JP2020054358A - 網膜形成不全を治療するためのウイルスベクター - Google Patents

Abstract

【課題】網膜疾患および失明に罹患している対象の網膜内のタンパク質を発現させるための、組換えウイルスベクターおよび組換えウイルスベクターの使用方法の提供。【解決手段】レチンアルデヒド結合タンパク質１（ＲＬＢＰ１）コード配列を含むベクターゲノムを有するウイルスベクターであって、網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞およびミュラー細胞におけるＲＬＢＰ１コード配列の発現を誘導するように適合されたウイルスベクター。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、参照によりその内容が完全に本明細書に組み込まれている、２０１２年５月
４日に出願された米国仮出願第６１／６４２，６３０号、および２０１３年３月１１日に
出願された米国仮出願第６１／７７６，１６７号の優先権を主張するものである。

発明の背景
網膜色素変性症（ＲＰ）は、視力低下および失明をもたらす網膜の光受容体細胞（桿体
細胞および錐体細胞）の一群の遺伝的変性を指す。光変換（光受容体細胞外側セグメント
において光のフォトンエネルギーをニューロンシグナルに変換するプロセス）、視神経回
路（網膜におけるビタミンＡの生成およびリサイクル）、光受容体構造、および転写因子
に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含めた、任意の広範囲の遺伝子の変異がＲＰ
を引き起こす可能性がある（Phelan and Bok,2000）。

ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全は、第１５染色体上のレチンアルデヒド結合タンパク質１
（ＲＬＢＰ１）遺伝子の変異によって引き起こされる稀な型のＲＰである。この遺伝子の
変異は、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、視神経回路において重
要であるタンパク質の消滅または機能障害を引き起こす（He et al 2009）。ＣＲＡＬＢ
Ｐは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）およびミュラー細胞、毛様体上皮、虹彩、角膜、視神経と
脳の松果腺および希突起神経膠細胞のサブセットにおいて発現される（Saari et al 1997
）。ＣＲＡＬＢＰはイソメラーゼＲＰＥ６５から１１−シス−レチノールを受け取り、１
１−シス−レチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ５）に関するこの基質の担体として働き
、基質を１１−シス−レチナールに変換する。クロモフォア再生の割合は機能的ＣＲＡＬ
ＢＰの不在下では著しく低下する（Travis et al 2007）。ＲＰＥ外でのＣＲＡＬＢＰの
機能は十分には理解されていないが、ミュラー細胞におけるＣＲＡＬＢＰは錐体細胞特異
的視神経経路をサポートし、それによって錐体細胞は広範囲の光強度に素早く順応できる
ことが示唆されている（Wang and Kefalov 2011）。

ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全は、典型的には中年頃に法医学的失明につながる、初期の
重度の夜盲症と緩慢な暗順応、次に視力、視野および色覚の進行的消失によって特徴付け
られる。基底部の外観は網膜内の黄色または白色斑点によって特徴付けられる。視力と視
野の低減は患者の生活の質に著しく影響を与える(Burstedt and Monestam,2010)。

ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全をもたらす最も一般的なＲＬＢＰ１の変異は、Ｒ２３４Ｗ
およびＭ２２６Ｋと称する劣性変異である(Golovleva I and Burstedt M 2012)。これら
の劣性ミスセンス変異の１つまたは両方により引き起こされるＲＬＢＰ１関連網膜形成不
全は、ボスニア型ジストロフィーとしても知られている。ＲＬＢＰ１遺伝子の他の幾つか
の機能消失変異が、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全をもたらすことが報告されている。例え
ば、ＲＬＢＰ１のスプライシング接合変異はニューファンドランド型の桿体細胞−錐体細
胞形成不全を引き起こす。現在、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全に利用可能な治療は存在し
ない(Eichers et al 2002)。

本発明は、選択プロモーター、ＡＡＶゲノムおよびカプシド血清型の組合せを有する組
換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）からのＲＬＢＰ１の発現が、ＲＬＢＰ１関
連網膜形成不全に対する強力で有効な治療をもたらすという発見に部分的に基づく。

発明の要旨
本発明は一般に、網膜疾患および失明に罹患している対象の網膜内のタンパク質を発現
させるための、組換えウイルスベクターおよび組換えウイルスベクターの使用法に関する
。

本発明は、網膜に異種遺伝子を送達することができるウイルスベクターに関する。本発
明はさらに、網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞に異種遺伝子を向けることができるウ
イルスベクターに関する。本発明はさらに、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡ
Ｖ）であるウイルスベクターに関する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスベクター
は、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１２を非制限的に含めた、当技術分野で知られる任意のＡＡＶ血清
型の中から選択することができる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターカプシドはＡ
ＡＶ２血清型である。他の特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターカプシドはＡＡＶ８血
清型である。

