KR960013439B1 - 안정한 상피세포 성장인자(egf) 조성물 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

안정한 상피세포 성장인자(EGF) 조성물

제1도는 역상 고속액체 크로마토그래피로 EGF와 탈아미노 EGF를 분리한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.

제2도는 EGF와 탈아미노 EGF를 분리한 전기영동 사진과 분리된 밴드의 겔 밀도측정 결과를 나타내는 그래프이다.

제3도 및 제 4도는 각각 본 발명의 제제가 안정하다는 것을 나타내는 전기영동 사진이다.

본 발명은 신규한 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, 이하, 'EGF'라 함)의 약학적 조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 생물학적으로 활성인 EGF에 페놀, 폴리에틸렌글리콜, 지방산염, 슈크로스 지방산 에스테르, 계면활성제, 황산 나트륨, 아미노산, 타우린, 만니톨, 젤라틴, 휘브로넥틴, 히알우론산 및 유기산 완충액으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 또는 2가지 이상의 첨가제를 부가함으로 씨, 염, 산, 알카리 및/또는 단백질 분해조건에 대해 생물학적 활성 뿐만 아니라, 물리, 화학적 미세균질성을 유지하는 안정화 EGF 조성물에 관한 것이다.

EGF는 53개의 아미노산과 3개의 이황화물(disulfide) 결합을 갖는 분자량 6045의 폴리펩티드로서, 종래에는 유로가스트론(urogastron)으로도 알려져 있었다. EGF는 상피세포와 간엽(messenchymal) 세포를 포함한 각종 세포들에 대해 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산분비 억제 등의 활성이 있어 피부 또는 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료제로 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다(Assoka Hiratoni., US Patent 140,998; Carpenter, Experimenta I Cell Research 164 1-10(1986)).

EGF가 약제로서 충분한 치료효과를 나타내기 위해서는 , 장기간 동안 생물학적 활성이 유지되어야 할 뿐만 아니라, 순도 및 균질성을 유지해야 한다. 그러나 EGF는 순수한 폴리펩타이드로서 장기보관시, 실온에서 뿐만 아니라 심지어 냉장보관 상태에서도 화학적, 물리적변화가 일어나 생물학적 활성 감소 및 폴리화학적 불균질화로 인한 치료효과의 감소, 분해 산물에 의한 알레르기의 위험등 제제화에 많은 문제점이 있었다.

일반적으로, 단백질의 분해경로는 화학적 불안정성과 물리적 불안정성의 크게 두가지로 분류된다 : 이중 화학적 불안정성은 새로운 분해산물을 형성하는 탈아미화 반응 혹은 펩타이드 결합의 형성이나 절단과 같은 단백질의 구조의 수식을 동반하는 과정이고, 물리적 불안정성은 공유적 수식을 동반하지 않는 변성, 응집과 침전 등을 말한다(Manning et.al., Pharmaceutical Research, 6:903-917(1989):Tallan Stain, Journal of Biological Chemistry. 200 507-514(1953)).

EGF의 화학적 분해경로에서 주목하여야 할 것은 구성 아미노산 중 아스파라긴과 글루타민의 결사슬(sidechain) 아미그룹이 가수분해되어 아스파르트산과 글루탐산으로 되는 탈아미노 반응(DiAugstine, Analytical Bi℃hemistry, 165:420-429 1983)과 물리적 불안정성에서 EGF가 이황화물 교환반응을 통하여 다분자체로 되는 경향이 크고(Brake et.al., Pr℃. Natl. Acad. Acad. Sci. USA. 81 : 4642-4646(1984)).

고속액체 크로마트 그래피에 의해 이분자체와 삼분자체가 90% 이상을 차지하며, 이들은 단분자체와 아미노산 조성이 동일하다는 것이다(Heath Merrifield, Pr℃. Natl. Acad. Scin. USA, 83: 6367-6371(1986)).

특히, 탈아미노화 반응은 중성이나 알카리성 용액에서 더욱 뚜렷하고, 탈아미노화되어 생긴 새로운 펩타이드와 응집되어 생긴 다분자체는 단백질의 생물학적 활성이나 면역학적 활성이 크게 바뀔 수도 있다(Scheinberg et.al., Prog. Allergy, 27:250-276(1980)). EGF에 있어서는 탈아미노 EGF도 원 EGF와 생물학적 활성이 동일하기 때문에, 유용한 EGF 제제가 되기 위해서는 단순한 생물학적 활성의 유지 뿐만 아니라, 이러한 화학적 변화와 물리적 변화의 과정을 늦추거나 방해하는 방법에 의해 단백질의 화학적, 물리학적 안정성도 증가되어야 한다.

