CN112334477A - 具有增加的溶解度和改善的药代动力学特性的坎普他汀类似物 - Google Patents

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Abstract

公开了包含能够结合C3蛋白并抑制补体激活的肽的化合物。所述化合物包含坎普他汀类似物，其中N末端和/或C末端含有添加的组分，与同等条件下未修饰的坎普他汀肽相比，所述组分改善了(1)所述肽在生理pH下的溶解度；(2)所述肽的血浆半衰期；(3)所述肽的眼内保留；和/或(4)所述肽与C3或其片段的结合亲和性。还公开了药物组合物和使用所述化合物的方法。

Description

具有增加的溶解度和改善的药代动力学特性的坎普他汀类 似物
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号AI030040和AI068730的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及体内补体级联的激活。具体地，本发明提供了坎普他汀类似物，其以纳摩尔亲和性结合C3蛋白并表现出强大的补体抑制活性、在生理pH下增加的溶解度、血浆稳定性和体内保留。
背景技术
在整个说明书中引用了各种出版物，包括专利、公开的申请、技术文章和学术文章。这些引用的出版物中的每一个都通过引用整体并入本文。
人类补体系统在抵抗病原生物和介导免疫反应方面发挥了强大的作用。补体可以通过三种不同的途径激活：经典途径、凝集素途径和替代途径。所有这三种途径共有的主要激活事件是补体系统的中心蛋白C3被C3转化酶蛋白水解切割成其激活产物C3a和C3b。这些片段的产生导致病原细胞被C3b和iC3b调理，该过程使它们易于吞噬或清除，并通过与补体受体的相互作用激活免疫细胞。C3b在靶细胞上的沉积还诱导了新的转化酶复合物的形成，从而启动了自扩增环。
血浆和细胞表面结合蛋白的集合小心地调节补体的激活，以防止宿主细胞通过补体级联而自我攻击。然而，补体的过度激活或调节不当可以导致多种病理状况，从自身免疫到炎性疾病。因此，非常需要开发治疗性补体抑制剂。在这种情况下，C3和C3b已成为有希望的靶标，因为它们在级联中的核心作用允许同时抑制补体的起始、扩增和下游激活。
随着与补体系统异常激活有关的临床状况的数量持续增长，补体治疗领域也必须满足对有效的和针对疾病的治疗日益增长的需求。尽管在此领域的研究和药物开发方面进行了大量的努力，但是第一种靶向补体的药物依库珠单抗(
Figure BDA0002764388340000021
Alexion)在FDA批准用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)后十多年来，仍然是市场上唯一的治疗剂。依库珠单抗是针对C5的人源化单克隆抗体，可防止其切割成C5a和C5b，从而阻断补体末端途径的激活。因此，仍然需要鉴定另外的靶向补体的化合物作为潜在的治疗剂。
考虑到C3参与多种致病途径，在补体级联的主要组分C3水平的上游干预已被探索为一种干预方法。坎普他汀家族是一组由约13个氨基酸组成的环状肽，最初在二十多年前被引入，对来自人类和非人类灵长类动物(NHP)的C3显示出强结合亲和性(Sahu等人,1996,The Journal of Immunology 157:884-891)。坎普他汀的持续研究和进一步开发已产生了许多具有改进的补体抑制活性和靶亲和性的下一代类似物，包括最有效的衍生物Cp40(参见Qu等人,2011,Mol Immunol48:481-489；Qu等人,2013,Immunobiology 218:496-505)。如Qu等人(2013,同上)所述，Cp40对C3具有亚纳摩尔结合亲和性，几乎比母体肽高6,000倍，并具有延长的血浆半衰期。然而，尽管Cp40在水中的溶解度很高，但在生理pH下却显示出较低的溶解度，因此限制了可用于递送有效量Cp40的施用途径，并可能引起注射部位沉淀物增加，从而对患者产生局部刺激或疼痛。此外，在生理pH下具有高溶解度的坎普他汀类似物会改善其用于静脉内和皮下施用两者的适用性，后者相比于静脉内注射提供了多种益处，例如降低了卫生保健系统的成本，降低了施用频率，增加了便利性和患者依从性，并为自我施用提供了更多选择。
肽修饰已用于增强溶解度并延长化合物在体内的半衰期。然而，此类修饰可以降低化合物的活性和/或结合，从而降低化合物的有益特征。PEG化已被用于增强具有不良特性的药物，并且这些PEG化的化合物往往显示出更高的溶解度。然而，由于在一些情况下保留这些修饰化合物的药理活性仍然是一项挑战，因此通过PEG化赋予的改善的溶解度可能是有代价的，从而限制了某些化合物的治疗益处(例如，参见Zhang等人,2014,Expert OpinDrug Megab Toxicol 10:1691-1702)。实际上，虽然已成功地使用PEG化来延长Cp40的血浆半衰期和溶解度，但据报道，与mPEG(40k)偶联的Cp40表现出降低超过100倍的对C3片段的结合亲和性和抑制活性的下降(Risitano等人,2014,Blood123:2019-2101)。此外，关于体内药物清除率，据报道，PEG从体内的清除率与PEG的大小成比例地降低(参见例如Webster等人,2007,Drug Metab&Dispos 35:9-16)。
鉴于前述，很明显，开发具有更大活性、体内稳定性、血浆停留时间、溶解度和/或生物利用度的修饰的坎普他汀肽将构成本领域的重大进步。
发明内容
本发明提供了补体抑制肽坎普他汀的类似物。具体地，提供了一种具有C末端和/或N末端修饰的坎普他汀类似物，所述修饰改善了肽的溶解度而不导致其药代动力学特性显著降低，并且在一些情况下，出乎意料地赋予增强的血浆和玻璃体稳定性和/或对C3及其片段的结合亲和性。
本发明的一方面的特征在于包含具有由以下表示的氨基酸序列的坎普他汀或坎普他汀类似物的化合物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7；和包含添加的末端组分的末端修饰，与同等条件下未修饰的坎普他汀肽相比，所述组分改善了(1)所述肽的C3、iC3b、C3b或C3c结合亲和性，(2)所述肽在生理pH下的溶解度，(3)所述肽的血浆稳定性和/或血浆停留时间，和/或(4)所述肽的玻璃体稳定性和/或玻璃体停留时间。
末端修饰可以是C末端组分或N末端组分。在一些实施方案中，添加的末端组分包含一个或多个、两个或更多个、或三个或更多个亲水/带电荷氨基酸残基，例如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或其任何组合。在具体的实施方案中，所述一个或多个亲水/带电荷氨基酸残基是赖氨酸。
在一些实施方案中，所述化合物包含具有由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的坎普他汀类似物(Cp40)。在其他实施方案中，所述化合物具有由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列；优选地，氨基酸序列由SEQ ID NO:9(Cp40-KK)或SEQ IDNO:10(Cp40-KKK)表示。
所述化合物可另外或可替代地包括聚合物组分。这样的组分可用于增加化合物的生物利用度或延长其体内保留。具体地，添加的组分是短聚合物，通常是平均分子量为约3kDa或更小的聚乙二醇(PEG)。PEG与坎普他汀类似物的N末端或C末端结合。在一个实施方案中，PEG通过酰胺键与N末端共价键合。在前述实施方案中，PEG可以是分子量为约0.5kDa至约3kDa的单分散PEG或平均分子量为约0.5kDa至约3kDa的多分散PEG。
在另一方面，坎普他汀肽具有氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Cys-Val-Xaa3-Gln-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-His-Xaa7-Cys-Xaa8(SEQ ID NO:7)，
其中Xaa5与Xaa6之间的Gly任选地被修饰以约束骨架构象；其中：
Xaa1不存在或是Tyr、D-Tyr或Sar；
Xaa2是Ile、Gly或Ac-Trp；
Xaa3是Trp或Trp类似物，其中与Trp相比，所述Trp类似物具有增加的疏水性；
Xaa4是Asp或Asn；
Xaa5是Trp或包含对其吲哚环的化学修饰的Trp类似物，其中所述化学修饰增加了所述吲哚环的氢键电势；
Xaa6是His、Ala、Phe或Trp；
Xaa7是Arg或Orn；并且
Xaa8是Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile，其中所述Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile中任一个的羧基末端-OH任选地被-NH2替代；并且
所述肽通过Cys-Cys或硫醚键为环状。
在这样的方面，坎普他汀肽包括包含添加的末端组分的末端修饰，与同等条件下未修饰的坎普他汀肽相比，所述组分改善了(1)所述肽的C3、iC3b、C3b或C3c结合亲和性，(2)所述肽在生理pH下的溶解度，和/或(3)所述肽的血浆稳定性和/或血浆停留时间；和/或(4)所述肽的玻璃体稳定性和/或玻璃体停留时间。
在本发明的另一方面，描述了一种药物组合物，其包含前述化合物中任一种与药学上可接受的载体的组合。药物组合物可以被配制用于多种施用途径，包括口服、局部、眼内(包括玻璃体内或通过眼部植入物)、牙周(包括牙龈或通过乳头内浸润)、肺部、皮下、肌内或静脉内。在一些实施方案中，描述了一种抑制补体激活的方法，所述方法包括施用前述药物组合物中的任一种。
在一些实施方案中，所述化合物是连接至平均分子量为约3kDa或更小的聚合物的坎普他汀或坎普他汀类似物。在具体实施例中，聚合物是平均分子量为约3kDa或更小的聚乙二醇(PEG)。在一些方面，PEG连接至N或C末端。PEG可以是单分散的或多分散的，并且可以具有约0.5kDa与3kDa之间的平均分子量。
在另一方面，描述了新颖Cp40类似物，其包含由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，新颖Cp40类似物包括Cp40-KK、Cp40-KKK、mPEG(1K)-Cp40和mPEG(3K)-Cp40。
本文还描述了治疗患有与补体激活相关的病理状况的个体的方法，所述方法包括以下步骤：提供患有与补体激活相关的病理状况的个体；向所述个体施用治疗有效量的本文所述的药物组合物中的任一种；和测量所述病理状况的一个或多个参数。在这些方法中，施用所述药物组合物导致补体的抑制。可以通过这些方法治疗的病理状况包括但不限于非典型溶血尿毒症综合征(aHUS)；致密沉积病(DDD)；C3肾小球肾炎(C3GN)；C3肾小球病变；其他补体介导的肾病和肾小球炎性疾病；年龄相关性黄斑变性(AMD)；以黄斑变性、脉络膜新血管形成(CNV)、视网膜新血管形成(RNV)、增生性玻璃体视网膜病变、青光眼、葡萄膜炎、眼部炎症或以上任意组合为特征的任何眼病；阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)；冷凝集素病(CAD)；温抗体自身免疫性溶血性贫血(wAIHAs)；镰状细胞病；移植相关的血栓性微血管病；类风湿关节炎(RA)；系统性红斑狼疮(SLE)；若干自身免疫和自身炎性肾脏疾病；自身免疫性心肌炎；多发性硬化症；外伤性脑和脊髓损伤；脑、肠和肾缺血再灌注(IR)损伤；自发性和反复性流产；抗磷脂综合征(APS)；帕金森氏病；阿尔茨海默氏病；由异常突触重塑、过度小胶质细胞活性和认知能力下降支撑的其他神经退行性炎性疾病；哮喘；抗核细胞质抗原相关的弱免疫性血管炎(韦格纳综合征)；非狼疮性自身免疫性皮肤病，例如天疱疮、大疱性类天疱疮和大疱性表皮松解；创伤后休克；癌症；牙周炎；牙龈炎；和动脉粥样硬化。
在一些实施方案中，所述方法采用以约0.125mg/kg与约10mg/kg之间，或约0.25mg/kg与约5mg/kg之间，或约0.5mg/kg与约5mg/kg之间，或约0.5mg/kg与约4mg/kg之间，或约3mg/kg的治疗有效剂量静脉内或皮下施用的药物组合物。在其他实施方案中，药物组合物以约0.25mg/kg与约50mg/kg之间，或约0.25mg/kg与约35mg/kg之间，或约0.25mg/kg与约10mg/kg之间，或约0.25mg/kg与约5mg/kg之间，或约2.5mg/kg的治疗有效剂量肌内施用。在其他实施方案中，药物组合物以约1mg/kg与约20mg/kg之间，或约1mg/kg与约10mg/kg之间，或约1mg/kg与约5mg/kg之间的治疗有效剂量口服施用。在其他实施方案中，药物组合物以约1μg与约10mg之间，或约1μg与约2,000μg之间，或约1mg的治疗有效剂量玻璃体内施用。在其他实施方案中，药物组合物以约1μg与约1,000μg之间，或约10μg与约200μg之间，或约20μg与约100μg之间，或约25μg或50μg的治疗有效剂量牙周施用。在一些方面，牙周施用是通过龈内注射或乳头内浸润。这些药物组合物可以单剂量或以每12小时一次至每3个月一次的规则间隔(例如，每2-3天一次、每2周一次或每3个月一次)施用。
所述方法的其他方面设想了以约0.125mg/kg与约10mg/kg之间(或约0.5mg/kg至约3mg/kg之间)的第一治疗有效剂量静脉内或皮下施用于个体的药物组合物，然后以在肌内施用时在约0.25mg/kg与约50mg/kg之间或在口服施用时在约1mg/kg与约20mg/kg之间的第二治疗有效维持剂量进一步施用药物组合物。此外，第二治疗有效维持剂量在肌内施用时可在约0.25mg/kg与约10mg/kg之间或约0.25mg/kg与约5mg/kg之间。可替代地，第二治疗有效剂量可以约1mg/kg与约10mg/kg或约1mg/kg与约5mg/kg之间的范围口服施用。
在本发明的另一方面，提供了一种抑制个体中补体激活的方法，所述方法包括以下步骤：提供个体；向所述个体施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和前述化合物中的任一种；和测量所述个体中补体激活的一个或多个参数。在此方法中使用的药物组合物可以包括上述任何制剂和剂量，并且可以以单剂量或以每12小时一次至每3个月一次(例如，每2-3天、每2周或每3个月)的规则间隔施用。药物组合物可以第一治疗有效剂量(例如，静脉内或皮下)施用，然后以第二治疗有效维持剂量(例如，肌内或口服)施用。可以用于此方法的治疗有效剂量包括但不限于：以约0.125与约10mg/kg、约0.25mg/kg与约5mg/kg、约0.5mg/kg与约5mg/kg、约0.5mg/kg与约4mg/kg或约0.5mg/kg与约3mg/kg之间的范围静脉内或皮下；以约0.25mg/kg与约50mg/kg、约0.25mg/kg与约35mg/kg、约0.25mg/kg与约30mg/kg、约0.25mg/kg与约10mg/kg、约0.25mg/kg与约5mg/kg之间的范围肌内；或以约1mg/kg与约20mg/kg、约1mg/kg与约10mg/kg或约1mg/kg与约5mg/kg之间的范围口服。在这样的实施方案中，所述第二治疗有效维持剂量每2-3天或每2周施用于所述个体。在一些实施方案中，药物组合物通过眼部植入物以约100μg与约50mg之间(例如约100μg与约10mg之间，或约100μg与约5mg之间，或约100μg与约500μg之间)的治疗有效剂量施用。眼部植入物可以在个体(例如人类)的眼睛上或眼睛中维持至少约2天的时间。在其他实施方案中，眼部植入物可以在眼睛上或眼睛中维持至少约1周的时间。在其他实施方案中，眼部植入物在眼睛上或眼睛中维持至少约1个月的时间。
在另一方面，本文提供了一种检测生物样品中坎普他汀类似物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供包含第一多个坎普他汀类似物分子的生物样品，其中至少一部分所述坎普他汀类似物分子与C3和/或其片段C3b、iC3b和C3c结合以产生多个与C3结合的坎普他汀类似物分子；(2)对所述生物样品进行热灭活以产生热灭活的样品，其中坎普他汀分子与其靶C3分子解离；(3)提供CM5传感器芯片，第二多个坎普他汀类似物分子共价连接至所述CM5传感器芯片；(4)将所述热灭活的样品与预定量的C3/C3b/iC3b/C3c或人类血浆(作为C3的来源)混合，并且使所述混合物与所述CM5传感器芯片接触，由此所述生物样品中存在的放热的坎普他汀类似物分子与固定的坎普他汀类似物分子竞争结合C3；和(5)检测游离C3/C3b/iC3b/C3c与所述CM5芯片上的坎普他汀类似物分子的结合，由此结合的C3/C3b/iC3b/C3c的减少与所述热灭活的生物样品中坎普他汀类似物分子的存在成比例。
在一些实施方案中，检测方法利用表面等离子体共振。在其他实施方案中，所述生物样品是从人类或非人类灵长类动物中提取的玻璃体样品或血浆样品。此方法可以使用上述任何类似物例如Cp40-KK、Cp40-KKK、mPEG(1K)-Cp40或mPEG(3K)-Cp40进行。
本文还提供了一种生成用于检测赖氨酸修饰的或未修饰的坎普他汀类似物的高度特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用第一坎普他汀或坎普他汀类似物对第一哺乳动物进行免疫接种；(b)用第二坎普他汀或坎普他汀类似物对第二哺乳动物进行免疫接种，其中所述第二坎普他汀或坎普他汀类似物具有与(a)中的第一坎普他汀或坎普他汀类似物相同的氨基酸序列，不同之处在于一个或多个赖氨酸残基连接至C末端；(c)向所述第一哺乳动物注射所述第一坎普他汀或坎普他汀类似物，其中所述注射每至少两天进行，持续至少2周的时间，并且其中生成第一多个抗体；(d)向所述第二哺乳动物注射所述第二坎普他汀或坎普他汀类似物，其中所述注射每至少两天进行，持续至少2周的时间，并且其中生成第二多个抗体；和(e)纯化所述第一多个抗体和所述第二多个抗体。通过此方法产生的第一和第二抗体能够分别将第一坎普他汀或坎普他汀类似物的抗原与第二坎普他汀或坎普他汀类似物的抗原区分开。在一个优选的实施方案中，通过此方法产生的第一和第二抗体是单克隆抗体。
通过参考下面的详细描述、附图和实施例，将理解本发明的其他特征和优点。
附图说明
图1，图a)描绘了Cp40的一般结构以及Cp40的N末端和C末端修饰。图1，图b)描绘了本文所述的基于Cp40的类似物的各种实施方案的概述。图1，图c)是在13.9与18.7min之间洗脱的Cp40及其类似物的UV-HPLC色谱图的摘录。
图2是基于Cp40的类似物的MALDI光谱的概述。图2A显示：图a)mPEG(3k)-Cp40，图b)mPEG(2k)-Cp40，图c)mPEG(1k)-Cp40，图d)mPEG(1056)-Cp40，和图e)mPEG(528)-Cp40；图2B显示：图a)Cp40，图b)Cp40-K，图c)Cp40-KK，和图d)Cp40-KKK。
图3说明了通过ELISA测量的示例性坎普他汀类似物对经典途径补体的抑制作用，在每幅图中显示了Cp40用于比较。y轴代表补体活性的抑制百分比，x轴是肽的浓度。
图4是与在N末端或C末端修饰的Cp40相比的Cp40的动力学分析。每个SPR传感图都是在五个浓度下对单个肽进行单周期动态滴定的至少三个SPR实验中代表性实施例分析的结果(黑色：处理过的SPR数据；灰色：动力学拟合至1:1Langmuir模型)。
图5是在拟合至1:1Langmuir结合模型后通过SPR实验评估的示例性基于Cp40的类似物与C3b结合的图。
图6是NHP中Cp40和示例性修饰的Cp40肽的药代动力学评估。图a)描绘了在时间零时(垂直箭头)通过s.c.注射在两只食蟹猴中进行单剂量肽施用的方案。将Cp40或修饰的Cp40注射至每只动物中(2mg/kg；净8mg)，并在多个时间点(水滴)收集血液样品。图b)是Cp40的药代动力学曲线。图c)是mPEG(3k)-Cp40的药代动力学曲线。图d)是Cp40-KK的药代动力学曲线。图e)是通过NHP血浆样品的UPLC-ESI-MS分析所评估的Cp40-KKK的药代动力学曲线。每只动物中的C3水平以相应的颜色显示为点线。
图7，图a)和b)显示了通过UPLC-ESI-MS测定的两只食蟹猴血浆样品中Cp40-KK的定量。图7，图c)和图d)显示了通过UPLC-ESI-MS测定的两只食蟹猴血浆样品中Cp40-KKK的定量。还包括在各个样品中检测到的片段以及与每个样品中的肽总量相对应的检测片段的总和。
图8是以8μM浓度(实线)加标至非人类灵长类动物(NHP)血浆中的Cp40-KKK的叠加基峰强度(BPI)色谱图的摘录和在单剂量s.c.注射2mg/kg Cp40-KKK至NHP中后5min(长虚线)、30min(点线)、1h(虚点线)和2h(短虚线)收集的四个血浆样品的BPI色谱图的摘录。
图9是每48小时三次2mg/kg静脉内注射后食蟹猴中Cp40-KKK的血浆浓度的图。x轴代表通过质谱法测定的NHP血浆中的肽浓度(μM)，y轴代表注射后的时间(小时)。点线代表血浆C3的平均水平。
图10是在0、8、16和24小时施用2mg/kg Cp40(图a)或在0、12、24和36小时施用4mg/kg Cp40(图b)的四次皮下注射后，食蟹猴中Cp40的NHP血浆浓度的图。x轴代表NHP血浆中的肽浓度(μM)，y轴代表注射后的时间(小时)。点线代表血浆C3的平均水平。
图11示出了单次静脉内注射了2mg/kg Cp40-KK(图a)、Cp40-KKK(图b)、mPEG(1k)-Cp40(图c)和mPEG(3k)-Cp40(图d)的食蟹猴中肽浓度随时间变化的图。x轴代表NHP血浆中的肽浓度(nM)，y轴代表注射后的时间(小时)。
图12是在单次静脉内注射2mg/kg Cp40-KK(图a和b)或Cp40-KKK(图c和d)后，食蟹猴血浆中肽切割片段的定量。x轴代表通过UPLC-ESI-MS测定的NHP血浆中的肽浓度(μM)，y轴代表注射后的时间(小时)。
图13显示了在单次肌内注射100mg Cp40(图a)、Cp40-KK(图b)和Cp40-KKK(图c)后，食蟹猴的NHP血浆中肽浓度随时间的变化。x轴代表通过MS测定的NHP血浆中的肽浓度(μM)，y轴代表注射后的时间(天)。
图14是示例性直接ELISA测定法，其显示了固定在ELISA板中的Cp40和Cp40-KKK抗体的特异性。Cp40抗体(AB-101)与含有Cp40肽的生物样品(实心圆形)反应，但滴度比Cp40-KKK肽(实心正方形)低10倍。同样，Cp40-KKK抗体(AB-102)与含有Cp40-KKK肽的生物样品(无阴影的正方形)反应，但滴度比Cp40肽(无阴影的圆形)低10倍。y轴代表在405nm下的OD读数，而x轴代表抗血清稀释度。
图15是代表性的五点标准曲线(图a)和通过运行被加标到兔玻璃体样品中的预定量的Cp40-KKK肽而获得的简单的蛋白质印迹凝胶(图b)。在图a)中，x轴代表肽浓度(nM)，y轴代表峰面积。
图16代表用于定量生物流体中的Cp40类似物的SPR方法的示意图。将血浆样品稀释并在95℃下加热5m(3号)，然后离心并添加C3或C3血浆源(4号)。然后将样品流过相应的Cp40类似物固定芯片(5号)。
图17是通过对以预定量的Cp40-KKK肽加标的兔玻璃体样品进行表面等离子体共振分析而获得的代表性标准曲线。x轴代表肽浓度(nM)，y轴代表相对光单位。
图18描绘了在单次玻璃体内注射后在来自食蟹猴的玻璃体样品中检测到的mPEG(3k)-Cp40(点线条)、mPEG(1k)-Cp40(方格条)、Cp40-KK(黑条)和Cp40-KKK(白条)化合物的浓度。x轴代表注射500μg化合物后的天数，y轴代表化合物的浓度(nM)。
图19是Cp40-KKK与纯化的C3b结合的SPR曲线。图a)是阳性对照的标准曲线，显示了以2、4、8和16nM的浓度添加至兔玻璃体中的Cp40-KKK对C3b的结合。x轴代表肽浓度(nM)，y轴代表相对光单位。图b)显示了从注射了Cp40-KKK的NHP眼玻璃体获得的C3b结合信号。y轴代表相对光单位。在芯片固定之前，对玻璃体样品进行热灭活(白条)或不进行热灭活(黑条)。
图20描绘了在存在兔玻璃体(正方形)或不存在兔玻璃体(圆形)的条件下与Cp40(图a)、Cp40-K(图b)、Cp40-KK(图c)和Cp40-KKK(图d)温育的人眼血浆中的经典补体途径抑制。x轴代表类似物浓度(nM)，y轴代表C3b沉积的抑制百分比。
图21是Cp40-KK(图a)和Cp40-KKK(图b)的体内和体外Lys切割的概述。
具体实施方式
定义：
在整个说明书和权利要求书中使用了与本发明的方法和其他方面有关的各种术语。除非另外指出，否则这些术语被给予其在本领域中的普通含义。其他具体定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式进行解释。
在此可以使用以下缩写：Ac，乙酰基；BSA，牛血清白蛋白；DCM，二氯甲烷；DMF，二甲基甲酰胺；ELISA，酶联免疫吸附测定法；ESI，电喷雾电离；Fmoc，9-芴基甲氧基羰基；MALDI-TOF-MS，基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱；NHP，非人类灵长类动物；PBS，磷酸盐缓冲盐水；RP-HPCL，反相-高效液相色谱；Sar，N-甲基甘氨酸；s.c.，皮下；SPR，表面等离子体共振；TFA，三氟乙酸；UPLC-ESI-MS，超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法；VBS，Veronal缓冲盐水；WFI，注射用水。
除非上下文另有明确规定，否则词语的单数形式包括复数形式，反之亦然。不带具体数量的指称通常包括各个术语的复数形式。例如，对“化合物”或“方法”的指称包括多个这样的“化合物”或“方法”。类似地，词语“包含”将被包括地而不是排他地解释。同样，术语“包括”应全部解释为包括性的，除非从上下文中明确禁止这种解释。
术语“包含”或“包括”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施方案。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施方案。此外，术语“基本上由……组成”将实施方案的范围限制为指定的组分或步骤以及那些不会实质性地影响实施方案的基本和新颖特征的组分或步骤。
当涉及可测量值例如量、时间持续时间等时，本文所使用的术语“约”意在涵盖相对于指定值±20％或±10％的变化，在一些实施方案中为±5％，在一些实施方案中为±1％，并且在一些实施方案中为±0.1％，因为这样的变化适合于制备和使用所公开的化合物和组合物。
如本文所用，术语“坎普他汀”是指包含SEQ ID NO:1，I[CVVQDWGHHRC]T(通过方括号所示的二硫键的环状C2-C12)的肽。术语“坎普他汀类似物”是指修饰的坎普他汀，其包含天然和/或非天然氨基酸或氨基酸类似物的取代，以及各种氨基酸内部或之间的修饰，如本文中更详细描述的和本领域已知的。当提及坎普他汀或坎普他汀类似物内的特定氨基酸或类似物的位置时，有时将那些位置称为肽内的“位置”，其位置编号为1(坎普他汀中的Ile)至13(坎普他汀中的Thr)。例如，Gly残基占据“第8位”。
术语“药物活性”和“生物活性”是指本发明化合物结合C3或其片段并抑制补体激活的能力。如本文更详细描述的，可以通过几种本领域公认的测定法中的一种或多种测量此生物活性。
如本文所用，“烷基”是指具有约1至约10个碳原子(以及其中范围和特定碳原子数的所有组合和子组合)，优选约1至约7个碳原子的任选取代的饱和直链、支链或环状烃。烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、环戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、环己基、环辛基、金刚烷基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基和2,3-二甲基丁基。术语“低级烷基”是指具有约1至约5个碳原子(以及其中范围和特定碳原子数的所有组合和子组合)的任选取代的饱和直链、支链或环状烃。低级烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、环戊基、异戊基和新戊基。