本発明は、一部分は、一本鎖ベクターゲノムを有するウイルスベクターに関する。一本
鎖ウイルスベクターにおいて、ベクターゲノムは５’ＩＴＲ、ＲＬＢＰ１コード配列を含
む組換えヌクレオチド配列、および３’ＩＴＲを含むことができる。ベクターゲノムの組
換え核酸配列は、本明細書に記載するプロモーターも含み得る。一態様では、プロモータ
ーはＲＬＢＰ１（長鎖）プロモーター（配列番号１０）であり、別の態様では、プロモー
ターはＲＬＢＰ１（短鎖）プロモーター（配列番号３）である。本発明の特定の具体的態
様では、ベクターゲノムは５’から３’方向に、ａ）配列番号２、１０、５、６、８およ
び９、ｂ）配列番号２、１１、５、６、８、１４、９、ｃ）配列番号２、２２、５、６、
８、２３および９、ならびにｄ）配列番号２、３、４、５、６、８、２３および９から選
択される核酸配列を含む。

本発明は、一部分は、自己相補的ゲノムを有するウイルスベクターに関する。自己相補
的ベクターゲノムは、５’から３’方向に、５’ＩＴＲ、第１の組換えヌクレオチド配列
、非分解性ＩＴＲ（例えばΔＩＴＲ）、第２の組換えヌクレオチド配列、および３’ＩＴ
Ｒを含むことができ、第１と第２の組換えヌクレオチド配列は自己相補的である。第２の
組換えヌクレオチド配列は、５’から３’方向にプロモーター、ＲＬＢＰ１コード配列、
およびＳＶ４０ポリＡ配列を含む。プロモーターはＲＬＢＰ１プロモーターであってよく
、さらにＲＬＢＰ１（短鎖）プロモーター（配列番号３）であってよい。本発明の特定の
態様では、第２の組換えヌクレオチド配列は５’から３’方向に配列番号３、４、５、６
、および８の核酸配列を含み、第１の組換えヌクレオチド配列は、自己相補的である、ま
たは第２の組換え配列の逆相補的配列である配列、例えば配列番号６２、６３、６４、６
５、および６６を含む。本発明はさらに、自己相補的ベクターゲノムを含むウイルスベク
ターであって、ゲノムが５’から３’方向に配列番号３６、６２、６３、６４、６５、６
６、１、３、４、５、６、８、および９の核酸配列を含むウイルスベクターに関する。前
に記載した自己相補的ベクターゲノムは、ＡＡＶ１〜１２を非制限的に含めた、当技術分
野で知られる任意のＡＡＶ血清型から選択されるＡＡＶカプシド中にパッケージングする
ことができる。一態様では、自己相補的ゲノムはＡＡＶ８カプシド中にパッケージングす
る。別の態様では、自己相補的ゲノムはＡＡＶ２カプシド中にパッケージングする。

本発明はさらに、網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞に異種遺伝子の発現を誘導する
ことが可能なウイルスベクターに関する。ウイルスベクターカプシドがＡＡＶ２またはＡ
ＡＶ８血清型カプシドであること、およびウイルスベクターがベクターゲノムを含み、異
種遺伝子がＲＬＢＰ１プロモーターと作動可能に連結することは企図される。ＲＬＢＰ１
プロモーターはＲＬＢＰ１（短鎖）プロモーター（配列番号３）またはＲＬＢＰ１（長鎖
）プロモーター（配列番号１０）であることがさらに企図される。本発明の別の態様では
、ＲＰＥ細胞およびミュラー細胞において発現される異種遺伝子は、例えば配列番号６の
配列を有するＲＬＢＰ１コード配列であることが企図される。

本発明はさらに、網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞に異種遺伝子の発現を誘導する
ことが可能なウイルスベクターに関するものであり、ウイルスベクターカプシドはＡＡＶ
８血清型カプシドであり、ウイルスベクターは自己相補的ベクターゲノムを含み、異種遺
伝子はＲＬＢＰ１プロモーターと作動可能に連結する。ＲＬＢＰ１プロモーターはＲＬＢ
Ｐ１（短鎖）プロモーター（配列番号３）であることがさらに企図される。本発明の別の
態様では、ＲＰＥ細胞およびミュラー細胞において発現される異種遺伝子は、例えば配列
番号６の配列を有するＲＬＢＰ１コード配列であることが企図される。

本発明はさらに、本明細書に記載するウイルスベクターを含む組成物、および薬学的に
許容される担体と組み合わせたウイルスベクター組成物に関する。具体的には、本発明は
さらに、表４中に記載するウイルスベクターを含む組成物に関する。本発明は、さらに他
に、当技術分野で知られており本明細書に記載するｒＡＡＶ生成法と共に、表２中に記載
するプラスミドを使用して作製することができるウイルスベクターを含む組成物に関する
。本明細書に記載する組成物は、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象の治療、およ
び／またはＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象における暗順応の比率（rate of da
rk adaption）の改善に有用である。

本発明はさらに、本明細書に記載するウイルスベクターを作製するため、当技術分野で
知られており本明細書に記載するｒＡＡＶ生成法と共に使用することができる核酸に関す
る。本発明は、遺伝子カセットを含む核酸であって、遺伝子カセットが５’から３’方向
に、（ｉ）５’ＩＴＲまたは非分解性ＩＴＲ、（ｉｉ）ＲＬＢＰ１コード配列を含む組換
えヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）３’ＩＴＲを含む核酸に関する。核酸は、配列番
号５１、５２、５３、５４および５５から選択される核酸配列を含む遺伝子カセットを含
むことができることは企図される。本発明の核酸がプラスミドであってよいことは企図さ
れる。核酸が、配列番号２６、２７、２８、２９、３０および５０から選択される核酸配
列を含むプラスミドであってよいことが、さらに企図される。

