CN115873124A - Glp-1类似物的融合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及GLP‑1类似物的融合多肽。具体地，本发明涉及GLP‑1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP‑1类似物的融合多肽包含GLP‑1(7‑37)类似物、GLP‑1(7‑37)类似物的C‑末端延伸区段，和融合蛋白片段；进一步地本发明涉及包含所述GLP‑1类似物的融合多肽或其可药用盐的组合物、其制备方法以及用途。

Description

GLP-1类似物的融合多肽
技术领域
本发明属于多肽领域，具体地说，涉及GLP-1类似物的融合多肽。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由高血糖素原衍生出来的肽段，在人体摄入营养成分时候由内分泌细胞分泌出来。它具有刺激胰岛素基因的表达和胰岛素释放；抑制胰岛血糖素的释放；抑制食物摄取的欲望，有减肥功效；刺激β细胞的增值和分化；对β细胞的凋亡有保护作用。在治疗糖尿病领域具有广泛的应用。
存在两种GLP-1两种N末端截短的产物，GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)，其被发现识别胰腺受体，并且确定为体内的活性种类。天然GLP-1在糖尿病治疗上具有诸多缺点，例如，它在体内易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)快速降解。
目前已有多种GLP-1类似物上市，NovoNordis k开发了具有1.8mgs.c./天的每天一次给药的利拉鲁肽(Liraglutide)(美国专利号6,268,343)，并且于2010年批准，另外，GLP-1类似物索马鲁肽(Semaglutide)(国际公布号WO 2006/097537 A2)由USFDA批准。上述两种已上市的GLP-1类似物都有脂肪酸侧链，不易生产。
因此，目前仍然需要对GLP-1进行改进，以获得便于生产，并具有改善功能的GLP-1类似物。
发明内容
本发明涉及一种GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1类似物的融合多肽包含GLP-1(7-37)类似物、GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段，和融合蛋白片段。
在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白片段为融合蛋白的β折叠片段。
在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白片段具有30～80个氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白片段具有如下所示的氨基酸序列MATKAVSVLKGDGPVQGIIN FEQKESNGPVKVWGSIKGLT EG(SEQ ID NO：2)，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在本发明的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物基本上保留了天然GLP-1(7-37)的功能，优选地，所述天然GLP-1(7-37)包含如下所示的氨基酸序列，或由其组成：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO：1)。
在本发明所述的GLP-1类似物的融合多肽的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物在对应于天然GLP-1(7-37)的第7至第37位的任一氨基酸被第一半胱氨酸取代，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段中包含第二半胱氨酸，并且所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸形成二硫键，优选地，所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸形成分子内二硫键。
在本发明所述的GLP-1类似物的融合多肽的一个实施方案中，所述所述第一半胱氨酸与所述第二半胱氨酸间隔至多为40个氨基酸长度，优选地，间隔35至3个氨基酸，更优选地，间隔30至5个氨基酸，更优选地，间隔35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个氨基酸，或间隔上述两点间的任一范围。
在根据本发明所述的GLP-1类似物的融合多肽的一个实施方案中，所述GLP-1类似物与SEQ ID NO：1所示的天然GLP-1(7-37)相比，还包含至多10个、9个、8个7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个保守氨基酸修饰，任选地，所述保守氨基酸修饰包括氨基酸的取代、缺失和/或添加，而不改变GLP-1(7-37)的活性或功能。任选地，所述保守氨基酸修饰可以为本领域技术人员公知的任何不改变GLP-1(7-37)的活性或功能氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在本发明所述的GLP-1类似物的融合多肽的进一步的实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段为包含1-15个氨基酸的肽段。
在本发明所述的GLP-1类似物的融合多肽的进一步的实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸组成的肽段，其中一个氨基酸为半胱氨酸，其余为除半胱氨酸以外的任意氨基酸。
在本发明所述的GLP-1类似物的融合多肽的进一步的实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段的一个氨基酸为半胱氨酸，其余为甘氨酸或精氨酸。
在本发明所述的GLP-1类似物的融合多肽的进一步的实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段选自C、GCGR、或GCGGGGGG。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1类似物的融合多肽从N-末端至C-末端具有式(I)所示的结构:
X-E-Y (I)
其中，所述X为GLP-1(7-37)类似物，所述E为GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段，所述Y为融合蛋白片段。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物基本上保留了天然GLP-1(7-37)的功能，优选地，所述天然GLP-1(7-37)包含如下所示的氨基酸序列，或由其组成：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ IDNO：1)。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物在对应于天然GLP-1(7-37)的第7至第37位的任一氨基酸被第一半胱氨酸取代，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段中包含第二半胱氨酸，并且所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸形成二硫键，优选地，所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸形成分子内二硫键。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述所述第一半胱氨酸与所述第二半胱氨酸间隔至多为40个氨基酸长度，优选地，间隔35至3个氨基酸，更优选地，间隔30至5个氨基酸，更优选地，间隔35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个氨基酸，或间隔上述两点间的任一范围。