JP4747238B2 - 生物応答修飾タンパク質の効力を改善する方法及び典型的な突然変異タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、生物応答修飾機能を有する結合ドメイン内のフェニルアラニン残基を、受容体、リガンドまたは基質に結合することによってバリンに置換するタンパク質変異体に関するものである。より具体的には、本発明は、ヒトサイトカインタンパク質の対応する受容体に対する結合に関与するα-へリックス領域内フェニルアラニン残基をバリンに置換するタンパク質変異体に関するものである。

多くのヒト疾患は、タンパク質の欠損または量不足に起因するタンパク質機能の低下によって引き起こされる。かかる疾患を治療するため、関連タンパク質が患者に直接投与されている。しかし、医薬として使用される多くの生理活性タンパク質は、標的組織に達してその中で作用する前に血清中で容易に分解されてしまう。 このため、治療価値を有するほとんどの生理活性タンパク質は、満足な治療効果を提供する能力のある適切な濃度を維持するために、過剰ないしは頻繁に患者に投与される。

上記問題を解決する方法には、ポリエチレングリコールと共役させる（ペグ化）か、または生理活性タンパク質をマイクロカプセル化する方法があるが、これらのアプローチは、主に微生物内で生成される標的タンパク質を精製し、次いでペグ化またはマイクロカプセル化しなくてはならないため、面倒である。しかも、架橋結合が望ましくない位置で起こる可能性があり、最終産物の均一性にネガティブに作用する場合もある。

別のアプローチでは、グリコシル化を要する。真核細胞が生成する細胞表面タンパク質及び分泌タンパク質はグリコシル化過程によって修飾される。グリコシル化は、タンパク質の生体内安定性と機能、ならびにそれらの生理学的性質に影響をおよぼすことが分かっている。しかし、グリコシル化タンパク質は、グリコシル化を行う能力のある真核細胞によってのみ生成できるので、その生成過程は複雑であり、すべての所望位置でグリコシル化された均一な最終産物を得ることは困難である。

しかも、本従来技術のすべてのアプローチは、投与頻度に関連する問題を改善するが、タンパク質の生理学的効力を増加せず、結果として過剰用量を招く。たとえば、Amgen社（米国特許第６,５８６,３９８号を参照）によって開発されたＮＥＳＰは、血液中タンパク質の半減期を延長させることによって頻繁な投与を改善するが、タンパク質の効力を増加せず、結果として過剰用量を招き、遮断抗体の産生を誘導する可能性がある。

生理活性タンパク質の効力を改善するために使用されるアプローチは、野生型タンパク質のアミノ酸残基の一部を変異誘発してタンパク質の生物活性を改善する。関連タンパク質変異体は、以下の特許刊行物において開示されている：（１）米国特許第５,４５７,０８９号：カルボキシル領域が変化してＥＰＯのその受容体に対する結合親和性が高められていることを特徴とするヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）変異体。（２）国際特許公開番号０２/０７７０３４：Ｔ細胞エピトープが変化してヒトにおけるヒトＧ-ＣＳＦ免疫原性が低下されていることを特徴とするヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）変異体。（３）国際特許公開番号９９/５７１４７：ヒト成熟ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）アミノ酸残基位置７〜１５１位に対応するアミノ酸配列を有するＴＰＯタンパク質において、グルタミニン酸を１１５の位置で、リシン、アルギニンまたはチロシンと置換することによって調製されたヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）変異体。（４）米国特許第６,１３６,５６３号及び第６,０２２,７１１号：第１８、２２、２５、２６、２９、６５、１６８及び１７４位にてアラニン置換体を有するヒト成長ホルモン変異体。

しかし、前記タンパク質変異体は、生体内抗原性の変化に拘わらず、治療効力のみを改善するために作られた変形態である。したがって、これらの改変の量、程度及び位置は、ヒトにおいて免疫反応を誘導する可能性が高い。ヒトにおける抗原性は、重大な有害事象を引き起こす恐れがある（Casadevall らの N. Eng. J. Med. ２００２、vol.３４６、p.４６９）。

よって、投与直後に生物応答修飾作用を最大限に引き出す能力と、従来の生物応答修飾タンパク質の効力改善を介して遮断抗体の形成を防止する能力があることを特徴とする、改良された薬理作用を有する生物応答修飾タンパク質変異体を提供すること、及びかかる変異体の調製方法を提供することが本発明の目的である。

一実施態様において本発明は、生物応答修飾機能を有するタンパク質結合ドメイン内のフェニルアラニン残基を、受容体、リガンドまたは基質に結合することによってバリンに置換するタンパク質変異体を提供する。

別の態様において本発明は、生物応答修飾機能を有するタンパク質結合ドメイン内のフェニルアラニン残基を、受容体、リガンドまたは基質に結合することによってバリンに置換するタンパク質変異体をコードするＤＮＡを提供する。

さらなる実施態様において本発明は、生物応答修飾機能を有するタンパク質結合ドメイン内のフェニルアラニン残基を、受容体、リガンドまたは基質に結合することによってバリンに置換するタンパク質変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターを提供する。

またもう一つの態様において本発明は、生物応答修飾機能を有するタンパク質結合ドメイン内のフェニルアラニン残基を、受容体、リガンドまたは基質に結合することによってバリンに置換するタンパク質変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。

さらに別の態様において本発明は、生物応答修飾機能を有するタンパク質結合ドメイン内のフェニルアラニン残基を、受容体、リガンドまたは基質に結合することによってバリンに置換するタンパク質変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養すること、及び該タンパク質変異体を結果として得られる培養物から単離することを含むタンパク質変異体の調製方法を提供する。

さらに別の態様において本発明は、生物応答修飾機能を有するタンパク質結合ドメイン内のフェニルアラニン残基を、受容体、リガンドまたは基質に結合することによってバリンに置換するタンパク質変異体と、医薬的に受容し得る担体ｊとを含む医薬組成物を提供する。

本発明の上記および他の目的、特徴および他の利点は、下記の添付図面と併せて以下の詳細説明からより明確に理解されるであろう。

本明細書中で使用したアミノ酸を意味する１大文字は、国際生化学連合（ＩＵＢ）によって規定された標準略語に基づいて以下のアミノ酸を表す：
Ａ：アラニン、Ｂ：アスバラギンまたはアスパラギン酸、
Ｃ：シスチン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、
Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ： ヒスチジン、
Ｉ：イソロイシン、Ｋ：リシン、Ｌ：ロイシン、
Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスバラギン、Ｐ：プロリン、
Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン、
Ｔ：トレオニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファン、
Ｙ：チロシン、及びＺ：グルタミンまたはグルタミン酸。

本明細書中で使用した記号表示「（アミノ酸を表す１大文字）（アミノ酸の位置）（別のアミノ酸を表す１大文字）」は、前述のアミノ酸が特定タンパク質の指定アミノ酸位置で後述のアミノ酸によって置換されることを意味する。たとえば、Ｆ４８Ｖは、フェニルアラニン残基が特定タンパク質のアミノ酸位置４８位でバリンによって置換されることを示す。このアミノ酸の位置は、成熟野生型タンパク質のＮ末端から番号付けされる。

本明細書中で使用した用語「タンパク質変異体」は、受容体、リガンドまたは基質に結合すること、具体的には、ドメイン内で受容体、リガンドまたは基質への結合に関与することにより、生理的機能を有するタンパク質中のフェニルアラニン残基をバリンに置換することによって、野生型形態とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。本発明では、タンパク質変異体を便宜上、「タンパク質名-［（アミノ酸を表す１大文字）（アミノ酸の位置）（別のアミノ酸を表す１大文字）］」と表す。たとえば、ＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］は、野生型ＴＰＯの１３１位での該フェニルアラニン残基がバリンによって置換されるＴＰＯ変異体を示す。

本明細書中で使用した用語「生物応答修飾タンパク質」、多細胞体内で発生する種々生物応答の開始または停止を誘導すること、及び互いに有機的に結合されるように応答を調節することによって、体内の恒常性維持に関与するタンパク質を意味する。これらのタンパク質は、典型的には受容体、リガンドまたは基質に結合することによって作用する。

本発明に従って変性する能力のあるタンパク質には、受容体、リガンドまたは基質を結合することによって生物応答を調節するという生得的な機能を有するすべてのタンパク質が含まれる。

該タンパク質の非限定的な例としては、サイトカイン、サイトカイン受容体、接着分子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、酵素、受容体チロシンキナーゼ、ケモカイン受容体、他の細胞表面タンパク質、及び可溶リガンドが挙げられる。該サイトカインの非限定的な例としては、ＣＮＴＦ（神経細胞栄養因子）、ＧＨ（成長ホルモン）、ＩＬ-１、ＩＬ-ＩＲａ（インターロイキン-１受容体拮抗薬）、胎盤ラクトゲン（ＰＬ）、カルジオリピン（cardioliphin）、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２、ＩＬ-１７、ＴＮＦ、ＴＧＦ（トランスフォーミング成長因子）、ＩＦＮ（インターフェロン）、ＧＭ-ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、Ｇ-ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）、Ｍ-ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、ＬＩＦ（白血病抑制因子）、ＯＳＭ（オンコスタチン-Ｍ）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、及びＬＰＴ（レプチン）が挙げられる。該サイトカイン受容体の非限定的な例には、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、ＩＬ-１３Ｒ、ＩＬ-１Ｒ、ＩＬ-２Ｒ、ＩＬ-３Ｒ、ＥＬ-４Ｒ、Ｌ-５Ｒ、ＩＬ-６Ｒ、Ｌ-７Ｒ、ＩＬ-９Ｒ、ＩＬ-１５Ｒ、ＴＮＦＲ、ＴＧＦＲ、ＩＦＮＲ（例えば、ＩＦＮ-γＲ α-連鎖、ＩＦＮ-γＲ β-連鎖）、インターフェロン-αＲ、-βＲ及び-γＲ、ＧＭ-ＣＳＦＲ、Ｇ-ＣＳＦＲ、ＥＰまたは、ｃＭｐｌ、ｇｐｌ３０、及びＦａｓ（Ａｐｏ１）が挙げられる。該ケモカイン受容体の例には、ＣＣＲ１及びＣＸＣＲＭが含まれる。該受容体チロシンキナーゼの例には、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｈｒｋ、ＲＥＫ７、Ｒｓｅ/Ｔｙｒｏ-３、肝細胞成長因子Ｒ、血小板由来成長因子Ｒ、及びＦｌｔ-１が含まれる。他の細胞表面タンパク質の例には、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ１００、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＬＡＧ-３、Ｂ７、Ｂ６１、β-ニューレキシン、ＣＴＬＡ-４、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ-１、補体Ｒ-２（ＣＤ２１）、ｌｇＥＲ、リソソーム膜ｇｐ-１、α２-マイクログロブリン受容体関連タンパク質、及びナトリウムペプチド受容体が含まれる。

生物応答調節機能を有する前記多数タンパク質びための生物応答調節効力を改善するため、本発明は、野生型と比べて疎水力が強い受容体、リガンドまたは基質に結合する能力のあるタンパク質変異体を提供することを意図する。この目的を達成するため、本発明は、該タンパク質のそれぞれの結合ドメイン内のフェニルアラニン残基をバリンに置換することを特徴とする。

フェニルアラニンは、芳香族側鎖及び３.０の既知疎水性指数を有する比較的に無極性のアミノ酸である。バリンは、脂肪族の側鎖及び４.０の既知疎水性指数を有する無極性の疎水性アミノ酸である。しかも、バリンはフェニルアラニンよりも小さいので、フェニルアラニン残基をバリンに置換するタンパク質は、対応する受容体、リガンドまたは基質に結合するポケット内においてより深く陥没するようになる。したがって、結合ドメイン内のフェニルアラニン残基をバリンに置換するタンパク質の疎水力は増大して、より深く陥没した空間を有するようになるので、該タンパク質の受容体、リガンドまたは基質に対する結合親和性は高まり、結果として所望する生物応答調節効率の向上を得ることができる。

しかも、フェニルアラニン残基のバリン置換は保存的置換としてタンパク質の二次または三次構造に最小限の影響しか及ぼさず、かくしてタンパク質の機能にはほとんど影響しない（Argos、EMBO J. の１９８９、vol.８、pp.７７９-８５）。さらに、フェニルアラニンは、主に高い疎水性を示す領域に存在しているため、外部に暴露されることはまれである。かかるフェニルアラニン残基がバリンによって置換されると、バリンの高い疎水性のために、タンパク質は表面からより深く陥没するようになる。したがって、この置換が抗体産生を誘導する可能性は低い。特定のタンパク質は、好ましくは主に対応する受容体、リガンドまたは基質に結合して特異的な生物応答を調節する。この結合がより強力な場合では、生物応答を調節する効力は改良され、関連タンパク質はすべて本発明に従って変性することができ、本発明には結果として得られるタンパク質変異体のすべてが含まれる。

フェニルアラニン残基のかかるバリン置換が結果として結合親和性の増大を招くという事実は、ヒトの自己免疫性疾患におけるＮＫ細胞上に発現されるＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）の突然変異の発見によって支持される。ヒトの受容体タンパク質は遺伝子多型を持つ。つまり、個体は、抗体リガンドのＦｃ認識に関与する領域の１７６位で２つのグループ：フェニルアラニンを有すると、バリンを有するグループとに分かれている。該受容体の１７６位でフェニルアラニンを有する個体は、該抗体リガンドのＦｃ領域に対して弱まった結合親和性を持ち、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に対して高度の感受性を示す（Jianming Wu らの J. Clin. Invest. １９９７、vol.１００、pp.１０５９-７０）。

その反面、上述のとおりに、本発明は、生物応答調節タンパク質結合ドメイン内のフェニルアラニン残基のバリン置換を特徴とする。

本明細書中で使用した用語「結合ドメイン」は、受容体、リガンドまたは基質に結合することによって、その生物学的機能を実施するタンパク質の部分（つまり、ドメイン）を意味し、該タンパク質の他領域と比べて比較的に高い疎水性と低い抗原性を持つ。タンパク質結合ドメインは当技術分野で公知であり、たとえば、本発明の実施形態で使用する一部の４-ａへリックスバンドル構造のサイトカイン及びインターフェロンはそれぞれ、対応する受容体のために結合ドメインとしての機能を果たすＤ-αへリックス構造及びＡ-αへリックス構造を持つことが知られている。

但し、本発明に従って変性される結合ドメインは、当技術分野で公知の結合ドメインに限定されるものではない。これは、生物応答調節タンパク質の受容体、リガンドまたは基質に対する結合が、直接結合に関与するアミノ酸残基に加えて、他のいくつかのアミノ酸残基の影響を受けるためである。本発明に従って変性される、生物応答調節タンパク質の「結合ドメイン」にはさらに、当技術分野で公知の結合ドメインの両端から約５０のアミノ酸残基、好ましくは約２５のアミノ酸残基、より望ましくは約１０のアミノ酸残基が含まれる。

一態様本発明では、典型的にいくつかのへリックス構造を含有するサイトカインを要する。該へリックス構造の中で、Ｎ末端から最初のへリックスと最後のへリックスは、サイトカインの対応するサイトカイン受容体に対する結合に関与する結合ドメインとして知られている（第１図を参照）。サイトカインを対応する受容体に結合する役割をもつα-へリックスはサイトカインのタイプによって異なり、当技術分野で公知である。たとえば、ＩＬ-２では、第２へリックス及び第５へリックスはＩＬ-２受容体の中でｐ５５α受容体に結合し、第１へリックスはＩＬ-２受容体の中でｐ７５γ受容体に結合し、そして第６へリックスはガンマ受容体に結合する（Femando Bazan、Science J. １９９２、vol.２５７、pp.４１０-２）。上記のように、個々のサイトカインは結合に関与する特定のへリックスを持つが、該へリックスは高度に保存されるアミノ酸配列を持つ。本発明は、サイトカインの結合ドメインに対応するα-へリックス内フェニルアラニン残基をバリン置換することによって、野生型サイトカインよりも高い親和性でサイトカイン受容体に結合する能力のあるサイトカイン変異体を提供する。