本発明の特定の具体的態様では、核酸は、５’から３’方向に、ａ）配列番号２、１０
、５、６、８および９、ｂ）配列番号２、１１、５、６、８、１４および９、ｃ）配列番
号２、２２、５、６、８、２３および９、ｄ）配列番号２、３、４、５、６、８、２３お
よび９、またはｅ）配列番号１、３、４、５、６、８、および９から選択される配列を含
む遺伝子カセットを含むことができる。

本発明はさらに、遺伝子カセットを含む核酸であって、遺伝子カセットが５’から３’
方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ、（ｉｉ）レポーター遺伝子に作動可能に連結したプロモータ
ーを含む組換えヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）３’ＩＴＲを含む核酸に関する。核
酸は、配列番号５６、５７、５９および６０から選択される核酸配列を含む遺伝子カセッ
トを含むことができることは企図される。核酸が、配列番号３１、３２、３４および３５
から選択される核酸配列を含むプラスミドであってよいことが、さらに企図される。

本発明はさらに、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象を治療する方法であって、
本明細書に記載するウイルスベクターを含む組成物をそれを必要とする対象に投与するこ
とを含む方法に関する。

本発明はさらに、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象における暗順応の比率を改
善するための方法であって、本明細書に記載するウイルスベクターを含む組成物をそれを
必要とする対象に投与することを含む方法に関する。

本発明は、さらに他に、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象の網膜においてＲＰ
Ｅ細胞およびミュラー細胞内でのＲＬＢＰ１コード配列の発現を誘導する方法（method o
f directing expression）であって、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２血清型カプシド、およびＲ
ＬＢＰ１プロモーター、例えば本明細書に記載するＲＬＢＰ１（短鎖）（配列番号３）ま
たはＲＬＢＰ１（長鎖）（配列番号１０）プロモーターなどと作動可能に連結したＲＬＢ
Ｐ１コード配列を含むベクターゲノムを含むウイルスベクターと、対象の網膜を接触させ
るステップを含む方法に関する。

本発明は、さらに他に、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象の網膜においてＲＰ
Ｅ細胞およびミュラー細胞内にＲＬＢＰ１コード配列を送達する方法であって、ＡＡＶ８
またはＡＡＶ２血清型カプシド、およびＲＬＢＰ１プロモーター、例えば本明細書に記載
するＲＬＢＰ１（短鎖）（配列番号３）またはＲＬＢＰ１（長鎖）（配列番号１０）プロ
モーターなどと作動可能に連結したＲＬＢＰ１コード配列を含むベクターゲノムを含むウ
イルスベクターと、対象の網膜を接触させるステップを含む方法に関する。

本発明はさらに、表１、または表４中に記載するウイルスベクター、および表２中に記
載するプラスミドを含む。

定義
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属す
る技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

用語「カプシド」は、ウイルスまたはウイルスベクターのタンパク質コートを指す。用
語「ＡＡＶカプシド」は、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、ＶＰ２またはＶＰ３であっ
てよい、各サブユニットがアミノ酸配列である全６０サブユニットで構成されるアデノ随
伴ウイルス（ＡＡＶ）のタンパク質コートを指す（Muzyczka N and Berns KI 2001）。

用語「遺伝子カセット」は、１組以上の制限部位間の対象の１個以上の遺伝子、または
コード配列を有し、かつそれらを発現可能な操作可能なＤＮＡの断片を指す。遺伝子カセ
ットは、制限酵素を使用して断片を「切断」し、それを新たな状態、例えば新たなプラス
ミド骨格に連結させることによって、（プラスミドベクター中に存在することが多い）１
個のＤＮＡ配列から別の配列に移すことができる。

用語「異種遺伝子」または「異種ヌクレオチド配列」は、典型的には、ウイルス中に本
来存在しない遺伝子またはヌクレオチド配列を指す。あるいは、異種遺伝子またはヌクレ
オチド配列は、（例えば、ウイルスにおいて本来結合しないプロモーターとの結合によっ
て）非天然環境に置かれたウイルス配列を指すことができる。

用語「ＩＴＲ」または「逆位末端配列（inverted terminal repeat）」は、ＡＡＶの溶
解および潜伏ライフサイクルを終えるのに必要なＴ型形状パリンドローム構造を形成し得
るアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および／または組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒ
ＡＡＶ）において存在する核酸配列の延長部分を指す（Muzyczka N and Berns KI 2001）
。用語「非分解性ＩＴＲ」は、Ｒｅｐタンパク質による分解が低減するように修飾された
ＩＴＲを指す。非分解性ＩＴＲは、非分解性ＩＴＲの分解をほとんどまたは全くもたらさ
ず９０〜９５％の自己相補的ＡＡＶベクターを生成し得る、末端分解部位（ＴＲＳ）を含
まないＩＴＲ配列であってよい（McCarty et al 2003）。非分解性ＩＴＲの具体例は配列
番号１の配列を有する「ΔＩＴＲ」である。

