónias simples. 36

Recuperação e análise de clones mutantes de TNFrED:

Analisou-se aproximadamente 50 clones individuais de levedura de cada biblioteca por citometria de fluxo. Incubou-se 100 ul de células induzidas a uma OD60onm de 0,15 com 50 nM ou lOnM de TNF-α biotinilado num volume total de 140 ul, nas mesmas condições como descritas acima. Detectou-se a ligação de TNF-α com FITC-avidina (2,2ug/ml) e analisou-se as células por citometria de fluxo num Becton Dickinson FACsort. Escolheu-se os clones possuindo uma fluorescência mediana maior do que a levedura que expressa o controlo de pYES2hTNFrED-Agg para recolha de plasmideo. Recuperou-se o ADN de plasmideo da levedura e transformou-se em E. coli JM109 competente (Promega Corp.) seguindo o protocolo do fabricante. Retransformou-se o ADN de plasmideo purificado em células de levedura BJ2168 como se descreveu acima e reanalisou-se os clones individuais utilizando métodos descritos acima. As regiões TNFrED de clones positivos após a retransformação foram sequenciadas utilizando o estojo de sequenciação finalizador de ciclo marcado radioactivamente Thermo Sequenase (Amersham Pharmacia Biotech).

Ensaio de ligação ao TNF-a

Ressuspendeu-se a levedura que expressa a fusão TNFrED-aglutinina de tipo selvagem ou mutante ou a levedura contendo o vector de controlo pYES2 em PBS /BSA (10 mg/ml) a uma concentração de 1 x 108 células/ml. Em cada poço de uma placa de 96 poços Durapore (Millipore Corp.), incubou-se 50 ul da suspensão de células com 50 ul de PBS/BSA (10 37 mg/ml) contendo várias concentrações de 125I-TNF-a (Amersham Pharmacia Biotech) durante 2 h à temperatura ambiente. Após a incubação, lavou-se os poços três vezes com PBS gelado utilizando o sistema de filtração

MultiScreen (Millipore Corp.). A ligação não especifica foi determinada com a levedura contendo o vector de controlo pYES2 e a ligação não especifica foi <10% das contagens totais. Determinou-se os Kd e Bmax utilizando o programa GraphPad Prism.

Expressão de mutantes de TNFrED.

As construções de pCMVhTNFrED foram transfectadas transitoriamente em células HEK293-EBNA utilizando um método de fosfato de cálcio. As transfecções foram realizadas em triplicado e a expressão de hTNFrED foi quantificada a partir de meio colhido 48 h após transfecção utilizando uma ELISA para hTNF R-l (R & D Systems).

Análise BIAcore de mutantes de TNFrED.

Construiu-se superfícies que apresentam anticorpos policlonais de cabra anti-TNFrED humano ligando anticorpo biotinilado (BAF225 de R&D Systems) a chips sensores Sensor SA revestidos com estreptavidina (P/N BR-1000-32, BIAcore Inc.). Nas condições destas experiências a interacção estreptavidina-anti-TNFrED biotinilado comporta-se como se fosse irreversível. Os dados para a comparação da interacção TNFrED/TNF-α entre o TNFrED mutantes e de tipo selvagem foram colhidos em HBS (HEPES lOmM pH 7,4, NaCl 150mM, EDTA 3,4mM, 0,005% de P20) como se segue. 38