該サイトカインに関連する一態様では、サイトカインの４-へリックスバンドルファミリーを要する。かかるサイトカインには、ＣＮＴＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、Ｌ-４、ＩＬ-５、Ｌ-６、ＩＬ-１２ｐ３５、ＬＰＴ、ＬＩＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＯＳＭ、ＰＬ、ＳＣＦ、ＴＰＯＧ-ＣＳＦ、ＧＨＲ及びＩＦＮが含まれる。 これらサイトカインのすべては４つのα-へリックスを有し、そのそれぞれはＡ-α-へリックス、Ｂ-α-へリックス、Ｃ-α-へリックス及びＤ-α-へリックスと称される。

該Ｄ-及びＡ-α-へリックスは主に受容体への結合に関与する（Fernando Bazar の Immunology today、１９９０、vol. １１pp. ３５０-４、The Cytokine Facts Book、１９９４、pp.１０４-２４７）。

前記４-へリックスバンドル構造のサイトカイン：ＣＮＴＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、Ｌ-１２ｐ３５、ＬＰＴ、ＬＩＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＯＳＭ、ＰＬ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｇ-ＣＳＦ及びＧＨＲの中では、それぞれにＤ-α-へリックス、及びＣ-α-へリックスと該Ｄ-α-へリックスとを結合する領域が含まれる結合ドメインを持つ。より具体的にいうと、該４-へリックスバンドル構造のサイトカインのアミノ酸残基の中で、該結合ドメインは、位置１１０位と１８０位との間にアミノ酸残基を含む。よって、一態様で本発明は、４-へリックスバンドル構造のサイトカインの位置１１０位と１８０位との間のアミノ酸残基の中で、フェニルアラニンのバリン置換によって、野生型よりも高い親和性で対応する受容体に結合する能力のある４-へリックスバンドル構造のサイトカイン変異体を提供する。

前記４-へリックスバンドル構造のサイトカインのインターフェロン（例えば、ＩＦＮ-α２Ａ、ＩＦＮ-α２Ｂ、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-ω、ＩＦＮ-τ）は、「Ａ-α-へリックス」を含有する結合ドメインを持つ。より具体的には、インターフェロンの結合ドメインには、位置１位と５０位との間にアミノ酸残基が含まれる。よって、本発明の別の態様では、インターフェロンの位置１位と５０位との間のアミノ酸残基の中で、フェニルアラニンのバリン置換によって、野生型よりも高い親和性を有するインターフェロン受容体に結合する能力のあるインターフェロン変異体を提供する。

その反面、本発明に従って変性された結合ドメインには、２つの以上のフェニルアラニン残基を含むことができる。２つ以上のフェニルアラニン残基はすべてバリンによって置換され得るが、この場合、タンパク質の発現量の大幅な低下を招くため、好ましくは１つのみのフェニルアラニン残基をバリンによって置換する。この点で、本発明者らは、高い疎水性を示す領域に存在するフェニルアラニン残基がバリンによって置換されると、生物応答調節タンパク質の効力は大いに向上することを見出した。よって、本発明では、バリンによって置換されるフェニルアラニン残基は、好ましくは本発明に従って規定された結合ドメインに存在する高い疎水性を示す領域において選択する。

タンパク質を含むアミノ酸配列の特異的領域の疎水性は、当技術分野で公知の方法によって測定することができる（Kyte、J. らの J. Mol. Biol. １９８２、vol.１５７、pp.１０５-１３２、Hopp、T. P. らの プロc. Nat. Acad. Sci. USA、１９８１、vol.７８（６）、pp.３８２４-３８２８）。

本発明に係る生物応答調節タンパク質変異体は、当技術分野で公知の化学合成法によって調製することが可能である（Creighton、Protein： Structures and Molecular Principles、W. H. Freeman and Co., NY １９８３）。限定するものではないが、代表方法には、液相合成または固相合成、フラグメント縮合、及びＦ-ＭＯＣまたはＴ-ＢＯＣ化学合成が含まれる（Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins、Williams らの Eds. 、CRC Press、Boca Raton Florida、１９９７、A Practical Approach、Atherton & Sheppard、Eds.、IRL Press、Oxfor d、England、１９８９）。

代替方法として、本発明に係るタンパク質変異体は、組換えＤＮＡ技術によって調製することも可能である。これらの技術には、本発明に係るタンパク質変異体をコードするＤＮＡ配列の調整工程が含まれる。かかるＤＮＡ配列は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変することによって調製することも可能である。手短に言えば、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列の合成後、フェニルアラニンのコドンを部位特異的変異誘導によってバリンの別コドンに変換して所望ＤＮＡ配列を作成する。

また、本発明に係るタンパク質変異体をコードするＤＮＡ配列の調製は化学的方法によって行うことができる。たとえば、該タンパク質変異体をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的方法によって合成することができる。

オリゴヌクレオチドは、所望のタンパク質変異体のアミノ酸配列に基づいて作られるが、好ましくはタンパク質変異体を生成する宿主細胞によって使用される適切なコドンを選択することによって作られる。１つのアミノ酸を１つを超えるコドンによって指定することを意味する遺伝暗号の縮重は、当技術分野で公知である。したがって、特異的タンパク質変異体をコードする縮重を伴う複数のＤＮＡ配列があり、それらのすべては本発明の範囲に入る。

本発明に係るタンパク質変異体をコードするＤＮＡ配列には、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列が含まれていても含まれていなくてもよい。該シグナル配列は、存在する場合、タンパク質変異体を発現させるために選択された宿主細胞によって認識される必要がある。該シグナル配列は、原核生物由来または真核生物由来またはその組み合わせ配列であってよく、天然タンパク質のシグナル配列であってもよい。シグナル配列の使用は、タンパク質変異体を生成する組換え細胞内の分泌型としてのタンパク質変異体の発現効果に従って決定することができる。選択された細胞が原核細胞である場合、ＤＮＡ配列は通常、シグナル配列をコード化しないが、その代わりに、好ましくは所望のタンパク質を直接発現するためのＮ末端メチオニンを含有し、最も好ましくは、野生型タンパク質に由来するシグナル配列が使用される。

上記のように調製されたかかるＤＮＡ配列は、本発明のタンパク質変異体をコードする別のＤＮＡ配列に作動可能に結合され、結果として得られるＤＮＡ配列を調節する１つまたは複数の発現制御配列を含んだベクターに挿入される。次いで、宿主は、結果として得られる組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされる。結果として得られる形質転換体またはトランスフェクタントは、ＤＮＡ配列の発現に好適な条件下で好適な培地内において培養される。ＤＮＡ配列によってコード化された生物応答調節タンパク質の実質上純粋な変異体は、結果として得られる培養物から回収される。

本明細書中で使用した用語「ベクター」は、外来遺伝子を宿主細胞に安定的に運ぶ能力のある媒介物としての機能を果たすＤＮＡ分子を意味する。有用なアプリケーションのためには、ベクターは、複製可能であり、ベクター自体を宿主細胞に導入するシステムを有し、及び選択可能マーカーを所有する必要がある。しかも、本明細書中で使用した用語「組換え発現ベクター」は、宿主細胞内で発現されるように環状ＤＮＡ分子に作動可能に結合された外来遺伝子を運ぶ環状ＤＮＡ分子を意味する。宿主細胞に導入されると、組換え発現プラスミドは、宿主染色体ＤＮＡに拘わらず、大量のコピー数で複製して異種ＤＮＡを生成する能力を持つ。当技術分野で公知のように、宿主細胞内でトランスフェクトされた遺伝子の発現量を高めるためには、該遺伝子が、発現系として選択された宿主細胞内で機能的な転写配列及び翻訳調節配列に作動可能に結合される必要がある。該発現調節配列及び該外来遺伝子は、細菌選択可能マーカー及び複製開始点を含有する１つの発現ベクターで運ばれることが好ましい。真核細胞が発現系として使用される場合、その発現ベクターは好ましくは真核宿主細胞内で有用な発現マーカーをさらに含む。

組換え発現ベクターと関連して本明細書中で使用した用語「発現制御配列」は、本発明に係るタンパク質変異体の発現に必要または有益であるヌクレオチド配列を意味する。個々の制御配列は、該タンパク質変異体をコードするヌクレオチド配列と同質であっても異質であってもよい。該発現制御配列の非限定的な例には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが含まれる。該発現制御配列は少なくとも１つのプロモーター配列を含有する。

用語「作動可能に結合された」は、ヌクレオチド配列が機能的関連を持って別のヌクレオチド配列と並べられている状態を意味する。該ヌクレオチド配列は、好適な分子（たとえば、転写活性化タンパク質）が該制御配列に結合すると、遺伝子発現が誘導されるような様式で結合される遺伝子及び制御配列であってもよい。たとえば、プレ配列（シグナルペプチド）または分泌リーダーが成熟タンパク質の分泌を促進するとき、それは「そのタンパク質に作動可能に結合された」と見なされる。プロモーターがコーディング配列の転写を調節するとき、そのプロモーターはコーディング配列に作動可能に結合される。リボソーム結合部位が該コーディング配列の翻訳を可能にする位置に存在するとき、リボソーム結合部位はコーディング配列に作動可能に結合される。典型的には、用語「作動可能に結合された」は、結合されたヌクレオチド配列が互いに接触することを意味する。分泌リーダー配列の場合では、該用語は、分泌リーダー配列がコーディング配列に接触し、該コーディング配列のリーディングフレームの範囲内に存在していることを意味する。但し、エンハンサーがコーディング配列に接触する必要はない。該ヌクレオチド配列の連鎖は、好都合な制限酵素認識部位でのライゲーション（連結）によって達成することができる。制限酵素認識部位の不在時では、従来の方法によって合成される、オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用することが可能である。

本発明に係るタンパク質変異体をコードするＤＮＡ配列を発現するために、発現系としての宿主細胞とベクターの多種さまざまなの組み合わせを使用することが可能である。真核宿主細胞の形質転換に役立つ発現ベクターは、たとえば、ＳＶ４０、ウシのパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスからの発現調節配列を含有する。細菌宿主細胞内で有用な発現ベクターには、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びその誘導体によって例証される大腸菌からの細菌プラスミドと、λｇｔ10、λｇｔ１１及びＮＭ９８９を始めとする多種さまざまなのλファージ誘導体によって例証されるＲＰ４、ファージＤＮＡなどのいろいろな種類の宿主細胞を有するプラスミドと、Ｍ１３などの糸状一本鎖ＤＮＡファージによって例証されるその他のＤＮＡファージとが含まれる。酵母細胞内で有用な発現ベクターには、２μプラスミド及びその誘導体が含まれる。昆虫細胞内で有用な発現ベクターには、ｐＶＬ９４１が含まれる。

本発明に係るタンパク質変異体をコードするＤＮＡ配列を発現するために、多種さまざまなの発現制御配列のいずれかを、これらのベクターによって使用することができる。かかる有用な発現制御配列には、前記発現ベクターの構造遺伝子と関連付けられた配列が含まれる。発現制御配列の有用な例としては、ＳＶ４０またはアデノウィルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージλの主要オペレーター領域及びプロモーター領域、ｆｄ被覆タンパク質の制御領域、３-ホスホグリセラートキナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、ホスファターゼのプロモーター（たとえばＰｈｏ５）、原核細胞または真核細胞またはそれらのウィルスの遺伝子発現を制御することで知られている酵母のα-接合系プロモーター及び他の配列、及びその種々の組み合わせが挙げられる。具体的には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ф１０は、大腸菌内におけるポリペプチドの発現に有用である。

前記組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、本発明の別の態様を構成する。さまざまなモノラルニュークレア宿主細胞を、本発明のタンパク質変異体をコードするＤＮＡ配列の発現に使用することが可能である。

該宿主細胞の例としては、大腸菌、シュードモナス種、桿菌種、ストレプトマイセス種、菌類または酵母などの原核細胞及び真核細胞と、スポドプテラフルギペルタ（Ｓｆ９）などの昆虫細胞と、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはマウス細胞などの動物細胞と、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０またはＢＭＴ１０などのアフリカミドリザル細胞と、組織培養されたヒト及び植物細胞とが挙げられる。好適な宿主には、細菌など大腸菌及び枯草菌、及び組織培養された哺乳動物細胞が含まれる。

該形質転換及びトランスフェクションは、基礎実験ガイドブック（Davis らの Basic Methods in Molecular Biology、１９８６、Sambrook、J. らの Basic Methods in Molecular Biology、１９８９）に記載された方法によって実行することができる。本発明に係るタンパク質変異体をコードするＤＮＡ配列を宿主細胞に導入するための好適な方法には、たとえば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ-デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、クレープローディング、弾丸導入、及び感染が含まれる。

また、当然のことながら、すべてのベクター及び発現制御配列が本発明のＤＮＡ配列の発現において等しく機能すること限らない。同様に、すべての宿主は同一発現系に対して等しく機能するとは限らない。しかし、当業者であれば、本発明の範囲内で、大きな実験負担なしに、種々のベクター、発現制御配列及び宿主から好適な選択を行うことができるであろう。たとえば、ベクターを宿主細胞を考慮に入れて選択することができる。その理由は、好ましくは該ベクターが該宿主細胞内で複製される必要があるからである。

ベクターのコピー数、該コピー数を制御する能力、及び該ベクター、たとえば抗生物質マーカー、によってコード化された他のタンパク質発現が審議される必要がある。また、発現制御配列は、いくつかの要因を考慮に入れて選択することも可能である。たとえば、相対強度、制御能力及び該配列の本発明のＤＮＡ配列との適合性、特に二次構造の可能性に関して審議される必要がある。さらに、宿主細胞の選択は、選択されるベクターとの適合性、ヌクレオチド配列によってコード化される産物の毒性、該産物の分泌性質、ポリペプチド適正に折り畳む能力、発酵または培養の必要性、ヌクレオチド配列によってコード化される産物の容易な精製を確実にする能力などを考慮して行うことができる。

本発明に係るタンパク質変異体の調製方法では、該宿主細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて、ポリペプチド生成に好適な栄養培地で培養される。たとえば、該細胞は、Ｂａｓｋ振盪培養、好適な培地内及び該ポリペプチドの発現および/または単離を可能にする条件下で行われる実験室規模または産業用発酵槽内の小規模または大規模発酵によって培養することができる。該培養は、当技術分野で公知の手順を用いて、炭素及び窒素源及び無機塩類を含有する好適な栄養培地中で行われる。好適なメディアは、商業者から市販されており、公開成分に従って調製することが可能である（たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）のカタログ）。該ポリペプチドが該栄養培地に分泌される場合は、該ポリペプチドを直接的に該培地から回収することができる。該ポリペプチドが分泌されない場合には、該ポリペプチドは細胞ライセートから回収することができる。

本発明に係る生物応答調節タンパク質変異体は、当技術分野で公知の方法によって回収することができる。たとえば、該タンパク質変異体は、限定するものではないが、遠心単離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿を含めた従来の手順によって該栄養培地から回収することができる。さらに、該タンパク質変異体は、限定するものではないが、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、親和性、疎水性、及びサイズ排除クロマトグラフィー）、電気泳動、差次的な溶解（例えば、硫安塩析）、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、または抽出を含めた当技術分野で公知の種々手順によって精製することもできる。

本発明は、生物応答調節タンパク質変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物では、該生物応答調節タンパク質変異体が治療有効量で含まれていることが好ましい。

本発明の医薬組成物に用いられる担体には、一般的に使用される担体、アジュバント及び媒介物が含まれるが、製剤領域では、それらは総じて「医薬的に受容し得る担体」と呼ばれる。本発明の医薬組成物で有用な非限定的な医薬的に受容し得る担体としては、イオン交換、酸化アルミニウム、アルミニウムステアラート、レシチン、血清タンパク質（たとえばヒト血清アルブミン）、緩衝剤（たとえばリン酸ナトリウム、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルバート、野菜の飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物）、水、塩類または電解液（たとえば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、及び亜鉛塩類）、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニールピロリドン、セルロースベースの基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカボキシルメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、所望の組織に到達することができるのであれば、通常の投与経路を介して投与することが可能である。よって、本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、眼内投与、経皮投与、直腸内投与及び腔内投与を行うことができ、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル及び徐放性製剤で処方することができる。本明細書中で使用した用語「非経口投与」には、皮下投与、鼻腔内投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、関節内投与、滑液嚢内投与、基部内投与、心臓内投与、クモ膜下腔内投与、病巣内投与及び脳内注射または注入技術が含まれる。

