JP2020518270A - タンパク質の半減期を増加させる方法 - Google Patents
タンパク質の半減期を増加させる方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
1.発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
(1)発現ベクタークローニング
EGFをクローニングするためにHeLa細胞(ATCC、CRM−CCL−2TM)からTrizolとクロロホルムを用いて精製されたRNAを抽出した。次にSuperScriptTM First−Strand cDNA Synthesis System(Invitrogen、Grand Island、NY)を用いて一本鎖cDNAを合成した。合成されたcDNAをテンプレート(template)として用いて重合酵素連鎖反応を通じてEGFを増幅した。EGF DNA増幅産物とpcDNA3−myc(5.6kb)を制限酵素であるBamHIとXhoIにより切片を作った後に接合してクローニングし(図1、EGFのアミノ酸配列:配列番号1)、制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図2)。また、図1の塩基配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットであり、その結果もまたアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図2)。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである;初期変性を94℃で3分間反応させた後、変性(denature)反応のために94℃で30秒間、アニーリング(annealing)反応のために52℃で30秒間、延長(extention)反応のために72℃で30秒間を25サイクルで繰り返して実行し、その後、72℃で10分間反応させた。このように作製されたDNAがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図1のマップに表示されたpcDNA3−mycベクターに存在するmycを抗−myc(9E10、Santa Cruz Biotechnology、sc−40)抗体を用いてウェスタンブロット(Western blot)を通じてその発現を確認した。それにより、mycに結合されたEGFタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチン(actin)で確認したブロット(blot)を通じて適正量がロード(loading)されたことを確認した(図3)。
部位特異的突然変異誘発(site−directed mutagenesis)を用いてリジン残基をアルギニン(Arginine、R)で置換し、特定の突然変異を誘発するDNA配列を用いてプライマー(EGF K28R FP 5’−GAAGCATTGGACAGGTATGCATGCAAC−3’(配列番号2)、RP 5’−GTTGCATGCATACCTGTCCAATGCTTC−3’(配列番号3);EGF K48R FP 5’−TACCGAGACCTGAGGTGGTGGGAACTG−3’(配列番号4)、RP 5’−CAGTTCCCACCACCTCAGGTCTCGGTA−3’(配列番号5)を作製した後、PCRを実行して特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドDNAを作製した。pcDNA3−myc−EGFをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換(K→R)されたプラスミドDNAを作製した(表1)。
pcDNA3−myc−EGF WTとpMT123−HA−ユビキチン(J Biol Chem.、279(4)、2368−2376、2004;Cell Research、22、873885、2012;Oncogene、22、12731280、2003;Cell、78、787−798、1994)をコードするプラスミドを用いてHEK 293T細胞(ATCC、CRL−3216)を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、pcDNA3−myc−EGF WT 3μgとpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgを細胞に共トランスフェクション(co−transfection)し、24時間後にMG132(プロテアソーム阻害剤、5μg/ml、Sigma Aldrich)を6時間処理した後、免疫沈降分析を実施した(図4)。また、WTと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、pcDNA3−myc−EGF WT、pcDNA3−myc−EGF置換体(K28R)およびpcDNA3−myc−EGF置換体(K48R)の各々3μgをpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgと共にHEK 293T細胞(ATCC、CRL−3216)を共トランスフェクション(co−transfection)させ、24時間後に免疫沈降分析を実施した(図5)。
pcDNA3−myc−EGF WT、pcDNA3−myc−EGF置換体(K28R)、pcDNA3−myc−EGF置換体(K48R)およびpcDNA3−myc−EGF置換体(K28R+K48R)を各々3μgずつHEK 293T細胞にトランスフェクション(transfection)した。トランスフェクションして48時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)(Sigma−Aldrich)(100μg/ml)を処理し、1時間、2時間、4時間にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトEGFの分解が抑制されることを確認した(図6)。ヒトEGFの半減期は2時間以内であるのに対し、ヒトEGF置換体(K28R)、EGF置換体(K48R)、EGF置換体(K28R+K48R)の半減期は4時間以上とWTより長く、その結果をグラフで示した(図6)。