如本文所用，“卤素”是指F、Cl、Br或I。
如本文所用，“烷酰基”可与“酰基”互换使用，是指具有约1至约10个碳原子(以及其中范围和特定碳原子数的所有组合和子组合)，优选约1至约7个碳原子的任选取代的直链或支链脂族酰基残基。烷酰基包括但不限于甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、2-甲基-丁酰基、2,2-二甲基丙酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基等。术语“低级烷酰基”是指具有约1至约5个碳原子(以及其中范围和特定碳原子数的所有组合和子组合)的任选取代的直链或支链脂族酰基残基。低级烷酰基包括但不限于甲酰基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基等。
如本文所用，“芳基”是指具有约5至约14个碳原子(以及其中范围和特定碳原子数的所有组合和子组合)，优选约6至约10个碳的任选取代的单环或双环芳族环系统。非限制性实例包括例如苯基和萘基。
如本文所用，“芳烷基”是指带有芳基取代基且具有约6至约20个碳原子(以及其中范围和特定碳原子数的所有组合和子组合)，优选约6至约12个碳原子的上述烷基。芳烷基可以任选地被取代。非限制性实例包括例如苄基、萘基甲基、二苯甲基、三苯甲基、苯乙基和二苯乙基。
如本文所用，术语“烷氧基”是指任选取代的烷基-O-基团，其中烷基如先前所定义。示例性的烷氧基尤其包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和庚氧基。
如本文所用，“羧基”是指-C(＝O)OH基团。
如本文所用，“烷氧羰基”是指-C(＝O)O-烷基，其中烷基如先前所定义。
如本文所用，“芳酰基”是指-C(＝O)-芳基，其中芳基如先前所定义。示例性的芳酰基包括苯甲酰基和萘甲酰基。
通常，取代的化学部分包括一个或多个替代分子上选定位置处的氢的取代基。示例性的取代基包括例如卤素、烷基、环烷基、芳烷基、芳基、巯基、羟基(-OH)、烷氧基、氰基(-CN)、羧基(-COOH)、酰基(烷酰基：-C(＝O)R)、-C(＝O)O-烷基、氨基羰基(-C(＝O)NH2)、-N-取代的氨基羰基(-C(＝O)NHR”)、CF3、CF2CF3等。关于上述取代基，每个部分R”可以独立地是例如H、烷基、环烷基、芳基或芳烷基中的任一个。
如本文所用，“L-氨基酸”是指通常存在于蛋白质中的任何天然存在的左旋α-氨基酸或那些α-氨基酸的烷基酯。术语“D-氨基酸”是指右旋α-氨基酸。除非另有说明，否则本文所指的所有氨基酸均为L-氨基酸。
“疏水的”或“非极性的”在本文中同义地使用，并且是指没有以偶极子为特征的任何分子间或分子内相互作用。
“PEG化”是指其中至少一个聚乙二醇(PEG)部分(无论大小)化学连接至蛋白质或肽以形成PEG-肽缀合物的反应。“PEG化”是指至少一个PEG部分(无论大小)化学连接至肽或蛋白质。术语PEG通常带有数字后缀，表示PEG聚合物的近似平均分子量；例如，PEG-8,000是指平均分子量为约8,000道尔顿(或g/mol)的聚乙二醇。
“单分散”是指由具有近似相同质量的链长的分子组成的聚合物。
“多分散”是指由链长在一定分子质量范围内的分子组成的聚合物，其中质量通常由平均分子量表示。
如本文所用，“药学上可接受的盐”或“药学上可接受的酯”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过制成与药物组合物的任何其他成分相容并且对要施用组合物的受试者无害的酯或者酸式或碱式盐形式进行修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基例如胺的无机或有机酸盐；酸性残基例如羧酸的碱金属或有机盐；等等。因此，术语“酸加成盐”是指通过加酸制备的母体化合物的相应盐衍生物。药学上可接受的盐包括例如由无机或有机酸形成的母体化合物的常规盐或季铵盐。例如，这样的常规盐包括但不限于衍生自无机酸的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；由有机酸制备的盐，所述有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、帕莫酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。本发明的某些酸性或碱性化合物可以两性离子形式存在。包括游离酸、游离碱和两性离子在内的所有形式的化合物均被设想在本发明的范围内。
如本文所用，特别是提及本发明化合物的溶解度(但不限于此)时，短语“药学上适合的流体”或“药学上适合的液体”共同地是指包括但不限于缓冲液和其他具有生理pH的水溶液的流体，以及通常用于通过本文所述的各种途径将药物制备和递送至体内的非水溶剂和液体介质。这样的非水溶剂和液体介质包括：极性质子和/或非质子非水有机溶剂，如低级醇、甲基和乙烯基吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮、甲基磺酰基甲烷、二甲基亚砜和相关化合物、羟基和多羟基酸如聚乳酸等等。此短语可以与术语“临床相关溶剂”互换使用。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可以与坎普他汀类似物组合，并且在组合后可以用于向个体施用坎普他汀类似物的化学组合物。
如本文所用，“眼内施用”或“眼部施用”药物组合物包括以引入眼内为特征的任何施用途径，包括“玻璃体内施用”。术语“玻璃体内施用”药物组合物包括特征在于引入到眼睛的玻璃体腔中的任何施用途径。“玻璃体”是玻璃体腔内的凝胶状物质，其填充晶状体与视网膜之间的空间并有助于眼睛维持其形状。
如本文所用，“肌内施用”药物组合物包括以引入肌肉内为特征的任何施用途径。
如本文所用，“牙周施用”药物组合物是指在牙齿周围和/或周边的组织内的施用(例如，通过注射、局部施用或可生物降解的植入物)，包括“牙龈施用”和“乳头内浸润”。如本文所用，“牙龈施用”药物组合物是指以引入牙龈或齿龈之上或之内为特征的任何施用途径。“乳头内浸润”或“乳头内浸润注射”是牙龈施用的一种类型，是指将药物组合物施用到齿间乳头中，齿间乳头是存在于牙齿的颊与舌表面的游离龈缘的冠状的牙龈(齿龈)组织。
如本文所用，“口服施用”或“肠内施用”药物组合物包括以引入胃肠道为特征的任何施用途径。“口服施用”包括经口喂养以及口胃或胃内管饲。“口服施用”或“肠内施用”还可包括舌下、颊、鼻内、肺或直肠施用，以及本领域已知的其他途径。
如本领域技术人员将理解的，“生理pH”通常是指人类血液的pH，其维持在7.35与7.45之间。如本文所用，术语“生理pH”包括7.3至7.5的pH范围。
术语“治疗”是指成功治疗或改善疾病或病况的任何标志。治疗可以包括例如降低或减轻疾病或病况的一种或多种症状的严重性，或者可以包括降低个体如人类患者所经历的疾病、缺陷、病症或不利病况等的症状出现的频率。
术语“预防”是指预防个体如人类患者的疾病或病况。例如，如果具有患炎性疾病风险的个体用本发明化合物和/或使用本发明方法进行了治疗，并且随后不患上所述疾病或病况，那么已在所述个体中预防了所述疾病。
有时在本文中使用术语“治疗或预防”来指导致某种程度的疾病或病况的治疗或改善的方法，并且设想了针对所述目的的一系列结果，包括但不限于完全预防所述病况。
如本文所用，术语“参数”是指使用本领域中可用的合适的测量技术来测量可观察或可测量的任何身体功能。如本领域普通技术人员将理解的，与平均正常参数相比，测量身体功能的一个或多个“参数”可以用于检测特定的功能障碍，并且还可以用于确定所述身体功能在治疗之后或期间是否得到改善。这样的参数可以是一般参数，例如，体温、血压、脉搏(心率)和呼吸率，或者可以是具体器官、组织或疾病或病况的特定参数，例如来自血液或其他器官/组织的功能测试结果。
术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是足以向施用药物组合物的个体提供有益作用的药物组合物的量。
描述：
本发明部分源于发明人开发的坎普他汀类似物，其显示出增加的溶解度和改善的药代动力学参数。用小聚合物(例如，约3,000Da或更小)在N末端修饰坎普他汀或坎普他汀类似物，使坎普他汀类似物在临床相关溶剂中的溶解度得到改善，同时补体抑制活性类似于在同等条件下未修饰的母体化合物。平均分子量约为500-3,000Da的多分散的，尤其是单分散的聚乙二醇(PEG)是特别合适的。
另外，在N末端或C末端添加一个或多个带电荷亲水氨基酸残基例如赖氨酸而修饰坎普他汀或坎普他汀类似物，可以赋予坎普他汀或坎普他汀类似物改善的药代动力学特性(例如，增加的溶解度)。例如，本文描述了在C末端添加一个或多个带电荷亲水残基(例如赖氨酸)而修饰坎普他汀或坎普他汀类似物，这不仅增加了肽的溶解度，而且出乎意料地延长了停留时间，增强了坎普他汀类似物对C3或其片段的结合亲和性。修饰的坎普他汀类似物Cp40在非人类灵长类动物中的药代动力学评估显示，修饰的Cp40肽的血浆半衰期值与未修饰的基于Cp40的类似物相似或甚至更高。因此，本发明坎普他汀类似物表现出改善的药代动力学特性以及增加的在生理pH下的溶解度。
因此，根据本发明的一种修饰包含向坎普他汀(Ile-Cys-Val-Val-Gln-Asp-Trp-Gly-His-His-Arg-Cys-Thr(环状C2-C12)(SEQ ID NO:1)或以下更详细描述的任何类似物的C末端添加组分，与未修饰的母体肽在同等条件下相比，所述组分改善了肽在生理pH下的溶解度，同时维持相似的C3结合亲和性、血浆半衰期和/或补体抑制活性。例如，在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个亲水和/或带电荷氨基酸(例如Arg或Lys)被添加至C末端。在一些实施方案中，两个或更多个亲水和/或带电荷氨基酸残基被添加至坎普他汀类似物的C末端。在其他实施方案中，三个或更多个亲水/带电荷氨基酸残基被添加至坎普他汀类似物的C末端。在具体实施方案中，亲水/带电荷氨基酸残基是Lys、Arg或其组合。在更优选的实施方案中，一个或多个赖氨酸氨基酸残基被添加至坎普他汀或坎普他汀类似物的C末端。例如，在下面更详细描述的示例性实施方案中，一个或多个赖氨酸氨基酸残基被添加至坎普他汀类似物Cp40的C末端。
本发明的示例性实施方案的特征是坎普他汀类似物Cp40，其中两个或更多个赖氨酸氨基酸残基被添加至C末端。如下文和实施例中更详细描述的，发明人发现Cp40-KK和Cp40-KKK不仅与未修饰的Cp40相比显示出增加的溶解度，而且出人意料地，与Cp40和其他基于Cp40的类似物相比，显示出增加的血浆和玻璃体保留和增强的C3结合。实际上，Cp40-KKK在玻璃体内施用后显示出等于或超过三个月的体内停留时间。值得注意的是，与Cp40相比，Cp40-KK和Cp40-KKK类似物两者均显示出显著改善的药代动力学特性。
根据本发明的另一种修饰包含向坎普他汀或其类似物的N末端或C末端中的一个或两个添加组分，与未修饰的母体肽在同等条件下相比，所述组分改善了肽在生理pH下的溶解度，同时维持相似的C3结合亲和性、血浆半衰期和/或补体抑制活性。在具体实施方案中，所添加的组分是添加短聚合物，例如链长比以前使用的PEG短的聚乙二醇(PEG)。根据本发明使用的PEG具有约500至约5,000，例如500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800，1,900，2,000，2,100，2,200，2,300，2,400，2,500，2,600，2,700，2,800，2,900，3,000，3,100，3,200，3,300，3,400，3,500，3,600，3,700，3,800，3,900，4,00，4,100，4,200，4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900或5,000的平均分子量。在优选的实施方案中，PEG的平均分子量小于5,000。在一个实施方案中，坎普他汀类似物在一个或两个末端处被修饰成包括平均分子量为约500至约5,000Da的PEG。在另一实施方案中，PEG具有约1,000至约3,000Da的平均分子量。在示例性实施方案中，基于Cp40的类似物被修饰成包括平均分子量为约1,000至约3,000Da的N末端PEG。
聚合物修饰可以是与坎普他汀或坎普他汀类似物共价键合的单分散PEG或多分散PEG。例如，在一个实施方案中，末端修饰是分子量为约500至约1,000的单分散PEG。在其他实施方案中，修饰是平均分子量为约1,000至约3,000的多分散PEG。单分散PEG特别适用于本发明，因为它通过实现从基本上单个的峰收集PEG化的化合物而促进将化合物纯化至均质(参见例如图2A，图a-c与图d和e相比)。
本发明的坎普他汀和坎普他汀类似物可以通过连接基团与PEG共价键合。这样的方法是本领域众所周知的。(综述于Kozlowski A.等人,2001,BioDrugs NM:419-29；还参见Harris JM和Zalipsky S编聚(乙二醇)、化学和生物应用(Poly(ethylene glycol),Chemistry and Biological Applications),ACS研讨会系列680(1997))。可接受的连接基团的非限制性实例包括酯基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羟基、碳水化合物、琥珀酰亚胺基(包括但不限于琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧甲基化物(SCM)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧基、氧羰基咪唑基(包括但不限于羰基二咪唑(CDI))、硝基苯基(包括但不限于碳酸硝基苯酯(NPC)或碳酸三氯苯酯(TPC))、甲苯磺酸酯基、醛基、异氰酸酯基、乙烯基砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基或伯胺。在某些实施方案中，连接基团是琥珀酰亚胺基。在一个实施方案中，连接基团是NHS。
或者，本发明的坎普他汀和坎普他汀类似物可以通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG偶联(即，没有连接基团)。在一个实施方案中，PEG与添加至坎普他汀C末端的赖氨酸残基偶联。在具体的实施方案中，PEG通过酰胺键与坎普他汀或坎普他汀类似物的N末端偶联。
在一些实施方案中，对坎普他汀或坎普他汀类似物的修饰包含以下两者：PEG化和添加一个或多个亲水或带电荷氨基酸残基至C末端。在某些这些实施方案中，PEG通过酰胺键与坎普他汀或坎普他汀类似物的N末端直接偶联，并且PEG的平均分子量为约500至约3,000，或者如果为单分散，那么实际分子量在该范围内。在某些这些实施方案中，一个或多个赖氨酸残基与C末端共价连接。
在利用PEG(mw 500-3,000DA)作为聚合物且赖氨酸作为带电荷残基的示例性实施方案中，可以如下选择组分的各种排列(其中“Comp A”代表“坎普他汀类似物”)：
PEG-Comp A
Comp A-Lys(1-3)
PEG-Comp A-Lys(1-3)
Comp A-Lys(1-3)-PEG
PEG-Comp A-Lys(1-3)-PEG
这些修饰的坎普他汀类似物的分子量可以通过改变PEG的大小来增加或减少。本领域技术人员还将理解各种市售PEG，包括多分散PEG、单分散PEG、异双官能和支链PEG(参见例如Creative PEGWorks,Chapel Hill,NC；XL-Protein GMBH,Freising,Germany；BroadPharm,San Diego,CA)
如果坎普他汀类似物的N末端未用聚合物修饰(即，以上示例性系列中的排列是Comp A-Lys(1-3)或Comp A-Lys(1-3)-PEG)，那么N末端可以用另一种方式修饰。例如，结合白蛋白的小分子(例如，ABM2)可以连接至N末端。这种类型的具体实施方案的特征是坎普他汀类似物Cp40，其包含与C末端连接的1-3个带电荷残基(例如，Lys)和通过酰胺键与N末端连接的ABM2。
与未修饰的肽在同等条件下相比，本文所述的N末端和/或C末端修饰增加了坎普他汀或坎普他汀类似物在pH约7.3至约7.5的流体中的溶解度。在某些实施方案中，溶解度的增加是至少约5倍。在具体的实施方案中，与等同但未修饰的肽在同等条件下相比，溶解度的增加是至少约10倍，或至少约20倍，或至少约30倍，或至少约40倍，或至少约50倍，或至少100倍、150倍、200倍、300倍、400倍、或甚至500倍或更多。此外，在具体的方面，与未修饰的肽在同等条件下相比，含有本文所述的N末端和/或C末端修饰的坎普他汀或坎普他汀类似物表现出小于约2倍的补体抑制活性降低。另外，在优选的实施方案中，与未修饰的肽在同等条件下相比，含有本文所述的N末端和/或C末端修饰的坎普他汀或坎普他汀类似物在C3结合亲和性上的降低小于约5倍。在一些方面，与未修饰的肽在同等条件下相比，含有本文所述的N末端和/或C末端修饰的坎普他汀或坎普他汀类似物在C3结合亲和性上的降低小于约10倍。在其他方面，与未修饰的肽在同等条件下相比，含有本文所述的N末端和/或C末端修饰的坎普他汀或坎普他汀类似物显示出C3结合亲和性的增加。
作为示例说明，尽管与母体化合物Cp40相比，通过mPEG缀合进行的Cp40 N末端修饰导致与其配体C3的缔合常数(ka)降低了约3至6倍，但未观察到解离常数(kd)的显著变化。与Cp40(KD，0.5nM)相比，较低的ka值反映在较低的亲和性值中，特别是对于携带较大PEG链的类似物(mPEG(3k)-Cp40，7.9nM；mPEG(2k)-Cp40，4.4nM)。然而，表观上较低的亲和性并未显著影响类似物的补体抑制活性(参见实施例中的表2)。类似地，向Cp40添加Lys残基没有显著影响上述任何生化参数，表明所选的修饰没有诱导类似物与其配体C3之间的相互作用发生重大变化(表2)。这里要强调的是，解离Kd对于化合物的停留时间具有最大的意义。
本文所述的C和/或N末端修饰可以应用于坎普他汀本身或其任何类似物。现在将进一步详细描述适用于本文公开的N末端和/或C末端修饰的坎普他汀类似物的非限制性实例。
坎普他汀类似物
可以将上述N末端和C末端修饰与先前显示改善活性的坎普他汀的其他修饰组合，从而产生具有显著改善的补体抑制活性的肽。例如，在其中N末端未被PEG化的实施方案中，可以将N末端乙酰化。另外，已知用Ala取代第9位的His改善了坎普他汀的活性，并且也是本发明肽的优选修饰。
在WO2004/026328和WO2007/062249中公开了，第4位的Trp和某些Trp类似物，以及第7位的某些Trp类似物，特别是与第9位的Ala组合，产生的活性比坎普他汀的活性高很多倍。这些修饰也用于本发明中。
具体地，已经显示在第4位上包含5-氟-色氨酸或5-甲氧基-、5-甲基-或1-甲基-色氨酸或1-甲酰基-色氨酸的肽具有比未修饰的坎普他汀大许多倍的活性。特别优选的是1-甲基和1-甲酰基色氨酸。据信，对于坎普他汀的结合和活性，在第4位不需要吲哚‘N’介导的氢键。通过在第4位处用低级烷基、烷酰基或吲哚氮替代氢，不存在此氢键或降低极性，可增强坎普他汀的结合和活性。在某些实施方案中，坎普他汀第4位的Trp被包含1-烷基取代基，更特别是如上所定义的低级烷基(例如，C1-C5)取代基的类似物替代。这些包括但不限于N(α)甲基色氨酸和5-甲基色氨酸。在其他实施方案中，坎普他汀第4位的Trp被包含1-烷酰基取代基，更特别是如上定义的低级烷酰基(例如C1-C5)取代基的类似物替代，例如N(α)甲酰基色氨酸、1-乙酰基-L-色氨酸和L-β-同色氨酸。
在WO2007/062249中公开了，相对于坎普他汀，在坎普他汀的第7位处掺入5-氟-色氨酸增加了所得坎普他汀类似物与C3之间的相互作用的焓，而在第4位处掺入5-氟-色氨酸降低了这种相互作用的焓。因此，如在WO2007/062249中描述的，在第7位处的Trp的修饰被认为是与上述N末端修饰组合的有用修饰。
WO2007/062249中描述的示例坎普他汀类似物是：
Xaa1-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa3-Gly-Xaa4-His-Arg-Cys-Xaa5(环状C2-C12)(SEQ ID NO:2)；其中：
Xaa1是Ile、Val、Leu、Ac-Ile、Ac-Val、Ac-Leu或包含Gly-Ile的二肽；
Xaa2是Trp或Trp类似物，其中与Trp相比，Trp类似物具有增加的疏水性，条件是如果Xaa3是Trp，那么Xaa2是Trp类似物；
Xaa3是Trp或包含对其吲哚环的化学修饰的Trp类似物，其中化学修饰增加了吲哚环的氢键电势；
Xaa4是His、Ala、Phe或Trp；
Xaa5是L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly、包含Thr-Asn的二肽或包含Thr-Ala的二肽或包含Thr-Ala-Asn的三肽，其中L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly或Asn中任一个的羧基末端-OH任选被-NH2替代；并且
两个Cys残基通过二硫键连接。
在各种实施方案中，Xaa2的Trp类似物是卤代Trp，如5-氟-l-色氨酸或6-氟-l-色氨酸。在其他实施方案中，在Xaa2处的Trp类似物在第5位上包含低级烷氧基或低级烷基取代基，例如5-甲氧基色氨酸或5-甲基色氨酸。在其他实施方案中，在Xaa2处的Trp类似物在1位上包含低级烷基或低级烷酰基取代基，示例性实施方案包含1-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸。在其他实施方案中，Xaa3的Trp类似物是卤代Trp，如5-氟-1-色氨酸或6-氟-1-色氨酸。
在某些实施方案中，Xaa2在色氨酸的1位上包含低级烷酰基或低级烷基取代基，Xaa3任选地包含卤代色氨酸，而Xaa4包含Ala。
在WO2010/127336中描述了具有对SEQ ID No:1和2的各种修饰的其他类坎普他汀类似物。该文件中公开的一种修饰包含在肽的第8位处约束肽骨架。在具体的实施方案中，通过用N-甲基甘氨酸替代第8位的甘氨酸(Gly8)来约束骨架。该文件中公开的另一种修饰包含用Ile、Leu、Nle(正亮氨酸)、N-甲基Thr或N-甲基Ile替代第13位的Thr。此类类似物由以下序列表示：
Xaa1-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa3-Gly-Xaa4-His-Arg-Cys-Xaa5(环状C2-C12)(SEQ ID NO:3)，其中第8位的Gly被修饰以约束肽在该位置处的骨架构象，并且其中：
Xaa1是Ile、Val、Leu、Ac-Ile、Ac-Val、Ac-Leu或包含Gly-Ile的二肽；
Xaa2是Trp或Trp类似物，其中与Trp相比，Trp类似物具有增加的疏水性；
Xaa3是Trp，或包含对其吲哚环的化学修饰的Trp类似物，其中化学修饰增加了吲哚环的氢键电势；
Xaa4是His、Ala、Phe或Trp；并且
Xaa5是Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile，其中Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile中任一个的羧基末端-OH任选被-NH2替代。
在此类类似物的实施方案中，Xaa 2处的Trp类似物在5位上包含低级烷氧基或低级烷基取代基，例如5-甲氧基色氨酸或5-甲基色氨酸；或在1位上包含低级烷基或低级烷酰基取代基，示例性实施方案包含1-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸。在其他实施方案中，Xaa3的Trp类似物是卤代色氨酸，如5-氟-1-色氨酸或6-氟-1-色氨酸。
在此类类似物的某些实施方案中，在第8位处的Gly是N-甲基化的，并且Xaa1是Ac-Ile，Xaa2是1-甲基-Trp或1-甲酰基-Trp，Xaa3是Trp，Xaa4是Ala，并且Xaa5是Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile。具体地，Xaa5可以是Ile、N-甲基Thr或N-甲基Ile。具体地，坎普他汀类似物包含类似物Cp20：
Ac-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-NH2(SEQID NO:4)
坎普他汀类似物的另一种修饰描述在WO2012/040259中。一种这样的修饰包含添加CH2替代C2-C12二硫键以在C2或C12处形成同半胱氨酸，和引入硫醚键以形成胱硫醚，如γ-胱硫醚或δ-胱硫醚。另一修饰包含在不添加CH2的情况下用硫醚键替代C2-C12二硫键，从而形成羊毛硫氨酸。包含硫醚键的类似物表现出的活性与某些二硫键类似物的活性基本相同，并且还具有等同或改善的稳定性特征。
在WO2013/036778中描述了另一类坎普他汀类似物，其特别适合用作本发明的C末端或N末端修饰的肽骨架，以产生具有新药代动力学特性的新颖化合物。此类类似物由氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Cys-Val-Xaa3-Gln-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-His-Xaa7-Cys-Xaa8(SEQ IDNO:5)表示，其中Xaa5与Xaa6之间的Gly任选地被修饰以约束骨架构象；
其中Xaa1不存在或是Tyr、D-Tyr或Sar；
Xaa2是Ile、Gly或Ac-Trp；
Xaa3是Trp或Trp类似物，其中与Trp相比，所述Trp类似物具有增加的疏水性；
Xaa4是Asp或Asn；
Xaa5是Trp或包含对其吲哚环的化学修饰的Trp类似物，其中所述化学修饰增加了所述吲哚环的氢键电势；
Xaa6是His、Ala、Phe或Trp；
Xaa7是Arg或Orn；并且
Xaa8是Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile，其中Thr、Ile、Leu、Nle或N-甲基Thr或N-甲基Ile中任一个的羧基末端-OH任选被-NH2替代，并且所述肽通过Cys-Cys或硫醚键为环状。
Xaa3的Trp类似物可以是卤代色氨酸，如5-氟-1-色氨酸或6-氟-1-色氨酸。Xaa3处的Trp类似物可以在5位上包含低级烷氧基或低级烷基取代基，例如5-甲氧基-色氨酸或5-甲基色氨酸。在其他实施方案中，Xaa3处的Trp类似物在1位上包含低级烷基或低级烷酰基取代基，示例性实施方案包含1-甲基色氨酸或1-甲酰基-色氨酸。在其他实施方案中，Xaa5的Trp类似物是卤代色氨酸，如5-氟-1-色氨酸或6-氟-1-色氨酸。在一些实施方案中，Xaa5与Xaa6之间的Gly被Nα-甲基Gly(Sar)替代。
参考以下所述的此类示例性坎普他汀类似物：
Cp30:
Sar-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-NH2
(SEQ ID NO:6)
Cp40:
DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-NH2
(SEQ ID NO:7)
如本文实施例中所述，通过修饰类似物Cp40来制备根据本发明的示例性N和C末端修饰的类似物。
表1.基于Cp40的C末端修饰类似物.