一態様では、本発明の医薬組成物を非経口投与用水溶液として処方することができる。好ましくは、ハンクス液、リンゲル液または緩衝生理食塩水などの好適な緩衝液溶液を利用することができる。水溶性の注入懸濁液は、該懸濁液の粘性を増加させる能力のある物質で補足することができ、それらはナトリウムカボキシルメチルセルロース、ソルビトール及びデキストランによって例証される。しかも、油状の注入懸濁液などの活性成分の懸濁液には、脂肪親和性溶媒または担体が含まれ、それらはゴマ油などの脂肪油、及びオレイン酸エチル、中性脂肪またはリポソームなどの合成脂肪酸エステルによって例証される。また、ポリカチオンの非脂質性アミノポリマーを媒介物として使用することも可能である。便宜、該懸濁液に好適な安定剤または薬物を含有させて、タンパク質変異体の溶解性を増加すること、及び高濃度の該タンパク質変異体を得ることが可能である。

本発明の医薬組成物は、好ましくは滅菌注射水溶液または油性懸濁液のような滅菌注射調製の形式である。かかる懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０）及び懸濁剤を用いて、当技術分野で公知の方法に従って処方することができる。また、該滅菌注射製剤は、１、３-ブタンジオール中溶液などの非毒性の非経口的に受容し得る希釈液または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であってもよい。該受容し得る媒介物及び溶媒には、マンニトール、水、リンゲル液及びは、等張食塩水が含まれる。しかも、滅菌不揮発性油を溶媒または懸濁培地にとして慣習的に使用することが可能である。この目的のため、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを始めとする任意の無刺激性の不揮発性油を使用するすることが可能である。しかも、オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸を、該薬剤的に受容し得る天然油類（たとえば、オリーブオイルまたは硬化ヒマシ油）、特に、ポリオキシエチル化されたその誘導体のような注射製剤の調製に使用することが可能である。

前記水溶性の組成物は、消毒剤と混合するか、または放射線を併用して細菌を除去するために、主にフィルターを用いる濾過によって滅菌する。滅菌された該組成物は、たとえば、フリーズドライ法（凍結乾燥法）によって硬化して硬化生成物を得ことができ、実用向きに、該硬化生成物は滅菌水または滅菌希釈液中に溶解される。

本明細書中で本発明の医薬組成物と関連して使用した用語「治療有効量」は、本発明の医薬組成物が適用される疾患に対して、改善または治療効果を示す活性成分の量を意味する。本発明の医薬組成物の治療有効量は、患者の年齢及び性別、適用部位、投与頻度、投与期間、シミュレーション型及びアジュバント型によって異なり得る。典型的には、本発明の医薬組成物は、野生型タンパク質と比べて少量、たとえば、０.０１-１０００μｇ/ｋｇ/日、より望ましくは０.１-５００μｇ/ｋｇ/日、及び最も好ましくは１-１００μｇ/ｋｇ/日で投与される。

その反面、本組成物が適用される疾患は、そのタンパク質のタイプによって異なり得ることは当業者であれば明白であろう。本発明の実施形態において変化したＥＰＯ及びＴＰＯは、貧血自体に加えて、他の疾患に関連する合併症としての貧血（たとえば、炎症性腸疾患によって起こる貧血、進行性腎臓病、腎不全によって起こる貧血、ジドブジン（ＡＺＴ）投与患者におけるＨＴＶ感染症に関連する貧血、癌化学療法に関連する貧血、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、鎌状赤血球貧血、子宮交換輸血後の新生児Ｒｈ溶血性疾患における遅発型低再生性貧血）の治療に使用することが可能である。しかも、本発明に従って変化したＧ-ＣＳＦは、好中球減少症自体、及び骨髄移植または癌化学療法後に発生する好中球減少症の治療に使用することが可能であり、該ＧＨ変異体は、下垂体性小人症、及び小児慢性腎不全の治療に使用することが可能である。しかし、本発明はこれらの用途に限定されるものではない。

以下に、本発明は、それぞれが、４-へリックスバンドル構造のサイトカイン、詳細には、ＣＮＴＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｇ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＧＨ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、Ｌ-６、ＩＬ-１２ｐ３５、ＬＰＴ、ＬＩＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＯＳＭ、ＰＬ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＦＮ-α２Ａ、ＩＦＮ-α２Ｂ、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-ω及びＩＦＮ-τの特異的フェニルアラニン残基をバリンに置換するインターフェロン変異体を提供する。

特定の一態様では、本発明は下のタンパク質変異体を提供する：（１）該フェニルアラニン残基を野生型ＣＮＴＦアミノ酸配列（配列識別番号１）位置３、８３、９８、１０５、１１９、１５２または１７８位にてバリンに置換するＣＮＴＦ変異体。（２）該フェニルアラニン残基を野生型ＥＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２）位置４８、１３８、１４２または１４８位にてバリンに置換するＥＰＯ変異体。（３）該フェニルアラニン残基を野生型Ｆｌｔ３Ｌアミノ酸配列（配列識別番号３）位置６、１５、８１、８７、９６または１２４位にてバリンに置換するＦｌｔ３Ｌ変異体。（４）該フェニルアラニン残基を野生型Ｇ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号４）位置１３、８３、１１３、１４０、１４４または１６０位にてバリンに置換するＧ-ＣＳＦ変異体。（５）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＭ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号５）位置４７、１０３、１０６、１１３または１１９位にてバリンに置換するＧＭ-ＣＳＦ変異体。（６）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＨアミノ酸配列（配列識別番号６）位置１、１０、２５、３１、４４、５４、９２、９７、１３９、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＧＨ変異体。（７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ａアミノ酸配列（配列識別番号７）置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ- α２Ａ変異体。（８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ｂアミノ酸配列（配列識別番号８）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ｂ変異体。（９）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-βアミノ酸配列（配列識別番号９）位置８、３８、５０、６７、７０、１１１または１５４位にてバリンに置換するＩＦＮ-β変異体。（１０）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-γアミノ酸配列（配列識別番号１０）位置１８、３２、５５、５７、６０、６３、８４、８５、９５または１３９位にてバリンに置換するＩＦＮ-γ変異体。（１１）該フェニルアラニン残基を野生型ＥＦＮ-ωアミノ酸配列（配列識別番号１１）位置２７、３６、３８、６５、６８、１２４または１５３位にてバリンに置換するＩＦＮ-ω変異体。（１２）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-τアミノ酸配列（配列識別番号１２）位置８、３９、６８、７１、８８、１２７、１５６、１５７、１５９または１８３位にてバリンに置換するＩＦＮ-τ変異体。（１３）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-２アミノ酸配列（配列識別番号１３）位置４２、４４、７８、１０３、１１７または１２４位にてバリンに置換するＩＬ-２変異体。（１４）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-３アミノ酸配列（配列識別番号１４）位置３７、６１、１０７、１１３または１３３位にてバリンに置換するＩＬ-３変異体。（１５）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-４アミノ酸配列（配列識別番号１５）位置３３、４５、５５、７３、８２または１１２位にてバリンに置換するＩＬ-４変異体。（１６）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-５アミノ酸配列（配列識別番号１６）位置４９、６９、９６または１０３位にてバリンに置換するＩＬ-５変異体。（１７）該フェニルアラニン残基を野生型IＬ-６アミノ酸配列（配列識別番号１７）位置７３、７７、９３、１０４、１２４、１６９または１７２位にてバリンに置換するＩＬ-６変異体。（１８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-１２ｐ３５アミノ酸配列（配列識別番号１８）位置１３、３９、８２、９６、１１６、１３２、１５０、１６６または１８０位にてバリンに置換するＩＬ-１２ｐ３５変異体。（１９）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＰＴアミノ酸配列（配列識別番号１９）位置４１または９２位にてバリンに置換するＬＰＴ変異体。（２０）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＩＦアミノ酸配列（配列識別番号２０）位置４１、５２、６７、７０、１５６または１８０位にてバリンに置換するＬＩＦ変異体。（２１）該フェニルアラニン残基を野生型Ｍ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号２１）位置３５、３７、５４、６７、９１、１０６、１２１、１３５、１４３、２２９、２５５、３１１、４３９、４６６または４８５位にてバリンに置換するＭ-ＣＳＦ変異体。（２２）該フェニルアラニン残基を野生型ＯＳＭアミノ酸配列（配列識別番号２２）位置５６、７０、１６０、１６９、１７６または１８４位にてバリンに置換するＯＳＭ変異体。（２３）該フェニルアラニン残基を野生型ＰＬアミノ酸配列（配列識別番号２３）位置１０、３１、４４、５２、５４、９２、９７、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＰＬ変異体。（２４）該フェニルアラニン残基を野生型ＳＣＦアミノ酸配列（配列識別番号２４）位置６３、１０２、１１０、１１５、１１６、１１９、１２６、１２９、１５８、１９９、２０５、２０７または２４５位にてバリンに置換するＳＣＦ変異体。及び（２５）該フェニルアラニン残基を野生型ＴＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２５）位置４６、１２８、１３１、１４１、１８６、２０４、２４０または２８６位にてバリンに置換するＴＰＯ変異体。

別の特定態様では、本発明は以下のＤＮＡ分子を提供する。（１）該フェニルアラニン残基を野生型ＣＮＴＦアミノ酸配列（配列識別番号１）位置３、８３、９８、１０５、１１９、１５２または１７８位にてバリンに置換するＣＮＴＦ変異体をコードするＤＮＡ。（２）該フェニルアラニン残基を野生型ＥＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２）位置４８、１３８、１４２または１４８位にてバリンに置換するＥＰＯ変異体をコードするＤＮＡ。（３）該フェニルアラニン残基を野生型Ｆｌｔ３Ｌアミノ酸配列（配列識別番号３）位置６、１５、８１、８７、９６または１２４位にてバリンに置換するＦｌｔ３Ｌ変異体をコードするＤＮＡ。（４）該フェニルアラニン残基を野生型Ｇ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号４）位置１３、８３、１１３、１４０、１４４または１６０位にてバリンに置換するＧ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡ。（５）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＭ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号５）位置４７、１０３、１０６、１１３または１１９位にてバリンに置換するＧＭ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡ。（６）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＨアミノ酸配列（配列識別番号６）位置１、１０、２５、３１、４４、５４、９２、９７、１３９、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＧＨ変異体をコードするＤＮＡ。（７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ａアミノ酸配列（配列識別番号７）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ａ変異体をコードするＤＮＡ。（８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ｂアミノ酸配列（配列識別番号８）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ｂ変異体をコードするＤＮＡ。（９）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-βアミノ酸配列（配列識別番号９）位置８、３８、５０、６７、７０、１１１または１５４位にてバリンに置換するＩＦＮ-β変異体をコードするＤＮＡ。（１０）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-γアミノ酸配列（配列識別番号１０）位置１８、３２、５５、５７、６０、６３、８４、８５、９５または１３９位にてバリンに置換するＩＦＮ-γ変異体をコードするＤＮＡ。（１１）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-ωアミノ酸配列（配列識別番号１１）位置２７、３６、３８、６５、６８、１２４または１５３位にてバリンに置換するＩＦＮ-ω変異体をコードするＤＮＡ。（１２）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-τアミノ酸配列（配列識別番号１２）位置８、３９、６８、７１、８８、１２７、１５６、１５７、１５９または１８３位にてバリンに置換するＩＦＮ-τ変異体をコードするＤＮＡ。（１３）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-２アミノ酸配列（配列識別番号１３）位置４２、４４、７８、１０３、１１７または１２４位にてバリンに置換するＩＬ-２変異体をコードするＤＮＡ。（１４）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-３アミノ酸配列（配列識別番号１４）位置３７、６１、１０７、１１３または１３３位にてバリンに置換するＩＬ-３変異体をコードするＤＮＡ。（１５）該フェニルアラニン残を基野生型ＩＬ-４アミノ酸配列（配列識別番号１５）位置３３、４５、５５、７３、８２または１１２位にてバリンに置換するＩＬ-４変異体をコードするＤＮＡ。（１６）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-５アミノ酸配列（配列識別番号１６）位置４９、６９、９６または１０３位にてバリンに置換するＩＬ-５変異体をコードするＤＮＡ。（１７）該フェニルアラニン残基を野生型IＬ-６アミノ酸配列（配列識別番号１７）位置７３、７７、９３、１０４、１２４、１６９または１７２位にてバリンに置換するＩＬ-６変異体をコードするＤＮＡ。（１８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-１２ｐ３５アミノ酸配列（配列識別番号１８）位置１３、３９、８２、９６、１１６、１３２、１５０、１６６または１８０位にてバリンに置換するＩＬ-１２ｐ３５変異体をコードするＤＮＡ。（１９）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＰＴアミノ酸配列（配列識別番号１９）位置４１または９２位にてバリンに置換するＬＰＴ変異体をコードするＤＮＡ。（２０）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＩＦアミノ酸配列（配列識別番号２０）位置４１、５２、６７、７０、１５６または１８０位にてバリンに置換するＬＩＦ変異体をコードするＤＮＡ。（２１）該フェニルアラニン残基を野生型Ｍ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号２１）位置３５、３７、５４、６７、９１、１０６、１２１、１３５、１４３、２２９、２５５、３１１、４３９、４６６または４８５位にてバリンに置換するＭ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡ。（２２）該フェニルアラニン残基を野生型ＯＳＭアミノ酸配列（配列識別番号２２）位置５６、７０、１６０、１６９、１７６または１８４位にてバリンに置換するＯＳＭ変異体をコードするＤＮＡ。（２３）該フェニルアラニン残基を野生型ＰＬアミノ酸配列（配列識別番号２３）位置１０、３１、４４、５２、５４、９２、９７、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＰＬ変異体をコードするＤＮＡ。（２４）該フェニルアラニン残基を野生型ＳＣＦアミノ酸配列（配列識別番号２４）位置６３、１０２、１１０、１１５、１１６、１１９、１２６、１２９、１５８、１９９、２０５、２０７または２４５位にてバリンに置換するＳＣＦ変異体をコードするＤＮＡ。及び（２５）該フェニルアラニン残基を野生型ＴＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２５）位置４６、１２８、１３１、１４１、１８６、２０４、２４０または２８６位にてバリンに置換するＴＰＯ変異体をコードするＤＮＡ。