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1类似物与SEQ ID NO：1所示的天然GLP-1(7-37)相比，还包含至多10个、9个、8个7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个保守氨基酸修饰。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段为包含1-15个氨基酸的肽段。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸组成的肽段，其中一个氨基酸为半胱氨酸，其余为除半胱氨酸以外的任意氨基酸。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段的一个氨基酸为半胱氨酸，其余为甘氨酸或精氨酸。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段选自C、GCGR、或GCGGGGGG。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述融合蛋白片段选自融合蛋白的β折叠片段。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述融合蛋白片段如SEQ ID NO：2所示，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在如式(I)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，本发明的融合蛋白片段如下所示：
MATKAVSVLKGDGPVQGIIN FEQKESNGPVKVWGSIKGLT EG(SEQ ID NO：2)，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1类似物的融合多肽从N-末端至C-末端具有式(II)所示的结构:
Y-L’-X-E (II)
其中，所述Y为融合蛋白片段，所述L’为接头或不存在，所述X为GLP-1(7-37)类似物，所述E为GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，当L’为接头时，其为长度为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的任意氨基酸组成的肽接头，优选地，L’为包含精氨酸的接头。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物基本上保留了天然GLP-1(7-37)的功能，优选地，所述天然GLP-1(7-37)包含如下所示的氨基酸序列，或由其组成：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ IDNO：1)。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物在对应于天然GLP-1(7-37)的第7至第37位的任一氨基酸被第一半胱氨酸取代，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段中包含第二半胱氨酸，并且所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸形成二硫键，优选地，所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸形成分子内二硫键。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述所述第一半胱氨酸与所述第二半胱氨酸间隔至多为40个氨基酸长度，优选地，间隔35至3个氨基酸，更优选地，间隔30至5个氨基酸，更优选地，间隔35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个氨基酸，或间隔上述两点间的任一范围。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1类似物与SEQ ID NO：1所示的天然GLP-1(7-37)相比，还包含至多10个、9个、8个7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个保守氨基酸修饰。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段为包含1-15个氨基酸的肽段。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸组成的肽段，其中一个氨基酸为半胱氨酸，其余为除半胱氨酸以外的任意氨基酸。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段的一个氨基酸为半胱氨酸，其余为甘氨酸或精氨酸。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段选自C、GCGR、或GCGGGGGG。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述融合蛋白片段选自融合蛋白的β折叠片段。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，所述融合蛋白片段如SEQ ID NO：2所示，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在如式(II)所示的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐的一个实施方案中，本发明的融合蛋白片段如下所示：
MATKAVSVLKGDGPVQGIIN FEQKESNGPVKVWGSIKGLT EG(SEQ ID NO：2)。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种GLP-1类似物的融合多肽，其具有SEQ ID NO：3-5中任一项所示的氨基酸序列。
G1：
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLCKGR GGCGGGGGGM ATKAVSVLKG DGPVQGIINFEQKESNGPVK VWGSIKGLTE G (SEQ ID NO：3)；
G2：
MATKAVSVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT EGKHAEGTFT SDVSSYLEGQAAKEFIAWLC KGRGGCGR (SEQ ID NO：4)；
G4：
HAEGTFTSDV SCYLEGQAAK EFIAWLVKGR GCMATKAVSV LKGDGPVQGI INFEQKESNGPVKVWGSIKG LTEG (SEQ ID NO：5)。
另一方面，本发明提供了编码本发明的GLP-1类似物的融合多肽的核苷酸序列。
又一方面，本发明提供了载体，其包含编码本发明的GLP-1类似物的融合多肽的核苷酸序列。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明所述的的GLP-1类似物的融合多肽和药学可接受的载体或赋形剂。
另一方面，本发明提供了根据本发明的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，以及包含其的组合物在制备用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病或肥胖症的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了治疗非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病或肥胖症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，以及包含其的组合物。