유럽특허공개 제205,051호에는 이러한 활성의 감소를 막기 위한 피부 및 안과용 크립의 조성물로 EGF와 1 내지 10%의 계면활성제, 5내지 45%의 지방질 및 0.3 내지 0.8%의 방부제로 된 조성물을 개시하고 있다.

유럽특허공개 제267,015호 및 미국특허 제4,717,717호에서는 EGF에 물에 녹는 셀룰로스 증합체를 첨가한 EGF 함유 안정화 조성물을 개시하고 있다.

유럽특허공개 제398,619호에서는 EGF에 약제학적으로 허용되는 아연등의 금속 양이온을 첨가한 EGF 함유 안정화 조성물을 개시하고 있다.

그러나, 이러한 선행기술에는 어느 것이나 EGF의 잔존량을 높이거나 단순히 생물학적 활성의 유제에만 초점이 맞추어져 있고, EGF의 탈아미노화나 응집등, 물리적, 화합적 미세불균질화에 의한 제제상의 문제는 전혀 해결하려는 노력이 개시되어 있지 않았다.

따라서, 본 발명의 목적은 EGF에 약학적으로 허용되는 페놀, 폴리에틸렌글리콜, 지방산 염, 계면활성제, 슈크로스 지방산 에스테르, 황산나트륨, 아미노산, 타우린, 마니톨, 젤라틴, 휘브로넥틴, 히알우론산 및 유기산 완충용액으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 또는 2 이상의 물질을 함유시킴으로써, 생물학적 활성의 유지 뿐만 아니라 탈아미노화 반응에 의한 탈아미노 EGF의 생성 및 응집에 의한 다분자체의 생성 등을 방지 또는 지연시켜 EGF의 미세균질성을 유지케하여, 생물학적, 화학적, 물리학적으로 안정한 EGF 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 EGF의 펩타이드 결합의 절단, 탈아미노화, 반응 및 분자간의 웅집 등을 방치 혹은 지연시킬 가능성이 있는 물질을 첨가제로 선전하고, 20mM 인산완충액에 용해시킨 EGF를 기준으로 하여 중성의 EGF 조성물은 37℃에서 7일간 및 60℃에서 14일간, 암모니아수로 알카리성으로 조정한 조성물을 60℃에서 1일간, 그리고 37℃ 수조에서 진탕 등의 방법으로 보관하였다. 그런 다음, 남아있는 EGF를 역상 고속액체 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드겔 전기영동, 자외선 흡광 광도 분석 및 유사분열 유도활성 시험법으로 측정한 결과, 놀라웁게도 EGF에 트리스 염산 완충액, 붕산염 완충액, 초산염 완충액, 구연산염 완충액 트리톤 X-100, 트윈-20, 크레아포아 A-25, 히알우론산, 휘브로넥틴, 폴리에틸렌글리콜, 페놀, 지방산염, 황산나트륨, 아미노산, 타우린, 만니톨, 젤라틴 및 슈크로스 지방산 에스테르로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 또는 2 이상의 물질을 부가하였을 때, 놀라웁게도 인산 완충액에 용해되어 있는 EGF보다 월등한 잔존활성을 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 의해 제조된 EGF 제제의 안정성은 본 출원과 동일자 출원되는 『인간 상피세포 성장인자(hEGF) 발현백터 및 그를 이용한 hEGF의 제조방법』(대한민국 특허출원 제93- 호)에 개시된 벡터를 함유하는 형질전환체인 대장균 JM 101(Escherichia coli JM 101 ; KCCM-10027)로부터 생산된 유전자 제조합 인간 EGF를 인산 완충액에 용해시킨 것을 기준으로 하여, 본 발명에서 제공되는 조성물에 대하여 실온 보관조건, 37℃ 보관조건, 중성 60℃ 가혹조건 및 알카리성 60℃ 가혹조건 등으로 처리하여, 다음과 같은 방법으로 확인하였다 :

(1) 역상 고속액체 크로마토그래피

역상 고속액체 크로마토그래피로 화학적 안정성, 유사분열 유도활성 측정으로 생물학적 활성을 측정하여 일차로 안정성이 우수한 EGF 조성을 선발하였다. 이와 같이 선발된 EGF 조성물에 대하여 자외선 흡광광도 분석으로 물리학적 안정성을 활인한 후, 폴리아크릴 아마이드겔 전기영동으로 본 발명의 조성물이 인산 완충액에 용해되어 있는 EGF 보다 미세균질성의 유지가 우수하다는 것을 육안으로 활인하였다.