さらなる特定の態様では、本発明は以下の組換え発現ベクターを提供する。（１）該フェニルアラニン残基を野生型ＣＮＴＦアミノ酸配列（配列識別番号１）位置３、８３、９８、１０５、１１９、１５２または１７８位にてバリンに置換するＣＮＴＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（２）該フェニルアラニン残基を野生型ＥＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２）位置４８、１３８、１４２または１４８位にてバリンに置換するＥＰＯ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（３）該フェニルアラニン残基を野生型Ｆｌｔ３Ｌアミノ酸配列（配列識別番号３）位置６、１５、８１、８７、９６または１２４位にてバリンに置換するＦｌｔ３Ｌ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（４）該フェニルアラニン残基を野生型Ｇ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号４）位置１３、８３、１１３、１４０、１４４または１６０位にてバリンに置換するＧ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（５）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＭ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号５）位置４７、１０３、１０６、１１３または１１９位にてバリンに置換するＧＭ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（６）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＨアミノ酸配列（配列識別番号６）位置１、１０、２５、３１、４４、５４、９２、９７、１３９、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＧＨ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ａアミノ酸配列（配列識別番号７）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ａ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ｂアミノ酸配列（配列識別番号８）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ｂ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（９）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-βアミノ酸配列（配列識別番号９）位置８、３８、５０、６７、７０、１１１または１５４位にてバリンに置換するＩＦＮ-β変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１０）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-γアミノ酸配列（配列識別番号１０）位置１８、３２、５５、５７、６０、６３、８４、８５、９５または１３９位にてバリンに置換するＩＦＮ-γ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１１）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-ωアミノ酸配列（配列識別番号１１）位置２７、３６、３８、６５、６８、１２４または１５３位にてバリンに置換するＩＦＮ-ω変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１２）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-τアミノ酸配列（配列識別番号１２）位置８、３９、６８、７１、８８、１２７、１５６、１５７、１５９または１８３位にてバリンに置換するＩＦＮ-τ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１３）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-２アミノ酸配列（配列識別番号１３）位置４２、４４、７８、１０３、１１７または１２４位にてバリンに置換するＩＬ-２変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１４）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-３アミノ酸配列（配列識別番号１４）位置３７、６１、１０７、１１３または１３３位にてバリンに置換するＩＬ-３変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１５）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-４アミノ酸配列（配列識別番号１５）位置３３、４５、５５、７３、８２または１１２位にてバリンに置換するＩＬ-４変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１６）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-５アミノ酸配列（配列識別番号１６）位置４９、６９、９６または１０３位にてバリンに置換するＩＬ-５変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-６アミノ酸配列（配列識別番号１７）位置７３、７７、９３、１０４、１２４、１６９または１７２位にてバリンに置換するＩＬ-６変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-１２ｐ３５アミノ酸配列（配列識別番号１８）位置１３、３９、８２、９６、１１６、１３２、１５０、１６６または１８０位にてバリンに置換するＩＬ-１２ｐ３５変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（１９）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＰＴアミノ酸配列（配列識別番号１９）位置４１または９２位にてバリンに置換するＬＰＴ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（２０）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＩＦアミノ酸配列（配列識別番号２０）位置４１、５２、６７、７０、１５６または１８０位にてバリンに置換するＬＩＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（２１）該フェニルアラニン残基を野生型Ｍ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号２１）位置３５、３７、５４、６７、９１、１０６、１２１、１３５、１４３、２２９、２５５、３１１、４３９、４６６または４８５位にてバリンに置換するＭ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（２２）該フェニルアラニン残基を野生型ＯＳＭアミノ酸配列（配列識別番号２２）位置５６、７０、１６０、１６９、１７６または１８４位にてバリンに置換するＯＳＭ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（２３）該フェニルアラニン残基を野生型ＰＬアミノ酸配列（配列識別番号２３）位置１０、３１、４４、５２、５４、９２、９７、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＰＬ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。（２４）該フェニルアラニン残基を野生型ＳＣＦアミノ酸配列（配列識別番号２４）位置６３、１０２、１１０、１１５、１１６、１１９、１２６、１２９、１５８、１９９、２０５、２０７または２４５位にてバリンに置換するＳＣＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。及び（２５）該フェニルアラニン残基を野生型ＴＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２５）位置４６、１２８、１３１、１４１、１８６、２０４、２４０または２８６位にてバリンに置換するＴＰＯ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクター。

またもう一つの特定態様では、本発明は以下の宿主細胞を提供する。（１）該フェニルアラニン残基を野生型ＣＮＴＦアミノ酸配列（配列識別番号１）位置３、８３、９８、１０５、１１９、１５２または１７８位にてバリンに置換するＣＮＴＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（２）該フェニルアラニン残基を野生型ＥＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２）位置４８、１３８、１４２または１４８位にてバリンに置換するＥＰＯ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（３）該フェニルアラニン残基を野生型Ｆｌｔ３Ｌアミノ酸配列（配列識別番号３）位置６、１５、８１、８７、９６または１２４位にてバリンに置換するＦｌｔ３Ｌ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（４）該フェニルアラニン残基を野生型Ｇ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号４）位置１３、８３、１１３、１４０、１４４または１６０位にてバリンに置換するＧ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（５）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＭ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号５）位置４７、１０３、１０６、１１３または１１９位にてバリンに置換するＧＭ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（６）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＨアミノ酸配列（配列識別番号６）位置１、１０、２５、３１、４４、５４、９２、９７、１３９、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＧＨ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ａアミノ酸配列（配列識別番号７）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ａ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ｂアミノ酸配列（配列識別番号８）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ｂ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（９）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-βアミノ酸配列（配列識別番号９）位置８、３８、５０、６７、７０、１１１または１５４位にてバリンに置換するＩＦＮ-β変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１０）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-γアミノ酸配列（配列識別番号１０）位置１８、３２、５５、５７、６０、６３、８４、８５、９５または１３９位にてバリンに置換するＩＦＮ-γ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１１）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-ωアミノ酸配列（配列識別番号１１）位置２７、３６、３８、６５、６８、１２４または１５３位にてバリンに置換するＩＦＮ-ω変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１２）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-τアミノ酸配列（配列識別番号１２）位置８、３９、６８、７１、８８、１２７、１５６、１５７、１５９または１８３位にてバリンに置換するＩＦＮ-τ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１３）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-２アミノ酸配列（配列識別番号１３）位置４２、４４、７８、１０３、１１７または１２４位にてバリンに置換するＩＬ-２変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１４）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-３アミノ酸配列（配列識別番号１４）位置３７、６１、１０７、１１３または１３３位にてバリンに置換するＩＬ-３変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１５）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-４アミノ酸配列（配列識別番号１５）位置３３、４５、５５、７３、８２または１１２位にてバリンに置換するＩＬ-４変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１６）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-５アミノ酸配列（配列識別番号１６）位置４９、６９、９６または１０３位にてバリンに置換するＩＬ-５変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-６アミノ酸配列（配列識別番号１７）位置７３、７７、９３、１０４、１２４、１６９または１７２位にてバリンに置換するＩＬ-６変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-１２ｐ３５アミノ酸配列（配列識別番号１８）位置１３、３９、８２、９６、１１６、１３２、１５０、１６６または１８０位にてバリンに置換するＩＬ-１２ｐ３５変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（１９）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＰＴアミノ酸配列（配列識別番号１９）位置４１または９２位にてバリンに置換するＬＰＴ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（２０）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＩＦアミノ酸配列（配列識別番号２０）位置４１、５２、６７、７０、１５６または１８０位にてバリンに置換するＬＩＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（２１）該フェニルアラニン残基を野生型Ｍ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号２１）位置３５、３７、５４、６７、９１、１０６、１２１、１３５、１４３、２２９、２５５、３１１、４３９、４６６または４８５位にてバリンに置換するＭ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（２２）該フェニルアラニン残基を野生型ＯＳＭアミノ酸配列（配列識別番号２２）位置５６、７０、１６０、１６９、１７６または１８４位にてバリンに置換するＯＳＭ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（２３）該フェニルアラニン残基を野生型ＰＬアミノ酸配列（配列識別番号２３）位置１０、３１、４４、５２、５４、９２、９７、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＰＬ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（２４）該フェニルアラニン残基を野生型ＳＣＦアミノ酸配列（配列識別番号２４）位置６３、１０２、１１０、１１５、１１６、１１９、１２６、１２９、１５８、１９９、２０５、２０７または２４５位にてバリンに置換するＳＣＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合される組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。及び（２５）該フェニルアラニン残基を野生型ＴＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２５）位置４６、１２８、１３１、１４１、１８６、２０４、２４０または２８６位にてバリンに置換するＴＰＯ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合された組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。

さらに別の特定の態様では、本発明は以下のタンパク質変異体調製方法を提供する。（１）該フェニルアラニン残基を野生型ＣＮＴＦアミノ酸配列（配列識別番号１）位置３、８３、９８、１０５、１１９、１５２または１７８位にてバリンに置換するＣＮＴＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（２）該フェニルアラニン残基を野生型ＥＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２）位置４８、１３８、１４２または１４８位にてバリンに置換するＥＰＯ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（３）該フェニルアラニン残基を野生型Ｆｌｔ３Ｌアミノ酸配列（配列識別番号３）位置６、１５、８１、８７、９６または１２４位にてバリンに置換するＦｌｔ３Ｌ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（４）該フェニルアラニン残基を野生型Ｇ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号４）位置１３、８３、１１３、１４０、１４４または１６０位にてバリンに置換するＧ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（５）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＭ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号５）位置４７、１０３、１０６、１１３または１１９位にてバリンに置換するＧＭ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（６）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＨアミノ酸配列（配列識別番号６）位置１、１０、２５、３１、４４、５４、９２、９７、１３９、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＧＨ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ａアミノ酸配列（配列識別番号７）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ａ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ｂアミノ酸配列（配列識別番号８）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ｂ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（９）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-βアミノ酸配列（配列識別番号９）位置８、３８、５０、６７、７０、１１１または１５４位にてバリンに置換するＩＦＮ-β変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１０）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-γアミノ酸配列（配列識別番号１０）位置１８、３２、５５、５７、６０、６３、８４、８５、９５または１３９位にてバリンに置換するＩＦＮ-γ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１１）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-ωアミノ酸配列（配列識別番号１１）位置２７、３６、３８、６５、６８、１２４または１５３位にてバリンに置換するＩＦＮ-ω変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１２）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-τアミノ酸配列（配列識別番号１２）位置８、３９、６８、７１、８８、１２７、１５６、１５７、１５９または１８３位にてバリンに置換するＩＦＮ-τ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１３）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-２アミノ酸配列（配列識別番号１３）位置４２、４４、７８、１０３、１１７または１２４位にてバリンに置換するＩＬ-２変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１４）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-３アミノ酸配列（配列識別番号１４）位置３７、６１、１０７、１１３または１３３位にてバリンに置換するＩＬ-３変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１５）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-４アミノ酸配列（配列識別番号１５）位置３３、４５、５５、７３、８２または１１２位にてバリンに置換するＩＬ-４変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１６）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-５アミノ酸配列（配列識別番号１６）位置４９、６９、９６または１０３位にてバリンに置換するＩＬ-５変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-６アミノ酸配列（配列識別番号１７）位置７３、７７、９３、１０４、１２４、１６９または１７２位にてバリンに置換するＩＬ-６変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-１２ｐ３５アミノ酸配列（配列識別番号１８）位置１３、３９、８２、９６、１１６、１３２、１５０、１６６または１８０位にてバリンに置換するＩＬ-１２ｐ３５変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（１９）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＰＴアミノ酸配列（配列識別番号１９）位置４１または９２位にてバリンに置換するＬＰＴ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（２０）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＩＦアミノ酸配列（配列識別番号２０）位置４１、５２、６７、７０、１５６または１８０位にてバリンに置換するＬＩＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（２１）該フェニルアラニン残基を野生型Ｍ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号２１）位置３５、３７、５４、６７、９１、１０６、１２１、１３５、１４３、２２９、２５５、３１１、４３９、４６６または４８５位にてバリンに置換するＭ-ＣＳＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（２２）該フェニルアラニン残基を野生型ＯＳＭアミノ酸配列（配列識別番号２２）位置５６、７０、１６０、１６９、１７６または１８４位にてバリンに置換するＯＳＭ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（２３）該フェニルアラニン残基を野生型ＰＬアミノ酸配列（配列識別番号２３）位置１０、３１、４４、５２、５４、９２、９７、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＰＬ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。（２４）該フェニルアラニン残基を野生型ＳＣＦアミノ酸配列（配列識別番号２４）位置６３、１０２、１１０、１１５、１１６、１１９、１２６、１２９、１５８、１９９、２０５、２０７または２４５位にてバリンに置換するＳＣＦ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。及び（２５）該フェニルアラニン残基を野生型ＴＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２５）位置４６、１２８、１３１、１４１、１８６、２０４、２４０または２８６位にてバリンに置換するＴＰＯ変異体をコードするＤＮＡが作動可能に結合され、結果として得られる培養物から該タンパク質変異体を単離する組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の培養を含むタンパク質変異体調製方法。

さらに別の特定態様では、本発明は以下の医薬組成物を提供する。（１）該フェニルアラニン残基を野生型ＣＮＴＦアミノ酸配列（配列識別番号１）位置３、８３、９８、１０５、１１９、１５２または１７８位にてバリンに置換するＣＮＴＦ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（２）該フェニルアラニン残基を野生型ＥＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２）位置４８、１３８、１４２または１４８位にてバリンに置換するＥＰＯ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（３）該フェニルアラニン残基を野生型Ｆｌｔ３Ｌアミノ酸配列（配列識別番号３）位置６、１５、８１、８７、９６または１２４位にてバリンに置換するＦｌｔ３Ｌ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（４）該フェニルアラニン残基を野生型Ｇ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号４）位置１３、８３、１１３、１４０、１４４または１６０位にてバリンに置換するＧ-ＣＳＦ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（５）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＭ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号５）位置４７、１０３、１０６、１１３または１１９位にてバリンに置換するＧＭ-ＣＳＦ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（６）該フェニルアラニン残基を野生型ＧＨアミノ酸配列（配列識別番号６）位置１、１０、２５、３１、４４、５４、９２、９７、１３９、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＧＨ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ａアミノ酸配列（配列識別番号７）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ａ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-α２Ｂアミノ酸配列（配列識別番号８）位置２７、３６、３８、４３、４７、６４、６７、８４、１２３または１５１位にてバリンに置換するＩＦＮ-α２Ｂ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（９）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-βアミノ酸配列（配列識別番号９）位置８、３８、５０、６７、７０、１１１または１５４位にてバリンに置換するＩＦＮ-β変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１０）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-γアミノ酸配列（配列識別番号１０）位置１８、３２、５５、５７、６０、６３、８４、８５、９５または１３９位にてバリンに置換するＩＦＮ-γ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１１）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-ωアミノ酸配列（配列識別番号１１）位置２７、３６、３８、６５、６８、１２４または１５３位にてバリンに置換するＩＦＮ-ω変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１２）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＦＮ-τアミノ酸配列（配列識別番号１２）位置８、３９、６８、７１、８８、１２７、１５６、１５７、１５９または１８３位にてバリンに置換するＩＦＮ-τ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１３）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-２アミノ酸配列（配列識別番号１３）位置４２、４４、７８、１０３、１１７または１２４位にてバリンに置換するＩＬ-２変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１４）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-３アミノ酸配列（配列識別番号１４）位置３７、６１、１０７、１１３または１３３位にてバリンに置換するＩＬ-３変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１５）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-４アミノ酸配列（配列識別番号１５）位置３３、４５、５５、７３、８２または１１２位にてバリンに置換するＩＬ-４変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１６）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-５アミノ酸配列（配列識別番号１６）位置４９、６９、９６または１０３位にてバリンに置換するＩＬ-５変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１７）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-６アミノ酸配列（配列識別番号１７）位置７３、７７、９３、１０４、１２４、１６９または１７２位にてバリンに置換するＩＬ-６変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１８）該フェニルアラニン残基を野生型ＩＬ-１２ｐ３５アミノ酸配列（配列識別番号１８）位置１３、３９、８２、９６、１１６、１３２、１５０、１６６または１８０位にてバリンに置換するＩＬ-１２ｐ３５変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（１９）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＰＴアミノ酸配列（配列識別番号１９）位置４１または９２位にてバリンに置換するＬＰＴ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（２０）該フェニルアラニン残基を野生型ＬＩＦアミノ酸配列（配列識別番号２０）位置４１、５２、６７、７０、１５６または１８０位にてバリンに置換するＬＩＦ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（２１）該フェニルアラニン残基を野生型Ｍ-ＣＳＦアミノ酸配列（配列識別番号２１）位置３５、３７、５４、６７、９１、１０６、１２１、１３５、１４３、２２９、２５５、３１１、４３９、４６６または４８５位にてバリンに置換するＭ-ＣＳＦ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（２２）該フェニルアラニン残基を野生型ＯＳＭアミノ酸配列（配列識別番号２２）位置５６、７０、１６０、１６９、１７６または１８４位にてバリンに置換するＯＳＭ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（２３）該フェニルアラニン残基を野生型ＰＬアミノ酸配列（配列識別番号２３）位置１０、３１、４４、５２、５４、９２、９７、１４６、１６６、１７６または１９１位にてバリンに置換するＰＬ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。（２４）該フェニルアラニン残基を野生型ＳＣＦアミノ酸配列（配列識別番号２４）位置６３、１０２、１１０、１１５、１１６、１１９、１２６、１２９、１５８、１９９、２０５、２０７または２４５位にてバリンに置換するＳＣＦ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。及び（２５）該フェニルアラニン残基を野生型ＴＰＯアミノ酸配列（配列識別番号２５）位置４６、１２８、１３１、１４１、１８６、２０４、２４０または２８６位にてバリンに置換するＴＰＯ変異体及び医薬的に受容し得る担体を含む医薬組成物。