术语
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
如本文所用的术语“GLP-1(7-37)类似物”指的是基本上保留GLP-1(7-37)活性或功能的多肽，其与天然存在的GLP-1(7-37)(如SEQ ID NO：1)相比，具有至多10个、9个、8个7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸的保守修饰，包括氨基酸的取代、缺失和/或添加，所述“保守修饰”是指用具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得不改变GLP-1(7-37)的活性或功能。
如本文所用，术语“基本上保留了天然GLP-1(7-37)的功能”，指的是本领域技术人员通过常规技术手段，能够确定本文所述的GLP-1(7-37)类似物与天然GLP-1(7-37)相比，功能和/或降低和/或减少不超过50％，优选地，不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过19％、不超过18％、不超过17％、不超过16％、不超过15％、不超过14％、不超过13％、不超过12％、不超过11％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％。
如本文所用的术语“可药用盐”，是指GLP-1类似物的融合多肽的盐形式。可以通过常规化学方法，例如在Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use，P.Heinrich Stahl(编)、Camille G.Wermuth(编)ISBN：3-90639-026-8精装388页，2002年8月中描述的方法，从含有碱性或酸性部分的母体化合物来合成本发明的盐。通常，可以通过水中、或在有机溶剂中、或在两者的混合物中，使这些化合物的游离酸或碱形式与适当的碱或酸进行反应，来制备这些盐。
能够与多种无机和有机酸形成酸加成盐(单盐或二盐)。酸加成盐的示例包括与选自以下的酸形成的单盐或二盐：乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙基磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(甲磺酸盐)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸和乳糖酸。一种具体的盐是盐酸盐。另一种具体的盐是乙酸盐。
如果化合物是阴离子化合物，或具有可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO-)，则可以与有机或无机碱形成盐，产生合适的阳离子。合适的无机阳离子的示例包括但不限于碱金属离子，如Li+、Na+和K+；碱土金属阳离子，如Ca2+和Mg2+；和其他阳离子。如Al3+或Zn+。合适的有机阳离子的示例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的取代铵离子的示例是衍生自以下的那些：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的示例是N(CH3)4 +。
术语“融合蛋白的β折叠片段”是指融合蛋白的具有β折叠结构的片段。
术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”与术语”多肽”可互换使用，并且也指氨基酸的聚合链。术语“多肽”涵盖天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白氨基酸序列的多肽类似物。除非上下文矛盾，否则术语“多肽”涵盖其片段和变体(包括变体的片段)。
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是如下的蛋白或多肽：根据其衍生的起源或来源，其与在其天然状态下伴随的天然相关组分分离、基本上不含来自同一物种的其他蛋白、由来自不同物种的细胞表达、或者在自然界中不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源的细胞的细胞系统中合成的多肽是从其天然相关组分中“分离的”。还可以使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，通过分离使由一条或多条多肽链组成的蛋白基本上不含天然相关组分。
术语“回收”是指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使化学物质例如多肽基本上不含天然相关组分的过程。
术语“分离的核酸”是指多核苷酸(例如，基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸，或其某种组合)，其通过人为干预从与其一起天然存在的全部或部分多核苷酸分离、与不是天然连接的多核苷酸可操作地连接、或不会作为天然中较大序列的一部分存在。
如本文所用术语多肽的序列“同一性”是指两个蛋白或多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同氨基酸残基占据时，例如如果两个多肽的一个位置都被同一个氨基酸残基占据时，那么所述分子在该位置是一致的。适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法。
如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指已将外源DNA引入其中的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含两个或更多个(例如，多个)编码抗体或结合蛋白的核酸，例如美国专利号7,262,028中描述的宿主细胞。此类术语不仅旨在指特定的受试细胞，而且还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括原核和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。一种特别有用的原核宿主细胞是大肠杆菌及其衍生物。特别有用的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO、HEK293、COS、NS0、SP2和PER.C6。HEK 293E细胞在用于重组蛋白的瞬时表达系统中作为哺乳动物宿主细胞特别有用。CHO细胞特别用作稳定转染的哺乳动物宿主细胞，以产生重组蛋白。特别有用的昆虫细胞系是Sf9细胞系及其衍生物。特别有用的真菌宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及其衍生物。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、细胞培养、组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染、转化)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述的进行。前述技术和步骤通常可以根据本领域公知的常规方法来执行，并且如本说明书通篇所引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。
附图说明
图1显示ELISA预实验中蛋白浓度和A450呈线性关系；
图2A至图2D显示ELISA检测的本发明GLP-1类似物的融合多肽的亲和力拟合曲线；
图3显示DPP-4的酶降解作用。
具体实施方式
为了更详细的说明本发明，本说明书提供了下列具体实施方案，但本发明的方案并非仅限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
本发明涉及了以下GLP-1类似物的融合多肽，其分别具有如下氨基酸序列：