Figure BDA0002764388340000291
*方括号表示Cys-Cys键。
**示出了Cp40用于比较。
PEG化或添加Lys残基可增加Cp40在生理pH下的溶解度。同时，Cp40的有利的C3抑制活性不受修饰的影响，并且令人惊讶地，Lys衍生物对C3的结合亲和性甚至比母体化合物Cp40强。另外，Cp40变体在皮下、静脉内、玻璃体内和/或肌内施用至非人类灵长类动物后显示出相似或延长的半衰期，而当使用Cp40变体时，C3浓度在较长的时间内饱和。
如实施例所述评估的最有前途的化合物称为mPEG(3k)-Cp40、Cp40-KK和Cp40-KKK，与母体肽Cp40相比，其溶解度显著提高(>200倍)。最重要的是，与Cp40相比，新颖类似物维持抑制活性并显示出改善的药代动力学特征。对非人类灵长类动物sc施用2mg/kg的单个类似物的体内研究表明，与Cp40化合物相比，mPEG(3k)-Cp40具有更高的cmax(约2倍)，更长的C3饱和时间(约34h)，t1/2稍微延长了约15h，增加了AUC0-t(约2.7倍)，降低了CL/F(约3倍)。在具有额外的Lys残基的类似物中，Cp40-KKK似乎是特征增强最多的候选物。当通过多次s.c.注射施用Cp40-KKK时，这种作用甚至更加明显。体内药代动力学研究表明，sc施用Cp40-KKK伴有与Cp40相比更高的cmax(约2倍)、更长的C3饱和时间(约42h)、增加的AUC0-t(约2.6倍)和降低的CL/F(约3倍)。对单个类似物的其他药代动力学研究表明，单次i.v.注射后，Cp40-KKK的AUC0-120 h值是Cp40-KK的超过3.5倍，与mPEG(1k)-Cp40和mPEG(3k)-Cp40相当。在这些i.v.PK研究中，mPEG(3k)-Cp40似乎具有增强最多的特征，与其他类似物相比，t1/2延长了至少约30h。此外，向非人类灵长类动物玻璃体内(i.v.t)施用0.5mg的Cp40-KK、Cp40-KKK、mPEG(1k)-Cp40或mPEG(3k)-Cp40的体内研究表明，对于PEG化的Cp40类似物，其玻璃体内停留时间是至少14天，Cp40-KK和Cp40-KKK的停留时间超过73天。更进一步，即使在90天后，Cp40-KKK在C3饱和水平下仍显示出玻璃体停留时间。
与这些新颖类似物有关的溶解度和药代动力学特征的总体改善是由于它们降低药物施用频率并使注射部位的局部刺激最小化的潜力所支持。另外，本文所述的药代动力学研究表明，与Cp40相比，有利于这些化合物长期全身施用的药代动力学参数得到了显著改善。
因此，在具体实施方案中，提供了基于SEQ ID No:7的化合物，其中至少一个赖氨酸氨基酸共价连接至C末端。在一些实施方案中，至少两个赖氨酸氨基酸共价连接至C末端，而在其他实施方案中，三个或更多个赖氨酸氨基酸共价连接至C末端。在优选的实施方案中，提供了基于SEQ ID No:7的化合物，其中两个或三个赖氨酸氨基酸共价连接至C末端。在其他实施方案中，提供了由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10组成的化合物。在其他实施方案中，化合物基本上由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10组成。例如，在一个实施方案中，提供了具有由SEQ ID NO:10(Cp40-KKK)表示的氨基酸序列的化合物，其中与具有由SEQ ID NO:7(Cp40)表示的氨基酸序列的化合物相比，所述化合物表现出增加的溶解度、血浆停留时间、玻璃体停留时间和/或C3结合。
小聚合物、小PEG的添加和/或亲水或带电荷残基的C末端添加可以应用于本领域已知的任何其他种类的坎普他汀类似物。这些包括但不限于WO2012/155107、WO2013/036778、WO2014/078731、WO2014/078734、WO2014/152931和WO2017/062879中描述的类似物。
本发明的修饰的坎普他汀肽可以根据常规的肽合成方法，通过缩合一个或多个氨基酸残基的各种肽合成的合成方法来制备。例如，肽根据标准固相方法合成。通过固相方法或液相合成肽或拟肽的其他方法是本领域技术人员众所周知的。在肽合成过程中，可以使用通常已知的保护基根据需要对支链氨基和羧基进行保护/脱保护。利用用于肽和肽衍生物的替代保护基的修饰对本领域技术人员将是显而易见的。
或者，本发明的某些肽可以通过在合适的原核或真核系统中表达来产生。例如，可将DNA构建体插入适于在细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))或酵母细胞(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中表达的质粒载体中，或插入适于在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体中或适于在哺乳动物细胞中表达的病毒载体中。这样的载体包含在宿主细胞中表达DNA所必需的调节元件，所述调节元件以一定方式定位以允许DNA在宿主细胞中表达。表达所需的这样的调节元件包括启动子序列、转录起始序列和任选地增强子序列。
肽还可以通过在体外或体内表达核酸分子来产生。可以将编码肽的串联体的DNA构建体引入体内表达系统，所述串联体的上限取决于所使用的表达系统。产生串联体后，通过使多肽暴露于肼来完成C末端Asn与随后的N末端Gly之间的切割。
在重组原核或真核系统中通过基因表达产生的肽可以根据本领域已知的方法来纯化。基因表达和合成方法的组合也可以用于产生坎普他汀类似物。例如，类似物可以通过基因表达产生，然后对其进行一种或多种翻译后合成过程，例如修饰N或C末端或使分子环化。
有利地，掺入非天然氨基酸例如甲基化氨基酸的肽可以通过在合适的原核或真核系统中体内表达来产生。例如，如Katragadda&Lambris(2006,Protein Expression andPurification 47:289-295)描述的通过在大肠杆菌营养缺陷型中的表达将非天然Trp类似物引入坎普他汀的那些方法可以用于在坎普他汀的选定位置处引入N-甲基化或其他非天然氨基酸。
坎普他汀的结构在本领域中是已知的，并且上述类似物的结构通过类似的方法确定。一旦确定了短肽的特定所需构象，设计适合该构象的肽或拟肽的方法是本领域众所周知的。与本发明特别相关，如上所述，可以通过考虑氨基酸残基的各种侧链的贡献来进一步完善肽类似物的设计(即，出于官能团的作用或出于空间考虑)。
本领域技术人员将理解，肽模拟物可以与提供与C3结合并抑制补体激活所需的特定骨架构象和侧链功能的肽一样好地发挥作用。因此，通过使用能够连接形成适当的骨架构象的天然存在的氨基酸、氨基酸衍生物、类似物或非氨基酸分子来产生C3结合的、抑制补体的化合物在本发明的范围内。非肽类似物或包含肽和非肽组分的类似物有时在本文中称为“拟肽”或“等位模拟物”，以指定具有相同骨架构象特征和/或其他功能的本发明肽的取代或衍生，从而与示例性肽足够相似以抑制补体激活。
拟肽在开发高亲和性肽类似物中的用途是本领域众所周知的(参见例如Vagner等人,2008,Curr.Opin.Chem.Biol.12:292-296；Robinson等人,2008,Drug Disc.Today 13:944-951)。假设旋转约束类似于肽中氨基酸残基的旋转约束，可以通过本领域众所周知的任何计算技术来分析包含非氨基酸部分的类似物，并验证其构象基序。
坎普他汀类似物的用途和治疗性施用
坎普他汀类似物、拟肽和缀合物的补体抑制活性可以通过本领域已知的多种测定法进行测试。在某些实施方案中，使用实施例中描述的测定法。其他测定法的非详尽列表在美国专利6,319,897、WO99/13899、WO2004/026328、WO2007/062249和WO2010/127336中列出，包括但不限于(1)与C3和C3片段结合的肽；(2)各种溶血测定法；(3)测量C3转化酶介导的C3切割；(4)测量因子D对因子B的切割。
如本领域中已知的，本文所述的肽和拟肽对于任何使用坎普他汀本身的目的均具有实用性。这样的用途包括但不限于：(1)抑制患者(人类或动物)的血清中以及细胞、组织或器官上的补体激活，这可以促进治疗某些疾病或病况，包括但不限于年龄相关性黄斑变性、地理萎缩、脉络膜新血管形成、视网膜新血管形成、眼部炎症、血液透析引起的炎症、青光眼、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、脊髓损伤、外伤性脑损伤、脑缺血/再灌注损伤(例如中风)、急性多发性创伤(失血性休克)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、癌症、败血症、阵发性夜间血红蛋白尿、自身免疫病因的溶血性病症(例如冷凝集素病和wAIHA)、银屑病和呼吸障碍如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性炎症，肺气肿，支气管炎，支气管扩张，囊性纤维化，结核，肺炎，呼吸窘迫综合征(RDS-新生儿和成人)、鼻炎和鼻窦炎、移植相关的血栓性微血管病、皮肤炎性疾病、牙周炎、牙龈炎、补体相关的肾脏疾病；(2)抑制在细胞或器官移植期间或在使用人造器官或植入物时发生的补体激活(例如，通过在手术之前、期间和/或之后通过限时全身施用，或用本发明的肽涂布或以其他方式处理细胞、器官、人造器官或植入物)；(3)抑制在体外分流生理性流体(血液、尿液)期间发生的补体激活(例如，通过在手术之前、期间和/或之后通过限时全身施用，或用本发明的肽涂布分流流体的管道)；和(4)筛选小分子文库以鉴定坎普他汀激活的其他抑制剂(例如，液相或固相高通量测定法，其被设计成测量测试化合物与坎普他汀类似物竞争与C3或C3片段结合的能力)。
为了实现上述一种或多种用途，本发明的另一方面的特征在于药物组合物，其包含本文描述和示例的坎普他汀类似物或缀合物。这样的药物组合物可以由适合于施用于受试者的形式的单独的活性成分组成，或者药物组合物可以包含活性成分和一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种其他成分或这些的某种组合。如本领域众所周知，活性成分可以以生理上可接受的酯或盐的形式存在于药物组合物中，如与生理上可接受的阳离子或阴离子组合。
可以基于其溶解度特征为特定制剂选择本发明的特定坎普他汀类似物。如上所述，高度可溶于水或缓冲盐水的类似物可能特别适合全身性注射，因为注射量可以最小化。相比之下，对于局部应用或局部注射(如眼内注射(包括玻璃体内注射))而言，水溶性高、在缓冲盐水中溶解度较低的类似物可产生更持久的凝胶、悬浮液或沉淀物。
因此，在具体实施方案中，基于Cp40的坎普他汀类似物可通过皮下、静脉内、眼内(包括玻璃体内)、肌内注射、牙周施用(包括牙龈施用或乳头内浸润注射)或局部施用来施用。在其他实施方案中，Cp40类似物口服递送。在一些实施方案中，基于Cp40的类似物以单次口服、皮下、静脉内、眼内(包括玻璃体内)、肌内注射、牙周施用或局部施用的方式施用。在其他实施方案中，基于Cp40的类似物通过多次口服、皮下、静脉内、眼内(包括玻璃体内)、肌内注射、牙周或局部施用来施用。在其他实施方案中，基于Cp40的类似物通过初始皮下、静脉内或肌内负荷剂量与重复的口服、肌内、皮下或静脉内给药相组合的方式来施用，持续延长的时间，以使与之前描述的已知坎普他汀类似物的施用方法相比而言，类似物剂量更低、给药间隔更短。在其他实施方案中，维持剂量通过皮下输注泵或眼部植入物通过Cp40类似物递送来完成(参见例如US2016/0060297和US 6,692,759)。
药物组合物的制剂可以通过制药技术领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分结合，然后，如果必要或期望，将产品成型或包装成所需的单剂量或多剂量单元。
可用于实施本发明的药物组合物可以单次推注施用，以递送0.125mg/kg与50mg/kg体重之间的剂量，或1μg与约10mg之间的玻璃体内剂量，或以重复方案，或本领域技术人员容易确定的其组合。在某些实施方案中，剂量包含每天或以另一种合适的周期性方案，至少0.05mg/kg、0.1mg/kg或至少0.2mg/kg或至少0.3mg/kg或至少0.4mg/kg或至少0.5mg/kg或至少0.6mg/kg或至少0.7mg/kg或至少0.8mg/kg或至少0.9mg/kg或至少1mg/kg或至少2mg/kg或至少3mg/kg或至少4mg/kg或至少5mg/kg或至少6mg/kg或至少7mg/kg或至少8mg/kg或至少9mg/kg或至少10mg/kg或至少15mg/kg或至少20mg/kg或至少25mg/kg或至少30mg/kg或至少35mg/kg或至少40mg/kg或至少45mg/kg或至少50mg/kg。
已经发现，与先前已知的坎普他汀类似物相比，本文公开的基于Cp40的类似物(例如，PEG(1K)-Cp40、PEG(3K)-Cp40、Cp40-KK或Cp40-KKK)的施用具有延长的血浆停留时间和延长的玻璃体内停留时间，因此，可以较低的治疗有效剂量和较低的给药间隔静脉内、玻璃体内、肌内和/或皮下施用。如本领域普通技术人员将理解的，特定的施用途径可影响治疗有效性所需的剂量。
在一个实施方案中，本发明设想了以约0.125mg/kg与约10mg/kg之间，例如0.125mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、1.25mg/kg、1.5mg/kg、1.75mg/kg、2mg/kg、2.25mg/kg、2.5mg/kg、2.75mg/kg、3mg/kg、3.25mg/kg、3.5mg/kg、3.75mg/kg、4mg/kg、4.25mg/kg、4.5mg/kg、4.75mg/kg、5mg/kg、5.25mg/kg、5.5mg/kg、5.75mg/kg、6mg/kg、6.25mg/kg、6.5mg/kg、6.75mg/kg、7mg/kg、7.25mg/kg、7.5mg/kg、7.75mg/kg、8mg/kg、8.25mg/kg、8.5mg/kg、8.75mg/kg、9mg/kg、9.25mg/kg、9.5mg/kg、9.75mg/kg或10mg/kg的治疗有效剂量静脉内或皮下施用本文所述的基于Cp40的类似物。在一优选实施方案中，基于Cp40的类似物通过静脉内或皮下递送(例如注射或输注)以约0.25mg/kg与约5mg/kg之间的治疗有效剂量施用。在另一实施方案中，所述治疗有效剂量在约0.5mg/kg与约5mg/kg之间。在又一实施方案中，所述治疗有效剂量在约0.5mg/kg与4mg/kg之间或在约0.5mg/kg与约3mg/kg之间。例如，在一个特定的实施方案中，基于Cp40的类似物(例如，PEG(1K)-Cp40、PEG(3K)-Cp40、Cp40-KK或Cp40-KKK)以约3mg/kg/24小时的剂量向人类i.v.或s.c.注射。
在另一实施方案中，本发明设想了以约0.25mg/kg与约50mg/kg之间，例如0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、19.5mg/kg、20mg/kg、20.5mg/kg、21mg/kg、21.5mg/kg、22mg/kg、22.5mg/kg、23mg/kg、23.5mg/kg、24mg/kg、24.5mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg或50mg/kg的治疗有效剂量肌内施用本文所述的基于Cp40的类似物。在一优选实施方案中，基于Cp40的类似物通过肌内递送(例如注射)以约0.25mg/kg与约35mg/kg之间的治疗有效剂量施用。在另一实施方案中，所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与30mg/kg之间。在又一实施方案中，所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与10mg/kg之间。在其他实施方案中，所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与5mg/kg之间。例如，在一个特定的实施方案中，基于Cp40的类似物(例如，PEG(1K)-Cp40、PEG(3K)-Cp40、Cp40-KK或Cp40-KKK)以约2.5mg/kg的剂量i.m.注射。
在又一实施方案中，本发明设想了以约1μg与约10mg之间，例如1μg、1.25μg、1.5μg、1.75μg、2μg、2.25μg、2.5μg、2.75μg、3μg、3.25μg、3.5μg、3.75μg、4μg、4.25μg、4.5μg、4.75μg、5μg、5.25μg、5.5μg、5.75μg、6μg、6.25μg、6.5μg、6.75μg、7μg、7.25μg、7.5μg、7.75μg、8μg、8.25μg、8.5μg、8.75μg、9μg、9.25μg、9.5μg、9.75μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg 900μg、950μg、1mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg或10mg的治疗有效剂量玻璃体内施用本文所述的基于Cp40的类似物；优选地，剂量在约1μg与约2,000μg之间，例如约1μg至约2,000μg或约100μg至约1,500μg或约500μg至约1,200μg或约500μg至约1,000μg。在一些实施方案中，通过玻璃体内施用递送的基于Cp40的类似物的治疗有效剂量是至少约0.02mg，例如至少约0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.55mg、0.6mg、0.65mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.85、mg、0.9mg、0.95mg或1mg。例如，在一个特定的实施方案中，基于Cp40的类似物(例如，PEG(1K)-Cp40、PEG(3K)-Cp40、Cp40-KK或Cp40-KKK)以约1mg的剂量i.v.t.注射。
在另一实施方案中，本发明设想了以约1mg/kg与约20mg/kg之间，例如1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、19.5mg/kg或20mg/kg的治疗有效剂量口服施用本文所述的基于Cp40的类似物。在一优选实施方案中，基于Cp40的类似物以约1mg/kg与约10mg/kg之间的治疗有效剂量通过口服递送而施用。例如，在一个特定的实施方案中，基于Cp40的类似物(例如，PEG(1K)-Cp40、PEG(3K)-Cp40、Cp40-KK或Cp40-KKK)以约1与5mg/kg的剂量向人类口服递送。在一些实施方案中，本文所述的口服剂量施用一次。在其他实施方案中，它每天施用。
在另一实施方案中，本发明设想了以约1μg与约1,000μg之间，例如1μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg、300μg、310μg、320μg、330μg、340μg、350μg、360μg、370μg、380μg、390μg、400μg、410μg、420μg、430μg、440μg、450μg、460μg、470μg、480μg、490μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg或1,000μg的治疗有效剂量牙周施用，如乳头内浸润本文所述的基于Cp40的类似物。例如，基于Cp40的类似物可以以约5μg与约500μg之间的剂量向人类牙周施用(例如，通过注射递送至齿间乳头中)。在一优选实施方案中，基于Cp40的类似物以约10μg/齿间乳头与约200μg/齿间乳头之间的剂量或以约20μg/齿间乳头与约100μg/齿间乳头之间的剂量向人类牙周递送。例如，在一个特定的实施方案中，基于Cp40的类似物(例如，PEG(1K)-Cp40、PEG(3K)-Cp40、Cp40-KK或Cp40-KKK)以约25μg/齿间乳头或约50μg/齿间乳头的剂量向人类牙周递送。
在一个实施方案中，本发明设想了施用剂量以使个体中基于Cp40的类似物的血清浓度在约0.01μM与约30μM之间。在某些实施方案中，组合剂量和方案将导致基于Cp40的类似物的血清浓度或随时间推移的平均血清浓度是至少约0.01μM，或至少约0.02μM，或至少约0.03μM，或至少约0.04μM，或至少约0.05μM，或至少约0.06μM，或至少约0.07μM，或至少约0.08μM，或至少约0.09μM，或至少约0.1μM,0.11μM，或至少约0.12μM，或至少约0.13μM，或至少约0.14μM，或至少约0.15μM，或至少约0.16μM，或至少约0.17μM，或至少约0.18μM，或至少约0.19μM，或至少约0.2μM，或至少约0.3μM，或至少约0.4μM，或至少约0.5μM，或至少约0.6μM，或至少约0.7μM，或至少约0.8μM，或至少约0.9μM，或至少约1μM，或至少约1.5μM，或至少约2μM，或至少约2.5μM，或至少约3μM，或至少约3.5μM，或至少约4μM，或至少约4.5μM，或至少约5μM，或至少约5.5μM，或至少约6μM，或至少约6.5μM，或至少约7μM，或至少约7.5μM，或至少约8μM，或至少约8.5μM，或至少约9μM，或至少约9.5μM，或至少约10μM，或至少约10.5μM，或至少约11μM，或至少约11.5μM，或至少约12μM，或至少约12.5μM，或至少约13μM，或至少约13.5μM，或至少约14μM，或至少约14.5μM，或至少约15μM，或至少约15.5μM，或至少约16μM，或至少约16.5μM，或至少约17μM，或至少约17.5μM，或至少约18μM，或至少约18.5μM，或至少约19μM，或至少约19.5μM，或至少约20μM，或至少约20.5μM，或至少约21μM，或至少约21.5μM，或至少约22μM，或至少约22.5μM，或至少约23μM，或至少约23.5μM，或至少约24μM，或至少约24.5μM，或至少约25μM，或至少约25.5μM，或至少约26μM，或至少约26.5μM，或至少约27μM，或至少约27.5μM，或至少约28μM，或至少约28.5μM，或至少约29μM，或至少约29.5μM，或至少约30μM。在某些实施方案中，组合剂量和方案将导致基于Cp40的类似物的血清浓度或随时间推移的平均血清浓度是至多约0.1μM，或至多约0.11μM，或至多约0.12μM，或至多约0.13μM，或至多约0.14μM，或至多约0.15μM，或至多约0.16μM，或至多约0.17μM，或至多约0.18μM，或至多约0.19μM，或至多约0.2μM，或至多约0.3μM，或至多约0.4μM，或至多约0.5μM，或至多约0.6μM，或至多约0.7μM，或至多约0.8μM，或至多约0.9μM，或至多约1μM，或至多约1.5μM，或至多约2μM，或至多约2.5μM，或至多约3μM，或至多约3.5μM，或至多约4μM，或至多约4.5μM，或至多约5μM，或至多约5.5μM，或至多约6μM，或至多约6.5μM，或至多约7μM，或至多约7.5μM，或至多约8μM，或至多约8.5μM，或至多约9μM，或至多约9.5μM，或至多约10μM，或至多约10.5μM，或至多约11μM，或至多约11.5μM，或至多约12μM，或至多约12.5μM，或至多约13μM，或至多约13.5μM，或至多约14μM，或至多约14.5μM，或至多约15μM，或至多约15.5μM，或至多约16μM，或至多约16.5μM，或至多约17μM，或至多约17.5μM，或至多约18μM，或至多约18.5μM，或至多约19μM，或至多约19.5μM，或至多约20μM，或至多约20.5μM，或至多约21μM，或至多约21.5μM，或至多约22μM，或至多约22.5μM，或至多约23μM，或至多约23.5μM，或至多约24μM，或至多约24.5μM，或至多约25μM，或至多约25.5μM，或至多约26μM，或至多约26.5μM，或至多约27μM，或至多约27.5μM，或至多约28μM，或至多约28.5μM，或至多约29μM，或至多约29.5μM，或至多约20μM。