生物応答を調節する効力を改善する本目的は、ＴＰＯ、ＥＰＯ、Ｇ-ＣＳＦ及びＧＨを用いて以下の実施例で達成した。以下の実施例は本発明を例示するためのみに提供されたものであって、本発明の範囲が該実施例に限定されるものではないことは当業者であれば明白であろう。

ＤＮＡがコードする野生型ＴＰＯ/ＥＰＯ/Ｇ-ＣＳＦ/ＧＨの構造
（Ａ） ＤＮＡがコードする野生型ＴＰＯの構造：
７５０μlのトリゾール試薬（MRC社、米国）を微小遠心管内で骨髄組織に加え、室温で５分間インキュベートした。２００μlのクロロホルムを該管に加え、次いで該管を勢いよく１５秒間振盪した。該管を室温で２〜３分間インキュベートした後、１５,０００ｒｐｍにて１５分間４℃で遠心分離した。該上相を１.５Ml 管に移し、５００μlのイソプロパノールを加えた。該サンプルを-７０℃で３０分間インキュベートし、１５,０００ｒｐｍにて１５分間４℃で遠心分離した。上清を廃棄した後、ＲＮＡペレットを７５%のＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）エタノールを用いてボルテックスすることによって一回洗浄し、１５,０００ｒｐｍにて１５分間４℃で遠心分離した。該上清を除去し、該ＲＮＡペレットを５分間室温で乾燥し、次いで該ペレットを５０μlのＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）処理した３°蒸留水に溶解した。

上記のように精製された２μｇのｍＲＮＡ及び１μｇのオリゴｄＴ３０プライマー（１０μＭ、Promega 社、米国）を混合し、７０℃で２分間加熱し、次いで直ちに氷上で２分間冷却した。

その後、この反応混合物を、２００ＵのＭ-ＭＬＶ逆転写酵素（Promega 社、米国）、１０μlの５Ｘ反応緩衝液（２５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８.３、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｎｍＤＴＴ）、１μlのｄＮＴＰ（１０ｍＭのｄＡＴＰ、１０ｍＭのｄＴＴＰ、１０ｍＭのｄＧＴＰ、１０ｍＭのｄＣＴＰ）と共に加え、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）処理した３°水を加えて全容積を５０μlにした。穏やかに混合した後、該反応混合物を４２℃で６０分間インキュベートした。

ｃＤＮＡがコードする野生型ＴＰＯを増幅するため、第１鎖ｃＤＮＡをテンプレートにして、プライマー１及びプライマー２（表１）を、２Ｕの Pfu DNA ポリメラーゼ（Stratagene 社、米国）、１０μlの１０Ｘ反応緩衝液、１%のトリトンＸ-１００、１ｍｇ/ｍｌのＢＳＡ、３μｌのプライマー１（１０μＭ）、３μlのプライマー２（１０μＭ）、２μlのｄＮＴＰ、１０ｍＭのｄＡＴＰ、１０ｍＭのｄＴＴＰ、１０ｍＭのｄＧＴＰ、１０ｍＭのｄＣＴＰを始めとするＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）管に加え、蒸留水を加えて全容積を１０μlにした。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）反応条件は以下の通りとした。１サイクル：９５℃で３分間、次いで３０サイクル：９５℃で３０秒間、５２℃で１分間、及び７２℃で１.５分間、及び最後に１サイクル：７２℃で１０分間行い、完全平滑末端を有するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を作る。

得た該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を０.８%のアガロースゲル（BMA 社、米国）中で単離し、Qiaex II ゲル抽出キット（Qiagen 社、米国）を用いて精製した。単離した該ＤＮＡを１５Ｕの EcoRI を、１０Ｕの NotI、３μlの１０Ｘ反応緩衝液と混合した後、３°蒸留水を加えて前容積を３０μlとし、３７℃にて２時間のインキュベーションによってＤＮＡを制限した。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を０.８%のアガロースゲル中で単離し、Qiaex II ゲル抽出キットを用いて精製した。

５μlの pBluescript KS II(+) ベクターを、１５ＵのEcoRI、１０ＵのＡＭ、３μlの１０Ｘ反応緩衝液と混合し、３°蒸留水を加えて全容積３０μlをとし、ＤＮＡを３７℃にて２時間のインキュベーションよって限定した。制限した該 pBluescript KS II(+) ベクターを０.８%のアガロースゲル中で単離し、Qiaex II ゲル抽出キットを用いて精製した。

１００ｎｇの消化された pBluescript KS II(+) ベクターを、同一酵素で消化した２０ｎｇの該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を用いてライゲート（連結）した。このライゲーション（連結）混合物を１６℃の水浴で１６時間インキュベートし、かくしてｃＤＮＡがコードする野生型ＴＰＯを含む組換え体ベクターを生成した。次いで、それを塩化ルビジウム法によってコンピテント細胞に対して作られた E.coli top １０（Invitrogen 社、米国）に形質転換した。該形質転換菌を５０μｇ/Mlのアンピシリン（Sigma 社、米国）を含有するＬＢ寒天プレート上で培養した。一晩のインキュベーション後、コロニーを、５０μｇ/Mlのアンピシリンを含有する３μlのＬＢ培地を有する管に移し、次いでそれらを、３７℃で１６時間培養した。アルカリ溶解法を用いてプラスミドを該培養菌から単離し、EcoRI/NotI の制限を用いて該プラスミド中のクローン化遺伝子の封入を検出した。

（Ｂ） ＤＮＡがコードする野生型ＥＰＯの構造ＤＮＡがコードする野生型ＥＰＯのクローニング法は、ＤＮＡがコードする野生型ＴＰＯのクローニングに使用したクローニング法と基本的に同一とした。

第１鎖ｃＤＮＡをテンプレートにして、プライマー１１及びプライマー１２（表２）をＤＮＡがコードする野生型ＥＰＯのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅に使用した。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物及びクローニングベクター、pBluescript KS II(+) を、EcoRI エンドヌクレアーゼ及び BamHt エンドヌクレアーゼの両方で消化した。消化されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物及びクローニングベクターをライゲート（連結）し、コンピテント細胞、E.coli top １０（lnvitrogen、米国）に形質転換した。

プラスミドをアルカリ溶解法を用いて該培養菌から単離し、EcoRI/BamHI の制限を用いて該プラスミド中のクローン化遺伝子の存在を検出した。

（Ｃ） ＤＮＡがコードする野生型Ｇ-ＣＳＦの構造：ＤＮＡがコードする野生型Ｇ-ＣＳＦの構成法は、ＤＮＡがコードする野生型ＴＰＯに使用した構成法と同様とした。

健常者から得た白血球を該ｍＲＮＡ抽出使用し、プライマー２１及び２２（表３）をｃＤＮＡがコードする野生型Ｇ-ＣＳＦのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅に使用した。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物及びクローニングベクター、pBluescript KS II(+) の両方を、SmaI エンドヌクレアーゼ及び EcoRI エンドヌクレアーゼで消化した。消化されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物及びクローニングベクターをライゲート（連結）し、コンピテント細胞、E.coli top １０（lnvitrogen、米国）に形質転換した。プラスミドをアルカリ溶解法を用いて該培養菌から単離し、SmaIIEcoRI の制限を用いて該プラスミド中のクローン化遺伝子の存在を検出した。

（Ｄ） ＤＮＡがコードする野生型ＧＨの構造：ＤＮＡがコードする野生型ＧＨをＡＴＣＣから購入した（ＡＴＣＣ番号６７０９７）。

リーダー配列をこのｃＤＮＡのＮ末端に追加するため、プライマー３５及び３６（表４）をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に使用した。該リーダー配列に結合する完全なｃＤＮＡがコードする野生型ＧＨを作るために、プライマー３７及び３８（表４）を用いて二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を実行した。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物及びクローニングベクター、pBluescript KS II(+) を、EcoRI エンドヌクレアーゼ及び Hindi エンドヌクレアーゼで消化した。 プラスミドをアルカリ溶解法を用いて該培養菌から単離し、EcoRI/HindIII の制限を用いて該プラスミド中のクローン化遺伝子の存在を検出した。

ｃＤＮＡがコードするＴＰＯ/ＥＰＯ/Ｇ-ＣＳＦ/ＧＨ突然変異タンパク質の構造
（Ａ） ｃＤＮＡがコードするＴＰＯ突然変異タンパク質の構造：
４つの突然変異タンパク質ＴＰＯ、ＴＰＯ-［Ｆ４６Ｖ］、ＴＰＯ-［Ｆ１２８Ｖ］、ＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］及びＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］を、それぞれの各位置でフェニルアラニンからバリンへの１つのアミノ酸置換を有するように、以下の手順に従って構築した。

ＴＰＯ-［Ｆ４６Ｖ］、ＴＰＯ-［Ｆ１２８Ｖ］、ＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］及びＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］をコード化するｃＤＮＡを、特異的プライマー（表１）及びユニバーサルプライマーＴ３を用いる一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、及び該一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物及びユニバーサルプライマーＴ７を用いる二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によって構築した。これらの反応に用いたテンプレートは、実施例１から得た、pBluescript KS II(+) でクローン化された該ｃＤＮＡコーディング野生型ＴＰＯであった。

一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を、２.５Ｕの Ex taq （Takara 社、日本）、５μlの１０Ｘ緩衝液、１ｍＭの塩化マグネシウム、２.５ｍＭのｄＮＴＰを加えることによって行い、蒸留水を加えて全容積を５０μlとした。 該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）条件は、１サイクル：９４℃で３分間、続いて３０サイクル：９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間からなり、次いで１サイクル：７２℃で７分間にリンクした。

該一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、ユニバーサルプライマーＴ７（１０ピコモル）と共に二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）におけるメガプライマーとして使用した。pBluescript KS II(+) でクローン化された該ｃＤＮＡコーディング野生型ＴＰＯを、二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）におけるテンプレートとして使用した。二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を、２.５Ｕの Ex taq （Takara 社、日本）、５μlの１０Ｘ緩衝液、１ｍＭの塩化マグネシウム、２.５ｍＭのｄＮＴＰを加えることによって行い、蒸留水を加えて全容積を５０μlとした。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）条件は、１サイクル９４℃で３分間、続いて３０サイクル：９４℃で１分間、５８℃で１分間、及び７２℃で１.５分間からなり、最後に終結に先立って１サイクル：７２℃で７分間にリンクした。

ＤＮＡ合成由来のエラーを最小限化するため、一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）におけるＭｇ２+濃度を１ｍＭに低下させた。増幅されたメガプライマーのサイズは、ＴＰＯ-［Ｆ４６Ｖ］の場合は２８０ｂｐ（塩基対）、ＴＰＯ-［Ｆ１２８Ｖ］の場合は５２０ｂｐ（塩基対）、ＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］の場合は５３０ｂｐ（塩基対）、及びＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］の場合は５６０ｂｐ（塩基対）であった。メガプライマーを用いる二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）では、ｃＤＮＡがコードする生成された各突然変異タンパク質は、１０６２ｂｐ（塩基対）と同一サイズを示した。個々のＴＰＯ突然変異タンパク質のヌクレオチド配列でのフェニルアラニンからバリンへの置換は、ダイレクトシーケンス法によって検証した。

１０６２ｂｐ（塩基対）の個々のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、０.８%のアガロースゲル中で単離し、Qiaex H ゲル抽出キットを用いて精製した。 該ＰＣＲ産物を、１５Ｕの EcoRI 及び１０Ｕの AM を用いて３７℃で２時間消化した。

消化されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、０.８%のアガロースゲル中で単離し、Qiaex II ゲル抽出キットを用いて精製し、上記のように pBluescript KS II(+) を用いてライゲート（連結）した。 ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］をコード化するＤＮＡを含有する該組換え発現ベクターを、Tefficacin-４と名付け、２００３年６月９日付けでブダペスト条約に基づいてＫＣＣＭ（韓国微生物保存センター）に寄託した。

国際寄託当局によって与えられたアクセッション番号はＫＣＣＭ-１０５００であった。

（Ｂ） ｃＤＮＡがコードするＥＰＯ突然変異タンパク質の構造：
４つの突然変異タンパク質ＥＰＯ、ＥＰＯ-［Ｆ４８Ｖ］、ＥＰＯ-［Ｆ１３８Ｖ］、ＥＰＯ-［Ｆ１４２Ｖ］及びＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］を、それぞれの各位置でフェニルアラニンからバリンへの１つのアミノ酸置換を有するように、以下の手順に従って構築した。

ｃＤＮＡがコードするＥＰＯ突然変異タンパク質の構成法は、基本的にＴＰＯの構築法と同様とした。ＥＰＯ-［Ｆ４８Ｖ］、ＥＰＯ-［Ｆ１３８Ｖ］、ＥＰＯ-［Ｆ１４２Ｖ］、及びＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］をコード化するｃＤＮＡを、特異的プライマー（表２）及びユニバーサルプライマーＴ３を用いる一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、及び該一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物及びユニバーサルプライマーＴ７を用いる二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によって構築した。これらの反応に用いたテンプレートは、実施例１から得た、pBluescript KS II(+) でクローン化された該ｃＤＮＡコーディング野生型ＥＰＯであった。

一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）における Me 濃度を１ｍＭに調節した。増幅されたメガプライマーのサイズは、ＥＰＯ-［Ｆ４８Ｖ］の場合は３００ｂｐ（塩基対）、ＥＰＯ-［Ｆ１３８Ｖ］の場合は５５０ｂｐ（塩基対）、ＥＰＯ-［Ｆ１４２Ｖ］の場合は５５０ｂｐ（塩基対）及びＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］の場合は５５０ｂｐ（塩基対）であった。該メガプライマーを用いる二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）では、ｃＤＮＡがコードする個々の突然変異タンパク質は、５８０ｂｐ（塩基対）と同一サイズに増幅した。個々のＥＰＯ突然変異タンパク質のヌクレオチド配列でのフェニルアラニンからバリンへの置換は、ダイレクトシーケンス法によって検証した。

５８０ｂｐ（塩基対）の個々のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、０.８%のアガロースゲル中で単離し、Qiaex II ゲル抽出キットを用いて精製した。該ＰＣＲ産物を、１５Ｕの EcoRI 及び１０Ｕの BamHI を用いて３７℃で２時間消化した。消化されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を上記のようにpBluescript KS II(+) にライゲート（連結）し、該発現ベクターの構築に使用した。ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］をコード化するＤＮＡを含有する該組換え発現ベクターを、Refficacin-４と名付け、２００３年６月９日付けでブダペスト条約に基づいてＫＣＣＭ（韓国微生物保存センター）に寄託した。国際寄託当局によって与えられたアクセッション番号はＫＣＣＭ-１０５０１であった。

（Ｂ） ｃＤＮＡがコードするＧ-ＣＳＦ突然変異タンパク質の構造：
突然変異タンパク質Ｇ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ［Ｆ１３Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ［Ｆ８３Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ［Ｆ１１３Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ［Ｆ１４０Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ［Ｆ１４４Ｖ］及びＧ-ＣＳＦ［Ｆ１６０Ｖ］を、それぞれの各位置でフェニルアラニンからバリンへの１つのアミノ酸置換を有するように、以下の手順に従って構築した。

ｃＤＮＡがコードするＧ-ＣＳＦ突然変異タンパク質の構成法は、基本的にＴＰＯの構築法と同様とした。Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１３Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ８３Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１１３Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４０Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４４Ｖ］、及びＧ-ＣＳＦ-［Ｆ１６０Ｖ］をコード化するｃＤＮＡを、特異的プライマー（表３）及びユニバーサルプライマーＴ３を用いる一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、及び該一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物及びユニバーサルプライマーＴ７を用いる二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によって構築した。

これらの反応に用いたテンプレートは、該実施例１から得た、pBluescript KS II(+) でクローン化された該ｃＤＮＡコーディング野生型Ｇ-ＣＳＦであった。