Concentrou-se meios condicionados de transfecções transitórias de células HEK293-EBNA com Centricon lOs e quantificou-se a quantidade de proteína TNFrED com os Sistemas R & D ELISA para hTNF R-l. Injectou-se TNFrED purificado diluído com tampão (BS03-99, obtido de IRCS) ou meio condicionado diluído com tampão contendo uma proteína mutante numa superfície BAF225 a 50nM, resultando na formação do complexo anticorpo-TNFrED. Injectou-se então TNF-α a 1 nM (trímero em HBS) e registou-se as cinéticas de ligação e dissociação via a resposta ao longo do tempo da ressonância de plasmão de superfície. A superfície do BAF-225 foi regenerada com 50% de citrato de sódio 100 mM pH 2,5/50% de citrato de sódio 100 mM pH 3, o qual eliminou os TNFrED e TNF-α. Repetiu-se esta série de injecções para o TNF-α a 2, 5, 10, 20, 50, e 100 nM enquanto se mantinha a concentração de TNFrED injectado (tipo selvagem ou mutante) a 50 nM. Cada conjunto de curvas de ligação foi globalmente ajustado utilizando um modelo para interacção 1:1 que inclui um termo para o desvio linear da linha de base. Utilizou-se meio condicionado (sem TNFrED) e HBS como controlos negativos. A superfície BAF225 foi regenerada com 50% de citrato de sódio 100 mM pH 2,5/50% de citrato de sódio 100 mM pH 3, o qual eliminou os TNFrED e TNF-α. Nas nossas mãos foi necessário ter condições de regeneração razoavelmente suaves para se conseguir uma taxa de recolha de dados suficientemente elevada para tornar esta tecnologia útil.

Análise de estruturas cristalinas.

Utilizou-se um conjunto de dados anteriormente descrito (Wang,Y., Huq,H.I., de,I.C., X & Lee,B. A new 39 procedure for constructing peptides into a given Calpha chain. Fold. Des. 3, 1-10, 1998) para analisar as distribuições do ângulo φ-ψ dos resíduos de prolina, serina, histidina e isoleucina nas estruturas cristalinas de proteínas não homólogas e de alta resolução. Este conjunto de dados contém 136 estruturas de raios X com uma resolução de 1,8 angstroms ou mais, e com uma identidade de sequência menor do que 25% entre qualquer par no conjunto. Existem 803 resíduos de prolina, 1251 resíduos de serina, 409 resíduos de histidina e 959 resíduos de isoleucina no conjunto. O espaço do ângulo φ-ψ está igualmente dividido em 36x36 blocos com um intervalo de 10 graus desde -180 graus até to 180 graus para o ângulo φ ou ψ. O enegrecimento dos blocos nos diagramas de distribuição do ângulo φ-ψ (Figura 3) está associado à frequência da distribuição binomial do resíduo de aminoácido no conjunto de dados. Quanto maior a frequência, mais escuro o bloco. Os blocos cinzentos mais claros representam uma relação adimensional do valor Z (número de vezes de erro provável sobre a probabilidade de base) de 1. O valor de Z dos blocos mais escuros (preto) é de 40 ou mais, e o dos outros blocos cinzentos é de 3, 5, 10 e 30, respectivamente. A probabilidade de base é np, onde n é o número total do resíduo de aminoácido no conjunto de dados e o p é 1/(36x36), e a variância do erro s é:

Jnpil-p)

Tanto o conjunto de dados anterior como o conjunto de dados de Hobohm (Hobohm,U. & Sander,C. Enlarged representative set of protein structures. Protein Sei. 3, 40 522-524 , 1994) foram utilizados para pesquisar para uma tri- ou a tetra-sequência de aminoácidos correspondente à mesma sequência que circunda os resíduos mutantes ou a sequência de tipo selvagem. A razão para incluir o conjunto de dados de Hobohm na pesquisa é para aumentar o número de estruturas de proteínas contendo a sequência para aumentar a relevância estatística. Existem 168 estruturas de proteínas no conjunto de dados de Hobohm e 35 estruturas sobrepõem-se às do primeiro conjunto de dados. O conjunto de dados combinado contém 269 estruturas de proteínas não redundantes, o que representa os diferentes tipos de dobragens e sequências da base de dados PDB completa. Os códigos pdb das três estruturas cristalinas contendo moléculas de TNFrED são lext, lncf e ltnr. Estas estruturas não estão nos conjuntos de dados anteriores.