G1：
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLCKGR GGCGGGGGGM ATKAVSVLKG DGPVQGIINFEQKESNGPVK VWGSIKGLTE G(SEQ ID NO：3)；
G2：
MATKAVSVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT EGKHAEGTFT SDVSSYLEGQAAKEFIAWLC KGRGGCGR(SEQ ID NO：4)；
G4：
HAEGTFTSDV SCYLEGQAAK EFIAWLVKGR GCMATKAVSV LKGDGPVQGI INFEQKESNGPVKVWGSIKG LTEG(SEQ ID NO：5)。
并且，上述G1、G2和G4多肽各自包含由其中的两个半胱氨酸形成的链内二硫键。
实施例1 GLP-1类似物的融合多肽的制备
G1的制备：
G1的氨基酸序列：
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLCKGR GGCGGGGGGM ATKAVSVLKG DGPVQGIINFEQKESNGPVK VWGSIKGLTE G (SEQ ID NO：3)；
采用固相合成法按照G1的氨基酸顺序连接氨基酸，脱除保护基和树脂，得到GLP-1类似物融合多肽的中间体粗品，用水或10～20％的乙腈溶解，采用反相C8-HPLC纯化，使用乙腈-水-三氟乙酸分离纯化，浓缩，冻干，得到GLP-1类似物融合多肽中间体的纯品，用水或10～20％的乙腈溶解，用碳酸氢铵或DMSO氧化形成二硫键，纯化，得到GLP-1类似物的融合多肽，MS测定分子量为8212.4Da，符合预期的G1蛋白的分子量。
G2的制备：
G2氨基酸序列：
MATKAVSVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT EGKHAEGTFT SDVSSYLEGQAAKEFIAWLC KGRGGCGR (SEQ ID NO：4)；
采用固相合成法按照G2的氨基酸顺序连接氨基酸，脱除保护基和树脂，得到GLP-1类似物的融合多肽的中间体粗品，用水或10～20％的乙腈溶解，采用反相C8-HPLC纯化,使用乙腈-水-三氟乙酸分离纯化，浓缩，冻干，得到GLP-1类似物的融合多肽的中间体纯品，用水或10～20％的乙腈溶解，用碳酸氢铵或DMSO氧化形成二硫键，纯化，得GLP-1类似物的融合多肽，MS测定分子量为8210.4Da，符合预期的G2蛋白的分子量。
G4的制备：
G4氨基酸序列：
HAEGTFTSDV SCYLEGQAAK EFIAWLVKGR GCMATKAVSV LKGDGPVQGI INFEQKESNGPVKVWGSIKG LTEG (SEQ ID NO：5)。
采用固相合成法按照G4的氨基酸顺序连接氨基酸，脱除保护基和树脂，得到GLP-1类似物的融合多肽的中间体粗品，用水或10～20％的乙腈溶解，采用反相C8-HPLC纯化,使用乙腈-水-三氟乙酸分离纯化，浓缩，冻干，得到GLP-1类似物的融合多肽的中间体纯品，用水或10～20％的乙腈溶解，用碳酸氢铵或DMSO氧化形成二硫键，纯化，得到GLP-1类似物的融合多肽，MS测定分子量为7828.2Da，符合预期的G4蛋白的分子量。
实施例2 GLP-1类似物的融合多肽与GLP-1受体亲和力实验
1)实验目的
GLP-1类药物对糖尿病的治疗效果是基于GLP-1与GLP-1受体结合后，启动G蛋白偶联信号通路，促使胰岛β细胞分泌胰岛素，因此制备的GLP-1类似物的融合多肽与GLP-1受体的结合能力与天然GLP-1蛋白相当。通过酶联免疫吸附试验，测定本发明制备的GLP-1类似物的融合多肽与INS胰岛素细胞上的GLP-1受体结合的亲和力，并与人GLP-1蛋白与INS胰岛素细胞上的GLP-1受体结合的亲和力进行对比，确认本发明的GLP-1类似物的融合多肽在蛋白质序列及空间结构上的改变是否会影响其与细胞表面GLP-1受体的结合能力。
2)受试物
G1:
溶剂：磷酸缓冲盐溶液(PBS)
A280：4.68
折算蛋白质浓度：3.05mg/ml
折算摩尔浓度：0.387mmol/L
G2:
溶剂：磷酸缓冲盐溶液(PBS)
A280：6.18
折算蛋白质浓度：3.95mg/ml
折算摩尔浓度：0.502mmol/L
G4:
溶剂：磷酸缓冲盐溶液(PBS)
A280：0.78
折算蛋白质浓度：0.48mg/ml
折算摩尔浓度：0.061mmol/L
阳性对照
人GLP-1(7-36)
生产商：中肽生化有限公司，货号：GLUC-010A，规格：1mg/瓶
3)试剂
人GLP1(7-36)ELISA试剂盒：
生产商：Abcam公司，产品货号：ab184857。
大鼠胰岛素瘤细胞：
生产商：上海复祥生物科技有限公司，产品货号：INS-1。
4)实验方法
4.1 ELISA反应底物的制备
将INS-1大鼠胰岛素瘤细胞在37℃培养箱中培养至超过80％的汇合度后，进行传代培养。将传代后的INS-1大鼠胰岛素瘤细胞加入96孔板中，每孔加入的细胞体积为100ul，在96孔板培养至细胞贴壁。用PBS缓冲液轻轻冲洗96孔板，冲洗三次，去除未贴壁的细胞。在每孔中加入100ul的4％的多聚甲醛，在室温下静置10分钟以固化细胞。固化后将多聚甲醛倒出，再在每孔加入甘油至终浓度为含2％甘油的pH7.5的PBS缓冲液100ul处理5分钟。获得包埋INS-1大鼠胰岛素瘤细胞的96孔板用于ELISA反应。
在96孔板上包埋INS-1大鼠胰岛素瘤细胞。使本发明的GLP-1类似物的融合多肽与细胞表面的GLP-1受体相结合，洗掉未结合的GLP-1类似物的融合多肽，封闭GLP-1受体，再用人GLP1(7-36)ELISA试剂盒中抗体与结合在GLP-1受体上的GLP-1类似物的融合多肽相互反应，反应机理类似于双抗体夹心法。
4.2 ELISA试验操作步骤
ELISA试剂盒预先从冰箱中取出，平衡至室温。
使用前准备以下试剂：
取出试剂盒中的10×清洗液PT用9倍体积的去离子水稀释到所需量。
取出试剂盒中的捕获抗体和检测抗体按1:1等比例混合，再用四倍体积抗体稀释液稀释到所需量，得到抗体混合液。
将96孔板中所需要用到的孔用BSA进行封闭，以消除细胞与待测样品的非特异性反应。将1％的BSA加满各反应孔，在37℃下封闭40分钟。
在96孔板每孔中加入50ul的待测样品或对照品。
再在每孔中加入50ul的抗体混合液。
将板盖好后，室温下置于酶标板振荡器上以400rpm的速度振荡孵育1小时。
将板中的反应液倒出，再在每孔中加入350ul的清洗液PT清洗三次。每次应将液体倒空并吸净。
在每孔中加入100ul的TMB，置于酶标板振荡器上在黑暗处以400rpm的速度振荡孵育15分钟，进行显色反应。
在每孔中加入100ul的终止液，置于酶标板振荡器上以400rpm的速度振荡1min使其混匀以终止反应。
将96孔板置于酶标仪上用450nm波长进行吸光度检测。
预实验
因为用自行制备的包埋有INS-1大鼠胰岛素瘤细胞的96孔板取代商品化的人GLP1(7-36)ELISA试剂盒中包埋了GLP-1抗体的96孔板，细胞表面的GLP-1受体与试剂盒中GLP-1抗体对GLP-1的结合能力会有区别，所以需要对开展预实验，用人GLP-1蛋白来测定INS-1大鼠胰岛素瘤细胞表面GLP-1受体的结合能力，确定最适反应物浓度范围及线性。同时摸索ELISA试剂盒反应中，当人GLP-1(7-36)蛋白饱和时的450nm吸光度，并通过饱和时的人GLP-1(7-36)蛋白浓度来估算INS-1大鼠胰岛素瘤细胞表面GLP-1受体的浓度。
预实验方案：用PBS稀释人GLP-1(7-36)蛋白获得不同的的蛋白浓度，从最高浓度0.1mg/ml开始向下逐步稀释，每个浓度稀释十倍，最终稀释至0.1ng/ml。将不同浓度的人GLP-1(7-36)蛋白用ELISA试剂盒按4.1的方法进行受体结合检测，获得450nm吸光度的检测结果，每个浓度平行两个样，使用PBS作为空白对照。检测方案见下表1：
表1
Figure BDA0003286854780000121
GLP-1类似物的融合多肽与GLP-1受体结合实验