一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）におけるＭｇ^２+濃度を１ｍＭに調節した。増幅されたメガプライマーのサイズは、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１３Ｖ］の場合は６００ｂ.ｐ（塩基対）、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ８３Ｖ］の場合は３９０ｂ.ｐ（塩基対）、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１１３Ｖ］の場合は３００ｂ.ｐ（塩基対）、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４０Ｖ］の場合は２００ｂ.ｐ（塩基対）、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４４Ｖ］の場合は２００ｂ.ｐ（塩基対）、及びＧ-ＣＳＦ［Ｆ１６０Ｖ］の場合は１５０ｂ.ｐ（塩基対）であった。該メガプライマーを用いる二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）では、ｃＤＮＡがコードする各突然変異タンパク質を６４０ｂ.ｐ（塩基対）と同一サイズに増幅した。個々のＧ-ＣＳＦ突然変異タンパク質のヌクレオチド配列でのフェニルアラニンからバリンへの置換は、ダイレクトシーケンス法によって検証した。

６４０ｂ.ｐ（塩基対）の個々のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、０.８%のアガロースゲル中で単離し、Qiaex II ゲル抽出キットを用いて精製した。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、１５Ｕの SmaI 及び１０Ｕの EcoRI を用いて３７℃にて２時間消化し、０.８%のアガロースゲル中で単離し、Qiaex II ゲル抽出キットを用いて精製した。消化されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、上記のように pBluescript KS II(+) にライゲート（連結）した。Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４０Ｖ］をコード化するＤＮＡを含有する該組換え発現ベクターを、Grefficacin-４と名付け、２００４年５月１７日付けでブダペスト条約に基づいてＫＣＣＭ（韓国微生物保存センター）に寄託した。

国際寄託当局によって与えられたアクセッション番号はＫＣＣＭ-１０５７１であった。

（Ｃ） ｃＤＮＡがコードするＧＨ突然変異タンパク質の構造：
４つの突然変異タンパク質ＧＨ、ＧＨ-［Ｆ４４Ｖ］、ＧＨ-［Ｆ９７Ｖ］、ＧＨ-［Ｆ１３９Ｖ］、ＧＨ-［Ｆ１４６Ｖ］、ＧＨ-［Ｆ１６６Ｖ］、及びＧＨ-［Ｆ１７６Ｖ］を、それぞれの各位置でフェニルアラニンからバリンへの１つのアミノ酸置換を有するように、以下の手順に従って構築した。

ｃＤＮＡがコードするＧＨ突然変異タンパク質の構成法は、基本的にＴＰＯの構築法と同様とした。突然変異タンパク質ＧＨ-［Ｆ４４Ｖ］、ＧＨ-［Ｆ９７Ｖ］、ＧＨ-［Ｆ１３９Ｖ］、ＧＨ-［Ｆ１４６Ｖ］、ＧＨ-［Ｆ１６６Ｖ］及びＧＨ-［Ｆ１７６Ｖ］をコード化するｃＤＮＡを、特異的プライマー（表４）及びユニバーサルプライマーＴ３を用いる一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、及び該一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物及びユニバーサルプライマーＴ７を用いる二次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によって構築した。これらの反応に用いたテンプレートは、実施例１から得た、pBluescript KS II(+) でクローン化された該ｃＤＮＡコーディング野生型ＧＨであった。

一次ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）におけるＭｇ^２+濃度を１ｍＭに調節した。個々の増幅メガプライマーのサイズは、ＧＨ-［Ｆ４４Ｖ］の場合は１３０ｂ.ｐ（塩基対）、ＧＨ-［Ｆ９７Ｖ］の場合は３００ｂ.ｐ（塩基対）、ＧＨ-［Ｆ１３９Ｖ］の場合は４２０ｂ.ｐ（塩基対）、ＧＨ-［Ｆ１４６Ｖ］の場合は４５０ｂ.ｐ（塩基対）、ＧＨ-［Ｆ１６６Ｖ］の場合は５００ｂ.ｐ（塩基対）、及びＧＨ-［Ｆ１７６Ｖ］ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の場合は５３０ｂ.ｐ（塩基対）であった。個々のＧＨ突然変異タンパク質のヌクレオチド配列でのフェニルアラニンからバリンへの置換は、ダイレクトシーケンス法によって検証した。

６5０ｂ.ｐ（塩基対）の個々のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、０.８%のアガロースゲル中で単離し、Qiaex II ゲル抽出キットを用いて精製した。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、１５Ｕの EcoRI 及び１０Ｕの Hindi を用いて３７℃にて２時間消化し、０.８%のアガロースゲル中で単離し、Qiaex II ゲル抽出キットを用いて精製した。 消化されたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、上記のように pBluescript KS II(+) にライゲート（連結）した。

ＴＰＯ突然変異タンパク質の発現及び精製
（Ａ）ＴＰＯ突然変異タンパク質：
（ａ）リポフェクション法を用いることによってトランスフェクトした細胞株の確立：
チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ-ＫＩ」）（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ６１）細胞を、１０%のウシ胎児血清（「ＦＢＳ」）で補足したダルベッコ改良Ｅａｇｌｅ培地（「ＤＭＥＭ」）［Gibco BRL 社、米国］を含有する３５ｍｍシャーレあたり１.５ｘ１０^５個の細胞密度で調製した。該細胞を、３７℃にて５%のＣＯ_２中で１８〜２４時間増殖させた。６μlのリポフェクタミンを、滅菌管内で、ＤＮＡがコードするＴＰＯ突然変異タンパク質を含む１.５Mlの該組換え発現ベクターに加えた。この混合物の容量を、無血清ＤＭＥＭを加えることによって１００μlに調節した。該管を室温で４５分間インキュベートした。

３５ｍｍシャーレ内で増殖させた細胞を無血清ＤＭＥＭを用いて２回洗浄し、８００μlの無血清ＤＭＥＭを該シャーレに加えた。洗浄した細胞を該リポフェクタミン-ＤＮＡ複合体上に穏やかに重ね、次いで３７℃にて５%のＣＯ_２中で５時間インキュベートした。５時間のインキュベーション後、２０%のＦＢＳを含有する１MlのＤＭＥＭをトランスフェクトした細胞に加え、次いで該細胞を３７℃にて、５%のＣＯ_２中で１８〜２４時間インキュベートした。該インキュベーション後、該細胞を無血清ＤＭＥＭを用いて２回洗浄し、次いで１０%のＦＢＳを含有する２MlのＤＭＥＭを該培養に加えた。これらの細胞を、３７℃にて７２時間インキュベートした。（５%のＣＯ_２中で）。

（ｂ） ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）を用いたＴＰＯ突然変異タンパク質の発現量の分析：
ｃＤＮＡがコードするＴＰＯ-野生型または突然変異タンパク質を含有するプラスミドをトランスフェクトした細胞のタンパク質の発現量を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）アッセイを用いることによって解析した。コーティング緩衝液［０.１Ｍの重炭酸ナトリウム、（ｐＨ９. ６）］で１０μｇ/Mlに希釈したヤギ抗ヒトＴＰＯポリクローナル抗体（R&D 社、米国）を、９６ウェルプレート（FALCON 社、米国）の各ウェルに、ウェルあたり最大で１００Mlまで加え、室温で１時間インキュベートした。該プレートを、１ＸＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で０.１%のＴｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄した。洗浄後、該プレートを、２００Mlの遮断緩衝液（１%のＦＢＳ、５%のサッカロース、０.０５%のアジ化ナトリウム）を用いて室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴを用いて３回洗浄した。該培養上清（トランスフェクトした細胞を含む）及び希釈緩衝液［０.１%のＢＳＡ、０.０５%のＴｗｅｅｎ２０、１ＸＰＢＳ］連続希釈法を用いて混合した。ポジティブコントロールとしての２５ｎｇ/ｍｌのヒト組換えＴＰＯ［Calbiochem 社、米国］と、ネガティブコントロールとしての非形質導入のＣＨＯ-Ｋ１培養上清とを同等に希釈した。これらの対照群及びサンプル群を室温で１時間インキュベートした。次いで、該プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。希釈緩衝液を用いて０.２μｇ/Mlに希釈したビオチン化ヤギ抗ヒトＴＰＯ抗体（R&D 社、米国）をウェルあたり最大で１００μlまで９６ウェルプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。希釈緩衝液中で１：２００に希釈したストレプトアビジン-ＨＲＰ（R&D 社、米国）を該９６ウェルプレートにウェルあたり１００μl加え、室温で１時間インキュベートした。１時間後、該プレートをＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、次いでＴＭＢ膜（マイクロウェル）ペルオキシダーゼ基質システム（KPL 社、米国）を用いることによって発色反応を行い、マイクロプレートリーダー［BIO- RAD 社、５５０型］を用いて６３０ｎｍにて吸光度を読み取った。

（ｃ） 突然変異タンパク質ＴＰＯの発現量及び分子量のウエスタンブロット法を用いた分析：
培地からＦＢＳを除外するために、CHO-S-SFM II （Gibco BRL 社、米国）を上記のトランスフェクトした細胞の培養に使用した。培養培地から CHO-S-SFM II を、０.２μＭのシリンジフィルターを用いて濾過し、centricon （Mol. ３０,０００ミリポア、米国）で濃縮した。低下ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行うには、５%の3-メルカプトエタノールを含有するサンプル添加液を該サンプルに加え、５分間加熱した。このドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）には、濃縮用ゲル及び分離ゲルを使用した。該濃縮用ゲルを、３.５%のアクリルアミド、０.３７５Ｍのトリス（ｐＨ６.８）、０.４%のＳＤＳから構成し、該分離ゲルは、１０%のアクリルアミドゲル、１.５Ｍのトリス（ｐＨ８.８）、０.４%のＳＤＳから構成した。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のゲル分離処理後、タンパク質サンプルを、４を有する Westran （ＰＶＤＦメンブレン（転写膜）、S&S 社）に移し、２５ｍＭのトリス-１９２ｍＭのグリシン（ｐＨ８.３）-２０%のメタノール緩衝液を含有するリザーバ内で、３５０ｍＡにて２時間詳細に検討した。移行後、それをＰＢＳＴ中で５%の無脂肪牛乳粉末を用いて１０分間、３回ブロックした。該ビオチン化ヤギ抗ヒトＴＰＯ抗体（R&D 社、米国）を、遮断緩衝液中で０.２５μｇ/Mlに希釈し、この溶液の３ｍｌを加えて、６時間振盪した。該膜を洗浄溶液で３回洗浄した。ストレプトアビジン-ＨＲＰ（R&D 社、米国）を遮断緩衝液中で１：１００に希釈し、１時間インキュベートした。該膜を洗浄溶液で３回洗浄した。タンパク質バンドを、ＤＡＢ基質（VECTOR LABORATORIES、米国）を用いて１０分間インキュベートすることによって可視化させた。この反応は、該膜を脱イオン水中に浸漬することで停止した。

図２Aでは、ＴＰＯの野生型形態と突然変異タンパク質形態は共に同一の分子量（５５ｋＤ）を有していた。

ＴＰＯの野生型及び突然変異タンパク質の相対発現量を図３Aに示した。

個々のＴＰＯ突然変異タンパク質の発現量を、対照としての野生型ＴＰＯの発現量と比較した。

ＴＰＯ-［Ｆ１２８Ｖ］発現量は、野生型ＴＰＯ発現量の１.４倍以上増加した。しかし、ＴＰＯ-［Ｆ４６Ｖ］、ＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］及びＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］の発現は、野生型発現量の２０%、４０%、及び４０%にそれぞれ減少した。

（Ｂ） ＥＰＯ突然変異タンパク質：
ｃＤＮＡがコードするＥＰＯ突然変異タンパク質を含有する発現ベクターをＣＨＯ-Ｋ１細胞にトランスフェクトし、ＥＰＯ突然変異タンパク質のそれぞれの発現量を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）アッセイを用いることによって検出した。そして、ＥＰＯの野生型と突然変異タンパク質のそれぞれの分子量を、ウエスタンブロット法によって分析した。

図２Ｂでは、ＥＰＯの野生型と突然変異タンパク質形態の分子量は共に同一とした（４５ｋＤ）。

ＥＰＯの野生型と突然変異タンパク質の相対発現量を図３Bに示した。

ＥＰＯ-［Ｆ４８Ｖ］及びＥＰＯ-［Ｆ１３８Ｖ］の発現量は、野生型ＥＰＯの発現量の１.４倍及び１.２倍以上にそれぞれ増加した。しかし、ＥＰＯ-［Ｆ１４２Ｖ］及びＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］の発現量は、野生型ＥＰＯの発現量の２０%及び３０%にそれぞれ減少した。

（Ｃ） Ｇ-ＣＳＦ突然変異タンパク質：
ｃＤＮＡがコードするＧ-ＣＳＦ突然変異タンパク質を含有する発現ベクターをＣＨＯ-Ｋ１細胞にトランスフェクトし、Ｇ-ＣＳＦ突然変異タンパク質のそれぞれの発現量を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）アッセイを用いることによって検出し、Ｇ-ＣＳＦの野生型と突然変異タンパク質のそれぞれの分子量をウエスタンブロット法によって分析した。

図２Cでは、Ｇ-ＣＳＦの野生型形態と突然変異タンパク質形態は共に同一の分子量（５0ｋＤ）を有していた。

Ｇ-ＣＳＦの野生型及び突然変異タンパク質の相対発現量を図３Cに示した。

他のＧ-ＣＳＦ突然変異タンパク質の発現量は、野生型Ｇ-ＣＳＦの発現量と同様とした。

Ｇ-ＣＳＦ突然変異タンパク質-［Ｆ８３Ｖ］の発現量は、野生型の発現量の１.９倍増加した。しかし、Ｇ-ＣＳＦ突然変異タンパク質-［Ｆ１４０Ｖ］及び-［Ｆ１４４Ｖ］の発現量は、野生型Ｇ-ＣＳＦの発現量の５０%及び７０%にそれぞれ減少した。

（Ｄ） ＧＨ突然変異タンパク質：
ｃＤＮＡがコードするＧＨ突然変異タンパク質を含有する発現ベクターを、ＣＨＯ-Ｋ１細胞にトランスフェクトした。

該ＧＨ突然変異タンパク質のそれぞれの発現法は、ＴＰＯ生成に使用された発現法と同一とした。

ＤＮＡがコードするＥＰＯ、ＴＰＯ、ＧＣＳＦ、及びＧＨ受容体の構造
（Ａ） ＤＮＡがコードするＥＰＯ及びＴＰＯ受容体の構造：
ＤＮＡがコードするＥＰＯ及びＴＰＯ受容体を構築して、ＥＰＯ突然変異タンパク質及びＴＰＯ突然変異タンパク質のそれぞれの結合親和性を解析した。ＤＮＡがコードする各受容体の細胞外ドメインを、各受容体の細胞外ドメインのＣ末端領域がヒト免疫グロブリンＧ１（ｌｇＧ１）ＦｃドメインＮ末端領域に融合するように、ＤＮＡがコードする免疫グロブリンＧ１（ｌｇＧ１）のＦｃドメインに結合した。ｃＤＮＡがコードするＥＰＯ受容体を、EcoRI の制限部位及びＥＰＯ受容体のリーダー配列を有するセンスプライマー（プライマー５１）、及びＥＰＯ受容体の配列コーディング３’末端及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の配列コーディング５’末端Ｆｃドメインを有するアンチセンスプライマー（プライマー５２）を用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって構築した。免疫グロブリンＧ１（ｌｇＧ１）のＦｃドメインに結合するｃＤＮＡがコードするＴＰＯ受容体を、hindi の制限部位及びＴＰＯ受容体のリーダー配列を有するセンスプライマー（プライマー５３）、及びＴＰＯ受容体の配列コーディング３’末端と免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃドメインの配列コーディング５’末端を有するアンチセンスプライマー（プライマー５４）を用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって構築した。上記のように生成されたｃＤＮＡがコードするＥＰＯ受容体及びＤＮＡがコードする免疫グロブリンＧ１（ｌｇＧ１）のＦｃドメインを同一管内で混合し、共通配列間の相補結合を誘導した。この混合物を用いて、免疫グロブリンＧ１（ｌｇＧ１）Ｆｃドメインに結合されるｃＤＮＡがコードするＥＰＯ受容体を、EcoRI の制限部位とＥＰＯ受容体のリーダー配列を有するセンスプライマー（プライマー５１）、及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃドメインの aI と３’末端の制限部位を有するアンチセンスプライマー（プライマー５５）を用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって構築した。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を EcoRI 及び Xbal で切断し、ＥＰＯ受容体-Ｆｃ融合タンパク質の生成のために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）-３発現ベクターに挿入した。上記のように生成されたｃＤＮＡがコードするＴＰＯ受容体及びＤＮＡがコードする免疫グロブリンＧ１（ｌｇＧ１）のＦｃドメインを同一管内で混合し、かくして共通配列間の相補結合を誘導した。この混合物を用いて、免疫グロブリンＧ１（ｌｇＧ１）Ｆｃドメインに結合されるｃＤＮＡがコードするＥＰＯ受容体を、EcoRI の制限部位とＴＰＯ受容体のリーダー配列を有するセンスプライマー（プライマー５３）、及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃドメインの Mal と３’末端の制限部位を有するアンチセンスプライマー（プライマー５５）を用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって構築した。該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を Hindi 及び Xbal で切断し、ＴＰＯ受容体-Ｆｃ融合タンパク質の生成のために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）-３発現ベクターに挿入した。