이에 사용된 역상 고속액체 크로마토그래피는 디오거스틴(DiAugstine) 등의 (J. Biol. Chem., 260:2807-2811(1988) ; Anal. Bi℃hem., 165:420∼429(1987)) 방법을 약간 수정하여, 실온 단일용매계(22% 아세토나이트릴, 78% 10mM 디에틸렌트리아민인산, pH 6.0)에서 유속 0.5ml/min으로 수행하였으며 214nm에서의 흡광도를 측정하였다. 제1도에서 보는 바와 같이, 파크 I과 피크 Ⅱ는 전기 문헌(DiAugstine., Anal. Bi℃hem., 165:420-429(1987)에 개시된 바대로, 탈아미노 EGF와 원 EGF를 동정하고 피크 I의 생산억제와 잔류하는 피크 Ⅱ의 면적을 비교하였다.

(2) 유사분열 유도활성

한편, 유사분열 유도활성 측정은 리멘(Riemen) 등(Peptides 8:877-855(1987))의 방법을 약간 수정하여, 5% 송아지 혈청함유 돌베코 엠.이.엠(Dulbrco, MEM) 배지 1ml를 넣은 코스타 24웰 세포배양 플레이트에 엔 알 케이(NRK) 49F 세포주를 2X10⁵세포/웰 농도로 접종하고 37℃, 5% CO₂조건하에서 24시간 배양하였다. 그런 다음, 인산완충 식영수로 각 웰을 2번 세척하고 무혈청 돌베코 엠.이.엠(MEM) 배지 1ml로 배지를 교체하여 24시간 추가 배양하였다. 여기에 각 농도를 희석한 EGF 조성물 시료를 가해 24시간 배양한 후, 삼중수소 표지 티미딘([3H]thymidine)을 1.0μCi/웰의 농도로 가해 24시간 배양하였다. 그 후 각 웰을 세척하고 1N 수산화 나트륨으로 처리하여 삼중수소 표지 티미딘이 세포에 흡입되는 정도를 액체섬광계수기(Packard Tricarb 1900TR)로 결정하였다.

(3) EGF의 응집정도

EGF의 응집정도는 차울라(Chawia)등의 방법(Diabetes, 34:420-426(1985))에 따라, 본 발명의 조성물을 37℃ 수조에서 분당 100회의 왕복운동으로 8일간 진탕한 후, 자외선 흡광강도 분석기(Pharmacia-LKB, U.S.A)를 사용하여 600nm에서의 광밀도를 측정하였다.

(4) EGF의 균질성

EGF의 균질성은 조빈(Jovin) 등의 방법(Anal. Bi℃hem., 9:351-369(1964))을 변형하여 폴리아크릴아마이드겔 전기영동으로 확인하였다. 즉, 스태킹 겔은 2.5% 아크릴아마이드, 0.625% 비스아크릴아마이드 0.06M 트리스, 0.25M 인산, 0.025% N,N,N',N'-테트라메칠 에틸렌디아민 및 0.0005% 폴라빈 모노 뉴클레오티드로 구성되고; 분리 겔은 12% 아크릴아마이드, 0.32% 비스아크릴아마이드, 0.357M 트리스, 0.1% N,N,N',N'-테트라메칠 에틸렌디아민 및 0.15% 황산암모늄으로 하여 전기 연동 키트(Biorad, U.S.A.)에서 음극 완충액(0.642% 트리스 및 0.398% 글리신), 양극 완충액(1.21% 트리스 및 0.05M 염산)으로 하여 겔당 20mA에서 전개하였다. 그런 다음, 쿠마시 염색약 0.24%로 염색하여 각 밴드를 겔 밀도 측정기(gel densitometer, Pharmacia-LKB, UltroScan XL)로 측정하여 비교하였다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

이들 실시예는 본 발명은 오로지 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1

EGF를 50μg/ml의 농도로 pH가 7인 20mM 인산염에 용해시키고, 하기 표 1-1 및 표 1-2에 개시된 첨가제의 그룹으로부터 선택된 1내지 2가지 이상의 첨가제를 함유한 조성물을 37℃ 및 60℃에서 보관하면서, 탈아미노화된 EGF가 형성(즉, 피크 I의 형성)되는 정도와 잔류 유사분열 유도활성을 측정하였다. 피크 면적비는 초기에 넣은 EGF의 피크 면적에 대비하여 퍼센트(%)로 나타내었으며, 피크 Ⅱ의 면적비가 표준품과 동일한 형태의 EGF양을 나타내고, 피크 I의 면적비가 탈아미노화에 의한 미세 불균질화된 EGF의 양을 나타낸다. 구 피크의 면적비의 합이 100%가 되지 못하는 경우는 펩타이드 결합의 분해 등의 결과로 EGF가 소실되었기 때문이며, 이것을 펩타이드 결합 분해율(%)로 나타내었다.