合适的范围包括约0.1至约30μM，或约1至约29μM，或约2至约28μM，或约3至约27μM，或约4至约26μM，或约5至约25μM，或约6至约24μM，或约7至约23μM，或约8至约22μM，或约9至约21μM，或约10至约20μM，或约11至约19μM，或约12至约18μM，或约13至约17μM，或约1至约5μM，或约5至约10μM，或约10至约15μM，或约15至约20μM，或约20至约25μM，或约25至约30μM。虽然精确的施用剂量将取决于许多因素，包括但不限于患者类型和所治疗疾病状态的类型、患者的年龄以及施用途径，但这样的剂量很容易由本领域技术人员确定。
含有基于Cp40的类似物的药物组合物可以每天多次向患者施用，也可以不那么频繁地施用，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次，或甚至更不频繁，如每几个月一次或甚至一年一次或更不频繁。剂量的频率对技术人员而言是显而易见的，并且将取决于许多因素，例如但不限于所治疗疾病的类型和严重性、患者的类型和年龄，如上所述。然而，并且如上所述，与先前已知的坎普他汀类似物相比，本公开内容的基于Cp40的类似物可以更不频繁的间隔施用。
例如，在一些实施方案中，含有基于Cp40的类似物的药物组合物的静脉内、肌内、眼内(包括玻璃体内)、皮下、牙周(包括牙龈施用或乳头内浸润)或局部施用是通过单次注射。在其他实施方案中，基于Cp40的类似物是口服递送的。另外，鉴于目前所述的基于Cp40的类似物(即mPEG化的和/或含Lys的基于Cp40的类似物)的停留时间延长，本发明设想了长期全身施用这些基于Cp40的类似物，其中基于Cp40的类似物以上述治疗剂量通过经一段时间多次递送(例如，通过口腔或注射)通过口服、静脉内、眼内(包括玻璃体内)、皮下、肌内、牙周(包括牙龈施用或乳头内浸润)或局部施用途径来递送，以提供基于Cp40的类似物的治疗有效维持剂量，这取决于患者的类型和年龄以及所治疗疾病的类型和严重性。因此，在一些实施方案中，基于Cp40的类似物(例如，PEG(1K)-Cp40、PEG(3K)-Cp40、Cp40-KK或Cp40-KKK)通过多次注射包含类似物的药物组合物来静脉内、眼内(包括玻璃体内)、皮下、肌内、牙周(例如，经由乳头内浸润)或局部地递送，所述药物组合物每约12小时施用一次至约每三个月施用一次，例如，每12小时一次，每24小时一次，每2天一次，每3天一次，每4天一次，每5天一次，每6天一次，每7天一次，每8天一次，每9天一次，每10天一次，每2周一次，每3周一次，每月一次，每两个月一次，每三个月一次。在其他实施方案中，基于Cp40的类似物通过摄入包含类似物的药物组合物口服递送，所述药物组合物每约12小时施用一次至约每三个月一次，例如，每12小时一次，每24小时一次，每2天一次，每3天一次，每4天一次，每5天一次，每6天一次，每7天一次，每8天一次，每9天一次，每10天一次，每2周一次，每3周一次，每月一次，每两个月一次，每三个月一次。
本文还提供了包括施用途径和剂量的组合的递送方法。例如，本文提供了含有本公开内容的基于Cp40的类似物(例如，PEG(1K)-Cp40、PEG(3K)-Cp40、Cp40-KK或Cp40-KKK)的药物组合物的全身治疗方法，其包括初始饱和剂量，然后以较低的治疗有效剂量和较不频繁的给药间隔进行多次给药。这种新的全身治疗方法将提供体内补体抑制的长期维持/控制。为此，在一些实施方案中，第一负荷剂量的基于Cp40的类似物以选自上述范围的更高治疗有效剂量皮下、静脉内或肌内施用，然后以规则的给药间隔进行肌内或口服施用。在一个这样的实施方案中，含有本文所述的基于Cp40的类似物之一(例如Cp40-KKK)的药物组合物以至少约0.5至约3mg/kg的初始治疗有效剂量皮下或静脉内注射，然后以约0.25mg/kg与约50mg/kg之间的治疗有效维持剂量口服或肌内注射，其中维持剂量每2天至3个月递送一次，例如，每2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、42天、45天、50天、56天、60天、65天、70天、77天、80天、84天或90天一次。例如，在一个特定的实施方案中，含有Cp40-KKK的药物组合物以约0.5mg/kg至约3mg/kg的饱和剂量i.v.施用，然后随后以约0.5至约10mg/kg的维持剂量每周或每两周i.m.施用。
如上所述，可用于本发明方法的含有基于Cp40的类似物的药物组合物可以在口服、肠胃外、眼科或眼内(包括玻璃体内)、静脉内、皮下、肌内(i.m.)、牙周(例如，乳头内浸润注射)、栓剂、气雾剂、局部、经皮或其他类似制剂中全身性施用。这样的药物组合物可以含有药学上可接受的载体和已知增强和促进药物施用的其他成分。根据本发明的方法，其他制剂，如纳米颗粒、脂质体、重新密封的红细胞和基于免疫学的系统也可以用于施用坎普他汀类似物。
适用于注射用途的药物组合物通常包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或林格氏溶液。
无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，天然药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化形式也可用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳剂和悬浮液。为了配制的目的，也可以使用其他通常使用的表面活性剂，如吐温(Tweens)、司盘(Spans)和其他乳化剂或生物利用度增强剂，其通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型。
通常，组合物应该是无菌的，并且应该是流体，以便存在容易的注射性。优选的药物制剂在制造和储存条件下是稳定的，并且可以被保存以抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。通常，相关的载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，来防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
可以通过将所需量的活性化合物按需要与上述成分中的一种或其组合掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。优选地，用于注射的溶液不含内毒素。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质和所需的其他上文列举的成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
适用于口服施用的药物组合物的制剂包含多种剂型的活性成分组合药学上可接受的载体，所述剂型包括但不限于丸剂、片剂、粒剂、粉剂、胶囊、分散液、悬浮液、溶液、乳剂、微乳剂、凝胶和薄膜等。这样的剂型通常包括载体、赋形剂和/或渗透促进剂，以促进活性成分的配制和递送。
药学上可接受的载体选自蛋白质、碳水化合物、脂质、有机和无机分子及其组合。活性成分可以在适当的稀释剂中与载体结合以形成溶液或悬浮液。根据量和所用的载体，这样的液体制剂可以是粘性的或非粘性的。液体制剂可以直接使用，或者可以通过本领域技术人员已知的方法进一步配制成合适的胶囊、凝胶胶囊或固体。或者，可以通过组合固体组分来制备固体制剂。这样的固体制剂可以粉末形式使用或配制成颗粒、胶囊、片剂或薄膜，其中任何一种可以制成定时释放制剂。
用作口服剂型载体的合适蛋白质包括乳蛋白如酪蛋白、酪蛋白酸钠、乳清、低乳糖乳清、浓缩乳清蛋白、明胶、大豆蛋白(分离的)、褐藻蛋白、赤藻蛋白、面包酵母提取物和白蛋白。合适的碳水化合物包括纤维素如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸纤维素和乙基纤维素，淀粉如玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、酸改性淀粉、预胶化淀粉和未改性淀粉，藻酸盐如海藻酸铵、海藻酸钠和海藻酸钙，麸质如玉米麸质和小麦麸质，树胶如阿拉伯胶(阿拉伯树胶)、茄替胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶(梧桐胶)和胶(黄蓍胶)，不溶性葡萄糖异构酶制剂，糖如玉米糖、转化糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆和葡萄糖酸钠。合适的脂质包括生育酚如乙酸α-生育酚、短链、中链和长链脂肪酸及其酯、脂肪醇及其醚，油如椰子油(精制)、大豆油(氢化)和菜籽油，棕榈酸铝，硫代二丙酸二月桂酯，酶改性的卵磷脂，硬脂酸钙，酶改性的脂肪，棕榈硬脂酸甘油酯，卵磷脂，单和双甘油酯，甘油和蜡如蜂蜡(黄色和白色)、小烛树蜡和巴西棕榈蜡，以及植物油。合适的有机和无机物质包括甲基和乙烯基吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮、甲基磺酰基甲烷、二甲基亚砜和相关化合物、羟基和多羟基酸如聚乳酸。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物的口服剂型含有一种或多种渗透促进剂和/或脂质赋形剂，以增加口服施用后组合物的生物利用度，如Maher等人(2016,Adv.Drug Deliv.Rev.106:277-319)所述的那些。适用于本文的示例性渗透促进剂包括C12E9、辛酰己酰PEG 8甘油酯、柠檬酸、十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷(DDM)、单癸酸甘油酯、月桂肉碱、正十四烷基β-D-吡喃麦芽糖苷(TDM)、N-三甲基化壳聚糖、棕榈酰肉碱、穿膜肽(D-穿膜肽)、SNAC、癸酸钠(C10)、辛酸钠(C8)、胆酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、牛磺胆酸钠和蔗糖单月桂酸酯。适用于本文的示例性脂质赋形剂包括(例如，硬脂酸聚烃氧酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、辛酰己酰聚烃氧-8甘油酯、辛酰己酰聚乙二醇-8甘油酯、月桂酰基聚氧甘油酯、硬脂酰基聚氧甘油酯、油酰基聚烃氧-6甘油酯、亚油酰基聚烃氧-6甘油酯和月桂酰基聚烃氧-6甘油酯)、丙二醇酯(例如I型丙二醇单辛酸酯、II型丙二醇单辛酸酯、I型丙二醇单月桂酸酯和II型丙二醇单月桂酸酯)、聚甘油酯(例如聚甘油-3二油酸酯)、甘油酯(例如甘油单酯、甘油二酯、I型单硬脂酸甘油酯40-55、中链甘油三酯、丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯、丙二醇二辛酰癸酸酯、单亚油酸甘油酯和40型单油酸甘油酯)和水醇溶剂(例如二甘醇单乙基醚)。
在一些实施方案中，配制用于口服递送的药物组合物可以包括纳米颗粒作为药物递送系统。适用于包封本文提供的Cp-40类似物的纳米载体涂层的聚合物包括但不限于卡波姆、壳聚糖、胆固醇聚合物、环糊精、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚氰基丙烯酸乙酯、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚丙交酯-共-乙交酯和聚烯丙胺(参见例如Gupta等人,2013,DrugDeliv.20(6):237-246)。
对于局部应用，可以将本文提供的药物组合物配制成合适的软膏剂，其含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的药学上活性的组分。用于本文公开的坎普他汀或坎普他汀类似物的局部施用的药学上可接受的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可以将药物组合物配制成含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适洗剂或乳膏剂。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酸酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
为了局部递送至眼睛，本文提供的药物组合物可以适当地配制，例如(但不限于)在等渗的、pH调节的无菌盐水或水中，可以添加或不添加防腐剂，如苯扎氯铵。或者，对于眼科用途，可以将药物组合物配制成软膏如凡士林或滴眼剂。
对眼睛局部施用的方法包括例如脉络膜注射、经巩膜注射或放置巩膜贴片、选择性动脉导管插入术、滴眼剂或眼药膏、眼内施用包括经视网膜、结膜下球囊、玻璃体内注射、脉络膜上注射、腱下注射、巩膜囊和巩膜切开注射、通过渗透泵等。Cp40类似物也可以替代地在血管内，如静脉内(IV)或动脉内施用。在脉络膜注射和巩膜贴片中，临床医生或操作人员在开始使用适当的麻醉剂(包括止痛药和眼部麻痹剂)后，对眼睛采用局部方法。将含有药物组合物的针插入受试者的脉络膜或巩膜，并在无菌条件下插入。恰当放置针时，将Cp40类似物注入脉络膜或巩膜中的一个或两个中。当使用这些方法中的任一种时，临床医生或操作人员可以选择持续释放或更长效的制剂。因此，取决于受试者对治疗和反应的耐受性，程序只能每几个月或几年进行重复。
眼内药物施用是本领域众所周知的。参见例如美国专利第5,632,984号和第5,770,589号以及美国公开第2016/0060297A1号。美国专利第6,378,526号提供了在视网膜上方的位置进行巩膜内注射治疗或诊断物质的方法，所述方法提供了一种微创技术，可将药剂递送至眼后段。
在某些实施方案中，含有本发明的Cp40类似物的药物组合物被递送至眼睛附近，例如，紧挨眼后段。“眼睛附近”是指眼眶内的位置，眼眶是头骨内眼和其附属物所在的腔。通常，将组合物递送至接近其在眼睛内的预期目标，例如，接近(在几毫米之内)巩膜覆盖在眼后段上的部分，或紧接在巩膜的外表面附近。在一优选的实施方案中，本发明的药物组合物被递送至眼睛的玻璃体腔中(即，玻璃体内)。
许多用于提供受控释放的聚合物递送媒介物已经用于眼中，并且可以用于施用本发明的药物组合物。可以使用各种可生物降解的聚合物，例如生物相容性聚合物。例如，美国专利第6,692,759号描述了制造用于提供治疗剂在眼中的受控释放的可植入装置的方法。已经描述了用于眼部施用治疗剂的其他有用的聚合物和递送系统。活性剂可随着聚合物降解而释放。已经用于药物递送的聚合物包括但不限于聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚酐、乙烯乙酸乙烯酯、聚乙醇酸、壳聚糖、聚原酸酯、聚醚、聚乳酸和聚(β氨基酯)。还使用了肽、蛋白质如胶原蛋白和白蛋白以及树状聚合物(例如PAMAM树状聚合物)。这些中的任何一个都可以用于本发明的各种实施方案中。
聚(原酸酯)已被引入眼睛，并表现出对持续释放眼部药物递送的有利特性(参见Einmahl,S.,2002,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43(5))。在玻璃体内注射此类颗粒的悬浮液后，已使用聚丙交酯颗粒将药剂靶向视网膜和RPE(Bourges等人,2003,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.44(8))。适用于引入眼后段或前段的宏观可植入装置在本文中称为眼部植入物(参见Jaffe,G.,2000,Invest.Ophthalmol.Hs.Sci.,41(11))。因此，本文提供了一种眼部植入物，其包含例如治疗有效量的Cp40类似物，以将Cp40类似物递送至患有可通过补体抑制治疗的疾病或病况的个体。这样的装置可以是包含Cp40类似物的宏观植入物，或者可以由浸渍或包封药剂的多个纳米颗粒或微粒组成。在一个实施方案中，眼部植入物是本领域已知的任何眼部植入物。例如在US 2009/0220572A1中描述了示例性植入物及其制造方法。也可以使用本领域已知的其他植入物。
其他实施方案包括包含可溶胶原蛋白的凝胶形成组合物，其可用于将坎普他汀或坎普他汀类似物递送至眼后段。胶原蛋白最初是可溶的，并形成具有低粘度但能够在适当条件下，例如在向哺乳动物受试者施用时遇到的条件下快速形成凝胶的溶液。因此，本发明提供了用于将药学活性剂递送至眼后段的系统。系统被设计为以足够的浓度定位此类分子以提供持续的递送，同时允许大分子以足够的量释放。另外，胶原蛋白凝胶可以保护坎普他汀或坎普他汀类似物免于例如被内源蛋白酶降解。
引入体内后，例如与生理流体接触后，组合物形成凝胶。组合物还可以在与如磷酸盐缓冲盐水或其他含有适当离子的流体的流体接触时形成凝胶。因此，可以将组合物注射到合适的位置，例如紧邻眼后段的位置，在此处形成凝胶。或者，可以例如通过将溶液引入所需形状的模具或型腔中并允许在适当浓度的盐的存在下发生凝胶形成来制造预成形的凝胶植入物。可以在将溶液引入模具或型腔之前或之后添加盐。模具或型腔可以是例如任何含有可将溶液引入其中的中空空间或凹入凹陷的结构。在另一实施方案中，由含有治疗剂的胶原蛋白溶液形成薄膜或膜。
药剂从凝胶中的释放可以通过任何机理发生，例如，药剂从凝胶中扩散出来，或由于凝胶的分解而发生，或两者兼而有之。本发明的一个方面是选择合适浓度的可溶性胶原蛋白和胶原蛋白固体，其导致凝胶将药剂保留在凝胶内，从而在期望的时间段内提供持续递送，同时还允许药剂以足够浓度从凝胶中释放，以在眼后段的作用部位有效。
根据本发明的某些实施方案，通过使用任何合适的方法，例如通过添加坎普他汀或坎普他汀类似物至含有可溶性胶原蛋白的溶液中，在溶液中组合可溶性胶原蛋白和坎普他汀或坎普他汀类似物，来制备含有可溶性胶原蛋白和坎普他汀或坎普他汀类似物的溶液。所述组合物被局部递送至哺乳动物受试者的眼睛中或附近的适当位置，通常递送至眼后段之外的区域或紧邻眼后段。溶液在施用部位或其附近迅速形成凝胶。坎普他汀或坎普他汀类似物被包埋在凝胶内，然后从凝胶中扩散出来或随着凝胶随时间的降解而释放，从而向与凝胶直接物理接触或位于附近的组织和结构连续提供坎普他汀或坎普他汀类似物，或递送至血流中。在某些实施方案中，溶液在眼睛巩膜后施用，如下文进一步讨论。递送可以通过注射(例如，使用30号针等)，通过导管等来完成，如下文进一步描述。
只要胶原蛋白最初是可溶的并且能够在适当的条件下迅速形成凝胶，就可以在本发明中使用多种不同的胶原蛋白制剂。合适的胶原蛋白制剂及其制造方法在例如美国专利第5,492,135号、第5,861,486号、第6,197,934号、第6,204,365号以及WO 00/47130中描述，但本发明不限于这样的制剂或方法。这些胶原蛋白以可溶形式制备，并且在暴露于生理流体或具有合适浓度的离子的其他流体时迅速形成凝胶。根据本发明，将胶原蛋白溶液注射或以其他方式引入眼睛或眼睛附近导致凝胶形成，推测是由于与生理流体接触而引起的。然而，应当指出，本发明绝不受形成凝胶的机理的限制。另外，如上所述，可以在体外形成凝胶，并且将它们植入适当的位置，例如，紧邻眼后段。
制备可溶性胶原蛋白溶液的一种合适的方法包括从天然来源中提取胶原蛋白，酸增溶胶原蛋白，并用含有螯合剂例如金属螯合剂如乙二胺四乙酸，二水合二钠盐(EDTA)的溶液透析增溶的胶原蛋白，同时提高pH。也可以针对缺乏螯合剂的溶液如去离子水进行一个或多个透析步骤。与在中性pH和室温下自发性原纤维形成的标准胶原蛋白溶液不同，用于本发明的胶原蛋白溶液在储存期间保持在溶液中延长的时间段，并且当暴露于生理流体时迅速经历凝胶形成。虽然不希望受到任何理论的束缚，但螯合剂可以改变一种或多种阳离子的浓度，从而防止原纤维形成，否则原纤维形成将随着pH升高而发生。螯合剂可以对胶原蛋白溶液具有其他期望的作用，并且在本发明的某些实施方案中，胶原蛋白溶液包含螯合剂，例如EDTA。螯合剂可以在透析后保留在胶原蛋白溶液中，或者可以添加到胶原蛋白溶液中。螯合剂的浓度可以在例如约0.02M与约0.05M之间，例如约0.025M与约0.035M之间的范围内。也可以使用其他螯合剂，包括但不限于美国专利第5,861,486号中所述的那些。
在某些实施方案中，胶原蛋白溶液的可溶性胶原蛋白浓度范围为在1mg/ml与100mg/ml之间，例如在10mg/ml与70mg/ml之间、在20mg/ml与50mg/ml之间，例如30mg/ml等。在本发明的某些实施方案中，胶原蛋白溶液的pH在6.0与8.0之间，例如在6.5与7.5之间，例如7.0。
在本发明的某些实施方案中，胶原蛋白组合物还包含含有纤维状胶原蛋白固体的纤维状组分。例如，某些胶原蛋白组合物含有0.5mg/ml与30mg/ml之间的原纤维胶原蛋白固体，或1mg/ml与20mg/ml之间的原纤维胶原蛋白固体，例如2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml等。根据重量/体积的原纤维胶原蛋白固体百分比，某些胶原蛋白组合物含有0.05与3％之间的原纤维胶原蛋白固体，或0.1与2％之间的原纤维胶原蛋白固体，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％等。任何合适的原纤维组分都可以用于本发明的胶原蛋白组合物中。可以使用多种方法制备原纤维胶原蛋白固体。例如，原纤维胶原蛋白可以是由如牛皮革之类的动物来源制备的重构胶原蛋白(Frontiers于Matrix Biology,第10卷,第1-58页,Methods of Connective Tissue Research,编辑Robert,Moczar和Moczar,S.Karger,Basel,1985)。原纤维胶原蛋白可以从人或动物来源制备，如美国专利第4,969,912号和第5,322,802号中所述。原纤维胶原蛋白固体以通常约10-100mg/ml的浓度悬浮在溶液中。在将治疗剂添加至包含可溶性胶原蛋白的溶液之前或之后，将含有原纤维胶原蛋白固体的胶原蛋白悬浮液与例如可溶性胶原蛋白组合物组合，例如添加至可溶性胶原蛋白组合物中。
在本发明的一些实施方案中，可溶性胶原蛋白制剂包含化学交联剂。所述试剂可以使胶原蛋白分子和/或原纤维彼此交联和/或可以使治疗剂如坎普他汀或其类似物与胶原蛋白分子或原纤维交联。典型的交联剂使胶原蛋白胺基团彼此交联或与治疗剂的胺、羧基、苯酚、磺酰基或碳水化合物基团交联。合适的交联剂包括但不限于WO 00/47130中描述的那些。不希望受到任何理论的束缚，交联可以稳定胶原蛋白凝胶(例如，降低其分解速率)和/或降低治疗剂从凝胶中的释放速率。
不希望受到任何理论的束缚，原纤维胶原蛋白固体的存在可能具有多种有利作用中的任何一种。作为非限制性实例，原纤维胶原蛋白固体可以增加胶原蛋白凝胶的体内稳定性，例如，它们可以降低凝胶的分解速率。原纤维胶原蛋白固体可以增加含在凝胶中的治疗剂的稳定性和/或降低或调节通过扩散和/或凝胶分解从凝胶中释放药剂的速率。
胶原蛋白制剂优选在与生理流体接触后5分钟(300秒)内形成凝胶。更优选地，胶原蛋白制剂在与生理流体接触后的90秒、2分钟(120秒)或3分钟(180秒)内形成凝胶。也可以使用在较短的时间段内，例如在5-90秒内，或在较长的时间段内，例如3-5分钟，形成凝胶的制剂。
I-XXVIII型胶原蛋白中的任何一种或其混合物均可用于本发明。胶原蛋白可以从天然来源(例如，人组织或动物组织，如牛、兔等)中纯化，如上述参考专利和出版物中所述。或者，可以使用重组DNA技术来制造胶原蛋白，在这种情况下，序列可以是人或动物来源的。参见例如美国专利第5,593,854号和第5,667,839号。使用重组DNA技术生产蛋白质，例如目的多肽如胶原蛋白链的方法是本领域众所周知的。合适的方法包括上述方法。术语“胶原蛋白”包括胶原蛋白片段。因此，在某些实施方案中，可溶性胶原蛋白包含胶原蛋白片段或片段组合或由其组成。在某些实施方案中，使用完整的胶原蛋白多肽链。