免疫グロブリンに融合されるＴＰＯ受容体及びＥＰＯ受容体の構築に用いたプライマーのリスト
（Ｂ） ＤＮＡがコードするＧ-ＣＳＦ受容体及びＧＨ受容体の構造：
ｃＤＮＡがコードするＧ-ＣＳＦ受容体を、hindi の制限部位とＧ-ＣＳＦ受容体のリーダー配列を有するセンスプライマー（プライマー５６）、及びを有するアンチセンスプライマー（プライマー５７）EcoRI の制限部位及びＧ-ＣＳＦ受容体の配列コーディング３’末端を用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって構築した。ｃＤＮＡがコードするＧＨ受容体を、EcoRI の制限部位とＧ-ＣＳＦ受容体のリーダー配列を有するセンスプライマー（プライマー５８）、及び SpeI の制限部位とＧ-ＣＳＦ受容体の配列コーディング３’末端を有するアンチセンスプライマー（プライマー５９）を用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって構築した。

Ｇ-ＣＳＦ受容体をコードする該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を、Hindi 及び EcoRI で消化し、HindEl EcoRI 部位にて市販されているクローニングベクター、pBluescript KS II(+) に挿入することによってクローン化した。ＧＨ受容体をコードする該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を EcoRI 及びSpeI で消化し、EcoRJI SpeI 部位にて市販されているクローニングベクター、pBluescript KS II(+) に挿入することによってクローン化した。

ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインを、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のヒンジ領域の配列コーディング５’末端部を有するセンスプライマー（Ｇ-ＣＳ用プライマー６０、ＧＨ用プライマー６１）、及びアンチセンスプライマー（プライマー６２）を用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって構築した。Ｇ-ＣＳＦ受容体に関しては、該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物がコードするヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインを EcoRI 及び AM で消化し、EcoRV "aI 部位にて市販されているクローニングベクター、pBluescript KS II(+) に挿入することによってクローン化した。ＧＨ受容体に関しては、該ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物がコードするヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインを SpeI 及び AM で消化し、SpeI 部位/MaI にて市販されているクローニングベクター、pBluescript KS II(+) に挿入することによってクローン化した。

該クローン化ｃＤＮＡがコードするＧ-ＣＳＦ受容体及び該クローン化ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインともに、EcoRU MaI で消化し、次いでライゲート（連結）して、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインに結合されるＤＮＡがコードするＧ-ＣＳＦ受容体を調製した。このＤＮＡ構成物を、HindE 及び XhaI で切断し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）-３発現ベクターに挿入した。該クローン化ｃＤＮＡがコードするＧＨ受容体及び該クローン化ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインともに、Spell al で消化し、次いでライゲート（連結）して、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインに結合されるＤＮＡがコードするＧ-ＣＳＦ受容体を調製した。このＤＮＡ構成物を、EcoRI 及び AM で切断し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）-３発現ベクターに挿入した。

ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）を用いることによって得た、サイトカイン及びその突然変異タンパク質のその受容体のそれぞれに対する結合親和性の測定値。

（Ａ） ＴＰＯ及びＴＰＯ突然変異タンパク質のＴＰＯ受容体に対する結合：
ＴＰＯ突然変異タンパク質のために遺伝子を運ぶ発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養上清を、サイトカインと受容体の相互作用を測定するために使用した。

タンパク質セファロース４Ｂカラム（Pharmacia 社、スウェーデン）を用いることによって、ＴＰＯ受容体-Ｆｃ融合タンパク質の遺伝子コーディングを行う組換え発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養上清から、ＴＰＯ受容体-免疫グロブリン融合タンパク質を精製した。コーティング緩衝液［０.１Ｍの重炭酸ナトリウム、（ｐＨ９. ６）］で１０μｇ/Mlに希釈した精製融合タンパク質を、９６ウェルプレート（FALCON 社、米国）の各ウェルに、ウェルあたり最大で１００μlまで加え、室温で１時間インキュベートした。該プレートを、１ＸＰＢＳ［ＰＢＳＴ］中で０.１%のＴｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄した。洗浄後、該プレートを、２００μlの遮断緩衝液（１%のＦＢＳ、５%のサッカロース、０.０５%のアジ化ナトリウム）を用いて室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴを用いて３回洗浄した。

洗浄後、４つのＴＰＯ突然変異タンパク質及び１つのＴＰＯ野生型からなる培養上清を、連続的に希釈緩衝液［０.１%のＢＳＡ、０.０５%のＴｗｅｅｎ２０、１ＸＰＢＳ］でそれぞれ希釈し、該ＴＰＯ受容体-Ｆｃ融合タンパク質で被覆した９６ウェルプレートに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳＴを用いて洗浄したを３回繰り返した。ポジティブコントロールとしてのヒト組換え体ＴＰＯ［Calbiochem 社、米国］と、ネガティブコントロールとしての非形質導入のＣＨＯ-Ｋ１培養上清とを同等に希釈した。該プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。希釈緩衝液中で０.２μｇ/Mlに希釈したビオチン化ヤギ抗ヒトＴＰＯ抗体（R&D 社、米国）をウェルあたり１００μlの量で９６ウェルプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。

希釈緩衝液中で１：２００に希釈したストレプトアビジン-ＨＲＰ（R&D 社、米国）を９６ウェルプレートにウェルあたり１００ｍｅ加え、室温で１時間インキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴを用いて該プレートを３回洗浄した。ＴＭＢ膜（マイクロウェル）ペルオキシダーゼ基質システム（KPL 社、米国）を用いて発色反応を行い、マイクロプレートリーダー［BIO- RAD 社、５５０型］を用いて６３０ｎｍにて吸光度を読み取った。

ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］及びＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］の該ＴＰＯ受容体に対する結合親和性は、野生型ＴＰＯの結合親和性と比較して増加した（図４A）。前述の突然変異タンパク質は、すべてのＴＰＯ突然変異タンパク質の中で最も高い結合親和性を持っていた。

（Ｂ） ＥＰＯ及びＥＰＯ突然変異タンパク質のＥＰＯ受容体に対する結合：
ＥＰＯ野生型及び突然変異タンパク質の該受容体に対する結合親和性の測定値は、ＴＰＯ及びＴＰＯ突然変異タンパク質のＴＰＯ受容体に対する結合親和性の測定値と基本的に同様とした。

ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］及びＥＰＯ-［Ｆ１４２Ｖ］の該ＥＰＯ受容体に対する結合親和性は、野生型ＥＰＯ（図４ｂ）の結合親和性と比較して増加した。前述の突然変異タンパク質は、すべてのＥＰＯ突然変異タンパク質の中で最も高い結合親和性を持っていた。

（Ｃ） Ｇ-ＣＳＦ及びＧ-ＣＳＦ突然変異タンパク質のＧ-ＣＳＦ受容体に対する結合：
Ｇ-ＣＳＦ野生型及び突然変異タンパク質の該受容体に対する結合親和性の測定値は、ＴＰＯ及びＴＰＯ突然変異タンパク質のＴＰＯ受容体に対する結合親和性の測定値と基本的に同様とした。

結果（図４C）は、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４０Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４４Ｖ］、及びＧ-ＣＳＦ-［Ｆ１６０Ｖ］の該Ｇ-ＣＳＦ受容体に対する結合親和性が野生型Ｇ-ＣＳＦの結合親和性比較して増加することを示し、また、第１突然変異タンパク質（Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４０Ｖ］）がすべてのＧ-ＣＳＦ突然変異タンパク質の中で最も高い結合親和性を有することを示した。

（Ｄ） ＧＨ及びＧＨ突然変異タンパク質のＧＨ受容体に対する結合：
ＧＨ野生型及び突然変異タンパク質の該受容体に対する結合親和性の測定値は、ＴＰＯ及びＴＰＯ突然変異タンパク質のＴＰＯ受容体に対する結合親和性の測定値と基本的に同様とした。

結果（図４D）は、ＧＨ-［Ｆ１３９Ｖ］が該ＧＨ受容体に対して最も高い結合親和性を有することを示した。

ＳＰＲ法を用いることによって得た、サイトカイン及びその突然変異タンパク質のその受容体のそれぞれに対する結合の測定値
（Ａ） ＴＰＯ及びＴＰＯ突然変異タンパク質のＴＰＯ受容体に対する結合：
ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］及びＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］のＴＰＯ受容体に対する結合親和性を測定するため、ＣＭ５センサーチップを用いた BIAcore ３０００測定装置を使用してＳＰＲ法を行った。抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を、アミンカップリング法を用いて個々のフローセル１及び２に固定化した。活性基を不活化するため、表面を１Ｍのエタノールアミンでブロックした。ＴＰＯ受容体-Ｆｃ融合タンパク質を、２分間、３０μl/分にて加えて該抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体に結合させ、次いでＴＰＯ及びＴＰＯ突然変異タンパク質を反応させて該ＴＰＯ受容体に結合させた。

同一リガンド密度でのレゾナンスユニット（ＲＵ）の増加は、結合親和性がより高いことを意味する。図５Aでは、野生型ＴＰＯ、ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］及びＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］のレゾナンスユニットは、それぞれ１０ＲＵ、３０ＲＵ及び２０ＲＵであった。この結果は、ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］が最も高い結合親和性を持つことを示した。加えて、野生型及び突然変異タンパク質ＴＰＯのＫＤ値を表７に示した。

（Ｂ） ＥＰＯ突然変異タンパク質：
ＳＰＲ法を行って、ＥＰＯ受容体とのＥＰＯ突然変異タンパク質-［Ｆ１４８Ｖ］及びＥＰＯ-［Ｆ１４２Ｖ］の結合親和性を測定した。実験手順は、ＴＰＯの実験手順と同様とした。

図５Bには、ＥＰＯ野生型及び突然変異タンパク質のＳＰＲ法の測定結果を示した。図５Bでは、ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］は、４０ＲＵ、ＥＰＯ-［Ｆ１４２Ｖ］３０ＲＵを示した。 これらの結果は、ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］が最も高い結合親和性を有することを示す。加えて、ＥＰＯ突然変異タンパク質のＫｐ値を表８に示した。

ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）を用いることによって得た、サイトカインの野生型タンパク質及び突然変異タンパク質の結合親和性測定値
（Ａ） ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞株の確立：
ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞株を、ｃＤＮＡがコードするｃ-ＭｐｌをＴＦ-１細胞にトランスフェクトすることによって確立した。

ｃ-Ｍｐｌの発現を、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析を用いることによって検証した。１ｘ１０^６/ｍｌの該ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、精製されたｃ-Ｍｐｌマウス抗ヒトモノクローナル抗体（BD 社 PharMingen 社、米国）を該ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞でインキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（全分子、Sigma 社、米国）を加えて、該ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞表面上のｃ-Ｍｐｌ発現を検証した。

結果として、該ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞のグラフは、ＴＦ-１細胞のグラフから右方向移行した。この結果により、ｃ-Ｍｐｌ、ＴＰＯ受容体、が、該ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞に発現することが明らかにされた。

（Ｂ） ＴＰＯ突然変異タンパク質のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析：
１x１０^６/ｍｌのＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞をＰＢＳ緩衝液中に懸濁し、ＴＰＯ野生型及びＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］を該懸濁液に加え、４℃で３０〜６０分間それぞれインキュベートした。

ビオチン化ヤギ抗ヒトＴＰＯポリクローナル抗体（R&D 社、米国）を上記細胞に加え、４℃で３０〜６０分間インキュベートした。ストレプトアビジン-ＦＩＴＣ（Sigma 社、米国）を上記細胞に加え、４℃で３０〜６０分間インキュベートした。該細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄して、非反応ストレプトアビジン-ＦＩＴＣを除去した。該細胞をＰＢＳ緩衝液中に懸濁し、EXCALIBUR （BD 社、米国）を用いて、４８８ｎｍにてフローサイトメトリー分析を行った。

図６Aでは、ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］の結合曲線は、野生型ＴＰＯの結合曲線から右方向に移行した。この結果により、ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］の受容体結合親和性が、該野生型ＴＰＯの該親和性よりもはるかに高いことが明らかにされた。

（Ｃ） ＥＰＯ突然変異タンパク質のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析：
ＥＰＯ突然変異タンパク質のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）法は、ＴＰＯのＦＡＣＳ法と同様とした。

図６Bでは、ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］の結合曲線は、野生型ＴＰＯの結合曲線から右方向に移行した。この結果により、ことが示されたＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］が受容体結合親和性において、該野生型ＥＰＯよりもはるかに高いことが明らかにされた。

ＴＰＯ、ＥＰＯ、Ｇ-ＣＳＦ及びＧＨ突然変異タンパク質の生物活性の測定値
（Ａ） ＴＰＯ突然変異タンパク質細胞増殖アッセイ：
ＴＰＯ-野生型と突然変異タンパク質間の細胞増殖及び生物活性の相違点を調査研究するため、上記で生成したＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞株を使用した。ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞を、１０%のウシ胎児血清、１ｎｇ/MlのＧＭ-ＣＳＦ、３７℃、５%のＣＯ_２で補足したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。

０.４、１、５、１０、２０、４０、７５ｎｇ/MlのＴＰＯ-野生型のそれぞれと、ＲＰＭＩ-１６４０中の突然変異タンパク質を、９６ウェル組織培養プレート（FALCON 社、米国）に播種した。１０%のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ-１６４０中の該ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞の１１０４個の細胞を、該９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。４日間の培養後、３７℃、５%のＣＯ_２、２０μlのＭＴＳ溶液［３-（４、５１imethy-２-イル）-５-（３-arboxymethオキシフェニル）-２-（４-スルホフェニル）-２Ｈ-テトラゾリウム、内塩、ＭＴＳ］及び該フェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ，Promega 社）を加え、４時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（BIO- RAD 社 ５５０型）を用いて、４９０ｎｍにて吸光度を測定した。

図７Aには、刺激的なＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞増殖刺激に関する、ＴＰＯ野生型と突然変異タンパク質の相違点を示した。０.４ｎｇ/Ml〜７５ｎｇ/MlのＴＰＯを該ＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌに加えた。細胞増殖を最大で５０ｎｇ/MlのＴＰＯ濃度まで増加させた。ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］のＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞増殖可能性は野生型と比べてはるかに高く、ＴＰＯ突然変異タンパク質中でその生物活性は最も高かった。ＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］の生物活性は、ＴＰＯ突然変異タンパク質中で第２番目に高かった。ＴＰＯ-［Ｆ４６Ｖ］の活性は、野生型の活性と同様であった。

（Ｂ） ＥＰＯ突然変異タンパク質細胞増殖アッセイ：
ＥＰＯ突然変異タンパク質の生物活性を、ＥＰＯ依存型ＴＦ-１細胞を用いて細胞増殖アッセイによって調べた。ＥＰＯ突然変異タンパク質の細胞増殖アッセイ実験手順は、ＴＰＯ突然変異タンパク質の細胞増殖アッセイ実験手順と同様とした。