根据预实验的结果，对所制备的三个GLP-1类似物的融合多肽G1、G2、G4进行与INS-1大鼠胰岛素瘤细胞表面GLP-1受体的结合实验，将三个GLP-1类似物的融合多肽的浓度梯度设置为100ng/ml，33ng/ml，10ng/ml，3.3ng/ml，1ng/ml，用PBS将G1、G2、G4三个类似物的融合多肽分别稀释到上述蛋白浓度，以人GLP-1(7-36)蛋白作为阳性对照，以PBS作为空白对照。以上每个浓度点三个平行样，按照上述ELISA实验步骤进行检测，检测方案见下表2：
表2
Figure BDA0003286854780000122
数据处理
人GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的融合多肽的Kd值的计算使用GraphPad Prism8.0软件。
计算方法，通过GraphPad Prism 8.0软件用单一位点亲和力方法进行拟合，获得Kd值。曲线中的横坐标为受测蛋白质摩尔浓度，纵坐标为
Figure BDA0003286854780000131
公式中A0为空白对照在450nm时的吸光度；Ai为每个检测浓度实测450nm吸光度的平均值；A∞为饱和时的450nm吸光度，该数值通过预实验测得；[x]tot为受体总浓度，该数值通过预实验结果计算获得。
5)实验结果
预实验
通过预实验确认固化的INS-1大鼠胰岛素细胞表面GLP-1受体与野生型GLP-1的结合效率，确认最适反应浓度，并得到饱和时的人GLP-1(7-36)蛋白浓度。
表3
Figure BDA0003286854780000132
可看出在人GLP-1(7-36)蛋白浓度为1ug/ml时，ELISA反应达到饱和，饱和时抗体摩尔浓度为1*1000*1000/3300(人GLP-1(7-36)蛋白分子量)＝303nM，饱和时450nm吸光度为3.550。
以双倒数作图，可见1ng/ml至1000ng/ml时蛋白浓度和A450呈线性关系(参见图1)。
正式实验
对所制备的三个GLP-1类似物的融合多肽G1、G2、G4进行与INS-1大鼠胰岛素瘤细胞表面GLP-1受体的结合实验，通过ELISA反应后检测所得A450结果如下：
表4
Figure BDA0003286854780000133
Figure BDA0003286854780000141
按照公式
Figure BDA0003286854780000142
对上述数据进行处理计算，A0为空白对照的平均值0.865，A∞为预实验时得到的人GLP-1(7-36)蛋白饱和时的450nm吸光度3.550，[x]tot为受体总浓度，该数值通过预实验结果计算获得，为303nM。
经计算后，表中的数据转换为下表5数值
表5
Figure BDA0003286854780000143
将上表数据导入GraphPad Prism 8.0软件用单一位点亲和力方法进行拟合，得到图2A-2D，并获得解离常数Kd值和决定系数R2。
解离常数Kd，检测抗体和受体间亲和力。在温度，PH值，盐浓度等影响亲和力的因素不变的情况下，Kd本身维持恒定，不受配体和受体浓度的影响。Kd等于一半的受体被配体结合时配体的浓度。Kd越小解离越慢，亲和力越强。
决定系数R2，判断拟合曲线对样本数据的拟合程度，决定系数越高，模型的拟合效果越好，即模型解释因变量的能力越强。
从图2A至图2D中可以看出，各组实验所获得的R2均在0.95以上，曲线对样本数据的拟合程度较佳，其中G1的Kd值为0.5845，亲和力显著优于人GLP-1(7-37)的2.447；G4的Kd值为1.345，亲和力略好于人GLP-1(7-36)，但处于同一个量级；G2的Kd值为14.44，亲和力相对于人GLP-1(7-36)下降明显。
实施例3 GLP-1类似物的融合多肽的DPP-4酶酶解拮抗作用
1)实验目的
GLP-1起到与GLP-1受体相结合，促使胰岛β细胞分泌胰岛素的作用，但人体内的GLP-1极易被DPP-4酶所降解而失去功能，因此所制备的GLP-1类似物的融合多肽是否能够抵御DPP-4酶的降解，从而延长所述GLP-1类似物的融合多肽作用时间，是本实验的考察目标。用过量的DPP-4酶对制备的三个GLP-1类似物的融合多肽进行酶切，用ELISA反应测量在相同条件下DPP-4酶对三个GLP-1类似物的融合多肽作用不同时间后GLP-1类似物的融合多肽的残留量，以人GLP-1蛋白(7-36)作为对照，通过体外试验模拟GLP-1类似物的融合多肽在体内维持作用时间，从而表征降糖效果持续时间。
2)实验材料
DPP-4酶
生产商：Sigma-Aldrich，产品货号：D4943-1VL,规格：酶浓度119ug/ml。
ELISA试剂盒
生产商：Abcam公司，产品货号：ab184857。
3)实验方法
在同样的反应条件下，以人GLP-1(7-36)蛋白作为对照，通过ELISA反应测定不同时间点经DPP-4酶酶切后残留的GLP-1类似物的融合多肽的量，生成酶切曲线，确定GLP-1类似物的融合多肽的抗降解能力。
ELISA试验操作步骤
反应体系残留人GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的融合多肽的量通过ELISA反应测定
ELISA试剂盒预先从冰箱中取出，平衡至室温。
使用前准备以下试剂：
取出试剂盒中的10×清洗液PT用9倍体积的去离子水稀释到所需量
取出试剂盒中的捕获抗体和检测抗体按1:1等比例混合，再用四倍体积抗体稀释液稀释到所需量，得到抗体混合液。
在96孔板每孔中加入50ul的待测样品或对照品。
再在每孔中加入50ul的抗体混合液
将板盖好后，室温下置于酶标板振荡器上以400rpm的速度振荡孵育1小时
将板中的反应液倒出，再在每孔中加入350ul的清洗液PT清洗三次。每次应将液体倒空并吸净。
在每孔中加入100ul的TMB，置于酶标板振荡器上在黑暗处以400rpm的速度振荡孵育15分钟，进行显色反应。
在每孔中加入100ul的终止液，置于酶标板振荡器上以400rpm的速度振荡1min使其混匀以终止反应。
将96孔板置于酶标仪上用450nm波长进行吸光度检测。
预实验
通过预实验确定合适的酶与底物的浓度。
以人GLP-1(7-36)作为反应的底物，分为两组，分别用pH为7.4的PBS稀释至浓度为0.1ug/ml，10ng/ml。将DPP-4酶解冻后用PBS稀释至浓度10ug/ml。在反应体系中先加入PBS400ul，然后底物与酶各加50ul，总反应体积500ul。反应在水浴锅中进行，水浴温度30℃。
取样检测时间点：加酶前，0时，0.1h，0.5h，1h，2h，4h。在相应时间点分别取样按上述中的ELISA实验步骤检测吸光度。
正式实验
根据预实验的结果将G1、G2、G4和人GLP-1(7-36)分别用pH为7.4的PBS稀释到10ng/ml，DPP-4酶用PBS稀释到10ug/ml。按照人GLP-1(7-36)，G1，G2，G4分为四组，每组首先加入PBS 800ul，然后分别加入各组底物100ul，DPP-4酶100ul，总反应体积为1ml。
取样检测时间点：加酶前，0时，0.1h，0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h。在相应时间点分别取样按上述ELISA实验步骤检测吸光度。
数据处理
以各组加酶前测得的ELISA反应结果作为基准，其他反应时间得到的ELISA反应结果与之相比，获得不同时间点残留的人GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的融合多肽与未加酶的初始值的百分比。使用GraphPad Prism 8.0软件对人GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的融合多肽随着时间的延长所剩余的百分比绘制曲线，计算线下峰面积AUC，通过人GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的融合多肽在相同条件下与过量的DPP-4酶反应后的线下峰面积来表征人GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的融合多肽在体内的降糖效果及持续时间。由于ELISA反应本身消耗一定的时间，0时的结果并不是真实的0时反应状态，而是完成ELISA反应后获得最快结果，由于ELISA反应的时间和试剂的干扰无法准确得出真正的0时结果。因此所有时间点均应视为扣除ELISA反应时间后的时长。