EGFは、成長因子としてRas−Raf−MEK1/2−Erkシグナル伝達(signaling)によってErk1/2を活性化させることが報告されている(Journal of Cell Science 117、4619−4628、2004)。
1.発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
(1)発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるPDGFAとPDGFB DNA増幅産物とpcDNA3−myc(5.6kb)を制限酵素であるBamHIとXhoIにより切片を作った後に接合してクローニングした(図8、PDGFAとPDGFBのアミノ酸配列:配列番号6と配列番号7)。その結果は、制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図9)。また、図8の塩基配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図9)。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである;初期変性を94℃で3分間反応させた後、変性反応のために94℃で30秒間、アニーリング反応のために60℃で30秒間、延長反応のために72℃で45秒間を25サイクルで繰り返して実行し、その後、72℃で10分間反応させた。このように作製されたDNAがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図8のマップに表示されたpcDNA3−mycベクターに存在するmycを抗−myc(9E10、Santa Cruz Biotechnology、sc−40)抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認した。mycに結合されたPDGFAとPDGFBタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した(図10)。
部位特異的突然変異誘発(site−directed mutagenesis)を用いてリジン残基をアルギニン(Arginine、R)で置換し、特定の突然変異を誘発するDNA配列を用いてプライマー(PDGFA K160R FP 5’−GAATACGTCAGGAGGAAGCCAAAATTA−3’(配列番号8)、RP 5’−TAATTTTGGCTTCCTCCTGACGTATTC−3’(配列番号9);PDGFA K165R FP 5’−AAGCCAAAATTAAGAGAAGTCCAGGTG−3’(配列番号10)、RP 5’−CACCTGGACTTCTCTTAATTTTGGCTT−3’(配列番号11);PDGFA K206R FP 5’−AAACGGAAAAGAAGAAGGTTAAAACCC−3’(配列番号12)、RP 5’−GGGTTTTAACCTTCTTCTTTTCCGTTT−3’(配列番号13)、(PDGFB K162R FP 5’−ATTGTGCGGAAGAGGCCAATCTTT−3’(配列番号14)、RP 5’−AAAGATTGGCCTCTTCCGCACAAT−3’(配列番号15);PDGFB K167R FP 5’−CCAATCTTTAAGAGGGCCACGGTG−3’(配列番号16)、RP 5’−CACCGTGGCCCTCTTAAAGATTGG−3’(配列番号17);PDGFB K179R FP 5’−CACCTGGCATGCAGGTGTGAGACA−3’(配列番号18)、RP 5’−TGTCTCACACCTGCATGCCAGGTG−3’(配列番号19)を作製した後、PCRを実行して特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドDNAを作製した。pcDNA3−myc−PDGFAをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換(K→R)された3個のプラスミドDNAを作製した(表2)。
pcDNA3−myc−PDGFA WTとpMT123−HA−ユビキチン(J Biol Chem.、279(4)、2368−2376、2004;Cell Research、22、873885、2012;Oncogene、22、12731280、2003;Cell、78、787−798、1994)をコードするプラスミドを用いてHEK 293T細胞(ATCC、CRL−3216)を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、pcDNA3−myc−PDGFA WT 3μgとpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgを細胞に共トランスフェクション(co−transfection)し、24時間後にMG132(プロテアソーム阻害剤、5μg/ml)を6時間処理した後、免疫沈降分析を実施した(図4)。また、WTと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、pcDNA3−myc−PDGFA WT、pcDNA3−myc−PDGFA置換体(K160R)、pcDNA3−myc−PDGFA置換体(K165R)およびpcDNA3−myc−PDGFA置換体(K206R)と、pcDNA3−myc−PDGFB WT、pcDNA3−myc−PDGFB置換体(K162R)、pcDNA3−myc−PDGFB置換体(K167R)およびpcDNA3−myc−PDGFB置換体(K179R)の各々3μgをpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgと共にHEK 293T細胞(ATCC、CRL−3216)を共トランスフェクション(co−transfection)し、24時間後に免疫沈降分析を実施した(図11)。