用語「作動可能に連結した」は、２個以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメ
ントの間の機能的関係を指す。典型的には、この用語は、転写される配列と転写制御配列
の機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、それが適切な宿
主細胞もしくは他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード
配列と作動可能に連結している。一般に、転写可能配列と作動可能に連結したプロモータ
ー転写制御配列は、転写可能配列と隣接している、すなわちそれらはシス作用性である。
しかしながら、エンハンサーなどの幾つかの転写制御配列は物理的に隣接している必要は
なく、またはその転写を促進するコード配列と非常に接近して位置する必要はない。

用語「プロモーター」は、作動可能に連結した遺伝子、またはタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列などの転写を制御する配列を指す。プロモーターは、転写を誘導するの
に十分な配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼの認識部位および有効な転写に必要な他の転
写因子をもたらし、細胞特異的発現を誘導することができる。転写を誘導するのに十分な
配列以外に、本発明のプロモーター配列は、転写調節に関与する他の制御エレメントの配
列（例えばエンハンサー、コザック配列およびイントロン）も含むことができる。当技術
分野で知られており本明細書に記載するウイルスベクターにおいて有用なプロモーターの
例には、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ｓｍＣＢＡプロモーター、および免
疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、もしくは他の組織特異的遺伝子由来のプロモーター（例
えば、ＲＬＢＰ１、ＲＰＥ、ＶＭＤ２）がある。特定のプロモーターは、表１中に記載す
るプロモーター、例えば「ＲＬＢＰ１（短鎖）」プロモーター（配列番号３）、「ＲＬＢ
Ｐ１（長鎖）」プロモーター（配列番号１０）、ＲＰＥ６５プロモーター（配列番号１１
）、ＶＭＤ２プロモーター（配列番号１２）、およびＣＭＶエンハンサー＋ＣＢＡプロモ
ーター（配列番号２２）も含むことができる。さらに、公知の制御エレメントを混合およ
び整合することにより機能的プロモーターを作製するための、標準的な技法が当技術分野
で知られている。「切断型プロモーター」をプロモーター断片から作製することもでき、
または公知の制御エレメントを混合および整合することにより、例えばｓｍＣＢＡプロモ
ーターをＣＢＡプロモーターから切断する。

用語「ＲＬＢＰ１」は、レチンアルデヒド結合タンパク質１を指す。ヒトＲＬＢＰ１遺
伝子は第１５染色体上に見られ、表１において配列番号６で述べる核酸コード配列を有す
る。「ＲＬＢＰ１遺伝子産物」は「細胞内レチンアルデヒド結合タンパク質」または「Ｃ
ＲＡＬＢＰ」としても知られ、ＲＬＢＰ１遺伝子によってコードされるタンパク質である
。ヒトＲＬＢＰ１遺伝子産物（ｈＣＲＡＬＢＰ）は表１において配列番号７で述べるアミ
ノ酸配列を有する。他種由来のＲＬＢＰ１コード配列およびＲＬＢＰ１遺伝子産物の例は
、表１において見ることができる（例えば、配列番号３７〜４８）。用語「ＲＬＢＰ１コ
ード配列」または「ＲＬＢＰ１遺伝子ＣＤＳ」または「ＲＬＢＰ１ＣＤＳ」は、ＲＬＢＰ
１遺伝子産物をコードする核酸配列を指す。当業者は、ＲＬＢＰ１コード配列が、ＲＬＢ
Ｐ１遺伝子産物をコードする任意の核酸配列を含むことができることを理解し得る。ＲＬ
ＢＰ１コード配列は、介在制御エレメント（例えば、イントロン、エンハンサー、または
他の非コード配列）を含むことができる、または含むことができない。

用語「対象」はヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物（例えば
、哺乳動物および非哺乳動物）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）など、マウス、ラ
ット、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む。示したとき以外、
用語「患者」または「対象」は本明細書中で交互に使用する。

本明細書で使用する用語、任意の疾患または障害（例えば、網膜色素変性症、ＲＬＢＰ
１関連網膜形成不全）を「治療すること」またはその「治療」は、疾患またはその少なく
とも１つの臨床症状の発症を遅延もしくは抑制もしくは低減することなどにより、疾患ま
たは障害を改善することを指す。「治療すること」または「治療」は、患者によって識別
可能ではないパラメーターを含めた、少なくとも１つの身体パラメーターを軽減または改
善することを指すこともできる。「治療すること」または「治療」は、身体的（例えば、
識別可能な症状の安定化）、生理的（例えば、生理的パラメーターの安定化）のいずれか
、または両方で、疾患または障害を調節することを指すこともできる。より具体的には、
ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全の「治療」は、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象に
おいて視覚機能および／または局所構造の改善または保持をもたらす任意の操作を意味す
る。本明細書で使用する「予防すること」または「予防」は、疾患または障害の発症もし
くは発達もしくは進行を予防または遅延することを指す。ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全に
関する限り「予防」は、以下に記載するような、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有し前記
悪化のリスクがある患者における、視覚機能、網膜構造、および／またはＲＬＢＰ１関連
網膜形成不全疾患のパラメーターの悪化を予防または遅延する任意の操作を意味する。疾
患の治療および／または予防を評価するための方法は当技術分野で知られており、本明細
書では以下に記載する。