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<210> 1 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 1

Asp ser vai Cys pro Gin Gly Lys Tyr ilg Mis Pro Gin Asn A$n Ser 1 5 10 15 ik Cys Cys Thr Lys Cys Hís Lys Gly Thr Tyr im Tyr Asn Asp cys 20 75 30

Pro Gly ΡΓΟ Gly Gin Asp Thr A$p cys Aro Glu Cvs Glu ser Gly Ser 35 40 45

Phe Thr Ala Ser Glu A$n hís Leu Arq Mis Cvs leu Ser Cys Ser i vs 50 55 ' 60

Cys Arg Lys Glu «et Gly Gin Vai Glu He Ser ser Cys Thr Vai Asp 65 70 7$ 80

Aro Asp Thr vai Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg hís Tyr Trp * 85 90 95

Ser Glu Asn teu phe Gin Cys Phe Asn cys ser Lm Cys teu Asn Gly 100 105 110 45

Thr vai His Leu Ser Cys Gin Glu Lys Gin Asn Thr val cys Thr cys ns 120 125 HlS Ala 61 y phe Phe leu Arg Glu Asn Glu cys vai sec cys ser Asn 130 135 140 cys 145 Lys Lys Ser teu Glu 150 Cys Thr lys Leu Cys IS 5 ieu ?ro Gin lie Glu 160

As η <210> 2 <211> 486

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 gatagtgtgt gtccccaagg aaaatatatc caccctcaaa ataattcgat ttgctgtacc 60 aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac 120 tgcagggagt gtgagagcgg atccttcact gcttcagaaa accacctcag acactgcctc 180 agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtcgac 240 cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt 300 ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag 360 aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc 420 tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc ccagattgag 480 aattga 486

<210> 3 <211> 486 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 46 ctatcacaca caggggttcc ttttatatag gtgggagttt tattaagcta aacgacatgg 60 ttcacggtgt ttccttggat gaacatgtta ctgacaggtc cgggccccgt cctatgcctg 120 acgtccctca cactctcgcc taggaagtga cgaagtcttt tggtggagtc tgtgacggag 180 tcgacgaggt ttacggcttt cctttaccca gtccacctct agagaagaac gtgtcagctg 240 gccctgtggc acacaccgac gtccttcttg gtcatggccg taataacctc acttttggaa 300 aaggtcacga agttaacgtc ggagacggag ttaccctggc acgtggagag gacggtcctc 360 tttgtcttgt ggcacacgtg gacggtacgt ccaaagaaag attctctttt gctcacacag 420 aggacatcat tgacattctt ttcggacctc acgtgcttca acacggatgg ggtctaactc 480 ttaact 486

Lisboa 18 de Setembro de 2007

Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Mutante isolado de um polipéptido nativo, em que o polipéptido nativo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N0:1 (Fig. 4), e em que o aminoácido na posição 23 ou o aminoácido na posição 76 da SEQ ID NO: 1 está substituído por prolina, e em que o referido mutante exibe uma maior expressão em comparação com a do polipéptido nativo.

2. Polipéptido da reivindicação 1, em que o aminoácido na posição 23 da SEQ ID NO: 1 está substituído com prolina.

3. Polipéptido da reivindicação 1, em que o aminoácido na posição 76 da SEQ ID NO: 1 está substituído com prolina.

4. Ácido nucleico isolado que codifica o polipéptido de qualquer uma das reivindicações precedentes.

5. Vector de expressão compreendendo o ácido nucleico da reivindicação 4, em que o referido ácido nucleico está ligado operacionalmente às sequências de controlo da expressão.

6. Célula hospedeira in vitro compreendendo um ácido nucleico da reivindicação 4 ou um vector de expressão da reivindicação 5.

7. Método de produção de um mutante isolado de um polipéptido nativo de acordo com a reivindicação 1 compreendendo: 2 2 de acordo com a (a) proporcionar uma célula hospedeira reivindicação 6; e opcionalmente (b) expressar o polipéptido mutante; e (c) recuperar o polipéptido mutante. Lisboa, 18 de Setembro de 2007