虽然在本发明的某些实施方案中特别优选如上所述的胶原蛋白制剂，但多种其他形成凝胶的物质也可以用于本发明的形成凝胶的组合物中。在某些实施方案中，凝胶是水凝胶，其是指含有大量水的凝胶。优选地，物质及其形成的凝胶是生物相容的。在某些实施方案中，物质和其形成的凝胶是生物可降解的。多种修饰或衍生的胶原蛋白也可用于本发明的各种实施方案中。参见例如美国专利第5,201,764号。例如，胶原蛋白可以用一种或多种酰化剂如戊二酸酐、琥珀酸酐和马来酸酐，以及至少一种选自甲基丙烯酸酐、β-苯乙烯磺酰氯、乙烯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸酐共聚物或聚(乙烯基)磺酸的其他酰化剂酰化。
其他形成凝胶的物质包括但不限于透明质酸及其修饰形式，多糖如藻酸盐及其修饰形式、自组装肽等。参见例如美国专利第6,129,761号，进一步描述了藻酸盐及其修饰形式、透明质酸及其修饰形式，以及在本发明的各种实施方案中使用的可溶性凝胶形成物质的其他实例。如本文所述，其他聚合物水凝胶前体包括聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物，如PluronicsTM或TetronicsTM，其通过氢键和/或通过温度变化而交联，如Steinleitner等人,Obstetrics&Gynecology,77:48-52(1991)；和Steinleitner等人,Fertility andSterility,57:305-308(1992)中所述。可以利用的其他物质包括蛋白质，如纤维蛋白或明胶。也可以使用聚合物混合物。例如，可以使用在混合时通过氢键凝胶化的聚氧化乙烯和聚丙烯酸的混合物。
共价可交联的水凝胶前体也是有用的。例如，水溶性多胺如壳聚糖可与水溶性二异硫氰酸酯如聚乙二醇二异硫氰酸酯交联。异硫氰酸酯将与胺反应形成化学交联的凝胶。也可以利用与胺例如与聚乙二醇二醛的醛反应。也可以使用羟基化的水溶性聚合物。
或者，可以使用包括取代基的聚合物，所述取代基在与自由基引发剂接触时通过自由基反应而交联。例如，如公开内容通过引用并入本文的WO 93/17669中所公开的，可以利用包括可以被光化学交联的烯键式不饱和基团的聚合物。在此实施方案中，提供了水溶性大分子单体，其包括至少一个水溶性区域、可生物降解的区域和至少两个可自由基聚合的区域。通过使可聚合区域暴露于例如由光敏化学品和/或光产生的自由基来使大分子单体聚合。这些大分子单体的实例是PEG-低聚乳酰-丙烯酸酯，其中丙烯酸酯基使用自由基引发体系如曙红染料或通过短暂暴露于紫外或可见光而聚合。另外，如Matsuda等人,ASAIDTrans.,38:154-157(1992)中所公开的，可以利用包括可以被光化学交联的肉桂酰基的水溶性聚合物。
通常，聚合物至少部分溶于水溶液，如水、缓冲盐溶液或醇水溶液。上述其他聚合物的合成方法是本领域技术人员已知的。参见例如Concise Encyclopedia of PolymerScience and Polymeric Amines and Ammonium Salts,E.Goethals编辑(PergamenPress,Elmsford,N.Y.1980)。许多聚合物，如聚(丙烯酸)是可商购的。天然存在的和合成的聚合物可以使用本领域可用，例如在March,“Advanced Organic Chemistry”,第4版,1992,Wiley-Interscience Publication,New York中所述的化学反应进行改性。
具有带电荷侧基的水溶性聚合物可以通过使聚合物与含有相反电荷的离子的水溶液反应而交联，如果聚合物具有酸性侧基，那么为阳离子；如果聚合物具有碱性侧基，那么为阴离子。用于使聚合物与酸性侧基交联以形成水凝胶的阳离子的实例是一价阳离子，如钠，和多价阳离子，如铜、钙、铝、镁、锶、钡和锡，以及二、三或四官能有机阳离子，如烷基铵盐。将这些阳离子的盐的水溶液添加到聚合物中，以形成柔软的、高度溶胀的水凝胶和膜。阳离子浓度越高或化合价越高，聚合物的交联度越高。另外，聚合物可以酶促地交联，例如纤维蛋白与凝血酶。在一些实施方案中，使用自组装肽，如美国专利第6,800,481号中所述的那些肽。在与单价阳离子例如细胞外液中存在的那些阳离子接触时这些肽自组装形成水凝胶结构。
在其中通过使聚合物链彼此交联而形成凝胶的本发明的实施方案中，组合物可包括适当的交联剂，其根据特定的聚合物选择。或者，交联剂可以在施用含有凝胶形成物质的组合物后在基本上相同的位置施用。这些凝胶中的任何一种都可以在体外形成，例如，如以上针对包含可溶性胶原蛋白的凝胶所描述的，并且植入在眼睛中或附近的适当位置。
在某些实施方案中，本文所述的植入物包含约100μg与约50mg之间的Cp40类似物，例如约100μg与约40mg之间，约100μg与约30mg之间，约100μg与约20mg之间，约100μg与约10mg之间，约100μg与约9mg之间，例如约100μg与约8mg之间，例如约100μg与约7mg之间，例如约100μg与约6mg之间，例如约100μg与约5mg之间，例如约100μg与约4mg之间，例如约100μg与约3mg之间，例如约100μg与约2mg之间，例如约100μg与约1mg之间，例如约100μg与约500μg之间。
制备微粒和纳米颗粒的方法是本领域已知的。通常，微粒将具有500微米或更小的直径，例如，在50与500微米之间，在20与50微米之间，在1与20微米之间，在1与10微米之间，并且纳米颗粒的直径将小于1微米。优选地，装置被植入玻璃体液占据的空间中。眼部植入物可以包含聚合物基质。本发明还提供了眼周植入物，其是适于在眼睛附近例如紧邻眼睛引入的宏观可植入装置。在某些实施方案中，眼周植入物由与上述类似的材料制成。
在其他实施方案中，可以将表达Cp40类似物的细胞植入眼睛。美国专利第6,436,427号提供了一种通过植入含有生物活性分子的细胞源的生物相容性胶囊将生物活性分子递送至眼睛的方法。
在一些实施方案中，可制备控制释放形式以实现坎普他汀类似物在消化道中的持续或位置特异性释放，以改善吸收并防止某些形式的代谢。例如，片剂的抗酸涂层或抗酸胶囊材料可用于防止坎普他汀类似物在胃中释放，并保护化合物免受胃酶的代谢。在胃通过后实现受控释放的合适材料和涂层主要由脂肪酸、蜡、虫胶、塑料和植物纤维组成，包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、琥珀酸乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(羟丙甲纤维素乙酸琥珀酸酯)、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、藻酸钠或硬脂酸。胃肠道的持续释放可以例如通过将坎普他汀类似物包埋在不溶性物质如各种丙烯酸类、甲壳质等的基质中来实现。制备此类制剂的方法是本领域技术人员已知的。
坎普他汀可配制成栓剂或灌肠剂，用于直肠、阴道或尿道施用。为此，可以将坎普他汀类似物溶解或悬浮在油性基础载体(如可可脂)中，所述载体在室温下为固体或半固体，但在体温下会熔化，或者在水溶性固体基质(如聚乙二醇或甘油(由甘油和明胶制成))中。可以添加其他赋形剂以改善制剂，并且将栓剂成形为便于施用的形式。在其他实施方案中，可以使用由坎普他汀类似物溶解或悬浮在适合于直肠递送的液体载体中组成的液体栓剂以用小注射器应用。
对于涉及补体激活的慢性或急性肺部病况的治疗，药物组合物的优选施用途径是肺部施用。因此，本发明的药物组合物可以适于通过颊腔肺部施用的制剂的形式制备、包装或出售。这样的制剂可以包含干燥颗粒，所述干燥颗粒包含活性成分并且直径为约0.5至约7纳米，优选约1至约6纳米。此类组合物方便地为干粉形式，以用于使用包含干粉贮存器的装置来施用，可将推进剂流引导至所述干粉贮存器中以散布粉末，或者使用自推进溶剂/粉末分配容器，如包含活性成分溶解或悬浮在密封容器中的低沸点推进剂中的装置。优选地，这样的粉末包含这样的颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5纳米的直径，并且按数量计至少95％的颗粒具有小于7纳米的直径。更优选地，按重量计至少95％的颗粒具有大于1纳米的直径，并且按数量计至少90％的颗粒具有小于6纳米的直径。干粉组合物优选包括固体细粉稀释剂，如糖，并以单位剂型方便地提供。
低沸点推进剂通常包括在大气压下沸点低于65°F的液体推进剂。通常，推进剂可占组合物的50至99.9％(w/w)，而活性成分可占组合物的0.1至20％(w/w)。推进剂可进一步包含其他成分，如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(优选具有与包含活性成分的颗粒相同数量级的粒度)。
配制用于肺部递送的本发明药物组合物也可以以溶液或悬浮液的液滴形式提供活性成分。这样的制剂可以包含活性成分的水性或稀醇溶液或悬浮液(任选地无菌的)被制备、包装或出售，并且可以使用任何雾化或喷雾装置方便地施用。这样的制剂可以进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于调味剂如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂包括替代肺表面活性剂、或防腐剂如甲基羟基苯甲酸酯。通过此施用途径提供的液滴优选具有约0.1至约200纳米的平均直径。
本文描述的可用于肺部递送的制剂也可用于鼻内递送本发明的药物组合物。
适于鼻内施用的另一种制剂是包含活性成分并且具有约0.2至500微米的平均颗粒的粗粉。这样的制剂以如下的方式施用，其中通过从置于鼻孔附近的粉末容器中通过鼻道快速吸入来吸入鼻烟。
适用于鼻腔施用的制剂可例如包含大约少至0.1％(w/w)且多至100％(w/w)的活性成分，并且还可包含一种或多种本文所述的其他成分。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括特征在于对受试者的组织进行物理破坏以及通过组织中的缺口进行药物组合物的施用的任何施用途径。肠胃外施用因此包括但不限于通过注射组合物，通过外科切口应用组合物，通过穿透组织的非外科伤口应用组合物等方式施用药物组合物。具体地，肠胃外施用预期包括但不限于静脉内、皮下、腹膜内、肌内、关节内、玻璃体内、胸骨内注射和肾透析输注技术。
适用于肠胃外施用的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。这样的制剂可以适合于推注施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射制剂可以单位剂型制备、包装或出售，如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中。肠胃外施用的制剂包括但不限于在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液、乳剂、糊剂和可植入的持续释放或可生物降解的制剂。这样的制剂可以进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方案中，以干燥(即粉末或颗粒)形式提供活性成分，以在肠胃外施用重构的组合物之前用合适的媒介物(例如无菌无热原的水)进行重构。
药物组合物可以以无菌可注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或出售。此悬浮液或溶液可以根据已知技术进行配制，并且除了活性成分外，还可以包含其他成分，如本文所述的分散剂、湿润剂或悬浮剂。可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，如水或1,3-丁二醇，来制备这样的无菌注射制剂。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发性油，如合成的甘油单酯或甘油二酯。有用的其他可肠胃外施用的制剂包括那些以微晶形式，在脂质体制剂中，在微泡中包含用于超声释放的递送或作为可生物降解的聚合物体系的组分的活性成分。用于持续释放或植入的组合物可包含药学上可接受的聚合物或疏水物质如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
如本文所用，“额外成分”包括但不限于以下一种或多种：赋形剂；表面活性剂，包括替代肺表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；制粒和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理可降解的组合物如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散剂或湿润剂；乳化剂，缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合或疏水物质。可以包括在本发明的药物组合物中的其他“额外成分”是本领域已知的，并且例如在Genaro编,1985,Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA中描述。
方法：
本发明的另一方面的特征在于调节补体激活的方法。通常，所述方法包含使需要调节补体激活的培养基与本发明的坎普他汀类似物接触，其中所述接触导致调节所述培养基中的补体激活。培养基可以是需要调节补体激活的任何培养基。在某些实施方案中，培养基包括生物体的细胞或组织，包括(1)培养的细胞或组织，(2)受试者或患者体内的细胞或组织，以及(3)已从一个受试者体内移出并被替换到同一患者体内(例如，体外血液分流或自体移植)或转移给另一位患者的细胞或组织。结合后一实施方案，培养基可以进一步包含生物材料，如在体外分流期间接触细胞或组织的管道、过滤器或膜。或者，培养基可以包含植入受试者体内的生物材料。
在某些实施方案中，调节补体激活的方法适用于活着的患者或受试者，并且包含治疗患者与补体激活，特别是AP介导的补体激活有关的病理状况的方法的部分或全部，其可以放大补体效应子反应并加剧组织和细胞中的炎症损伤，不论补体激活的触发机制如何。许多这样的病理状况是本领域已知的(参见例如Holers,2008，同上)，包括但不限于非典型溶血尿毒症综合征(aHUS)；致密沉积病(DDD)；C3肾小球肾炎(C3GN)；C3肾小球病变；其他补体介导的肾病和肾小球炎性疾病；年龄相关性黄斑变性(AMD)；以黄斑变性、脉络膜新血管形成(CNV)、视网膜新血管形成(RNV)、增生性玻璃体视网膜病变、青光眼、葡萄膜炎、眼部炎症或以上任意组合为特征的任何眼病；阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)；冷凝集素病(CAD)；温抗体自身免疫性溶血性贫血(wAIHAs)；镰状细胞病；移植相关的血栓性微血管病；类风湿关节炎(RA)；系统性红斑狼疮(SLE)；若干自身免疫和自身炎性肾脏疾病；自身免疫性心肌炎；多发性硬化症；外伤性脑和脊髓损伤；脑、肠和肾缺血再灌注(IR)损伤；自发性和反复性流产；抗磷脂综合征(APS)；帕金森氏病；阿尔茨海默氏病；由异常突触重塑、过度小胶质细胞活性和认知能力下降支撑的其他神经退行性炎性疾病；哮喘；抗核细胞质抗原相关的弱免疫性血管炎(韦格纳综合征)；非狼疮性自身免疫性皮肤病，例如天疱疮、大疱性类天疱疮和大疱性表皮松解；创伤后休克；癌症；牙周炎；牙龈炎；和动脉粥样硬化。在具体实施方案中，病理状况与编码FH和/或CD46的基因中的突变和多态性有关，包括但不限于：AMD、aHUS和II型膜增生性肾小球肾炎(MPGN-II，也称为致密性沉积物疾病(DDD))。在其他实施方案中，本发明的坎普他汀类似物适合用作依库珠单抗的替代品，用于治疗目前已开处方或正在临床前和临床研究中开发药剂的那些疾病。那些疾病包括但不限于aHUS、PNH、C3G(DDD/C3GN)、CAD和AMD。
治疗方法通常包含(1)鉴定患有可通过调节补体激活来治疗的疾病或病况的受试者，(2)使用本领域技术人员能力范围内的技术标准技术，测量可通过调节补体激活治疗的疾病或病况的参数(例如，活检、组织学、MRI、骨扫描、X射线、疼痛耐受性、体态等)，(3)使用适合于所治疗病况的治疗方案和持续时间向受试者施用有效量的本发明的坎普他汀类似物，和(4)测量疾病或病况的参数以指示疾病或病况已得到改善或已得到治疗。坎普他汀或坎普他汀类似物的递送可以通过本领域已知的任何合适的施用途径进行，包括口服、经鼻(例如，通过鼻喷雾剂)、眼内(包括玻璃体内)、直肠、静脉内注射/输注、皮下注射/输注、肌内、牙周(例如，牙龈施用或乳头内浸润)、局部等。合适剂量和治疗方案的开发将取决于许多因素而变化，这些因素包括但不限于患者的类型和所治疗的疾病状态的类型，患者的年龄和施用途径。技术人员熟悉考虑了这些变量的剂量方案的设计。例如，对于本领域技术人员显而易见的是，与例如静脉内注射相比，由于该途径的生物利用度较低，因此口服施用本发明的坎普他汀类似物将需要较高的初始剂量。同样，肌内施用本发明的坎普他汀类似物比通过静脉内或玻璃体内注射递送相同类似物需要更高的剂量。合适的治疗有效剂量在本文其他地方更详细地描述。
在一个实施方案中，提供了一种治疗患有可通过调节补体激活而治疗的疾病或病况的个体，如人类患者或非人类灵长类动物的方法，其包括以下步骤：首先鉴别患有可通过调节补体激活而治疗的疾病或病况的个体，然后向所述个体施用治疗有效量的本发明的基于Cp40的类似物，其中施用途径是静脉内或皮下，并且其中基于Cp40的类似物的治疗有效量在约0.125mg/kg至约10mg/kg之间；优选地，所述量在约0.25mg/kg与约5mg/kg之间，或约0.5mg/kg与约5mg/kg之间，或约0.5mg/kg与约4mg/kg之间，或约0.5mg/kg与约3mg/kg之间，或约3mg/kg。在另一实施方案中，施用途径是肌内，并且基于Cp40的类似物的治疗有效量在约0.25mg/kg至约50mg/kg之间；优选地，所述量在约0.25mg/kg与约35mg/kg之间，或约0.25mg/kg与约30mg/kg之间，或约0.25mg/kg与约10mg/kg之间，或约0.25mg/kg与约5mg/kg之间，或约2.5mg/kg。在一些方面，施用途径是口服，并且基于Cp40的类似物的治疗有效量在约1mg/kg至约20mg/kg之间；优选地，所述量在约1mg/kg与约10mg/kg之间或约1mg/kg与约5mg/kg之间。在另一实施方案中，施用途径是玻璃体内，并且基于Cp40的类似物的治疗有效量在约1μg至约10mg之间；优选地，所述量在约1μg与约2,000μg或约1mg之间。其他合适的治疗有效剂量和施用途径在本文其他地方更详细地描述。在这些实施方案中，所述方法还包括一个或多个测量步骤，其包括使用本领域技术人员能力范围内的技术标准技术，测量可通过调节补体激活治疗的疾病或病况的至少一种参数(例如，活检、组织学、MRI、骨扫描、X射线、疼痛耐受性、体态等)，因而测量疾病或病况的参数可以用作疾病或病况已被治疗的指示，应理解，测量步骤可以在施用基于Cp40的类似物之前、期间和/或之后进行。
在另一实施方案中，提供了一种治疗患有可通过调节补体激活而治疗的疾病或病况的个体的方法，其包括向所述个体施用初始治疗有效量的本发明的基于Cp40的类似物，其中施用途径是静脉内或皮下，并且其中基于Cp40的类似物的初始治疗有效量是至少约0.125mg/kg至约10mg/kg；优选地，所述量在约0.5mg/kg至约3mg/kg之间。此治疗后面是向个体施用维持剂量的本发明的基于Cp40的类似物，其中施用途径是肌内，并且其中基于Cp40的类似物的维持剂量在约0.25mg/kg与约50mg/kg之间；优选地，它在约0.25mg/kg与约10mg/kg之间。或者，维持剂量口服施用，并且基于Cp40的类似物的维持剂量在约1mg/kg与约20mg/kg之间；优选地，它在约1mg/kg与约10mg/kg之间。施用维持剂量的其他途径也在本文其他地方描述。然后通过每2-3天一次至大约每1个月一次；优选每2周一次的多次递送来施用维持剂量。或者，初始治疗有效剂量是至少约2mg/kg，通过肌内途径施用。在这些实施方案中，所述方法还包括一个或多个测量步骤，其包括使用本领域技术人员能力范围内的技术标准技术，测量可通过调节补体激活治疗的疾病或病况的至少一种参数(例如，活检、组织学、MRI、骨扫描、X射线、疼痛耐受性、体态等)，因而测量疾病或病况的参数可以用作疾病或病况已被治疗的指示，应理解，测量步骤可以在施用基于Cp40的类似物之前、期间和/或之后进行。
本文还提供了产生针对坎普他汀类似物的抗体的新颖方法。所述方法通常包括对合适的动物例如大鼠、小鼠、猴子、兔子、山羊、猪或绵羊进行免疫接种以产生抗体。在一优选实施方案中，用坎普他汀类似物对兔子进行免疫接种；优选地，坎普他汀类似物是Cp40或基于Cp40的类似物(例如，Cp40-KK或Cp40-KKK)。在此类方面，在免疫接种之前，将坎普他汀类似物与合适的载体蛋白，如匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合。在其他实施方案中，坎普他汀类似物在还包含佐剂的混合物中与载体蛋白缀合；优选地，它是强佐剂。典型的佐剂包括无机化合物(例如，明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙)、矿物油、去污剂、植物皂苷、细胞因子(例如，IL-1、IL-2、IL-12)、嵌段共聚物和其组合。例如，在一个特定的实施方案中，在强佐剂的存在下，用缀合至KLH的Cp40或基于Cp40的类似物对兔子进行免疫接种。免疫接种剂量为约50μg至约500μg；优选地，剂量为约100μg。然后通过每2天至每4周注射向免疫接种的动物施用类似物-KLH-佐剂组合物；优选地，每周向动物注射。注射持续至少2周，例如2周、3周、4周、5周或更长时间。在一优选实施方案中，向免疫接种的动物注射4周类似物-KLH-佐剂组合物，持续5周。注射的剂量范围为10μg至约100μg；优选地，剂量为约50μg。然后通过本领域已知的任何合适的蛋白质纯化技术，例如亲和色谱法，从动物血清中纯化Cp40特异性抗体。通过本文所述的方法产生的Cp40和Cp40-赖氨酸抗体对Cp40或Cp40-赖氨酸肽具有高度特异性，如以下实施例7中进一步详细描述。因此，这些新颖的抗体不仅可以特异性地检测不同的坎普他汀类似物，而且可以进一步区分其未修饰的和赖氨酸修饰的形式。在一优选实施方案中，新抗体是单克隆抗体。
本文还提供了新颖且灵敏的方法，用于在生物流体中检测本文所述的基于Cp40的类似物，所述生物流体包括仅可从中回收最小体积的稀薄样品的那些，如玻璃体。这样的方法仅需要非常少量的生物流体。这些方法采用对含有感兴趣的基于Cp40的类似物的玻璃体样品或血浆样品进行的SPR分析。在一个实施方案中，提供了一种检测生物样品中基于Cp40的类似物的方法，其包括以下步骤：(1)提供含有基于Cp40的类似物分子的生物样品，其中这些类似物的至少一部分与C3/C3b/C3c结合；(2)提供CM5传感器芯片，多个Cp40或Cp40类似物分子共价连接至该所述CM5传感器芯片；(3)热灭活生物样品以从靶分子(即，C3/C3b/C3c)释放坎普他汀类似物；(4)将热灭活的样品与预定量的作为C3来源的人血浆C3混合；(5)将热灭活的样品与固定量的C3或人类血浆的混合物与CM5传感器芯片接触，从而从生物样品中与靶标结合的Cp40复合物释放的Cp40类似物分子将与固定在CM5传感器芯片上的Cp40分子/类似物竞争与C3或血浆来源的C3结合；和(6)通过与固定在CM5传感器芯片上的Cp40或其类似物结合来检测游离的C3。SPR信号与固定化的Cp40分子或其类似物结合的C3量成正比。因此，SPR信号的减少对应于游离C3与固定的Cp40结合的减少，并用作热灭活生物样品中存在的游离Cp40或Cp40类似物的量的量度。根据已知肽浓度的标准曲线对样品中未知Cp40类似物的量进行定量。在一优选实施方案中，共价连接至CM5传感器芯片的Cp40分子是生物样品中相同的基于Cp40的所关注类似物分子。例如，在具体的实施方案中，Cp40-KKK共价连接至CM5传感器芯片，并且如上文所述，将生物样品(例如玻璃体样品)首先热灭活，随后与校准C3来源混合并流经芯片以便竞争检测样品中从结合C3/C3b/C3c的Cp40-KKK复合物释放的肽。
提供以下实施例以更详细地描述本发明。它们旨在说明而非限制本发明。
实施例1.基于Cp40的类似物的设计.