用語「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」は、遺伝子送達媒体として機
能しウイルス（例えばＡＡＶ）カプシド内にパッケージングされた組換えウイルスゲノム
を含む、非野生型組換えウイルス粒子（例えば、パルボウイルスなど）を指すものとする
。具体的なタイプのウイルスベクターは、「組換えアデノ随伴ウイルスベクター」、また
は「ｒＡＡＶベクター」であってよい。ウイルスベクター内にパッケージングされた組換
えウイルスゲノムは、本明細書では「ベクターゲノム」とも呼ぶ。

眼当たり（ａ）１×１０^９および（ｂ）１×１０^８個のベクターゲノム（ｖｇ）粒子の用量で様々なウイルスベクターを注射した眼内の、内在マウスＲＬＢＰ１ｍＲＮＡと比較したベクター媒介型ヒトＲＬＢＰ１ｍＲＮＡの相対的発現の図である。 ＲＬＢＰ１ＫＯ（−／−）および野生型（＋／＋）マウスにおける暗順応の図である。 様々なウイルスベクターで処置したＲＬＢＰ１ＫＯマウスの暗順応の比率の測定の図である。 様々なウイルスベクターで処置したＲＬＢＰ１ＫＯマウスの暗順応の比率の測定の図である。 様々な用量のＮＶＳ２およびＮＶＳ１１で処置したＲＬＢＰ１ＫＯマウスの、暗順応の比率の増大の測定の図である。水平軸の用量は科学的表記で示す（例えば、３Ｅ６＝３×１０^６）。 様々な用量のＮＶＳ４およびＮＶＳ１１で処置したＲＬＢＰ１ＫＯマウスの、暗順応の比率の増大の測定の図である。水平軸の用量は科学的表記で示す（例えば、３Ｅ６＝３×１０^６）。 異なる精製法で調製しＮＶＳ２で処置したＲＬＢＰ１ＫＯマウスの、暗順応の比率の増大の測定の図である。

詳細な説明
本発明は部分的に、網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞において異種遺伝子を発現す
るウイルスベクターの発見に基づく。本発明はさらに、ＲＬＢＰ１遺伝子産物（ＣＲＡＬ
ＢＰ）を発現する異種遺伝子を有する、一本鎖かつ自己相補的なウイルスベクターの両方
に関する。

したがって本発明は、網膜に対するＲＬＢＰ１コード配列の発現を誘導する組換えウイ
ルスベクター、ウイルスベクター組成物、ウイルスベクターを作製するのに有用なプラス
ミド、網膜にＲＬＢＰ１コード配列を送達する方法、網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細
胞においてＲＬＢＰ１コード配列を発現させる方法、およびこのようなウイルスベクター
の使用法を提供する。

他に示す場合以外、当業者に知られている標準的な方法を、ウイルス遺伝子カセットを
有する組換えプラスミド、パルボウイルスｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列を発現するパ
ッケージングプラスミド、ならびに一過的および安定的にトランスフェクトしたパッケー
ジング細胞を使用して、組換えパルボウイルスおよびｒＡＡＶベクターの構築に使用する
ことができる。このような技法は当業者には知られている（例えば、SAMBROOK et al.,MO
LECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL 2^ndEd.(Cold Spring Harbor,N.Y.,1989);Choi VW
et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(2007)）。

１．ウイルスベクター
本発明は、網膜に対する異種遺伝子の発現を誘導するウイルスベクターに関する。本発
明の特定の態様では、網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞に対して発現を誘導する。当
技術分野で知られる様々なウイルスベクター、例えば組換えアデノ随伴ウイルス、組換え
アデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えポックスウイルス、組換えバキュロウイ
ルスなどを、当業者は本発明における使用に適合させることが可能である。

特に、本発明のウイルスベクターは、組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）ベクターであって
よいことは企図される。ＡＡＶは、効率よい複製を容易にするのにヘルパーウイルスを必
要とする、低分子一本鎖ＤＮＡウイルスである（Muzyczka N and Berns KI 2001）。ウイ
ルスベクターは、ベクターゲノムとタンパク質カプシドを含む。ウイルスベクターカプシ
ドは、現在同定されているヒトおよび非ヒトＡＡＶ血清型を含めた当技術分野で知られる
任意のＡＡＶ血清型、ならびに未だ同定されていないＡＡＶ血清型から供給され得る（Ch
oi VW et al 2005,Schmidt et al 2008を参照）。ウイルスカプシドは他のベクター構成
要素と混合および整合してハイブリッドウイルスベクターを形成することができ、例えば
、ウイルスベクターのＩＴＲおよびカプシドは異なるＡＡＶ血清型に由来してよい。一態
様では、ＩＴＲはＡＡＶ２血清型に由来してよく、一方カプシドは、例えばＡＡＶ２また
はＡＡＶ８血清型に由来する。さらに当業者は、ベクターカプシドが、モザイクカプシド
（例えば、異なる血清型由来のカプシドタンパク質の混合物で構成されるカプシド）、ま
たはさらにキメラカプシド（例えば、マーカーを作製するためおよび／または組織の屈性
を変えるための、外来または無関連タンパク質配列を含有するカプシドタンパク質）であ
ってもよいことを理解し得る。本発明のウイルスベクターが、ＡＡＶ２カプシドを含み得
ることは企図される。本発明がＡＡＶ８カプシドを含み得ることが、さらに企図される。