図７Bには、ＴＦ-１細胞増殖刺激に関する、ＥＰＯ野生型と突然変異タンパク質の相違点を示した。０.０１ＩＵ/ｍｌ〜７ＩＵ/lnQ のＥＰＯを該ＴＦ-１細胞に加えた。ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］のＴＦ-１細胞増殖可能性は、該野生型と比べてはるかに高く、ＥＰＯ突然変異タンパク質の中でその生物力は最も高かった。ＥＰＯ-［Ｆ１４２Ｖ］及びＥＰＯ-［Ｆ１３８Ｖ］の生物活性は、ＥＰＯ突然変異タンパク質中、それぞれ第２番目及第３番目に高かった。

（Ｃ） Ｇ-ＣＳＦ突然変異タンパク質：
Ｇ-ＣＳＦ突然変異タンパク質の生物活性を、Ｇ-ＣＳＦ依存型ＨＬ-６０細胞を用いて細胞増殖アッセイによって調べた。Ｇ-ＣＳＦ突然変異タンパク質の細胞増殖アッセイ実験手順は、ＴＰＯ突然変異タンパク質の細胞増殖アッセイ実験手順と同様とした。

図７Cには、ＨＬ-６０細胞増殖刺激に関する、Ｇ-ＣＳＦ野生型と突然変異タンパク質の相違点を示した。

０.４ｎｇ/Ml〜７５ｎｇ/MlのＧ-ＣＳＦを該ＨＬ-６０細胞に加えた。Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４０Ｖ］のＨＬ-６０細胞増殖可能性は、該野生型と比べてはるかに高く、Ｇ-ＣＳＦ突然変異タンパク質の中でその生物力は最も高かった。

（Ｃ） ＧＨ突然変異タンパク質：
ＧＨ突然変異タンパク質の生物活性を、ＧＨ依存型ＮＢ２細胞を用いて細胞増殖アッセイによって調べた。ＧＨ突然変異タンパク質の細胞増殖アッセイ実験手順は、ＧＨ突然変異タンパク質の細胞増殖アッセイ実験手順と同様とした。

図７Dには、ＮＢ２細胞増殖刺激に関する、ＧＨ野生型と突然変異タンパク質の相違点を示した。０.４ｎｇ/Ml〜７５ｎｇ/MlのＧＨを該ＮＢ２細胞に加えた。ＧＨ-［Ｆ１３９Ｖ］のＮＢ２細胞増殖可能性は、該野生型と比べてはるかに高く、ＧＨ突然変異タンパク質の中でその生物力は最も高かった。

ＥＰＯ-及びＴＰＯ-野生型及び突然変異タンパク質の薬物動態特性
野生型間の、各ＥＰＯ-及びＴＰＯ-突然変異タンパク質の薬物動態特性の相違点を調べた。ＴＰＯまたはＴＰＯ突然変異タンパク質を、ウサギ（ニュージーランド産、白色、３ｋｇ）に静脈注射によって投与し、次いで血液サンプルを連続的に採取した。上記のように定量的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）アッセイを用いることによって、各サンプルのＥＰＯ及びＴＰＯ濃度を検出した。

ＥＰＯのマウス（１２weeks、Ｂａｌｂ/ｃマウス、３０g）への投与は、腹腔内投与及び静脈内投与の両方によって行った。ヘパリン含有管内の血液サンプルを、３,０００ｒｐｍにて１０分間の遠心単離よって単離した。上清含有血漿を用いて、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）により、ＥＰＯ及びＴＰＯの血液濃度を検出した。

５μl/ｋｇのＴＰＯ野生型及び-［Ｆ１４１Ｖ］をウサギに静脈内投与した後、ＴＰＯ野生型及び-［Ｆ１４１Ｖ］の血漿濃度プロファイルを図８Aに示した。ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］濃度を、野生型ＴＰＯの濃度と比べてさらに急速に低下させた。ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］は、その受容体に対する結合親和性がより高いため、より急速に血液から周辺標的組織に移行させた。

１０００ＩＵ/ｋｇの野生型ＥＰＯ及びＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］をウサギに静脈内投与した後の、血液中の野生型ＥＰＯ及びＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］血漿濃度プロファイルを図８Bに示した。

ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］濃度を、ＥＰＯ野生型の濃度と比べてさらに急速に低下させた。

２０ＩＵ/ｇの野生型ＥＰＯ及びＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］をマウスに腹腔内投入後の、血漿濃度プロファイルを図８Cに示した。ＥＰＯ野生型の拡散速度は、初期段階にてＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］の拡散速度よりも高く、また、野生型ＥＰＯ最大血中濃度（Ｃｍａｘ）も、ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］血中濃度よりも高かった。ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］のＣｍａｘは、野生型ＥＰＯよりも長く維持された。これらの結果により、ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］が、該野生型ＥＰＯと比べて、より高い疎水性を示し、受容体に対してより高い結合親和性を持つことが示唆された。また、これらの結果は、ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］は、野生型ＥＰＯと比べて、血液中により緩慢に拡散され、血液から周辺標的組織により迅速に移行するという結論につながるものである。

ＥＰＯ突然変異タンパク質の生体内活性：
ＥＰＯ-野生型と突然変異タンパク質間の生物活性の相違点をマウスにおいて検証した。

マウス（生後１２週間、Ｂａｌｂ/ｃマウス、２０ｇ、Jungang Lab Animal Inc.、韓国）を、７００Ｒａｄにてγ放射線照射した。５０μlのＰＢＳ中、２５０ｎｇの精製ＥＰＯ野生型及び突然変異タンパク質に、毎日３回腹腔内投与を行った。

血液サンプルを、該マウスの尾静脈から採取し、次いで血液学的パラメータを、通常のＣＢＣ検査によって検査した。野生型ＥＰＯをポジティブコントロールとして使用し、ＣＨＯ細胞培養上清をネガティブコントロールとして使用した。血液を、投与後から０、１、２、４、７、１０、１５、２０、２５、及び３０日目に、ＥＤＴＡを含有する管に採取した。

図９には、ＣＢＣ検査が、赤血球数（ＲＢＣ）及び網状赤血球数の変化をを検証するために、ＥＰＯ-野生型及び突然変異タンパク質を腹腔内投与されたマウスを結果としてもたらすことを示した。赤血球数（ＲＢＣ）増加（図９A）は、野生型ＥＰＯを投与したマウスと比べて、ＥＰＯ［Ｆ１４８Ｖ］投与マウスにおいてはるかに顕著であった。また、ＥＰＯ［Ｆ４８Ｖ］-及びＥＰＯ［１３８Ｖ］投与マウスにおける該赤血球数（ＲＢＣ）増加は、野生型ＥＰＯを投与したマウスと比べて少なかった。網状赤血球数及びヘマトクリット値の増加量（図９B）は、赤血球数（ＲＢＣ）ＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］を投与したマウスのおける変化と同様であった。

ＴＰＯ突然変異タンパク質の生体内活性
マウスにおけるＴＰＯ-野生型と突然変異タンパク質間の生物活性相違点を研究した。

マウス（生後１２週間、Ｂａｌｂ/ｃマウス、２０ｇ、Jungang Lab Animal Inc.、韓国）を、７００Ｒａｄにてγ放射線照射した。５０μlのＰＢＳ中、２５０ｎｇの精製ＴＰＯ野生型及び突然変異タンパク質に、毎日３回腹腔内投与を行った。

血液サンプルを、該マウスの尾静脈から採取し、次いで血液学的パラメータを、通常のＣＢＣ検査によって検査した。野生型ＴＰＯをポジティブコントロールとして使用し、ＣＨＯ細胞培養上清をネガティブコントロールとして使用した。血液を、該投与後から０、１、４、７、１０、１４、１８、２３、２８、及び３２日目に、ＥＤＴＡを含有する管に採取した。

図１０には、ＴＰＯ-野生型及び突然変異タンパク質を腹腔内投与したマウスにおける血小板数（図１０A）、白血球数（図１０B）、及び好中球数（図１０C）の変化を示した。

ＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］を投与したマウスにおける血小板数の増加は最も顕著であった。また、ＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］を投与したマウスの血小板数増加は２番目に高かった。ＴＰＯ-［Ｆ４６Ｖ］を投与したマウスの血小板数増加は野生型ＴＰＯを投与したマウスと同様であった。また、ＴＰＯ-［Ｆ１２８Ｖ］を投与したマウスは、ＰＢＳを投与したネガティブコントロールと同様のの血小板数を示した（図１０A）。白血球数（図１０B）及び好中球数（図１０C）の増加は、血小板数変化における増加に類似したパターンを示した。

本発明の上記結果から明らかなように、従来野生型生物応答調節タンパク質の対応する受容体、リガンドまたは基質に対する結合に関与するドメイン内に存在するフェニルアラニン残基のバリン置換は、結果として結合親和性及び生物活性の増加を招き、従来のタンパク質変異体に対する自己抗体の産生を低減し、それによって改良されたタンパク薬物の製造が可能となる。

４-へリックスバンドル構造のサイトカインの対応する受容体への結合に関与するドメインのアミノ酸配列の複数アライメント。 インターフェロンの対応する受容体への結合に関与するドメインのアミノ酸配列の複数アライメント。 本発明に係るＴＰＯ変異体のウエスタンブロット法の結果を示す（最左端のレーンから： マーカー、 野生型ＴＰＯ、 ＴＰＯ-［Ｆ４６Ｖ］、ＴＰＯ-［Ｆ１２８Ｖ］、ＴＰＯ-［Ｆ１３１Ｖ］、及びＴＰＯ-［Ｆ１４１Ｖ］）。 本発明に係るＥＰＯ変異体のウエスタンブロット法の結果を示す（最左端のレーンから：マーカー、野生型ＥＰＯ、ＥＰＯ-［Ｆ４８Ｖ］、ＥＰＯ-［Ｆ１３８Ｖ］、ＥＰＯ-［Ｆ１４２Ｖ］、及びＥＰＯ-［Ｆ１４８Ｖ］）。 本発明に係るＧ-ＣＳＦ変異体のウエスタンブロット法の結果を示す（最左端のレーンから：マーカー、野生型Ｇ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１３Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ８３Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１１３Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４０Ｖ］、Ｇ-ＣＳＦ-［Ｆ１４４Ｖ］、及びＧ-ＣＳＦ-［Ｆ１６０Ｖ］）。 野生型ＴＰＯと比較した、本発明に係るＴＰＯ変異体の相対発現量を示すグラフ。 野生型ＥＰＯと比較した、本発明に係るＥＰＯ変異体の相対発現量を示すグラフ。 野生型Ｇ-ＣＳＦと比較した、本発明に係るＧ-ＣＳＦ変異体の相対発現量を示すグラフ。 本発明に係るＴＰＯ変異体のＴＰＯ受容体に対する結合親和性のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）アッセイの結果。 本発明に係るＥＰＯ変異体のＥＰＯ受容体に対する結合親和性のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）アッセイの結果。 本発明に係るＧ-ＣＳＦ変異体のＧ-ＣＳＦ受容体に対する結合親和性のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）アッセイの結果。 本発明に係るＧＨ変異体のＧＨ受容体に対する結合親和性のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）アッセイの結果。 本発明に係るＴＰＯ変異体のＴＰＯ受容体に対する結合親和性のＳＰＲアッセイの結果。 本発明に係るＥＰＯ変異体のＥＰＯ受容体に対する結合親和性のＳＰＲアッセイの結果。 本発明に係るＴＰＯ変異体のＴＰＯ受容体に対する結合親和性のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析結果。 本発明に係るＥＰＯ変異体のＥＰＯ受容体に対する結合親和性のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析結果。 本発明に係るＴＰＯ変異体の濃度に応じたＴＦ-１/ｃ-Ｍｐｌ細胞の増殖率を示すグラフ。 本発明に係るＥＰＯ変異体の濃度に応じたＴＦ-１細胞の増殖率を示すグラフ。 本発明に係るＧ-ＣＳＦ変異体の濃度に応じたＨＬ６０細胞の増殖率を示すグラフ。 本発明に係るＧＨ変異体濃度に応じたＮＢ２細胞の増殖率を示すグラフ。 本発明に係るＴＰＯ変異体をウサギに静脈注射によって投与して該ＴＰＯ変異体の血清レベルを測定して得た、本発明に係るＴＰＯ変異体の薬物動態測定の結果を示すグラフ。 本発明に係るＥＰＯ変異体をウサギに静脈注射によって投与して該ＥＰＯ変異体の血清レベルを測定して得た、本発明に係るＥＰＯ変異体の薬物動態測定の結果を示すグラフ。 本発明に係るＥＰＯ変異体をマウスに腹腔内投与して該ＥＰＯ変異体の血清レベルを測定して得た、本発明に係るＥＰＯ変異体の薬物動態測定の結果を示すグラフ。 本発明に係るＥＰＯ変異体の生体内活性を評価するための試験において、該ＥＰＯ変異体を腹腔内投与したマウス体内の赤血球の増殖率の変化を示すグラフ。 本発明に係るＥＰＯ変異体の生体内活性を評価するための試験において、該ＥＰＯ変異体を腹腔内投与したマウス体内の網状赤血球の増殖率の変化を示すグラフ。 本発明に係るＥＰＯ変異体の生体内活性を評価するための試験において、該ＥＰＯ変異体を腹腔内投与したマウス体内のヘマトクリット値の変化を示すグラフ。 本発明に係るＴＰＯ変異体の生体内活性を評価するための試験において、該ＴＰＯ変異体を腹腔内投与したラット体内の血小板の増殖率を示すグラフ。 本発明に係るＴＰＯ変異体の生体内活性を評価するための試験において、該ＴＰＯ変異体を腹腔内投与したラット体内の白血球の増殖率を示すグラフ。 本発明に係るＴＰＯ変異体の生体内活性を評価するための試験において、該ＴＰＯ変異体を腹腔内投与したラット体内の好中球の増殖率を示すグラフ。

Claims (6)

1. サイトカインの受容体結合ドメインにおいて、フェニルアラニン残基をバリンに置換するタンパク質変異体であって、
   前記サイトカインがＥＰＯからなる４-α-へリックスバンドル構造のサイトカインであり、
   前記ＥＰＯが、配列識別番号２として番号付けたアミノ酸配列位置１４２または１４８位にて、フェニルアラニン残基のバリン置換によって変性されることを特徴とするＥＰＯ変異体からなるタンパク質変異体。
2. サイトカインの受容体結合ドメインにおいて、フェニルアラニン残基をバリンに置換するタンパク質変異体であって、
   前記サイトカインがＧ-ＣＳＦからなる４-α-へリックスバンドル構造のサイトカインであり、
   前記Ｇ-ＣＳＦが、配列識別番号４として番号付けたアミノ酸配列位置１１３または１４０位にて、フェニルアラニン残基のバリン置換によって変性されることを特徴とするＧ-ＣＳＦ変異体からなるタンパク質変異体。
3. サイトカインの受容体結合ドメインにおいて、フェニルアラニン残基をバリンに置換するタンパク質変異体であって、
   前記サイトカインがＧＨからなる４-α-へリックスバンドル構造のサイトカインであり、
   前記ＧＨが、配列識別番号６として番号付けたアミノ酸配列位置１３９、１６６または１７６位にて、フェニルアラニン残基のバリン置換によって変性されることを特徴とするＧＨ変異体からなるタンパク質変異体。
4. サイトカインの受容体結合ドメインにおいて、フェニルアラニン残基をバリンに置換するタンパク質変異体であって、
   前記サイトカインがＴＰＯからなる４-α-へリックスバンドル構造のサイトカインであり、
   前記ＴＰＯが、配列識別番号２５として番号付けたアミノ酸配列位置１３１または１４１位にて、フェニルアラニン残基のバリン置換によって変性されることを特徴とするＴＰＯ変異体からなるタンパク質変異体。
5. 請求項１〜４の任意の一項に記載の該タンパク質変異体をコードするＤＮＡ。
6. 請求項１〜４の任意の一項に記載のタンパク質変異体を含む医薬組成物、及び医薬的に受容し得る担体。

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