Cp40
(DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asn-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-NH2)(SEQ ID NO:7)、Cp40-Lys-NH2(Cp40-K；SEQ ID NO:8)、Cp40-Lys-Lys-NH2(Cp40-KK；SEQ IDNO:9)和Cp40-Lys-Lys-Lys-NH2(Cp40-KKK；SEQ ID NO:10)在内部或由GL Biochem(中国上海)使用Fmoc-固相肽合成法合成，并根据本领域已知技术使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行纯化(参见例如Qu,H.等人,2011,Mol Immunol48:481-489；Qu,H.等人,2013,Immunobiology 218:496-505)。如图2所示，通过RP-HPLC和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在
Figure BDA0002764388340000641
MALDI micro MXTM(Waters Corporation,Milford,MA)上验证化合物的纯度。根据化合物的量，使用直径为4.6、10或19mm的XBridgeBEH C18柱(5μm粒度，150mm长度，Waters Corporation,Milford,MA)进行RP-HPLC，并在30分钟内分别用2、4.5或16ml/min的流速以0.1％TFA水溶液中的5-70％乙腈的梯度进行洗脱。
mPEG(3k)-、mPEG(2k)-、mPEG(1k)-和mPEG(1056)-Cp40的合成基于本领域已知的PEG化程序进行(U.S.8,962,553；Risitano等人,2014,Blood 123:2094-2101)。简而言之，将1eq的Cp40(5mg/ml)溶解在乙腈/水(1:1)中，并加入2eq的各自的激活的mPEG酯。使用N-甲基吗啉将反应混合物的pH调节至8。在室温下搅拌0.5-1小时后，通过添加0.1％TFA水溶液(pH 2)将反应混合物淬灭。如上所述通过RP-HPLC纯化所有肽，并通过MALDI-TOF MS表征(参见图2)。
为了制备mPEG(528)-Cp40，线性Cp40如前所述在树脂上合成(参见例如Qu,H.等人,2011,Mol Immunol 48:481-489；Qu,H.等人,2013,Immunobiology 218:496-505)。在使用在DMF中的20％哌啶对最终的N末端氨基酸Fmoc-DTyr(tBu)-OH进行Fmoc-脱保护之后，将在DMF中的3eq的mPEG(528)-NHS酯加入干燥的珠粒中。使用N-甲基吗啉将pH调节至8.0，并在旋转器上进行搅拌2小时。通过Kaiser测试确认反应完成。随后用DMF和DCM洗涤珠粒，并在真空下干燥。如Qu等人(同上)所述，使肽从树脂上切割。将冻干的线性脱保护的粗肽(1eq)溶解在80％甲醇水溶液中，并在剧烈搅拌下缓慢加入在甲醇中的20mM碘(13eq)。在室温搅拌30分钟后，通过添加20mM抗坏血酸水溶液淬灭环化反应。减压除去甲醇，并如上所述通过RP-HPLC纯化粗肽。然后通过MALDI-TOF MS表征肽(参见图2)。
如EP 2163558A3中所述，首先以TFA盐的形式获得所有肽，然后在HPLC柱上使用25mM乙酸铵水溶液将其进一步转化为乙酸盐。通过MALDI-TOF MS确认最终化合物的质量。测试用于体内实验的肽是否存在内毒素(<0.03EU/ml)。Cp40、Cp40-K、Cp40-KK和Cp40-KKK由GL Biochem(中国上海)使用Fmoc-固相肽合成法合成，并基于先前由Qu等人所述的程序使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行纯化。通过RP-HPLC和MALDI-TOF MS(图2)在
Figure BDA0002764388340000651
MALDI micro MXTM(Waters Corporation,Milford,MA)上验证化合物的纯度。根据化合物的量，使用直径为4.6、10或19mm的XBridge BEH C18柱(5μm粒度，150mm长度，Waters Corporation,Milford,MA)进行RP-HPLC，并在30分钟内分别用2、4.5或16ml/min的流速以0.1％TFA水溶液中的5-70％乙腈的梯度进行洗脱。
实施例2.基于Cp40的类似物的溶解度.
为了测试实施例1中设计的基于Cp40的类似物的溶解度，对于每种类似物，在LoBind Eppendorf管中称量5-10mg的肽，并与20μl的PBS(pH 7.4)混合。将混合物涡旋并以16,873x g离心2分钟。除非另有说明，否则如果各肽不溶解，则以10μl的份数添加PBS，然后涡旋并离心，直到所有沉淀物消失。在指示纸(WhatmanTM 2614-991，CF型，带比色图的宽范围pH试纸，pH范围4.5-10，尺寸6x80 mm)上确定肽溶液的pH。基于在NanoDropTM 2000c分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington,DE)上在280nm处测得的吸光度，使用等式c＝A/ε·b(c＝浓度，A＝吸光度，ε＝消光系数，b＝路径长度)，确定最终溶液的浓度。
虽然Cp40在水中的溶解度很高，但在生理pH下溶解度较低(在pH 7.4的PBS中为0.8mg/ml)(Qu等人,2013,Immunobiology218:496-505)。因此，为了产生具有改善的溶解度而不显著降低抑制活性或对C3的结合亲和性的Cp40，如实施例1中所述，在其N末端区域或其C末端区域修饰Cp40。
先前的报道表明，在NHP中在体内施用后，与未修饰的Cp40相比，在其C末端用40kDa PEG链修饰的Cp40与抑制活性的下降有关，而在其N末端用40kDa PEG链修饰的Cp40在血浆中的停留时间延长，但具有低100倍以上的结合亲和性(Risitano等人,2014,Blood123:2094-2101；参见图2和3)。在本研究中，Cp40的N末端通过酰胺偶联而偶联到1、2或3kDa的多分散PEG链上。产生的类似物称为mPEG(3k)-Cp40、mPEG(2k)-Cp40和mPEG(1k)-Cp40(图1)。PEG化大大提高了所得基于Cp40的类似物的溶解度，其中mPEG(3k)-Cp40在PBS中的溶解度最高，＞270mg/ml(pH＝7.0，表2)。
用多分散聚合物PEG化的化合物具有不明确定义的结构，因此难以表征(Veronese,2001,Biomaterials 22:405-417)。为了产生可以更好地表征的更好定义的结构，使用单分散的聚合物通过mPEG(1056)和mPEG(528)的激活的NHS酯对Cp40进行PEG化。使用预合成的Cp40进行多分散PEG和mPEG(1056)的PEG化反应，而单分散化合物mPEG(528)-Cp40的PEG化则在树脂上进行，省去了HPLC纯化的另一步骤。发现所得的单分散类似物mPEG(1056)-Cp40的溶解度特性与其多分散对应物的溶解度特性非常相似。相比之下，较小的PEG链(528Da)的连接导致溶解度显著下降，在PBS中的溶解度从约140mg/ml降至2.3mg/ml(表2)。
除了PEG化以外，还使用掺入亲水/带电荷残基作为增加Cp40溶解度的替代方法。为此，在肽合成期间，一个、两个或三个赖氨酸残基连接至Cp40的C末端。值得注意的是，化合物的溶解度随Lys残基数量的增加而增加，即Cp40-K(37mg/ml)的溶解度远小于Cp40-KK和Cp40-KKK(>245mg/ml)的溶解度(表2)。值得注意的是，尽管在277mg/ml Cp40-KK的PBS溶液中测得的pH为7-7.5，但是第三Lys残基的存在导致相应的Cp40-KKK溶液中的pH较高。仅在Cp40-KKK浓度为7mg/ml时观察到pH在7范围内(表2)。
表2.基于Cp40的类似物在PBS中的溶解度和pH.
Figure BDA0002764388340000671
*加入PBS后调节的pH。
**从H2O额外冻干后。
实施例3.基于Cp40的类似物的补体抑制效力和靶亲和性.
为了确定修饰的肽是否保留了Cp40的抑制活性和靶亲和性，在体外酶联免疫吸附测定法(ELISA)中评估了补体活性经典途径的抑制(参见例如Mallik,2005,Journal ofMedicinal Chemistry 48:274-286)。简而言之，基于C3b沉积，在存在或不存在Cp40及其类似物的情况下，检测正常人血浆中抗原-抗体复合物介导的补体激活。为此，在环境温度下，用50μl在PBS(pH 7.4)中的1％卵清蛋白包被微量滴定孔(NUNC)2小时。用200μl在PBS中的1％BSA封闭孔1小时，然后用50μl在PBS中的1:1000α-卵清蛋白多克隆抗体包被1小时。在每个步骤之间，将板用200μl含0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤三次；将30μl VBS(Vernonal缓冲液1X；5mM veronal，pH 7.4，含有150mM NaCl，0.5mM CaCl2和0.5mM MgCl2)放入96孔板的每一行的除第一孔之外的所有孔中，并制备了5μM在VBS中的肽溶液。对于所有肽，在来自Thermo Scientific的NanodropTM 2000c分光光度计上在280nm处使用12,615·M-1cm-1的消光系数测定肽浓度。在VBS中以1:40稀释的人血浆与0.005至2.5μM的肽温育15分钟。用PBS-T洗涤后，将50μl/孔的在1％BSA的PBS中的1:1000山羊α-人C3 HRP缀合抗体添加到孔中，并在室温下温育1小时。通过加入HRP底物(0.05％ABTS和0.1％的30％H2O2水溶液在0.1M柠檬酸钠中，pH 4.2)检测指示激活的补体固定，并在405nm读取。将在405nm处获得的吸光度数据转换为抑制百分比，考虑到100％等于在不存在肽的情况下补体激活。将在405nm处获得的吸光度数据转换为抑制％，考虑到100％等于在不存在肽的情况下的补体激活。将抑制百分比相对于浓度的对数作图，并使用GraphPad Prism 5(La Jolla,CA)将所得数据集拟合为方程式“log(抑制剂)vs.归一化响应”。从至少三个独立实验的平均值的拟合参数获得IC50值。Cp40始终用作内部对照。
基于先前描述的方案使用Biacore 3000仪器(GE Healthcare,PiscatawayTownship,NJ)通过SPR评估基于Cp40的类似物与C3b的结合亲和性和动力学特征(参见例如Qu等人,2011,Mol Immunol48:481-489；Qu等人,2013,Immunobiology 218:496-505；Magotti等人,2009,J Mol Recognit 22:495-505；Huang等人,2014,ChemMedChem9:2223-2226)。所有实验均在25℃下，使用0.01M HEPES，pH 7.4、0.15M NaCl，3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20(HBS-EP)作为运行缓冲液的条件下进行。纯化的人C3b(ComplementTechnology,Inc.,Tyler,TX)通过通过酰胺偶联以11,000-20,000共振单位(RU)的密度涂布在CM5传感器芯片(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上，方法与GE Healthcare胺偶联试剂盒提供的固定化程序相适应。未涂覆的流通池用作参考表面。依次各自以30μl/min的流速注入一系列五个浓度递增的每种Cp40(2.5、5、10、20、40nM)类似物的样品，每次2分钟，最终解离步骤为80分钟。在每个SPR实验中都包括Cp40作为内部对照。在至少三个独立的实验中筛选每种肽。使用Scrubber软件(BioLogic Software,Campbell,Australia)处理所有传感图。在BIAevaluation软件(GE Healthcare)中，将所得数据全局拟合为1:1Langmuir结合模型，以从方程KD＝kd/ka获得平衡解离常数(KD)。
如表3和图3所示，修饰的Cp40肽的抑制活性不受在N末端的PEG化或在C末端的Lys残基的添加显著影响。相比之下，单个肽与C3b的结合亲和性受Cp40修饰的影响(表3)。与Cp40(KD 0.5nM)相比，向Cp40的N末端添加最短的PEG链(mPEG(528)-Cp40)导致与C3b的结合亲和性下降了5倍，而增加PEG链的长度进一步降低了mPEG(3k)-Cp40的亲和性(KD7.9nM)(表3以及图4和5)。另一方面，Lys残基的连接对所得类似物与C3b的结合具有积极影响。尽管添加单个Lys残基不会显著影响结合，但添加两个或三个Lys残基分别导致与C3b的结合亲和性提高1.25和2.5倍(表3以及图4和5)。通常，各种类似物的缔合速率的变化((0.7-4)x 106M-1s-1))高于解离速率的变化((1.2-2.8)x 10-3s-1)。
表3.基于Cp40的类似物的抑制活性和C3b结合亲和性.*
Figure BDA0002764388340000691
ka，缔合常数
kd，解离常数
KD，平衡解离常数
*所有值均由至少三个独立实验的人计算得出。
实施例4.皮下施用后非人类灵长类动物血浆中基于Cp40的类似物的药代动力学分析.
方法.在NHP中体内测试了Cp40、mPEG(3k)-Cp40、Cp40-KK和Cp40-KKK，以评估PEG化和Lys缀合对其药代动力学曲线的影响。这些研究是在Simian Conservation Breedingand Research Center(SICONBREC),Inc.(Makati,Philippines)进行的。每种肽类似物(Cp40、Cp40-KK、Cp40-KKK、mPEG(3k)-Cp40)在两只6至7岁、体重约为4kg的健康雄性食蟹猴(猕猴(Macaca fascicularis))中进行了测试。在单次皮下注射中，每种肽以2mg/kg施用：将8mg净Cp40溶于2ml无菌盐水(Cp40，Cp40-KK)、0.5ml无菌盐水(mPEG(3k)-Cp40)或0.25ml100mM磷酸盐缓冲液(Cp40-KKK)中，并使用带有29GX1/2”针的3/10mL胰岛素安全性注射器皮下注射。在样品施用之前(0h)和之后的不同时间点(t＝5min、30min、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120h)收集血液样品到EDTA-真空采血管中，以防止凝血和补体激活。将所有血液样品以约800x g离心10分钟，立即将所得血浆样品冷冻并运送到宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)进行进一步分析。所有NHP研究均根据动物福利法律和法规进行。
为了分析血浆样品并确定血浆半衰期，首先进行了标准溶液和血浆样品的制备。制备校准曲线并分析血浆样品：将相应肽(Cp40、Cp40-KK、Cp40-KKK或mPEG(3k)-Cp40)的储备溶液加标至未经处理的NHP血浆中，最终浓度为1、2、4、8和16μM。使用Thermo Scientific的NanodropTM 2000c分光光度计在280nm处确定储备溶液的浓度。在进一步分析之前，将所有血浆样品用甲醇处理，以进行蛋白质沉淀，如下所示：将50μl待分析的NHP血浆在0.5mlLoBind Eppendorf管中与150μl含0.5μg/ml同位素标记的Cp40(DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asn-Trp-Sar-Ala-His-[13C6；15N4]Arg-Cys]-mIle-NH2，Bachem,Torrance,CA)的甲醇混合，所述同位素标记的Cp40用作内标(IS)。将混合物涡旋约8分钟，使其在室温下静置10分钟，然后以16,873x g离心20分钟。在注射小瓶(TruView LCMS认证的透明玻璃12x32mm螺纹颈总回收小瓶，Waters Corporation,Milford,MA)中，将上清液与20％甲醇在10mM甲酸铵水溶液(pH 3)中的溶液1:1混合。对于mPEG(3k)-Cp40样品，使用3％的MeCN水溶液代替甲酸铵溶液。
对于液相色谱法和质谱法，如上述处理血浆样品，并基于本领域中描述的程序，通过超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法(UPLC-ESI-MS)进行分析(参见Qu等人,2013,Immunobiology218:496-505；Primikyri等人,2017,J Chromatogr B Analyt TechnolBiomed Life Sci 1041-1042:19-26)。对该方法进行了稍微调整，以分析含有mPEG(3k)-Cp40的血浆样品。在此，在离子阱中施加了35V的固定碰撞能量。为了制备标准曲线，通过积分确定各个MS峰(三电荷Cp40和同位素标记的Cp40、四电荷Cp40-K(片段)、Cp40-KK和Cp40-KKK，以及mPEG(3k)-Cp40(-Sar-Ala-His-Arg-)的在436.256m/z下的单电荷片段)的曲线下面积(AUC)，并针对浓度作图。使用相应的标准曲线，从每个肽的相同质量峰的提取峰面积计算出每个时间点的血浆浓度。
为了确定血浆半衰期和其他药代动力学参数，如Qu等人(同上)和Primikyri等人(同上)中所述测定NHP血浆中肽的半衰期。根据药代动力学曲线手动确定最大浓度(cmax)和观察到最大浓度的时间(tmax)。使用以下公式计算0-120h的AUC(AUC0-t)、0-无限时间的AUC(AUC0-∞)、表观分布体积Vz/F(F＝生物利用度)和表观清除率CL/F：
Figure BDA0002764388340000713
AUC0-∞＝AUC0-t+AUCt-∞，
Figure BDA0002764388340000712
其中tn＝120h，kel＝消除率常数。用Phoenix 64WinNonlin Build8.0.0.3176软件使用非隔室方法计算各个药代动力学参数。血浆模型(血管外给药)与线性梯形线性插值一起使用。
使用N血清抗人类补体因子(C3c)测定试剂盒(Dade Behring,Marburg,Germany)，进行了免疫比浊法以测定NHP血浆中补体组分C3的水平。为了验证NHP血浆中C3定量的测定法，首先在人中然后在NHP血浆中测量C3浓度，以确定试剂盒中抗体的不同反应程度。为此，将NHP血浆的系列稀释液掺入已知浓度的食蟹猴纯化C3。将人和NHP血浆中测定的C3浓度相关联，得出NHP血浆中C3浓度的校正因子(CF)为1.2。通过比浊法测量NHP血浆中的C3浓度cC3*，并使用等式cC3＝cC3*·CF将其校正为最终浓度。使用所描述的测定法评估C3基线水平和实验过程期间的C3水平。
为了评估NHP和人血浆以及NHP总蛋白皮肤组织中Cp40-KK和Cp40-KKK的蛋白水解，将Cp40-KK或Cp40-KKK掺入NHP或人血浆中，终浓度为16μM。还将Cp40-KKK掺入NHP皮肤总蛋白(来自食蟹猴；Zyagen,San Diego,CA)中，终浓度为20μM。将样品在水浴中于37℃温育24小时，并在温育之前和温育期间的各个时间点和温育结束时取样。如上所述对样品进行蛋白质沉淀，并如上所述通过UPLC-ESI MS进行分析。
结果.将每种肽以单剂量(8mg；2mg/kg)皮下(sc)注射至两只猴子中，并在5天的时间内收集血液样品(t＝注射前，注射后5、30分钟，1、2、4、6、12、24、48、72、96、120小时，图6A)。如图3B和表4所示，两只猴子的Cp40的半衰期为41h和48h。相比之下，以单剂量sc注射方式向两只食蟹猴施用mPEG(3k)-Cp40的药代动力学曲线表明，达到了更高的最大mPEG(3k)-Cp40浓度，并且半衰期得以延长(t1/2分别为65h和53h)(图6C和表4)。
表4.根据s.c.施用后NHP血浆中Cp40、Cp40-KK、Cp40-KKK和mPEG(3k)-Cp40的药代动力学曲线计算出的药代动力学参数.