本発明は、一部分は、ベクターゲノムが一本鎖であるウイルスベクターに関する。特定
の態様では、本発明は、（ｉ）５’ＩＴＲ、（ｉｉ）ＲＬＢＰ１コード配列を含む組換え
ヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）３’ＩＴＲを５’から３’方向に含む一本鎖ベクタ
ーゲノムに関する。本発明の特定の態様では、組換えヌクレオチド配列は５’から３’方
向に（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）ＲＬＢＰ１コード配列、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０ポ
リＡ配列を含む。特定の態様では、プロモーターはＲＬＢＰ１（短鎖）プロモーター、Ｒ
ＬＢＰ１（長鎖）プロモーター、またはＲＬＢＰ１の切断型プロモーターであってよい。
特に本発明は、ＲＬＢＰ１（長鎖）プロモーター（配列番号１０）、ＲＬＢＰ１コード配
列、およびＳＶ４０ポリＡ配列を５’から３’方向に含む組換えヌクレオチド配列を含む
一本鎖ベクターゲノムに関する。さらに本発明は、ＲＬＢＰ１（短鎖）プロモーター（配
列番号３）、ＲＬＢＰ１コード配列、およびＳＶ４０ポリＡ配列を５’から３’方向に含
む組換えヌクレオチド配列を含む一本鎖ベクターゲノムにも関する。本発明の特定の態様
は、さらに、ＡＡＶ２またはＡＡＶ８カプシドにパッケージングされた組換えヌクレオチ
ド配列を含む一本鎖ベクターゲノムに関する。

本発明の特定の態様では、ウイルスベクターは、（配列番号１８によってコードされる
）ＡＡＶ２カプシド、および以下のａ）配列番号２、１０、５、６、８および９、ｂ）配
列番号２、１１、５、６、８、１４、９、ｃ）配列番号２、２２、５、６、８、２３およ
び９、ならびにｄ）配列番号２、３、４、５、６、８、２３および９から選択されるヌク
レオチド配列を５’から３’方向に含むベクターゲノムを含む。特定の態様では、ＡＡＶ
２カプシドは、配列番号１９、６８、および６９のアミノ酸配列をそれぞれ有するカプシ
ドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。他の特定の態様では、ＡＡＶ２カプシ
ドはカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のサブコンビネーション（
subcombination）を含むことができる。

本発明の特定の態様では、ウイルスベクターは、（配列番号２０によってコードされる
）ＡＡＶ８カプシド、および以下のａ）配列番号２、１０、５、６、８および９、ｂ）配
列番号２、１１、５、６、８、１４、９、ｃ）配列番号２、２２、５、６、８、２３およ
び９、ならびにｄ）配列番号２、３、４、５、６、８、２３および９から選択されるヌク
レオチド配列を５’から３’方向に含むベクターゲノムを含む。特定の態様では、ＡＡＶ
８カプシドは、配列番号２１、７０、および７１のアミノ酸配列をそれぞれ有するカプシ
ドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。他の特定の態様では、ＡＡＶ８カプシ
ドはカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のサブコンビネーションを
含むことができる。