免疫沈降のために得られたタンパク質サンプルは、溶解緩衝液(1% Triton X、150mM NaCl、50mM Tris−HCl、pH 8および1mM PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)で溶解した後、抗−myc(9E10)一次抗体(Santa Cruz Biotechnology、sc−40)と混合して4℃で一晩培養した。免疫沈降体は、タンパク質A/Gビーズ(Santa Cruz Biotechnology)を用いて4℃で2時間反応させて分離した。次に、溶解緩衝液で2回洗浄した。タンパク質サンプルを2X SDS緩衝液と混合した後、100℃で7分間加熱した後、SDS−PAGEを実施して分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン(polyvinylidene difluoride、PVDF)膜(Millipore)に移動させた後、抗−myc(9E10、Santa Cruz Biotechnology、sc−40)、抗−HA(Santa Cruz Biotechnology、sc−7392)および抗−β−アクチン(Santa Cruz Biotechnology、sc−47778)を1:1,000の重量比で含むブロッキング溶液と抗−マウス(Peroxidase−labeled antibody to mouse IgG(H+L)、KPL、074−1806)二次抗体を用いてECLシステム(Western blot detection kit、ABfrontier、Seoul、Korea)で現像した。その結果、抗−myc(9E10、sc−40)で免疫沈降を実施した場合、pcDNA3−myc−PDGFA WTとpcDNA3−myc−PDGFB WTにはユビキチンが結合してポリユビキチン化が形成されることによって、スメア(smear)ユビキチンが探知されてバンドが濃く現れた(図4、レーン3、4、7および8)。また、MG132(プロテアソーム阻害剤、5μg/ml)を6時間処理した場合、ポリユビキチン化の形成が増加してユビキチンが探知されるバンドがさらに濃く現れた(図4、レーン4および8)。このような結果は、PDGFAとPDGFBがユビキチンと結合し、ユビキチン−プロテアソームシステムを通じてポリユビキチン化されることを提示する。また、pcDNA3−myc−PDGFA置換体(K160R)、pcDNA3−myc−PDGFA置換体(K165R)、pcDNA3−myc−PDGFA置換体(K206R)、pcDNA3−myc−PDGFB置換体(K162R)、pcDNA3−myc−PDGFB置換体(K167R)およびpcDNA3−myc−PDGFB置換体(K179R)の場合、WTよりバンドが薄く現れた。これは、これらの置換体にユビキチンが結合できずユビキチンが少なく検出されたことを示す(図12、レーン3〜5および8〜10)。
pcDNA3−myc−PDGFA WT、pcDNA3−myc−PDGFA置換体(K160R)、pcDNA3−myc−PDGFA置換体(K165R)およびpcDNA3−myc−PDGFA置換体(K206R)と、pcDNA3−myc−PDGFB WT、pcDNA3−myc−PDGFB置換体(K162R)、pcDNA3−myc−PDGFB置換体(K167R)およびpcDNA3−myc−PDGFB置換体(K179R)を各々3μgずつHEK 293T細胞にトランスフェクション(transfection)した。トランスフェクションして48時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)(Sigma−Aldrich)(100μg/ml)を処理し、30分、60分および90分と、15分、30分および60分にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトPDGFAとPDGFBの分解が抑制されることを確認した(図6)。ヒトPDGFAは60分後に分解されるのに対し、ヒトPDGFA置換体(K160R)、PDGFA置換体(K165R)およびPDGFA置換体(K206R)は90分以上でも分解されないことが分かり、ヒトPDGFBは30分で分解されるのに対し、ヒトPDGFB置換体(K162R)、PDGFB置換体(K167R)およびPDGFB置換体(K179R)は60分以上でも分解されないことが分かり、その結果をグラフで示した(図13、14および15)。
PDGFは、成長因子としてRas−Raf−MEK1/2−Erkシグナル伝達によってErk1/2を活性化させることが報告されている(Journal of Cell Science 117、4619−4628、2004)。
1.発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
(1)発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるGM−CSF DNA増幅産物とpcDNA3−myc(5.6kb)を制限酵素であるBamHIとXhoIにより切片を作った後に接合してクローニングし(図17、GM−CSFのアミノ酸配列:配列番号20)、その結果は制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図18)。また、図17の塩基配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図18)。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである;初期変性を94℃で3分間反応させた後、変性反応のために94℃で30秒間、アニーリング反応のために60℃で30秒間、延長反応のために72℃で30秒間を25サイクルで繰り返して実行し、その後、72℃で10分間反応させた。このように作製されたDNAがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図17のマップに表示されたpcDNA3−mycベクターに存在するmycを抗−myc(9E10、sc−40)抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認し、それにより、mycに結合されたGM−CSFタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した(図19)。