Figure BDA0002764388340000721
缩写：t1/2，半衰期；tmax，观察到最大浓度的时间；cmax，最大浓度；AUC，曲线下面积；Vz/F，表观分布体积(F＝生物利用度)；和CL/F，表观清除率。
*溶解于盐水中
**溶解于100mM磷酸盐缓冲液中。
另外，当施用mPEG(3k)-Cp40时，C3的水平在更长的时间内饱和(33-35h，而Cp40为4-5h)。在食蟹猴中单次s.c.注射mPEG(3k)-Cp40产生的药代动力学曲线与母体化合物Cp40施用所获得的相当，tmax为注射后2至6h(参见图6B，C)。尽管药代动力学曲线相似，但mPEG(3k)-Cp40的Cmax达到约10μM，比母体肽的Cmax几乎高2倍(图6C和表4)。此外，与Cp40获得的相应值相比，AUC0-120h(约592μM h)更高，t1/2(约59h)更长，且CL/F(约2610mL h-1kg-1)更慢(参见表4)。另外，靶蛋白C3饱和了更长的时间(约34h，而Cp40为约4.5h)(图6B，C，点线)。
图6D显示了在sc注射化合物的两只食蟹猴的血浆中Cp40-KK随时间的药代动力学曲线。Cp40-KK在两只动物的血浆中达到最高浓度(tmax＝1h)要比Cp40(tmax＝2h)快，并且达到了更高的浓度；然而，Cp40-KK的血浆浓度也比Cp40的血浆浓度下降更快(图6A和D以及表4)。Cp40在4-5小时内保持高于C3血浆水平，而Cp40-KK的血浆浓度在2.5-5小时后降至低于C3血浆水平。通常，肽浓度似乎取决于C3浓度。Cp40-KK的总体清除非常缓慢，在一只猴子中的半衰期为145h，在另一只猴子中的半衰期为276h。除了Cp40-KK，还在NHP血浆样品中检测到Cp40-K，从sc注射Cp40-KK后30分钟开始，这表明肽的末端Lys残基被酶促切割。然而，Cp40-K的水平随时间保持几乎不变(图7A和B)。由于Cp40-K是由Cp40-KK的Lys切割产生的，所以两种缀合物的浓度之和在图6中示出。
通过单剂量sc注射将Cp40-KKK施用于两只食蟹猴。代替盐水，使用磷酸盐缓冲液降低Cp40-KKK溶液的pH，使pH进入生理范围。单次s.c.注射Cp40-KKK产生的药代动力学曲线与Cp40和mPEG(3k)-Cp40相当。例如，Cp40-KKK肽的Cmax在注射后2至6h达到约13.5μM(图6E和表4)，AUC0-120h为约616μM h，CL/F为约2700mL h-1kg-1，t1/2为约44.3h。另外，在施用Cp40-KKK之后，C3的血浆水平保持饱和约40小时，这比未修饰的Cp40观察到的饱和期长约7倍(图6E)。这些数据表明，与母体Cp40化合物比较时，Cp40衍生物mPEG(3k)-Cp40和Cp40-KKK在s.c.注射后具有改善的药代动力学曲线。
与其他肽类似物相比，Cp40-KKK在NHP血浆中的定量证明更为繁琐。UPLC-ESI-MS分析显示血浆中的Cp40-KKK浓度低得可疑，在任何时间点，两只动物中的Cp40-KKK浓度均不超过2μM(图7C和D)。NHP血浆样品的BPI色谱图的叠加显示，注射Cp40-KKK后，随时间推移，在Cp40-KK(tR＝4.35min)和Cp40-K(tR＝4.65min)的保留时间处的峰增加；化合物本身的峰(tR＝4.10min)从一开始就很小。这些色谱图的实例在图8中示出。在与Cp40(tR＝4.92min)相同的保留时间出现的同位素标记的Cp40内标强度保持不变，表明在NHP血浆中从Cp40-KKK切割了一个或两个Lys残基，而不是三个。因此，测定了来自两只动物的所有血浆样品中的Cp40-KKK、Cp40-KK、Cp40-K和Cp40的浓度。
如图7C和D中所示，在任何血浆样品中均未检测到Cp40。发现Cp40-KKK的浓度最低，表明尽管在整个研究期间仍可检测到Cp40-KKK，但大多数化合物立即在血浆中切割形成Cp40-KK。与来自接受Cp40-KK的猴子的血浆样品相比，更大量的Cp40-KK被进一步切割为Cp40-K；在一只猴子中，在注射Cp40-KKK后4小时可检测到多达5μM的Cp40-K(图7D)。将Cp40-K、Cp40-KK和Cp40-KKK的量相加，以评估每个时间点在NHP血浆中肽的总浓度(图6E和图7)。Cp40-KKK的半衰期(两只猴子分别为42h和47h)与Cp40相当(表4)。但是，至少在一只动物中，与Cp40相比，Cp40-KKK的最大浓度更高，并且更晚地达到。另外，Cp40-KKK的水平保持在C3浓度之上的时间是Cp40的六到九倍。
在食蟹猴中多次s.c.注射后也可以观察到Cp40-KKK的切割(图9)。最有趣的是，随着时间的推移观察到了含有赖氨酸的衍生物水平的积累(图9)。这种“积累”现象是Cp40-KKK类似物所固有的，因为先前在多次s.c.注射母体Cp40化合物后未观察到(图10)。值得注意的是，即使将化合物以每8-12小时的频率在食蟹猴中给药，多次s.c.注射后观察到的Cp40的Cmax也不超过8-10μM(图10)。相反，多次s.c.给药后，观察到的相同剂量的Cp40-KKK的Cmax明显更高，达到或甚至超过20μM。另外，即使化合物通过s.c.途径以比Cp40更低频率的间隔(即每48小时)给药，Cp40-KKK类似物的血浆生物利用度也明显更高，这表明Cp40-KKK的独特结构可能赋予此化合物新的有益的药代动力学特性，有助于其延长的保留、提高的生物利用度以及持续的抑制活性。
实施例5.静脉施用后基于Cp40的类似物的药代动力学特性
进行体内药代动力学研究，其中对食蟹猴施用单次i.v.注射mPEG(1k)-Cp40、mPEG(3k)-Cp40、Cp40-KK或Cp40-KKK。表5和图11总结了Cp40类似物的药代动力学特征。
表5.i.v.注射后Cp40类似物的药代动力学特征.
Figure BDA0002764388340000751
i.v.注射研究表明，与Cp40-KK类似物(85.23μM h)相比，mPEG(1k)-Cp40\mPEG(3k)-Cp40和Cp40-KKK具有更高的AUC0-120h(304.4-312μM h)(参见表5和图11)。有趣的是，Cp40-KKK类似物显示出测试的Cp40类似物中最短的t1/2(参见表5)。
同时，虽然mPEG(1k)-Cp40、Cp40-KK具有相似的t1/2值，但相比之下，mPEG(3k)-Cp40的t1/2延长至少约30h(表5)。mPEG(3k)-Cp40的延长的t1/2指示了此类似物作为i.v.治疗全身补体介导的病况的疗法的发展潜力。
有趣的是，如实施例4所示，在s.c.注射的食蟹猴的血浆中，Cp40-KK或Cp40-KKK的肽切割片段的基于UPLC/ESI-MS的定量显示，Cp40-KK在体内被切割，产生最小量的Cp40-K，而Cp40-KKK类似物几乎完全代谢为Cp40-KK和少量Cp40-K(参见图7)。这些数据表明，s.c.注射后Cp40-KKK迅速切割成Cp40-KK，并表明NHP血浆中最大比例的活性化合物由Cp40-KK代谢物质代表。
类似地，在i.v.注射后，Cp40-KK也被代谢为最小量的Cp40-K(参见图12)。此外，在注射后12小时，大多数Cp40-KKK类似物也被代谢为Cp40-KK和少量的Cp40-K(参见图12)。因此，数据表明Cp40-KK是注射Cp40-KK或Cp40-KKK后保留在循环中的主要化合物。图18是在Cp40-KK和Cp40-KKK中的体内和体外Lys切割的总结。
实施例6.肌内施用后基于Cp40的类似物的药代动力学特性.
Cp40、Cp40-KK和Cp40-KKK的药代动力学特征在单次i.m.注射100mg化合物(相当于25mg/kg)后在体内进行了测试(图13)。值得注意的是，相对于i.v.或s.c.注射后观察到的特征，化合物在i.m注射后显示出不同的药代动力学特征，因此表明可以在新颖的给药方案中采用i.m.施用途径，以在某些补体介导的适应症中量身定制地递送这些化合物。最有趣的是，在单次i.m.注射这些类似物之后的t1/2是约8天(图13)。观察结果表明，在最初s.c.或i.v.注射所公开的Cp40类似物以饱和化合物的目标水平后，后续i.m.注射可以用作维持剂量(例如，每两周通过i.m.施用)。
实施例7.Cp40和Cp40赖氨酸类似物抗体的产生和特异性.
为了产生用于实施例8和9中所述的WES和SPR检测方法的针对坎普他汀类似物的抗体，在存在强佐剂(TiterMax Gold-100μl)的情况下，用与匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合的100μg Cp40或其他赖氨酸类似物对兔子(n＝2/类似物)进行免疫接种，随后每周注射50μgKLH-Cp40加佐剂，共5周。用直接ELISA监测抗体产生，将Cp40类似物(10μg/ml)涂布在96孔板上，然后用PBS/1％BSA封闭，并用连续稀释的免疫接种前和免疫接种后血浆温育。在与缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG温育，添加适当的生色底物并使用ELISA读板器测量405nm的吸光度后，开发了测定法。此免疫接种程序产生了抗Cp40和抗Lys类似物抗体(分别为AB101和AB102)，通过蛋白A亲和色谱法从兔血清中进一步纯化。ELISA和蛋白质印迹数据表明这些抗体是高度特异性的，因为它们仅与含有用作免疫原的相同肽的生物样品(血浆，玻璃体)反应(关于ELISA，参见图14)。AB102抗体对CP40-K、CP40-KK、CP40-KKK具有相同的特异性。AB101的抗原表位需要Cp40的C末端mIle，AB102的抗原表位需要C末端赖氨酸残基。因此，这些特征对于检测CP40及其类似物是独特的。
实施例8.基于Cp40的类似物在非人类灵长类动物玻璃体内的停留时间.
为了测定mPEG(3k)-Cp40、mPEG(1k)-Cp40、Cp40-KK和Cp40-KKK在猕猴玻璃体中的停留时间，在诱导轻度氯胺酮麻醉(10-15mg/kg，通过肌内注射(i.m.))，并用托吡卡胺/苯福林眼药水扩大瞳孔后，将这些基于Cp40的类似物玻璃体内(i.v.t.)施用于动物(研究设计见表6)。
表6.玻璃体内施用和检测基于Cp40的类似物的研究设计.
Figure BDA0002764388340000771
Figure BDA0002764388340000781
对于i.v.t.注射，用氯胺酮(15-25mg/kg，i.m.)和甲苯噻嗪(2mg/kg，i.m.)的组合麻醉食蟹猴，并用聚维酮-碘溶液清洁眼睛。在将盐酸奥布卡因溶液(
Figure BDA0002764388340000782
眼药溶液0.4％)作为局部麻醉剂应用至角膜后，将基于Cp40的类似物通过i.v.t.注射向动物施用，施用至每只动物的右眼(G1，G3)或左眼(G2，G4)。每次注射后立即施用单次局部剂量的0.5％左氧氟沙星。在i.v.t.注射mPEG(3k)-Cp40、mPEG(1k)-Cp40、Cp40-KK和Cp40-KKK之后，在第14、28、42(G1，G2，G3，G4)、56、73、90(G1，G2)天从基于Cp40的类似物处理的眼睛中取出玻璃体液样品(各约50μL)(执行三次或六次)。将样品收集在冰上，并保存在深度冷冻器(-79.3至-68.5℃)中，直至进一步分析。在第73和90天，从G1和G2取出约100μL玻璃体液。使用简单的蛋白质印迹技术(WES，ProteinSimple,San Jose,CA)或基于表面等离子体共振(SPR)实时测量Cp40-KKK固定化芯片上的结合动力学来确定基于Cp40的类似物的存在和浓度(参见下面的详细方法)。无论选择哪种定量方法，在玻璃体内停留时间和测试化合物的浓度水平方面都可获得相似的结果。
为了量化i.v.t.注射后不同时间点收集的玻璃体样品中所有测试化合物的水平(参见图15)，根据制造商的说明，使用2至40kDa的分离模块和抗兔检测模块，在WES仪器(ProteinSimple,San Jose,CA)上进行WES分析。简而言之，将未稀释的眼玻璃体样品与Fluorescent Master Mix混合，并在95℃加热5分钟。将样品、封闭剂、第一抗体(内部开发的抗Cp40抗体；在封闭剂中1:1000)、结合HRP的第二抗体(抗兔IgG)和化学发光底物移入板中(分离模块的一部分)。使用的仪器设置为：在375V下堆叠和分离27分钟；封闭剂30分钟，第一抗体和第二抗体两者均30分钟；鲁米诺/过氧化物化学发光检测约15分钟(5、15、30、60、120、240和480秒的暴露)。使用Compass软件(ProteinSimple,San Jose,CA)评估所得的电泳图。以下标准用于将低肽信号与背景区分开：软件给出的峰值信噪比(S/N)必须≥10，并且峰高/基线比(由软件给出的峰高和基线值手动计算)必须等于或大于3。使用Compass软件(Compass Software Inc.,Atlanta,GA)，使用在兔玻璃体中掺入已知浓度(100-2,000nM)肽的五点标准曲线来计算玻璃体样品中的肽浓度。曲线显示R2大于0.98。图15中示出了使用WES系统产生的代表性标准曲线，以及在运行预定量的掺入兔玻璃体样品中的纯化肽后获得的条带。
为了证实所有测试化合物的基于WES的测量，开发了一种基于SPR的竞争测定法，用于检测生物样品中的Cp40和Cp40类似物。简而言之，将1/1000稀释的血浆样品用于添加或不添加Cp40或Cp40类似物的测试。样品在95℃加热5分钟。热处理后，将样品离心，并将上清液与固定浓度的C3或血浆混合，作为C3的来源，并流过CM5传感器芯片，相应的Cp40类似物已固定在所述芯片上(例如，共价连接)。然后测量响应并将其与标准曲线比较以进行定量。在图16中总结了基于SPR的方法的示意图。
在25℃下，使用Biacore 3000仪器(GE Healthcare,Piscataway Township,NJ)在相同的玻璃体样品上进行了基于SPR的新型竞争测定法。使用标准胺偶联反应以HBS-EP作为运行缓冲液，将Cp40-KKK共价连接到CM5传感器芯片上。简而言之，将芯片用NHS/EDC(1:1)激活7分钟，使用300μg/ml Cp40-KKK在5mM乙酸钠(pH 5.0)中以Cp40-KKK涂布6分钟，并用1M乙醇胺-HCl(pH 9.5)灭活10分钟。空流通池用作参考表面。为了消除实验期间的非特异性结合，将运行缓冲液更改为含有100mM NaCl、0.05％Tween 20、10mM EDTA和1mg/ml硫酸葡聚糖(500kDa)的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。全部以10μl/min的流速进行实验，其中注入2分钟的样品，然后再生传感器芯片的表面。随后注入0.5％SDS 1分钟和注入50mM甘氨酸缓冲液(pH9.5)30秒来再生表面。
图17示出了相关的基于Cp40的类似物的代表性标准曲线，其通过用兔玻璃体稀释预定浓度的肽，然后在95℃热灭活5分钟并在室温水浴中平衡10分钟而制备。将标准样品以14,000x g离心10分钟，并将上清液与正常人血浆混合。类似地，为了检测眼玻璃体中未知浓度的mPEG(3k)-Cp40、mPEG(1k)-Cp40、Cp40-KK和Cp40-KKK，将样品在运行缓冲液中稀释，然后进行热灭活、平衡和离心，如上所述。如上所述将样品上清液与稀释的人血浆混合并注射。数据处理使用Scrubber软件(BioLogic Software,Campbell,Australia)进行。
如图18所示，在单次0.5mg注射基于Cp40的类似物后14天，在从处理动物收集的玻璃体中检测到Cp40-KK、Cp40-KKK、PEG(1K)-Cp40、PEG(3K)-Cp40。应当指出，在注射后第14天检测到PEG(1K)-Cp40和PEG(3K)-Cp40化合物，但在随后的时间点未检测到(参见图18)，这表明PEG化化合物的玻璃体停留时间是至少14天，但比含赖氨酸的化合物(即，Cp40-KK和Cp40-KKK)显著更短。
在注射后第14、28、42、56、73和90天检测到Cp40-KK和Cp40-KKK肽(图18)。虽然NHP玻璃体中CP40-KK的浓度随时间降低，但从第42天至第73天，Cp40-KKK的浓度水平在73天的观察期内保持稳定(图18)。值得注意的是，Cp40-KKK在眼组织中的停留时间最长，因为即使在处理后第90天也能检测到。相反，Cp40-KK在玻璃体内的停留时间明显短于Cp40-KKK，因为在第90天不再检测到。应当指出的是，在直至第90天的整个观察期内，Cp40-KKK的玻璃体内浓度相对于玻璃体内腔室中靶C3的浓度达到并保持饱和水平(0-140nM；参见Loyet KM等人,2012,Invest Ophthalmol Vis Sci.53:6628-37)(参见图18，点线)。
虽然添加微型PEG部分或以带电荷亲水残基如赖氨酸延伸肽都是本领域已知的化学修饰，因为它们具有增加肽溶解度的能力，但Cp40-KK和Cp40-KKK在眼组织中的停留时间明显增加是非常令人惊讶的结果，并且以前没有报道。测试化合物(Cp40-KK和Cp40-KKK)的长时间眼部停留对其结构是独特的，虽然无意于受理论束缚，但可归因于利用在化合物的C末端存在串联Lys重复序列的组织特异性机制。以下观察结果进一步证明了这一点：虽然微型PEG化的Cp40表现出与Cp40-Lys(n)化合物相当的溶解度特征(参见表1)，但其眼部停留明显短于Cp40-KK或Cp40-KKK。此外，与Cp40-KK衍生物相比，向Cp40-KKK添加第三个Lys残基可带来意想不到的显著眼部停留增加，这不能仅通过考虑它们相似的溶解度特征来解释(参见表1)，而是指出了一种新的途径，以致即使与Cp40-KK类似物相比，Cp40-KKK仍可在玻璃体液中保留更长的时间。
值得注意的是，第14天在处理的食蟹猴的玻璃体中检测到的化合物量约占初始注射剂量的0.2％，这表明了双相的、由靶标驱动的消除曲线，因此超过靶标C3浓度的化合物会从眼睛中迅速清除，只有与其靶标紧密结合的化合物在组织中的保留时间更长。换句话说，用这些基于Cp40的类似物i.v.t.施用可以在低得多的剂量下(例如，甚至小于约10μg或甚至1-2μg)实现观察到的停留时间。相反，当i.v.t施用100μg Cp40时，一个月后未观察到任何化合物的检测，这表明与本文讨论的基于Cp40的类似物相比，Cp40的停留时间非常短。因此，与Cp40相比，除了增加的溶解度之外，所公开的基于Cp40的类似物还赋予停留时间有益的增加。
总之，以上数据表明，Cp40-KK的玻璃体内停留时间小于Cp40-KKK，并且Cp40-KKK的停留时间等于或超过i.v.t.后约3个月。这些发现对用于治疗眼病和其他临床病理学的慢性给药方案的设计具有重要意义，所述方案涉及补体激活失调。与上一代化合物类似物Cp40和APL-2相比，Cp40-KK和Cp40-KKK的长时间眼部停留将使新药给药方案的应用成为可能，所述方案的给药频率显著降低，患者负担更轻。
实施例9.含赖氨酸的基于Cp40的类似物在非人类灵长类动物玻璃体内的活性.
为了确认存在于NHP玻璃体中的化合物维持C3b结合活性(这是在所有补体途径中引发其抑制作用的前提)，进行了表面等离子体共振(SPR)结合实验。简而言之，对于阳性结合对照，将Cp40-KKK的系列稀释液(16、8、4和2nM)添加到兔玻璃体样品中，并流到固定有纯化的人C3b(Complement Technology Inc,Tyler,TX)的Biacore CM5芯片上(参见图19A)。接下来，在注射后第14天从注射Cp40-KKK的眼睛中收集玻璃体样品，并在95℃下进行5分钟的热灭活。如上所述，将热灭活的样品和非热灭活的样品两者都流到固定有纯化的人C3b的CM5芯片上(图19B)。
如图14A中所示，掺入兔玻璃体样品中的Cp40-KKK以剂量依赖性方式结合C3b。此外，在测试从注射有Cp40-KKK的眼睛收集的玻璃体样品时观察到C3b结合的信号(图19B)，表明存在于玻璃体中的Cp40-KKK维持其C3b结合活性。
值得注意的是，与由非热灭活的样品(图19B，右条)得到的信号相比，由热灭活的玻璃体样品(图19B，左条)获得的C3b结合信号更高(分别为10vs.2个相对单位)。由于热灭活步骤确保了化合物与其靶标的解离，因此在SPR分析中观察到的差异反应可能表明大部分化合物与玻璃体中的补体C3蛋白结合。此观察结果与Cp40及其衍生物(Cp40-KKK，Cp40-KK)与C3的高亲和性、紧密结合相一致，并且与NHP研究中先前报道的这些化合物的双相靶标驱动消除特征相符(参见Risitano等人,2014,Blood 123(13):2091-2101；Berger等人,2018,J Med Chem 61(14):6153-6162)。
上文所示结果的另一种解释是，玻璃体还含有与Cp40-KKK类似物相关联的其他不确定因素。为了研究未知的玻璃体因子是否影响含赖氨酸的化合物的补体抑制活性，使用玻璃体样品进行了补体激活测定。简而言之，在连续稀释的基于Cp40的类似物与兔玻璃体混合存在的情况下，将人血浆与OVA-抗-OVA免疫复合物一起温育。使用与HRP缀合的多克隆抗人C3抗体(MP Biomedicals,Solon,OH)，通过ELISA测定经典途径激活(C3b沉积)的水平(图20)。
如图20所示，在没有玻璃体的情况下，所有测试的化合物(Cp40，Cp40-1K，Cp40-KK，Cp40-KKK)以剂量依赖性方式(实线)显示出补体经典途径介导的抑制活性。值得注意的是，玻璃体样品似乎具有次要的补体抑制活性，因为玻璃体的存在似乎增强了所测试化合物的补体抑制活性(图20，虚线与实线比较)。因此，数据表明受试化合物(即Cp40及其含赖氨酸的衍生物)的活性不受玻璃体中可能在某种程度上与这些化合物结合的不确定因素的抑制。
总结：比较单个类似物通过不同施用途径的PK特性及其在治疗药物开发中的潜力.