4)实验结果
表6
AUC G1 G2 G4 人GLP-1(7-36)
总面积 5.137 1.342 2.469 1.025
标准误差 0.1388 0.04715 0.09012 0.05201
95％置信区间 4.865-5.409 1.249-1.434 2.292-2.646 0.9232-1.127
从图3和上表可以看出，G2在DPP-4酶作用下的残留与人GLP-1(7-36)并无明显差异，不具备抑制DPP-4酶切的效果，而G4具有一定的抑制DPP-4酶降解的作用，其线下峰面积为2.469，超出人GLP-1(7-36)的1.025逾一倍。G1抑制DPP-4酶切的效果则非常显著，其线下峰面积为5.137，是人GLP-1(7-36)的5倍，并且在酶切24小时之后仍有20％左右的蛋白。这预示着G1在体内可以存在更长的时间，从而降糖效果维持时间更长。
实施例4 GLP-1类似物的融合多肽对链脲佐菌素致糖耐量受损小鼠模型的影响
1)实验目的及原理
构建糖耐量受损小鼠模型，通过模型鼠对制备的GLP-1类似物的融合多肽G1，G2，G4开展初步的药效研究，确认G1，G2，G4的降糖效果及持续时间，从而判断所制备的GLP-1类似物的融合多肽是否具备药用价值。进一步通过连续多次给药，观察连续给药对小鼠体重，摄食，摄水量的影响，并考察所制备的GLP-1类似物的融合多肽有无减轻体重的作用。
2)实验材料
受试物
G1
溶剂：磷酸缓冲盐溶液(PBS)
A280：4.68
折算蛋白质浓度：3.05mg/ml
折算摩尔浓度：0.387mmol/L
G2
溶剂：磷酸缓冲盐溶液(PBS)
A280：6.18
折算蛋白质浓度：3.95mg/ml
折算摩尔浓度：0.502mmol/L
G4
溶剂：磷酸缓冲盐溶液(PBS)
A280：0.78
折算蛋白质浓度：0.48mg/ml
折算摩尔浓度：0.061mmol/L
对照药
阴性对照品：
生理盐水
0.9％氯化钠，注射用，市售；
阳性对照品：
人GLP-1(7-36)
生产商：中肽生化有限公司，货号：GLUC-010A，规格：1mg/瓶
实验动物
实验动物动物种属：雄性，KM小鼠。
动物等级：SPF级。
性别和数量：购买70只，筛选62只入组，均为雄性。
动物年龄：动物给药时6～8周龄。
动物体重范围：动物给药时为18～25g。
动物来源：北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验动物适应性观察
动物接收后进行适应性观察，每天1次，连续观察3天，内容包括一般精神状态、皮毛、活动情况等。
实验动物饲养观察条件
普通动物房：温度：20-26℃，相对湿度：40％-70％。
饮水：除菌过滤纯化水，通过美国密理博Elix纯水机制备的纯化水，再经0.22μm除菌滤器过滤除菌。
饲料：SPF级KM小鼠维持配合饲料，营养成分符合GB14924.1-2001，GB14924.2-2001，GB14924.3-2010试验动物配合饲料通用质量标准，生产单位：北京科澳协力饲料有限公司。
3)实验方法
3.1糖耐量受损(IGT,Impaired Glucose Tolerance)小鼠模型建立
将52只KM小鼠根据体重注射链脲佐菌素，每只小鼠按40mg/kg的剂量，隔两天腹腔注射链脲佐菌素制作糖耐量受损小鼠模型，共注射3次。注射完一周后，禁食12小时测空腹血糖(基础血糖)，然后按照2.5g/kg灌胃给予葡萄糖溶液，灌胃体积为0.10-0.15ml/10g，灌胃30min后再测定血糖值。取30min血糖值增加幅度大于200％的造模小鼠按增加幅度大小从高往低排序，去掉增加幅度最高和最低值，按增加幅度大小取40只造模小鼠纳入糖耐量受损小鼠模型。
分组
将40只糖耐量受损模型小鼠分为模型对照组、GLP-1组、G1组、G2组、G4组，共5组，每组8只，按血糖值增加幅度及体重大小均衡分组。另取8只未造模小鼠作为NGT(NormalGlucose Tolerance，正常对照)组。
给药剂量
以市售利拉鲁肽作为参考，利拉鲁肽的分子量为3751，起始剂量为每天0.6mg，1周后，剂量应增加至1.2mg，推荐每日剂量不超过1.8mg。按照标准剂量1.2mg/天折算给药摩尔量，相当于GLP-1类似物成人给药剂量为0.32μmol/天。
20g体重的小鼠与70Kg的人的给药剂量换算关系为0.0026:1，即体重20g左右的小鼠折算给药剂量为0.83nmol/天。参考文献药理实验方法学(第三版)徐叔云，2002
将G1，G2，G4分别用生理盐水稀释到20μmol/L，每次给药1nmol，相当于每只小鼠每次给药25μl/10g体重。
给药方案
多次给药，每次给药间隔一天。首次给药后口服葡萄糖，测量不同时间，第2天后再给葡萄糖再测不同时间。
小鼠分组完毕后第1天上午9：30左右开始给药。NGT组和模型对照组皮下注射生理盐水，GLP-1，G1，G2，G4各组动物皮下注射相应人GLP-1(7-36)及本发明的GLP-1类似物的融合多肽，所有动物均为单次颈背部皮下注射给药。连续九天，每隔一天给药一次，给药时间均为上午9：30左右，共给药五次。
给药方案如下表7：
表7给药方案
Figure BDA0003286854780000191
3.2口服葡萄糖耐量试验(OGTT)
口服葡萄糖耐量试验又称糖耐量试验诊断检查(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)，是在口服一定量葡萄糖后2小时内做系列血浆内葡萄糖浓度的测定。长期以来，OGTT作为公认的诊断糖尿病的金标准为世界各国所采用。正常人服用一定量葡萄糖后，血糖浓度暂时性升高，但2h内血糖浓度又可恢复至正常水平，而糖代谢异常的患者在服用葡萄糖后会出现不同时段、不同程度的血糖升高。凡是临床上发现患者有可疑糖尿病者除试验禁忌外的病人都可进行口服葡萄糖耐量试验检查。可了解机体对葡萄糖代谢的调节能力。
本实验中，小鼠的灌胃给予葡萄糖剂量为2.5g/kg，给糖后2小时内于30min、60min、90min、120min进行尾尖取血测量血糖浓度。
试验方案：
小鼠分组完毕后，第1天上午9：30左右开始给药，给药前9小时禁食不禁水，给药后1h，小鼠尾静脉取血检测空腹血糖。测定血糖后立即灌胃给予2.5g/kg葡萄糖溶液(20％葡萄糖溶液，10ml/Kg)。测定灌胃后30min、60min、90min、120min的血糖。第2天9：30再次进行灌胃给予2g/kg的葡萄糖溶液(20％葡萄糖溶液，10ml/Kg)。测定灌胃后30min、60min、90min、120min的血糖。
检测指标
血糖水平
取血方法：用手术刀片从小鼠尾尖处取血，第一滴血液弃去不用，收集第二滴血液用于检测血糖。
使用仪器：强生ONETOUCH UltraEasyTM稳豪倍易型血糖仪。
检测指标：血糖值。
摄食量
按笼具统计，每笼具为同组小鼠4只。每天早晨8:30左右换食，对每笼放置的食物进行称重，作为F0，第二天换食时，对剩余的食物进行称重，作为F1，F1-F0即为该笼4只小鼠当日摄食量。
摄水量
按笼具统计，每笼具为同组小鼠4只。每天早晨8:30左右换水，对每笼放置的水进行称重，作为W0，第二天换水时，对剩余的水进行称重，作为W1，W1-W0即为该笼4只小鼠当日摄水量。
体重
每隔两天清晨对小鼠进行称重，其中第9天由于给药前禁食，获得的是空腹体重。
数据统计
梯形公式计算血糖-时间曲线下面积(AUC)：AUC＝1/2(0min血糖值+15min血糖值)×0.25h+1/2(15min血糖值+30min血糖值)×0.25h+1/2(30min血糖值+60min血糖值)×0.5h……
使用统计学软件GraphPad Prism 8对数据进行处理。各时间点的血糖水平采用双因素方差分析进行各时间点的组间比较，如有统计学差异(P<0.05)，则以Bonferroni test同正常组和模型对照组进行比较，以P<0.05为具有统计学差异。
血糖-时间曲线下面积(AUC)采用单因素方差分析进行比较，如有统计学差异(P<0.05)，则以Dunnett’s test同NGT组和模型对照组进行比较，以P<0.05为具有统计学差异。