部位特異的突然変異誘発(site−directed mutagenesis)を用いてリジン残基をアルギニンで置換し、特定の突然変異を誘発するDNA配列を用いてプライマー(GM−CSF K89R FP 5’−GGCAGCCTCACCAGGCTCAAGGGCC−3’(配列番号21)、RP 5’−GGCCCTTGAGCCTGGTGAGGCTGCC−3’(配列番号22);GM−CSF K91R FP 5’−CTC ACCAAGCTCAGGGGCCCCTTGACC−3’(配列番号23)、RP 5’−GGTCAAGGGGCCCCTGAGCTTGGTGAG−3’(配列番号24);GM−CSF K102R FP 5’−GCTAGCCACTACAGACAGCACTGCCCT−3’(配列番号25)、RP 5’−AGGGCAGTGCTGTCTGTAGTGGCTAGC−3’(配列番号26)を作製した後、特定の条件でPCRを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドDNAを作製した。pcDNA3−myc−GM−CSFをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換(K→R)された3個のプラスミドDNAを作製した(表3)。
pcDNA3−myc−GM−CSF WTとpMT123−HA−ユビキチンDNAをコードするプラスミドを用いてHEK 293T細胞を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、pcDNA3−myc−GM−CSF WT 3μgとpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgを細胞に共トランスフェクション(co−transfection)させ、24時間後にMG132(プロテアソーム阻害剤、5μg/ml)を6時間処理した後、免疫沈降分析を実施した(図20)。また、WTと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、pcDNA3−myc−GM−CSF WT、pcDNA3−myc−GM−CSF置換体(K89R)、pcDNA3−myc−GM−CSF置換体(K91R)およびpcDNA3−myc−GM−CSF置換体(K102R)の各々3μgをpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgと共にHEK 293T細胞(ATCC、CRL−3216)を共トランスフェクション(co−transfection)し、24時間後に免疫沈降分析を実施した(図21)。
pcDNA3−myc−GM−CSF WT、pcDNA3−myc−GM−CSF置換体(K89R)、pcDNA3−myc−GM−CSF置換体(K91R)、pcDNA3−myc−GM−CSF置換体(K102R)を各々3μgずつHEK 293T細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションして48時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)(Sigma−Aldrich)(100μg/ml)を処理し、30分、60分、90分にかけて半減期を測定してみた結果、ヒトGM−CSFの分解が抑制されることを確認した(図22および23)。ヒトGM−CSFの半減期は30分以内であるのに対し、ヒトpcDNA3−myc−GM−CSF置換体(K91R)、pcDNA3−myc−GM−CSF置換体(K102R)の半減期は60分および90分以上としてWTより長く、その結果をグラフで示した(図22および23)。
GM−CSFによる細胞内役割は、JAK/STAT、MAPKおよびPI3K/AKTシグナル伝達によって作用することが報告されている(Blood、119(15):3383−3393、2012)。
1.発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
(1)発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるFSH−αとFSH−βのDNA増幅産物とpcDNA3−myc(5.6kb)を制限酵素であるBamHIとXhoIにより切片を作った後に接合してクローニングし(図25、FSH−αのアミノ酸配列:配列番号27およびFSH−βのアミノ酸配列:配列番号28)、その結果は制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図26)。また、図25の塩基配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図26)。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである;初期変性を94℃で3分間反応させた後、変性反応のために94℃で30秒間、アニーリング反応のために56℃で30秒間、延長反応のために72℃で1分間を25サイクルで繰り返して実行し、その後、72℃で10分間反応させた。このように作製されたDNAがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図29のマップに表示されたpcDNA3−mycベクターに存在するmycを抗−myc(9E10、Santa Cruz Biotechnology、sc−40)抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認した。mycに結合されたFSH−αとFSH−βタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した(図27)。