ウイルスベクターは、自己相補的ゲノムを含むＡＡＶベクターであってもよい。自己相
補的ｒＡＡＶベクターは当技術分野では以前から記載されており（ＵＳ７４６５５８３お
よびMcCarty2008）、本発明における使用に適合させることが可能である。自己相補的ベ
クターゲノムは、５’から３’方向に、ゲノムのいずれかの末端に５’ＩＴＲおよび３’
ＩＴＲ（すなわち、分解性ＩＴＲまたは野生型ＩＴＲ）、および５’と３’ＩＴＲの間に
挿入された非分解性ＩＴＲ（例えば本明細書に記載するΔＩＴＲ）を含む。ゲノムの各部
分（すなわち、各分解性ＩＴＲと非分解性ＩＴＲの間）は組換えヌクレオチド配列を含み
、各半分（すなわち、第１の組換えヌクレオチド配列と第２の組換えヌクレオチド配列）
は互いに相補的であり、または自己相補的である。言い換えると、自己相補的ベクターゲ
ノムは本質的に、非分解性ＩＴＲにより接合した２つの半部分を有する逆方向反復配列で
ある。特定の態様では、本発明は、（ｉ）５’ＩＴＲ、（ｉｉ）第１の組換えヌクレオチ
ド配列、（ｉｉｉ）非分解性ＩＴＲ、（ｉｖ）第２の組換えヌクレオチド配列、および（
ｖ）３’ＩＴＲを５’から３’方向に含む自己相補的ベクターゲノムに関する。本発明の
特定の態様では、ベクターゲノムの第２の組換えヌクレオチド配列はＲＬＢＰ１プロモー
ター、ＲＬＢＰ１コード配列、およびＳＶ４０ポリＡ配列を含み、第１の組換えヌクレオ
チド配列は第２のヌクレオチド配列と自己相補的である。特定の具体的態様では、ＲＬＢ
Ｐ１プロモーターは配列番号３のヌクレオチド配列を有する。本発明の特定の態様では、
第２の組換えヌクレオチド配列は５’から３’方向に配列番号３、４、５、６、および８
の核酸配列を含み、第１の組換えヌクレオチド配列は、第２の組換え配列と自己相補的で
ある配列、またはその逆相補的配列、例えば配列番号６２、６３、６４、６５、および６
６を含む。本発明のウイルスベクターは自己相補的ゲノムを含むことができ、ベクターゲ
ノムの第１の組換えヌクレオチド配列はＲＬＢＰ１プロモーター、ＲＬＢＰ１コード配列
、およびＳＶ４０ポリＡ配列を含み、第２の組換えヌクレオチド配列は第１の組換えヌク
レオチド配列と自己相補的であることも企図される。

本発明の特定の態様では、自己相補的ウイルスベクターは、（配列番号１８によってコ
ードされる）ＡＡＶ２カプシド、および配列番号３６、配列番号６２、配列番号６３、配
列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列
番号５、配列番号６、配列番号８、および配列番号９の配列であるヌクレオチド配列を５
’から３’方向に含むベクターゲノムを含む。特定の態様では、ＡＡＶ２カプシドは、配
列番号１９、６８、および６９のアミノ酸配列をそれぞれ有するカプシドタンパク質ＶＰ
１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。他の特定の態様では、ＡＡＶ２カプシドはカプシドタン
パク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のサブコンビネーションを含むことができる
。

本発明の特定の態様では、自己相補的ウイルスベクターは、（配列番号２０によってコ
ードされる）ＡＡＶ８カプシド、および配列番号３６、配列番号６２、配列番号６３、配
列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列
番号５、配列番号６、配列番号８、および配列番号９の配列であるヌクレオチド配列を５
’から３’方向に含むベクターゲノムを含む。特定の態様では、ＡＡＶ８カプシドは、配
列番号２１、７０、および７１のアミノ酸配列をそれぞれ有するカプシドタンパク質ＶＰ
１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。他の特定の態様では、ＡＡＶ８カプシドはカプシドタン
パク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のサブコンビネーションを含むことができる
。

したがって、本発明はさらに、ＲＬＢＰ１の切断型プロモーターを含む、本明細書に記
載するウイルスベクターに関する。

本発明はさらに、網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞に対する異種遺伝子の発現を誘
導するウイルスベクターであって、ＡＡＶ８カプシド、および異種遺伝子と作動可能に連
結したＲＬＢＰ１（短鎖）プロモーター（配列番号３）を含むベクターゲノムを含むウイ
ルスベクターに関する。本発明の特定の態様では、ベクターゲノムは自己相補的ゲノムで
ある。

本発明はさらに、網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞においてＲＬＢＰ１を発現させ
る方法に関する。本発明の特定の態様では、方法は、ＡＡＶカプシド、およびＲＬＢＰ１
（短鎖）プロモーター（配列番号３）であってよいＲＬＢＰ１プロモーターと作動可能に
連結したＲＬＢＰ１コード配列を含むベクターゲノムを含むウイルスベクターと、網膜細
胞を接触させる工程を含む。本発明の特定の態様では、ＡＡＶカプシドはＡＡＶ２である
。他の特定の態様では、ＡＡＶカプシドはＡＡＶ８である。本発明の他の態様では、方法
は、ＡＡＶカプシド、およびＲＬＢＰ１（長鎖）プロモーター（配列番号１０）であって
よいＲＬＢＰ１プロモーターと作動可能に連結したＲＬＢＰ１コード配列を含むベクター
ゲノムを含むウイルスベクターと、網膜細胞を接触させる工程を含む。本発明の特定の態
様では、ＡＡＶカプシドはＡＡＶ２である。他の特定の態様では、ＡＡＶカプシドはＡＡ
Ｖ８である。

ウイルスベクターを作製するための方法は当技術分野でよく知られており、当業者が、
表２および実施例中に記載するプラスミドを使用して、表４中に記載するウイルスベクタ
ーを含めた本発明のウイルスベクターを作製するのを可能にし得る（例えば、米国特許第
７，４６５，５８３号参照）。

一般に、ｒＡＡＶベクターを生成する方法は本発明のウイルスベクターの生成に適用可
能であり、方法間の主な差はパッケージングされる遺伝子エレメントの構造である。本発
明によるウイルスベクターを生成するため、表２中に記載する遺伝子エレメントおよびプ
ラスミドの配列を使用して、カプシドに包まれたウイルスゲノムを生成することができる
。