由于摄水量和摄食量测量时，以每笼4只小鼠为统计，故每组由两个均值构成，亦采用单因素方差分析。
4)实验结果
4.1糖耐量受损小鼠造模结果
NGT组及造模完成后给药前各组小鼠基础血糖及给葡萄糖后30imn血糖值如表8所示：与NGT组比较，模型对照组和各给药组的基础血糖略所上升，但差异均无统计学意义(P＞0.05)；各给药组与模型对照组比较无明显差异(P＞0.05)。模型对照组和各给药组的30min血糖和血糖增幅较NGT组上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。模型对照组和各给药组间的基础血糖、30min血糖及血糖增幅均无明显差异(P＞0.05)。以上数据表明各组之间基础血糖无明显差异，有较好的一致性。在给葡萄糖之后，模型对照组和各给药组与NGT组相比，血糖显著上升，造模是成功的，造模小鼠的糖耐量明显低于正常小鼠。在给葡萄糖之后，模型对照组和各给药组之间血糖无明显差异，表明各组间一致性较好，组间差异较小，不会影响实验的代表性。
表8 NGT组及造模完成后给药前各组小鼠基础血糖及给葡萄糖后30imn血糖值
Figure BDA0003286854780000211
Figure BDA0003286854780000212
注：与NGT组比较，▲P<0.05；与模型对照组组比，*P<0.05。
4.2给药期间体重变化
各组给药期间体重变化情况如表9所示：与NGT组比较，模型对照组和各给药组小鼠的体重有所下降，第9天时差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组比较，G1和G 2组给药期间体重均无明显差异(P＞0.05)，G4组第9天体重有所降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。·
表9给药期间各组小鼠体重
Figure BDA0003286854780000213
Figure BDA0003286854780000214
Figure BDA0003286854780000221
注：与NGT组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。
4.3给药期间摄食摄水量变化
各组小鼠给药期间摄食摄水量如表10和表11所示：与NGT组小鼠比较，模型对照组的摄食量均有所增加，摄水量仅给药第1～2天增加，但差异均无统计学意义(P＞0.05)；G1和G2组小鼠的摄食量无明显差异，G4组的1～2天及7～8天的摄食量和摄水量均降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。与模型对照组比较，G1组给药第4～5、7～8天的的摄食、摄水量有所降低；G2组的3次摄食、摄水量均有所降低，且降低的幅度较G1组稍大；G4组在给药后第1～2天及7～8天可降低小鼠摄食、摄水量，第4～5天小鼠摄食、摄水量明显增加。但给药的三组和模型对照组比较均无统计学差异(P＞0.05)。
表10 NGT组及造模给药各组小鼠摄食量统计
Figure BDA0003286854780000222
Figure BDA0003286854780000223
注：与NGT组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型对照组比，*P<0.05，**P<0.01。
表11 NGT组及造模给药各组小鼠摄水量统计
Figure BDA0003286854780000224
Figure BDA0003286854780000225
注：与NGT组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型对照组比，*P<0.05，**P<0.01。
4.4各组小鼠末次给药后OGTT检测
各组小鼠末次给药后OGTT检测情况如表12和表13所示：各组小鼠第1次给葡萄糖后在30min血糖升到最高，60min时降低，120min时降到更低；第2次给葡萄糖后血糖再一次升高，血糖变化情况与第1次给葡萄糖一致但变化稍小。与NGT组比较，模型对照组小鼠的给药后1h血糖、第1和第2次OGTT 120min血糖均无明显差异，说明基础血糖不受影响；第1次OGTT 30min、60min和第2次OGTT 30min血糖值显著升高(P＜0.01)，说明糖负荷后模型组小鼠血糖异常升高，存在明显的糖耐量受损。
与模型对照组相比，末次给药后的第一次OGTT检测显示，G1组和G4组各时间点血糖均下降明显，第二次OGTT时，G1组各时间点血糖下降明显，G4组各时间点血糖下降，但没有G1组下降明显，因此，G1降糖效果显著，持续时间长，G4降糖效果显著，持续时间长，降糖效果不如G1。
末次给药后的第一次OGTT和第二次OGTT检测显示，G2组血糖下降，说明G2具有一定的降糖效果。
表12各组小鼠末次给药后糖耐量检测血糖值
Figure BDA0003286854780000231
/>
Figure BDA0003286854780000232
注：与NGT组比较，▲表示P<0.05；与模型对照组比，*表示P<0.05。
表13第2次OGTT糖耐量检测血糖值
Figure BDA0003286854780000233
Figure BDA0003286854780000234
Figure BDA0003286854780000241
注：与NGT组比较，▲表示P<0.05；与模型对照组比，*表示P<0.05。
5)结论与讨论
糖尿病前期包括空腹血糖调节受损和糖耐量受损。糖耐量受损(im-pairedglucose tolerance，IGT)患者是2型糖尿病和心血管疾病的高危人群，晚发现或未干预的，很容易发展成为糖尿病。
本试验通过3次(1次/3d)腹腔注射40mg/kg的链脲佐菌素，建立KM小鼠糖耐量受损模型。此动物模型不造成空腹血糖受损，仅存在糖耐量受损。本次试验造模结束后给药前各组小鼠的空腹血糖(基础血糖)无明显差异。而小鼠给予葡萄糖后30min，血糖和血糖增幅均较正常组明显升高，说明本实验成功建立了糖尿量异常KM小鼠模型。
本试验给药方式为皮下注射0.02mL/只，周期为9天，给药频率为q2d，共5次。试验第9天禁食9h后给药，检测给药后1h血糖，随即进行连续2次OGTT试验。模型组小鼠给药后1h血糖、第1和第2次OGTT 120min血糖均不受明显影响，第1次OGTT 30min、60min和第2次OGTT30min血糖值显著升高。
综上，G1有明显的降糖作用，降糖效果持续时间长。G4有降糖作用，降糖效果持续时间长，降糖效果不如G1。G2具有一定的降糖作用。
序列表
<110> 合肥天汇孵化科技有限公司
<120> GLP-1类似物的融合多肽
<130> 310148CG
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
20 25 30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly
35 40
<210> 3
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G1
<220>
<221> DISULFID
<222> (27)..(33)
<223> 两个半胱氨酸残基形成链内二硫键
<400> 3
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Cys Lys Gly Arg Gly Gly
20 25 30
Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu
35 40 45
Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu
65 70 75 80
Gly
<210> 4
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G2
<220>
<221> DISULFID
<222> (70)..(76)
<223> 两个半胱氨酸残基形成链内二硫键
<400> 4
Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