部位特異的突然変異誘発(site−directed mutagenesis)を用いてリジン残基をアルギニンで置換し、特定の突然変異を誘発するDNA配列を用いてプライマー(FSH−αK75R FP 5’−ATGTTGGTCCAAAGGAACGTCACC−3’(配列番号29)、RP 5’−GGTGACGTTCCTTTGGACCAACAT−3’(配列番号30)、FSH−αK99R FP 5’−ATGGGGGGTTTCAGAGTGGAGAAC−3’(配列番号31)、RP 5’−GTTCTCCACTCTGAAACCCCCCAT−3’(配列番号32)、FSH−αK115R FP 5’−TGTTATTATCACAGATCTTAACTCGAG−3’(配列番号33)、RP 5’−CTCGAGTTAAGATCTGTGATAATAACA−3’(配列番号34)、FSH−βK67R FP 5’−GGCCCAAAATCCAGAGAACATGTACCTT−3’(配列番号35)、RP 5’−AAGGTACATGTTCTCTGGATTTTGGGCC−3’(配列番号36)、FSH−βK104R FP 5’−GTCACTGTGGCAGGTGTGACAGCGA−3’(配列番号37)、RP 5’−TCGCTGTCACACCTGCCACAGTGAC−3’(配列番号38)、FSH−βK128R FP 5’−GGTGAAATGAGAGAAACGCGTACGCGG−3’(配列番号39)、RP 5’−CCGCGTACGCGTTTCTCTCATTTCACC−3’(配列番号40)を作製した後、特定の条件でPCRを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドDNAを作製した。pcDNA3−myc−FSH−αとpcDNA3−myc−FSH−βをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換(K→R)された各々3個のプラスミドDNAを作製した(表4)。
pcDNA3−myc−FSH−αWTとpMT123−HA−ユビキチンDNAをコードするプラスミドを用いてHEK293T細胞を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、pcDNA3−myc−FSH−αWTおよびpcDNA3−myc−FSH−βWTの各々3μgとpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgを細胞に共トランスフェクション(co−transfection)し、24時間後にMG132(プロテアソーム阻害剤、5μg/ml)を6時間処理した後、免疫沈降分析を実施した(図28)。また、WTと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、pcDNA3−myc−FSH−αWT、pcDNA3−myc−FSH−α置換体(K75R)、pcDNA3−myc−FSH−α置換体(K99R)およびpcDNA3−myc−FSH−α置換体(K115R)と、pcDNA3−myc−FSH−β置換体(K67R)、pcDNA3−myc−FSH−β置換体(K104R)、pcDNA3−myc−FSH−β置換体(K128R)の各々3μgをpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgと共にHEK 293T細胞(ATCC、CRL−3216)を共トランスフェクション(co−transfection)し、24時間後に免疫沈降分析を実施した(図28)。
pcDNA3−myc−FSH−αWT、pcDNA3−myc−FSH−α置換体(K75R)、pcDNA3−myc−FSH−α置換体(K99R)、pcDNA3−myc−FSH−α置換体(K115R)、およびpcDNA3−myc−FSH−βWT、pcDNA3−myc−FSH−β置換体(K67R)、pcDNA3−myc−FSH−β置換体(K104R)、pcDNA3−myc−FSH−β置換体(K128R)を3μgずつHeLa細胞にトランスフェクション(transfection)した。トランスフェクションして48時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)(Sigma−Aldrich)(100μg/ml)で処理し、30分、60分、90分にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトFSHの分解が抑制されることを確認した(図27)。ヒトFSH−αの半減期は45分であるのに対し、ヒトpcDNA3−myc−FSH−α置換体(K99R)の半減期は90分以上とWTより長く、ヒトFSH−βの半減期は30分以内であるのに対し、ヒトpcDNA3−myc−FSH−β置換体(K104R)の半減期は60分以上、pcDNA3−myc−FSH−β置換体(K67R)、pcDNA3−myc−FSH−β置換体(K128R)の半減期は90分以上とWTより長く、その結果をグラフで示した(図30、31および32)。
FSHシグナル伝達は、細胞内cAMPを増加させ、それによってPKAが活性になると、CREBPのような転写因子などのリン酸化を調節し、また、Erk、PI3K/AKTシグナル伝達と関連することが報告されている(Front Endocrinol(Lausanne)、6:142、2015;Biochem J.、473(11):1483−1501、2016)。
1.発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
(1)発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるANGPT−1 DNA増幅産物とpcDNA3−myc(5.6kb)を制限酵素であるBamHIとXhoIにより切片を作った後に接合してクローニングし(図34、ANGPT−1のアミノ酸配列:配列番号41)、その結果は制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図35)。また、図34の塩基配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した(図35)。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである;初期変性を94℃で3分間反応させた後、変性反応のために94℃で30秒間、アニーリング反応のために60℃で30秒間、延長反応のために72℃で1分30秒間を25サイクルで繰り返して実行し、その後、72℃で10分間反応させた。このように作製されたDNAがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図34のマップに表示されたpcDNA3−mycベクターに存在するmycを抗−myc(9E10、Santa Cruz Biotechnology、sc−40)抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認した。mycに結合されたANGPT−1タンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した(図36)。