표 1-1 및 표 1-2에서 보는 바와 같이, EGF 조성물에 트리스 염산, 붕산 나트륨(Na, borate), 초산나트륨(Na. acetate), 구연산 나트륨(Na, citrate). 페놀, 폴리에틸렌글리콜 및 데옥시콜산 나트륨 등의 물질이 1 또는 2 이상이 첨가되었을 때, EGF의 탈아미노화 현상이 상당히 억제되었고 유사분열 유도활성도 남아있었다.

실시예 2

보다 가혹한 조건에서의 EGF 조성물의 안정성을 알아보기 위해, 암모니아 알카리성 용액에 EGF를 용해시키고 선정된 첨가제를 1가지 혹은 2가지 이상을 넣은 제제를 60℃에서 보관하면서, 24시간 후에 탈아미노화된 EGF의 형성(즉, 피크 I의 형성)되는 정도와 펩다이드 결합 분해율, 그리고, 잔류 유사분열 유도활성을 측정하여하기 표2에 제시하였다.

표 2에서 보는 바와 같이, 휘보로멕틴, 슈크로스 지방산 에스테르, 히알우론산, 트리톤 X-100, 트읜 20 및 크레모포아 A-25 등의 물질이 첨가되었을 때, 탈아미노화 반응에 의한 미세 불균질화가 억제되었으며, 유사분열 유도활성으로 측정한 생물학적 활성도 높게 유지되는 것으로 나타났으며, 0.1M 이상의 염화나트륨은 EGF의 안정성을 저해하는 것으로 나타났다.

*S.M.C는 sucrose moncaprate의 약어임.

실시예 3

본 발명의 조성물을 37℃ 수조에서 8일간 진탕하면서 보관한 것의 응집정도를 측정하였을 때, 표 3에서와 같이 응집이 억제되어 물리적 안정성 및 생물학적 활성이 유지되는 것으로 나타났다.

실시예 4

하기 표 4의 첨가제를 함유한 조성물을 실온에서 3개월간 보관한 후, 전기영동분석으로 원 EGF와 탈아미화된 EGF를 분리하여 쿠마시 브릴리안트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R 염색약으로 염색하고 겔밀도측정기호 각 밴드의 크기를 정량적으로 분석하여 제2도 및 하기 표 4에 제시하였다.

아울러, 제3도 및 제4도에서와 같이 전기 영동에 의한 분석에서도 본 발명의 조성물은 EGF의 탈아미노화 반응 및 펩타이드 결합의 절단이 명백히 억제되고 있음을 보여주었다. 제3도에서, 제1레인은 표준품;제2레인은 20mM 인산 완충액; 제3레인은 페놀; 제4레인은 20mM 트리스; 제5레인은 1% 크레모포아; 제6레인은 1% 브리쥬(Brij) 58; 제7레인은 0.1% 트윈 20; 제8레인은 1% 황산 나트륨; 제9레인은 1% 폴리에틸렌글리콜을 각각 나타낸다. 제4도에서, 제1레인은 표준품; 제2레인은 20mM 인산 완충액; 제3레인은 1% 글리신; 제4레인은 1% 타우린; 제5레인은 1% 카프릴 나트륨; 제6레인은 0.2% 데옥시콜린산 나트륨; 제7레인은 0.1% 휘브로넥틴; 제8레인은 0.2% 히알우론산; 제9레인은 5% 만니톨+0.25 젤라틴을 각각 나타낸다.

본 발명에서 EGF를 안정화시키기 위하여 가한 첨가제는 수용액 상태 뿐만 아니라, 동결건조 상태 및 연고, 크림 등의 의약품 기재와 혼합했을 때에도 유효하기 때무에, 본 발명의 조성물은 점안액, 인연고제, 크림제, 외용 연고제 등으로 사용가능하다. 점안액은 유효량의 EGF를 안정화 시키는 역할을 하는 붕산염 완충액에 용해시키고, 본 발명의 트윈-20, 큐스로스 모노 팔미테이트와 같은 첨가제를 안정화제로 넣어 제조할 수 있다. 이때 티메로살, 클로로부탄올 및 파라벤유도체 같은 방부제를 넣을 수 있으며, 등장액으로 제조하기 위해 댁스트로스, 만니톨과 같은 당 혹은 글리신, 알라닌 및 리신과 같은 아미노산을 넣을 수 있고 0.2μM의 여과지를 사용하여 2번 이상 여과하여 멸균할 수 있다. 안연고 및 외용 연고제는 백색 바셀린, 라놀린 및 유동파라핀과 같은 연고기제를 가열하여 녹인 후, 60℃로 냉각하여 트윈-20, 슈크로스 모노 카프레즈 같은 본 발명의 첨가제를 안정화제로 넣고 40℃에서 유효량의 EGF를 넣고 잘 혼합하여 제조한다. 이때 클로로부탄올, 파라벤류 같은 방부제를 넣을 수 있다.