20 25 30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Lys His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Cys Lys Gly Arg Gly Gly Cys Gly Arg
65 70 75
<210> 5
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G4
<220>
<221> DISULFID
<222> (12)..(32)
<223> 两个半胱氨酸残基形成链内二硫键
<400> 5
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
20 25 30
Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
50 55 60
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly
65 70

Claims (25)

1.一种GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1类似物的融合多肽包含GLP-1(7-37)类似物、GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段，和融合蛋白片段。
2.根据权利要求1所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1类似物的融合多肽从N-末端至C-末端具有式(I)所示的结构：
X-E-Y(I)
其中，所述X为GLP-1(7-37)类似物，所述E为GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段，所述Y为融合蛋白片段。
3.根据权利要求1所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1类似物的融合多肽从N-末端至C-末端具有式(II)所示的结构:
Y-L’-X-E(II)
其中，所述Y为融合蛋白片段，所述L’为接头或不存在，所述X为GLP-1(7-37)类似物，所述E为GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段。
4.根据权利要求3所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中当L’为接头时，其为长度为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的任意氨基酸组成的肽接头。
5.根据权利要求4所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中L’为包含精氨酸的接头。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1(7-37)类似物在对应于天然GLP-1(7-37)的第7至第37位的任一氨基酸被第一半胱氨酸取代，所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段中包含第二半胱氨酸，并且所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸形成二硫键。
7.根据权利要求6所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸形成分子内二硫键。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1(7-37)类似物基本上保留了天然GLP-1(7-37)的活性和/或功能。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1(7-37)类似物与SEQ ID NO：1所示的天然GLP-1(7-37)相比，还包含至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个保守氨基酸修饰。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段为包含1-15个氨基酸的肽段。
11.根据权利要求10所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸组成的肽段，其中一个氨基酸为半胱氨酸，其余为除半胱氨酸以外的任意氨基酸。
12.根据权利要求11所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段的一个氨基酸为半胱氨酸，其余为甘氨酸或精氨酸。
13.根据权利要求12所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1(7-37)类似物的C-末端延伸区段选自C、GCGR、或GCGGGGGG。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述融合蛋白片段选自融合蛋白的β折叠片段。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述融合蛋白片段如SEQ ID NO：2所示，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
16.根据权利要求6-15中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述第一半胱氨酸与所述第二半胱氨酸间隔至多为40个氨基酸长度，优选地，间隔35至3个氨基酸，更优选地，间隔30至5个氨基酸。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，其中所述GLP-1类似物的融合多肽具有SEQ ID NO：3-5中任一项所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列中的两个半胱氨酸形成分子内二硫键。
18.分离的核酸，其编码根据权利要求1-17中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽。
19.一种载体，其包含权利要求18所述的分离的核酸。
20.一种宿主细胞，其包含权利要求19所述的载体。
21.一种制备GLP-1类似物的融合多肽的方法，其包括在适当的条件下培养权利要求20所述的宿主细胞，表达和回收权利要求1-17中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽的步骤。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-17中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，以及药学可接受的载体或赋形剂。
23.根据权利要求1-17中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，或根据权利要求22所述的药物组合物，在制备用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病或肥胖症的药物中的用途。
24.根据权利要求1-17中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，或根据权利要求22所述的药物组合物，用作药物。
25.一种治疗非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病或肥胖症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的GLP-1类似物的融合多肽或其可药用盐，或根据权利要求22所述的药物组合物。
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