部位特異的突然変異誘発(site−directed mutagenesis)を用いてリジン残基をアルギニンで置換し、特定の突然変異を誘発するDNA配列を用いてプライマー(ANGPT−1 K175R FP 5’−ACCTACAAGCTAGAGAGGCAACTTCTTCAA−3’(配列番号42)、RP 5’−TTGAAGAAGTTGCCTCTCTAGCTTGTAGGT−3’(配列番号43)、ANGPT−1 K216R FP 5’−ACCTTAAAGGAAGAGAGAGAGAACCTTCAA−3’(配列番号44)、RP 5’−TTGAAGGTTCTCTCTCTCTTCCTTTAAGGT−3’(配列番号45)、ANGPT−1 K414R FP 5’−GGGACAGCAGGAAGACAGAGCAGC−3’(配列番号46)、RP 5’−GCTGCTCTGTCTTCCTGCTGTCCC−3’(配列番号47)を作製した後、特定の条件でPCRを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドDNAを作製した。pcDNA3−myc−ANGPT−1をテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換(K→R)された3個のプラスミドDNAを作製した(表5)。
pcDNA3−myc−ANGPT−1 WTとpMT123−HA−ユビキチンDNAをコードするプラスミドを用いてHEK 293T細胞を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、pcDNA3−myc−ANGPT−1 WT 3μgとpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgを細胞に共トランスフェクション(co−transfection)し、24時間後にMG132(プロテアソーム阻害剤、5μg/ml)を6時間処理した後、免疫沈降分析を実施した(図37)。また、WTと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、pcDNA3−myc−ANGPT−1 WT、pcDNA3−myc−ANGPT−1置換体(K175R)、pcDNA3−myc−ANGPT−1置換体(K216R)およびpcDNA3−myc−ANGPT−1置換体(K414R)の各々3μgをpMT123−HA−ユビキチンDNA 1μgと共にHEK 293T細胞(ATCC、CRL−3216)を共トランスフェクション(co−transfection)し、24時間後に免疫沈降分析を実施した(図38)。
pcDNA3−myc−ANGPT−1 WT、pcDNA3−myc−ANGPT−1置換体(K175R)、pcDNA3−myc−ANGPT−1置換体(K216R)、pcDNA3−myc−ANGPT−1置換体(K414R)を3μgずつHEK 293T細胞にトランスフェクション(transfection)した。トランスフェクションして48時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)(Sigma−Aldrich)(100μg/ml)を処理し、30分、60分および90分にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトANGPT−1の分解が抑制されることを確認した(図39および40)。ヒトANGPT−1の半減期は20分以内であるのに対し、ヒトpcDNA3−myc−ANGPT−1置換体(K216R)の半減期は30分以上としてWTより長く、その結果はグラフで示した(図39および40)。
ANGPT−1は、細胞内ANGPTTIEシグナル伝達経路によってMAPKおよびPI3K/AKTシグナル伝達を活性化し、その後、内皮細胞間の相互作用および細胞成長に関与することが報告されている(Nat Rev Cancer、10(8):575−585、2010)。
Claims (31)
- タンパク質または(ポリ)ペプチドにおいてユビキチン(ubiquitin)のC末端のグリシン(glycine)と結合するリジン(lysine)のうち一つ以上をアルギニン(arginine)で置換することを含む、タンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期(half−life)を増加させる方法。
- 前記タンパク質がEGFであることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記EGFが配列番号1のアミノ酸配列を有し、そのN末端から28および48番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項2に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がPDGFAであることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記PDGFAが配列番号6のアミノ酸配列を有し、そのN末端から160、165および206番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項4に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がPDGFBであることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記PDGFBが配列番号7のアミノ酸配列を有し、そのN末端から162、167および179番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項6に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がGM−CSFであることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記GM−CSFが配列番号20のアミノ酸