实施例8中显示的数据表明，与其他测试化合物相比，Cp40-KKK和Cp40-KK化合物在眼玻璃体内的停留时间得到改善，同时维持了它们的结合活性，因此支持了将这些分子开发为眼部病况治疗剂的潜力。另外，从食蟹猴的皮下(s.c.)和静脉内(i.v.)研究获得的药代动力学数据表明，mPEG(1k)-Cp40、mPEG(3k)-Cp40、Cp40-KK和Cp40-KKK具有与其母体分子Cp40不同的药代动力学特性，并凭借这些药代动力学特性，具有开发为局部和全身性施用的治疗药物来调节临床病症中的补体活性的独特潜力(参见图6和11；表4)。
具体来说，s.c.施用Cp40-KKK化合物使C3血浆水平饱和约40小时，这比未修饰的Cp40所观察到的饱和期长约7倍(实施例4；图6E)。Cp40-KKK的长靶标饱和期及其增加的溶解度共同赋予了开发为适合于治疗全身性和/或慢性补体介导的病况的s.c.治疗药物的独特潜力。Cp40-KKK类似物的独特结构可能指示其延长的半衰期，并可能增强其在不同隔室(如眼玻璃体)中的生物分布，这是由于潜在的储库效应可以促进其在多次给药方案期间的积累并通过与其他未知的载体样或结合蛋白的潜在相互作用缓慢释放到靶组织中。此外，观察到在注射了Cp40-KKK的食蟹猴的血浆中检测到显著量的Cp40-K代谢物(图12)，而注射了CP40-KK的动物的血浆中几乎没有这种代谢物，表明Cp40-KK代谢物在循环中可能更稳定(例如，不太容易进一步蛋白水解降解)，并且在母体Cp40的C末端添加第三赖氨酸残基赋予了所得肽新的生物转化特性和新颖的药代动力学特性，共同增强了其血浆和玻璃体内的停留。因此，这些特征为Cp40-KKK类似物提供了更有利的药代动力学特征，其使得能够以较不频繁的给药间隔长期施用此类似物。图21示出了Cp40-KK和Cp40-KKK的体内和体外Lys切割的概述。
类似地，在NHP中i.v.注射后观察到mPEG(3k)-Cp40的延长的t1/2(实施例5；表5)，指出此类似物作为i.v.治疗全身补体介导的病况的治疗剂的发展潜力。此外，如实施例6所示，可以在新颖的给药方案中利用i.m.施用途径，以在补体介导的适应症中定制递送Cp40类似物。
本发明不限于在此描述和示例的实施方案，而是能够在所附权利要求书的范围内进行变化和修改。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学理事会（Trustees of the University of Pennsylvania）
<120> 具有增加的溶解度和改善的药代动力学特性的坎普他汀类似物
<130> 34092-158
<150> US 62/654,055
<151> 2018-04-06
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(12)
<400> 1
Ile Cys Val Val Gln Asp Trp Gly His His Arg Cys Thr
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
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<221> VARIANT
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 酰胺化(任选的)
<220>
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<222> (16)..(16)
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<220>
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<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化(任选的)
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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Xaa Xaa Cys Val Xaa Gln Asp Xaa Gly Xaa His Arg Cys Xaa
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
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<223> 乙酰化
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 酰胺化
<400> 4
Ile Cys Val Trp Gln Asp Trp Gly Ala His Arg Cys Ile
1 5 10
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa不存在或者是Tyr、D-Tyr或Sar。
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Ile、Gly或Ac-Trp。
<220>
<221> DISULFID
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<223> 任选的二硫键或硫醚键
<220>
<221> THIOETH
<222> (3)..(13)
<223> 任选的二硫键或硫醚键
<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa是Trp或Trp类似物。
<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa是Asp或Asn。
<220>
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<223> Xaa是Trp或Trp类似物。
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> N-甲基化(任选的)
<220>
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<223> Xaa是His、Ala、Phe或Trp。
<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa是Arg或Orn。
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile。
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 酰胺化(任选的)
<400> 5
Xaa Xaa Cys Val Xaa Gln Xaa Xaa Gly Xaa His Xaa Cys Xaa
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
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<223> 甲基化
<220>
<221> DISULFID
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 酰胺化
<400> 6
Gly Ile Cys Val Trp Gln Asp Trp Gly Ala His Arg Cys Ile
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是D-Tyr
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<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 酰胺化
<400> 7
Xaa Ile Cys Val Trp Gln Asp Trp Gly Ala His Arg Cys Ile
1 5 10
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是D-Tyr
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(13)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 酰胺化
<400> 8
Xaa Ile Cys Val Trp Gln Asp Trp Gly Ala His Arg Cys Ile Lys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是D-Tyr
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(13)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 9
Xaa Ile Cys Val Trp Gln Asp Trp Gly Ala His Arg Cys Ile Lys Lys
1 5 10 15
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是D-Tyr
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(13)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 酰胺化
<400> 10
Xaa Ile Cys Val Trp Gln Asp Trp Gly Ala His Arg Cys Ile Lys Lys
1 5 10 15
Lys

Claims (165)

1.一种化合物，其包含：
(a)包含具有由以下表示的氨基酸序列的坎普他汀或坎普他汀类似物的化合物：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7；和
(b)包含添加的末端组分的末端修饰，与同等条件下未修饰的坎普他汀肽相比，所述组分改善了(1)所述肽的C3、iC3b、C3b或C3c结合亲和性，(2)所述肽在生理pH下的溶解度，(3)所述肽的血浆稳定性和/或血浆停留时间，和/或(4)所述肽的玻璃体稳定性和/或玻璃体停留时间。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述添加的末端组分是添加的C末端组分。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述添加的末端组分是添加的N末端组分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述添加的末端组分包含一个或多个亲水/带电荷氨基酸残基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述添加的末端组分是两个或三个更多个亲水/带电荷氨基酸残基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中所述添加的末端组分是三个或更多个亲水/带电荷氨基酸残基。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的化合物，其中所述一个或多个亲水/带电荷氨基酸残基选自赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或其任何组合。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的化合物，其中所述一个或多个亲水/带电荷氨基酸残基是赖氨酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其包含具有由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的坎普他汀类似物。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其包含由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO:9表示。
12.根据权利要求10所述的化合物，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO:10表示。
13.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其进一步包含平均分子量为约3kDa或更小的聚合物。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中所述PEG连接至所述坎普他汀或坎普他汀类似物的N或C末端。
16.根据权利要求14或15所述的化合物，其中所述PEG是分子量为约0.5kDa至约3kDa的单分散PEG。
17.根据权利要求14或15所述的化合物，其中所述PEG是平均分子量为约0.5kDa至约3kDa的多分散PEG。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的化合物，其包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10，其中所述PEG连接至N末端。
19.一种化合物，其包含：
(a)具有以下氨基酸序列的坎普他汀肽：
Xaa1-Xaa2-Cys-Val-Xaa3-Gln-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-His-Xaa7-Cys-Xaa8，
其中Xaa5与Xaa6之间的Gly任选地被修饰以约束骨架构象；
其中：
Xaa1不存在或是Tyr、D-Tyr或Sar；
Xaa2是Ile、Gly或Ac-Trp；
Xaa3是Trp或Trp类似物，其中与Trp相比，所述Trp类似物具有增加的疏水性；
Xaa4是Asp或Asn；
Xaa5是Trp或包含对其吲哚环的化学修饰的Trp类似物，其中所述化学修饰增加了所述吲哚环的氢键电势；
Xaa6是His、Ala、Phe或Trp；
Xaa7是Arg或Orn；
Xaa8是Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile，其中所述Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile中任一个的羧基末端-OH任选地被-NH2替代；并且
所述肽通过Cys-Cys或硫醚键为环状；和
(b)包含添加的末端组分的末端修饰，与同等条件下未修饰的坎普他汀肽相比，所述组分改善了(1)所述肽的C3、iC3b、C3b或C3c结合亲和性，(2)所述肽在生理pH下的溶解度，和/或(3)所述肽的血浆稳定性和/或血浆停留时间；和/或(4)所述肽的玻璃体稳定性和/或玻璃体停留时间。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中：
Xaa5与Xaa6之间的Gly是N-甲基化的；
Xaa1是D-Tyr或Sar；
Xaa2是Ile；
Xaa3是Trp、1-甲基-Trp或1-甲酰基-Trp；
Xaa5是Trp；
Xaa6是Ala；并且
Xaa8是Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile，其中所述羧基末端-OH任选地被-NH2替代。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中：
Xaa1是D-Tyr；
Xaa2是Ile；
Xaa3是1-甲基-Trp；
Xaa4是Asp；
Xaa5是Trp；
Xaa6是Ala；
Xaa7是Arg；并且
Xaa8是N-甲基Ile，其中所述羧基末端-OH被-NH2替代。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的化合物，其中所述添加的末端组分是添加的C末端组分。
23.根据权利要求19至21中任一项所述的化合物，其中所述添加的末端组分是添加的N末端组分。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的化合物，其中所述添加的末端组分是一个或多个亲水/带电荷氨基酸残基。
25.根据权利要求19至23中任一项所述的化合物，其中所述添加的末端组分是两个或三个亲水/带电荷氨基酸残基。
26.根据权利要求19至23中任一项所述的化合物，其中所述添加的末端组分是三个或更多个亲水/带电荷氨基酸残基。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的化合物，其中所述亲水/带电荷氨基酸残基选自赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或其任何组合。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的化合物，其中所述一个或多个亲水/带电荷氨基酸残基是赖氨酸。
29.根据权利要求19至28中任一项所述的化合物，其进一步包含包括平均分子量为约3kDa或更小的聚合物的额外组分。
30.根据权利要求29所述的化合物，其中所述额外组分是聚乙二醇(PEG)。
31.根据权利要求30所述的化合物，其中所述PEG连接至所述坎普他汀类似物的N或C末端。
32.根据权利要求30或31所述的化合物，其中所述PEG是分子量为约0.5kDa至约3kDa的单分散PEG。
33.根据权利要求30或31所述的化合物，其中所述PEG是平均分子量为约0.5kDa至约3kDa的多分散PEG。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的化合物，其包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10，其中所述PEG共价连接至N末端。
35.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其被配制用于口服施用所述化合物。
37.根据权利要求35所述的药物组合物，其被配制用于局部施用所述化合物。
38.根据权利要求35所述的药物组合物，其被配制用于眼内施用所述化合物。
39.根据权利要求35或38所述的药物组合物，其被配制用于玻璃体内施用。
40.根据权利要求35所述的药物组合物，其被配制用于牙周施用所述化合物。
41.根据权利要求35或40所述的药物组合物，其被配制用于牙龈施用或乳头内浸润注射所述化合物。
42.根据权利要求35所述的药物组合物，其被配制用于肺部施用所述化合物。
43.根据权利要求35所述的药物组合物，其被配制用于皮下或肌内施用所述化合物。
44.根据权利要求35所述的药物组合物，其被配制用于静脉内施用所述化合物。
45.一种抑制补体激活的方法，其包含施用根据权利要求35至44中任一项所述的药物组合物。
46.一种化合物，其包含：
(a)具有由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10中任一个表示的氨基酸序列的坎普他汀或坎普他汀类似物；和
(b)平均分子量为约3kDa或更小的聚合物。
47.根据权利要求46所述的化合物，其中所述聚合物是平均分子量为约3kDa或更小的聚乙二醇(PEG)。
48.根据权利要求47所述的化合物，其中所述PEG连接至N或C末端。
49.根据权利要求47或48所述的化合物，其中所述PEG是分子量为约0.5kDa至约3kDa的单分散PEG。
50.根据权利要求47或48所述的化合物，其中所述PEG是平均分子量为约0.5kDa至约3kDa的多分散PEG。
51.一种药物组合物，其包含根据权利要求47至50中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
52.一种具有SEQ ID NO:9的序列的肽。
53.一种具有SEQ ID NO:10的序列的肽。
54.一种基本上由SEQ ID NO:9组成的肽。
55.一种基本上由SEQ ID NO:10组成的肽。
56.一种由SEQ ID NO:9组成的肽。
57.一种由SEQ ID NO:10组成的肽。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的肽，其被设置为包含用于所述肽的药学上可接受的载体的药物组合物。
59.一种治疗患有与补体激活相关的病理状况的个体的方法，所述方法包含以下步骤：
(1)提供患有与补体激活相关的病理状况的个体；
(2)向所述个体施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和根据权利要求1至34中任一项所述的化合物；和
(3)测量所述病理状况的一个或多个参数；
其中施用所述药物组合物导致补体的抑制，从而治疗所述患有与补体激活相关的病理状况的个体。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述与补体激活相关的病理状况选自非典型溶血尿毒症综合征(aHUS)；致密沉积病(DDD)；C3肾小球肾炎(C3GN)；C3肾小球病变；补体介导的肾病和肾小球炎性疾病；年龄相关性黄斑变性(AMD)；以黄斑变性、脉络膜新血管形成(CNV)、视网膜新血管形成(RNV)、增生性玻璃体视网膜病变、青光眼、葡萄膜炎、眼部炎症或以上任意组合为特征的眼病；阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)；冷凝集素病(CAD)；温抗体自身免疫性溶血性贫血(wAIHAs)；镰状细胞病；移植相关的血栓性微血管病；类风湿关节炎(RA)；系统性红斑狼疮(SLE)；自身免疫和自身炎性肾脏疾病；自身免疫性心肌炎；多发性硬化症；外伤性脑和脊髓损伤；脑、肠和肾缺血再灌注(IR)损伤；自发性和反复性流产；抗磷脂综合征(APS)；帕金森氏病；阿尔茨海默氏病；由异常突触重塑、小胶质细胞活性和认知能力下降支撑的神经退行性炎性疾病；哮喘；抗核细胞质抗原相关的弱免疫性血管炎(韦格纳综合征)；非狼疮性自身免疫性皮肤病，例如天疱疮、大疱性类天疱疮和大疱性表皮松解；创伤后休克；癌症；牙周炎；牙龈炎；和动脉粥样硬化。
61.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述化合物包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述化合物包含SEQ ID NO:10。
63.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述化合物进一步包含分子量为约1kDa至约3kDa的单分散PEG，其中所述单分散PEG共价连接至所述坎普他汀类似物的N末端。
64.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述化合物进一步包含分子量为约1kDa至约3kDa的多分散PEG，其中所述多分散PEG共价连接至所述坎普他汀类似物的N末端。
65.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约0.125mg/kg与约10mg/kg之间的治疗有效剂量静脉内或皮下施用。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与约5mg/kg之间。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.5mg/kg与约5mg/kg之间。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.5mg/kg与约4mg/kg之间。
69.根据权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量是约3mg/kg。
70.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约0.25mg/kg与约50mg/kg之间的治疗有效剂量肌内施用。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与约35mg/kg之间。
72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与约10mg/kg之间。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与约5mg/kg之间。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量是约2.5mg/kg。
75.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约1μg与约10mg之间的治疗有效剂量玻璃体内施用。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约1μg与约2,000μg之间。
77.根据权利要求75或76所述的方法，其中所述治疗有效剂量是约1mg。
78.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约1μg与约1,000μg之间的治疗有效剂量经牙周施用。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约10μg与约200μg之间。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约20μg与约100μg之间。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量是约25μg或约50μg。
82.根据权利要求78至81中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过乳头内浸润注射施用。
83.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约1mg与约20mg之间的治疗有效剂量口服施用。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约1mg与约10mg之间。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约1mg与约5mg之间。
86.根据权利要求59至85中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以单剂量施用。
87.根据权利要求59至85中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以每12小时一次至每3个月一次的规则间隔施用。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述药物组合物每2-3天施用一次。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述药物组合物每2周施用一次。
90.根据权利要求87所述的方法，其中所述药物组合物每3个月施用一次。
91.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约0.125mg/kg与约10mg/kg之间的第一治疗有效剂量静脉内或皮下施用于所述个体，并且其中所述药物组合物进一步被如下施用：(i)以约0.25mg/kg与约50mg/kg之间的第二治疗有效维持剂量肌内施用于所述个体；或(ii)以约1mg/kg与约20mg/kg之间的第二治疗有效维持剂量口服施用于所述个体。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量每2-3天施用于所述个体。
93.根据权利要求91所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量每2周施用于所述个体。
94.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述第一治疗有效剂量在约0.5mg/kg至约3mg/kg之间。
95.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量在约0.25mg/kg与约10mg/kg之间并且肌内施用。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量在约0.25mg/kg与约5mg/kg之间。
97.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量在约1mg/kg与约20mg/kg之间并且口服施用。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量在约1mg/kg与约5mg/kg之间。
99.根据权利要求59至98中任一项所述的方法，其中所述个体是非人类灵长类动物或人类。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述个体是人类。
101.一种抑制个体中补体激活的方法，所述方法包含以下步骤：
(1)提供个体；
(2)向所述个体施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和根据权利要求1至34中任一项所述的化合物；和
(3)测量所述个体中补体激活的一个或多个参数；
其中施用所述药物组合物导致补体激活的抑制。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述化合物包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
103.根据权利要求101所述的方法，其中所述化合物包含SEQ ID NO:10。
104.根据权利要求101所述的方法，其中所述化合物进一步包含分子量为约1kDa至约3kDa的单分散PEG，其中所述单分散PEG共价连接至所述坎普他汀类似物的N末端。
105.根据权利要求101所述的方法，其中所述化合物进一步包含分子量为约1kDa至约3kDa的多分散PEG，其中所述多分散PEG共价连接至所述坎普他汀类似物的N末端。
106.根据权利要求101至105中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约0.125mg/kg与约10mg/kg之间的治疗有效剂量静脉内或皮下施用。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与约5mg/kg之间。
108.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.5mg/kg与约4mg/kg之间。
109.根据权利要求106至108中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量是约3mg/kg。
110.根据权利要求101至105中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约0.25mg/kg与约50mg/kg之间的治疗有效剂量肌内施用。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与约35mg/kg之间。
112.根据权利要求110或111所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与约10mg/kg之间。
113.根据权利要求110至112中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约0.25mg/kg与约5mg/kg之间。
114.根据权利要求110至113中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量是约2.5mg/kg。
115.根据权利要求101至105中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约1μg与约10mg之间的治疗有效剂量玻璃体内施用。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约1μg与约2,000μg之间。
117.根据权利要求115或116所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约100μg与约1,500μg之间。
118.根据权利要求115至117中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量是约1mg。
119.根据权利要求101至105中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约1mg与约20mg之间的治疗有效剂量口服施用。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约1mg与约10mg之间。
121.根据权利要求119或120所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约1mg与约5mg之间。
122.根据权利要求101至105中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约1μg与约1,000μg之间的治疗有效剂量通过乳头内浸润注射施用。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约10μg与约200μg之间。
124.根据权利要求122或123所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约20μg与约100μg之间。
125.根据权利要求101至124中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以单剂量施用。
126.根据权利要求101至124中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以每12小时一次至每3个月一次的规则间隔施用。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述药物组合物每2-3天施用一次。
128.根据权利要求126所述的方法，其中所述药物组合物每2周施用一次。
129.根据权利要求126所述的方法，其中所述药物组合物每3个月施用一次。
130.根据权利要求101至105中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约0.125与约10mg/kg之间的第一治疗有效剂量静脉内或皮下施用于所述个体，并且其中所述药物组合物进一步被如下施用：(i)以约0.25mg/kg与约50mg/kg之间的第二治疗有效维持剂量肌内施用于所述个体；或(ii)以约1mg/kg与约20mg/kg之间的第二治疗有效维持剂量口服施用于所述个体。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量每2-3天施用于所述个体。
132.根据权利要求130所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量每2周施用于所述个体。
133.根据权利要求130至132中任一项所述的方法，其中所述第一治疗有效剂量在约0.5mg/kg与约3mg/kg之间。
134.根据权利要求130至133中任一项所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量在约0.25mg/kg与约10mg/kg之间并且肌内施用于所述个体。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述第二治疗有效维持剂量在约0.5mg/kg与约5mg/kg之间。
136.根据权利要求130至133中任一项所述的方法，其中所述第二治疗有效剂量在约1mg/kg与约20mg/kg之间并且口服施用于所述个体。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述第二治疗有效剂量在约1mg/kg与约10mg/kg之间。
138.根据权利要求136或137所述的方法，其中所述第二治疗有效剂量在约1mg/kg与约5mg/kg之间。
139.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过眼部植入物以约100μg与约50mg之间的治疗有效剂量施用。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约100μg与约10mg之间。
141.根据权利要求139或140所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约100μg与约5mg之间。
142.根据权利要求139至141中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量在约100μg与约500μg之间。
143.根据权利要求139至142中任一项所述的方法，其中所述眼部植入物在眼睛上或眼睛中维持至少约2天的时间。
144.根据权利要求139至143中任一项所述的方法，其中所述眼部植入物在眼睛上或眼睛中维持至少约1周的时间。
145.根据权利要求139至144中任一项所述的方法，其中所述眼部植入物在眼睛上或眼睛中维持至少约1个月的时间。
146.根据权利要求101至145中任一项所述的方法，其中所述个体是非人类灵长类动物或人类。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述个体是人类。
148.一种检测生物样品中坎普他汀类似物的方法，所述方法包含以下步骤：
(1)提供包含第一多个坎普他汀类似物分子的生物样品，其中至少一部分所述坎普他汀类似物分子与C3和/或其片段C3b、iC3b和C3c结合以产生多个与C3结合的坎普他汀类似物分子；
(2)对所述生物样品进行热灭活以产生热灭活的样品，其中坎普他汀分子与其靶C3分子解离；
(3)提供CM5传感器芯片，第二多个坎普他汀类似物分子共价连接至所述CM5传感器芯片；
(4)将所述热灭活的样品与预定量的C3/C3b/iC3b/C3c或人类血浆(作为C3的来源)混合，并且使所述混合物与所述CM5传感器芯片接触，由此所述生物样品中存在的放热的坎普他汀类似物分子与固定的坎普他汀类似物分子竞争结合C3；和
(5)使用所述CM5芯片上的坎普他汀类似物分子检测游离C3/C3b/iC3b/C3c的结合，由此结合的C3/C3b/iC3b/C3c的减少与所述热灭活的生物样品中坎普他汀类似物分子的存在成比例。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述检测包含表面等离子体共振。
150.根据权利要求148或149所述的方法，其中所述生物样品是从人类或非人类灵长类动物中提取的玻璃体样品或血浆样品。
151.根据权利要求148至150中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从人类或非人类灵长类动物中提取的玻璃体样品。
152.根据权利要求148至151中任一项所述的方法，其中所述第一多个坎普他汀类似物分子、所述第二多个坎普他汀类似物分子或所述第一多个坎普他汀类似物分子和所述第二多个坎普他汀类似物分子两者包含具有选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽，并且其中，如果所述氨基酸序列是SEQ ID NO:7，那么所述坎普他汀类似物分子进一步包含共价连接至所述坎普他汀类似物的N末端的分子量为约1kDa至约3kDa的PEG。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:10。
154.一种生成用于检测赖氨酸修饰的或未修饰的坎普他汀类似物的高度特异性抗体的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)用第一坎普他汀或坎普他汀类似物对第一哺乳动物进行免疫接种；
(b)用第二坎普他汀或坎普他汀类似物对第二哺乳动物进行免疫接种，其中所述第二坎普他汀或坎普他汀类似物具有与(a)中的第一坎普他汀或坎普他汀类似物相同的氨基酸序列，不同之处在于一个或多个赖氨酸残基连接至C末端；
(c)向所述第一哺乳动物注射所述第一坎普他汀或坎普他汀类似物，其中所述注射每至少两天进行，持续至少2周的时间，并且其中生成第一多个抗体；
(d)向所述第二哺乳动物注射所述第二坎普他汀或坎普他汀类似物，其中所述注射每至少两天进行，持续至少2周的时间，并且其中生成第二多个抗体；和
(e)纯化所述第一多个抗体和所述第二多个抗体；
其中所述第一多个抗体和所述第二多个抗体在组合使用时能够将所述第一坎普他汀或坎普他汀类似物的抗原与所述第二坎普他汀或坎普他汀类似物的抗原区分开。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述第一哺乳动物、所述第二哺乳动物或所述第一哺乳动物和所述第二哺乳动物两者选自大鼠、小鼠、猴子、兔子、山羊、猪和绵羊。
156.根据权利要求155所述的方法，其中所述第一哺乳动物、所述第二哺乳动物或所述第一哺乳动物和所述第二哺乳动物两者是兔子。
157.根据权利要求154至156中任一项所述的方法，其中(c)中的注射、(d)中的注射步骤或(c)中的注射步骤和(d)中的注射步骤两者每周进行，持续至少3周的时间。
158.根据权利要求157所述的方法，其中(c)中的注射、(d)中的注射步骤或(c)中的注射步骤和(d)中的注射步骤两者每周进行，持续至少5周的时间。
159.根据权利要求154至158中任一项所述的方法，其中免疫接种步骤(a)包含约50μg至约500μg范围内的第一剂量的所述第一坎普他汀或坎普他汀类似物。
160.根据权利要求154至158中任一项所述的方法，其中免疫接种步骤(b)包含约50μg至约500μg范围内的第二剂量的所述第二坎普他汀或坎普他汀类似物。
161.根据权利要求159或160所述的方法，其中所述第一剂量、所述第二剂量或所述第一剂量和所述第二剂量两者是约100μg。
162.根据权利要求154至161中任一项所述的方法，其中注射步骤(c)包含约10μg至约100μg范围内的第三剂量的所述第一坎普他汀或坎普他汀类似物。
163.根据权利要求154至161中任一项所述的方法，其中注射步骤(d)包含约10μg至约100μg范围内的第四剂量的所述第二坎普他汀或坎普他汀类似物。
164.根据权利要求162或163所述的方法，其中所述第三剂量、所述第四剂量或所述第三剂量和所述第四剂量两者是约50μg。
165.根据权利要求154至164中任一项所述的方法，其中所述第一多个抗体、所述第二多个抗体或所述第一多个抗体和所述第二多个抗体两者是单克隆抗体。
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