실시예 5

점안액 조성물의 제조( I )

하기의 처방으로 용액으로 제조한 후 무균여과하여 점안액으로 하였다.

EGF 50μg

슈크로스 모노카프레이트 100mg

황산나트륨 150mg

붕산 1240mg

덱스트로스 1544mg

염산 벤잘코니움 10mg

주사용 중류수 적량

실시예 6

점안액 조성물의 제조(Ⅱ)

실시예 1에서 슈크로스 모노카프레이트 대신 동량의 크레모포아 A25를 혼합하는 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 제조하였다.

실시예 7

점안액 조성물(Ⅲ)

실시예 1에서 슈크로스 모노카프레이트 대신 10배량의 폴리에틸렌글리콜 1500을 혼합하는 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 제조하였다.

실시예 8

안연고제 조성물의 제조

하기의 처방으로 무균적으로 제조하여 안연고제로 하였다.

EGF 50μg

트윈 20 10mg

정제 라놀린 10mg

유동 파라핀 50mg

백색 바셀린 875mg

클로로부탄올 5mg

실시예 9

외용 연고제 조성물의 제조

하기의 처방으로 무균적으로 제조하여 외용 연고제로 하였다.

EGF 50μg

폴리에틸렌글리콜1500 100mg

백색 바셀린 895mg

클로로부탄올 5mg

실시예 10

크림제 조성물 제조( I )

하기의 처방으로 무균적으로 제조하여 크림제로 하였다.

EGF 50μg

크레모포아 A25 25mg

폴리에틸렌크리콜 4000 72mg

유동파라핀 60mg

백색 바셀린 150mg

인산 나트륨 3mg

비.에치.에이 1mg

프로필 파라벤 1mg

주사용 중류수 적량

실시예 11

크림제 조성물의 제조(II)

실시예 10에 첨가된 폴리에틸렌글리콜 4000 대신 동량의 카프릴산 나트륨을 넣어 제조하였다. 본 발명에서 EGF 양은 비스테르이드 항염중제인 인도메타신에 비해 현저하게 작고 치료상태에 따라 그 양을 조절할 수 있었다. 예컨대 성인 환자의 각막과 피부 상처 치료에 사용시, 이 조성물의 EGF 농도는 0.01 내지 100μg/ml 또는 g. 바람직하게는 0.1 내지 50μg/ml 또는 g으로 이 조성물을 매일 1 내지 4회 투여하여 바람직한 범위내의 투여량이 되게하는 것이 바람직하다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하여듯이, 본 발명은 샘물학적으로 활성인 EGF에 첨가제로서 페놀, 폴리에틸렌글리콜, 지방산 염, 슈크로스 지방산 에스테르, 계면활성제, 황산나트륨, 아미노산, 타우린, 만니톨, 젤라틴, 휘브로넥틴, 히알우론산 및 유기산완충액 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 또는 2 이상의 첨가제를 함유하며, 생물학적 활성 및 미세균질성을 지속적으로 유지하는 안정한 EGF 조성물을 제공한다.

Claims (10)

1. (ⅰ ) 생물학적 활성이 있는 상피 세포 성장인자(EGF)와, ( ii) 0.01 내지 1,0% 휘브로넥틴, 0.1 내지 0.4% 히알우론상으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 물질을 함유하는 EGF 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상피세포 성장인자(EGF)는 제조합 벡터 pTE 105로 형질전환된 대장균 JM101(E. coli JM 101 ; KCCM-10027)으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 EGF 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상피세포 성장인자(EGF)는 20mM 인산 완충액에 용해되어 있는 것을 특징으로 하는 EGF 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상피세포 성장인자(EGF)는 동결건조된 분말상태인 것을 특징으로 하는 EGF 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 단백질 제제의 pH가 6 내지 8인 것을 특징으로 하는 EGF 조성물.
6. 제 1항에 있어서, EGF 농도가 0.01 내지 100μg/ml인 것을 특징으로 하는 EGF 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 점안제인 EGF 조성물.
8. 제 1항에 있어서, 안연고제인 EGF 조성물.
9. 제 1항에 있어서, 외용 연고제인 EGF 조성물.
10. 제 1항에 있어서. 크림제인 EGF 조성물.