配列を有し、そのN末端から89、91および102番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項8に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がFSH−αであることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記FSH−αが配列番号27のアミノ酸配列を有し、そのN末端から75、99および115番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項10に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がFSH−βであることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記FSH−βが配列番号28のアミノ酸配列を有し、そのN末端から67、104および128番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項12に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がANGPT−1であることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記ANGPT−1が配列番号41のアミノ酸配列を有し、そのN末端から175、216および414番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項14に記載のタンパク質または(ポリ)ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 増加した半減期を有するタンパク質であって、前記タンパク質のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換され、前記置換されたリジン残基はユビキチンのC末端グリシンと結合することを特徴とする、増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記増加した半減期を有するタンパク質は、成長ホルモン放出ホルモン(growth hormone releasing hormone、GHRH)、成長ホルモン放出ペプチド(growth hormone releasing peptide)、インターフェロン(interferons、interferon−α or interferon−β)、インターフェロン受容体(interferon receptors)、コロニー刺激因子(colony stimulating factors、CSFs)、グルカゴン様ペプチド(glucagon−like peptides)、インターロイキン(interleukins)、インターロイキン受容体(interleukin receptors)、酵素(enzymes)、インターロイキン結合タンパク質(interleukin binding proteins)、サイトカイン結合タンパク質(cytokine binding proteins)、Gタンパク質共役受容体(G−protein−coupled receptor)、ヒト成長ホルモン(human growth hormone、hGH)、マクロファージ活性因子(macrophage activating factor)、マクロファージペプチド(macrophage peptide)、B細胞因子(B cell factor)、T細胞因子(T cell factor)、タンパク質A(protein A)、アレルギー阻害剤(allergy inhibitor)、細胞壊死糖タンパク質(cell necrosis glycoproteins)、Gタンパク質共役受容体(G−protein−coupled receptor)、免疫毒素(immunotoxin)、リンフォトキシン(lymphotoxin)、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、腫瘍抑制因子(tumor suppressors)、転移成長因子(metastasis growth factor)、α−1抗トリプシン(alpha−1 antitrypsin)、アルブミン(albumin)、α−ラクトアルブミン(alpha−lactalbumin)、アポリポタンパク質−E(apolipoprotein−E)、エリスロポエチン(erythropoietin)、高度グリコシル化エリスロポエチン(highly glycosylated erythropoietin)、アンジオポエチン(angiopoietins)、ヘモグロビン(hemoglobin)、トロンビン(thrombin)、トロンビン受容体活性ペプチド(thrombin receptor activating peptide)、トロンボモジュリン(thrombomodulin)、第VII因子(factor VII)、第VIIa因子(factor VIIa)、第VIII因子(factor VIII)、第IX因子(factor IX)、第XIII因子(factor XIII)、プラスミノゲン活性因子(plasminogen activating factor)、ウロキナーゼ(urokinase)、ストレプトキナーゼ(streptokinase)、ヒルジン(hirudin)、タンパク質C(protein C)、C−反応性タンパク質(C−reactive protein)、レニン阻害剤(renin inhibitor)、コラゲナーゼ阻害剤(collagenase inhibitor)、スーパーオキシドディスムターゼ(superoxide dismutase)、レプチン(leptin)、血小板由来成長因子(platelet−derived growth factor)、上皮成長因子(epithelial growth factor)、上皮成長因子(epidermal growth factor)、アンギオスタチン(angiostatin)、アンギオテンシン(angiotensin)、骨成長因子(bone growth factor)、骨刺激タンパク質(bone stimulating protein)、カルシトニン(calcitonin)、インスリン(insulin)、アトリオペプチン(atriopeptin)、軟骨誘導因子(cartilage inducing factor)、フィブリン結合ペプチド(fibrin−binding peptide)、エルカトニン(elcatonin)、結合組織活性因子(connective tissue activating factor)、組織因子経路阻害剤(tissue factor pathway inhibitor)、卵胞刺激ホルモン(follicle stimulating hormone)、黄体形成ホルモン(luteinizing hormone)、黄体形成ホルモン放出ホルモン(luteinizing hormone releasing hormone)、神経成長因子(nerve growth factors)、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone)、レラキシン(relaxin)、セクレチン(secretin)、ソマトメジン(somatomedin)、インスリン様成長因子(insulin−like growth factor)、副腎皮質ホルモン(adrenocortical hormone)、グルカゴン(glucagon)、コレシストキニン(cholecystokinin)、膵臓ポリペプチド(pancreatic polypeptide)、ガストリン放出ペプチド(gastrin releasing peptide)、副腎皮質刺激ホルモン放出因子(corticotropin releasing factor)、甲状腺刺激ホルモン(thyroid stimulating hormone)、オートタキシン(autotaxin)、ラクトフェリン(lactoferrin)、ミオスタチン(myostatin)、受容体(receptors)、受容体拮抗薬(receptor antagonists)、細胞表面抗原(cell surface antigens)、ウイルス由来ワクチン抗原(virus derived vaccine antigens)、モノクローナル抗体(monoclonal antibodies)、ポリクローナル抗体(polyclonal antibodies)または抗体フラグメントであることを特徴とする、請求項16に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号1を有するEGFであり、そのN末端から28および48番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項16に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号6を有するPDGFAであり、そのN末端から160、165および206番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項16に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号7を有するPDGFBであり、そのN末端から162、167および179番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項16に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号20を有するGM−CSFであり、そのN末端から89、91および102番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項16に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号27を有するFSH−αであり、そのN末端から75、99および115番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項16に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号28を有するFSH−βであり、そのN末端から67、104および128番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項16に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号41を有するANGPT−1であり、そのN末端から175、216および414番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項16に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 請求項18に記載のEGFおよび賦形剤を含む、細胞成長、皮膚およびヘアの再生および/または治療のための薬学および/または美容組成物。
- 請求項19に記載のPDGFAまたは請求項20に記載のPDGFBおよび賦形剤を含む、細胞成長、血管生成および慢性潰瘍と骨損失の回復のための薬学および/または美容組成物。
- 請求項21に記載のGM−CSFおよび薬剤学的に許容される賦形剤を含む、好中球減少症の予防および/または免疫疾患および/または固形癌および血液癌を含む癌および/またはリウマチ関節炎の予防および/または治療用の薬学組成物。
- 請求項22に記載のFSH−αまたは請求項23に記載のFSH−βおよび薬剤学的に許容される賦形剤を含む、過排卵誘導のための不妊治療剤および/または固形癌治療用の薬学組成物。
- 請求項24に記載のANGPT−1および薬剤学的に許容される賦形剤を含む、糖尿病、心臓疾患および/または敗血症治療用の薬学組成物。
- (a)プロモータ、(b)請求項16〜24のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする塩基配列、および任意のリンカーを含む発現ベクターであって、前記プロモータと塩基配列が作動的に連結されたものである、発現ベクター。
- 請求項30に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
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