表２中に記載する遺伝子エレメントは環状プラスミドの状態であるが、当業者は、裸Ｄ
ＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはウイルスベ
クター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、Ａ
ＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクターなど）だけには限られないが、これら
を含めた当技術分野で知られている任意の型で、ＤＮＡ基質を提供することができること
を理解している。あるいは、本明細書に記載するウイルスベクターを生成するのに必要な
表２中の遺伝子エレメントを、パッケージング細胞のゲノム内に安定的に組み込むことが
できる。

本発明によるウイルスベクター粒子は、例えば、複製およびパッケージングする配列の
複製許容またはパッケージング細胞への導入によって、これらの用語が当技術分野で理解
されるように（例えば、「複製許容」細胞はウイルスによって感染もしくは形質導入され
る可能性があり、「パッケージング」細胞はヘルパー機能をもたらす安定的に形質転換さ
れた細胞である）、当技術分野で知られている任意の方法によって生成することができる
。

一実施形態では、ＲＬＢＰ１ウイルスベクターを生成するための方法であって、パルボ
ウイルスカプシド内に包まれたベクターゲノムを含むウイルスベクターを細胞内で生成す
るのに十分な条件下で、（ａ）（以下および表２中で詳細に記載するような）本発明のベ
クターゲノムを生成するための遺伝子エレメントを含有するヌクレオチド配列、（ｂ）ベ
クターゲノムを生成するための、（ａ）中のベクターゲノム配列の複製に十分なヌクレオ
チド配列、（ｃ）パルボウイルスカプシドにベクターゲノムをパッケージングするのに十
分なヌクレオチド配列を、パルボウイルス複製が許容可能な細胞に与えることを含む方法
を提供する。パルボウイルス複製および／またはカプシドコード配列は、ＡＡＶ配列であ
ることが好ましい。

エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、カチ
オン性またはアニオン性リポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソーム
だけには限られないが、これらを含めた、複製およびパッケージング用の細胞宿主に、以
下に記載した遺伝子カセットを有するヌクレオチド配列を導入する任意の方法を利用する
ことができる。

本明細書に記載するウイルスベクターは、当技術分野で知られている方法、例えばトリ
プルトランスフェクションまたはバキュロウイルス媒介ウイルス生成などを使用して生成
することができる。当技術分野で知られている任意の適切な複製許容またはパッケージン
グ細胞を利用して、ベクターを生成することができる。哺乳動物細胞が好ましい。複製欠
陥ヘルパーウイルスから欠失した機能をもたらす、トランス相補的パッケージング細胞系
、例えば２９３細胞または他のＥ１ａトランス相補的細胞も好ましい。当技術分野で知ら
れているＤＮＡ修復に欠陥がある哺乳動物細胞または細胞系も好ましい。これらの細胞系
は、本明細書に記載するプラスミドに導入された変異を補正するそれらの能力が損なわれ
ているからである。

遺伝子カセットは、パルボウイルス（例えばＡＡＶ）ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子の一部
または全部を含有し得る。しかしながら、カプシドおよび／またはＲｅｐタンパク質をコ
ードするパッケージングベクター（複数可）を細胞内に導入することにより、ｃａｐおよ
びｒｅｐ機能の一部または全部がトランスで与えられることが好ましい。遺伝子カセット
は、カプシドまたはＲｅｐタンパク質をコードしないことが最も好ましい。あるいは、安
定的に形質転換されてｃａｐおよび／またはｒｅｐ遺伝子を発現する、パッケージング細
胞系を使用する（例えば、Gao et al.,(1998) Human Gene Therapy9:2353;Inoue et al.,
(1998) J.Virol.72:7024、米国特許第５，８３７，４８４号、ＷＯ９８／２７２０７、米
国特許第５，６５８，７８５号、ＷＯ９６／１７９４７を参照）。

さらに、ヘルパーウイルス機能をウイルスベクターに与えて、新たなウイルス粒子を伝
播させることが好ましい。アデノウイルスと単純ヘルペスウイルスの両方がＡＡＶのヘル
パーウイルスとして働くことができる。例えば、BERNARD N.FIELDS et al.,VIROLOGY,vol
ume2,chapter69(3^rded.,Lippincott-Raven Publishers)を参照。例示的なヘルパーウイル
スには、単純ヘルペス（ＨＳＶ）水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、およびエプスタ
インバールウイルスがあるが、これらだけには限られない。感染多重度（ＭＯＩ）および
感染期間は、使用するウイルスのタイプおよび利用するパッケージング細胞系に依存する
。任意の適切なヘルパーベクターを利用することができる。ヘルパーベクターは、例えば
Xiao et al.,(1998) J.Virology72:2224により記載されたプラスミドであることが好まし
い。前に記載したように、当技術分野で知られる任意の適切な方法によって、パッケージ
ング細胞にベクターを導入することができる。

汚染ヘルパーウイルスを含まないベクターストックは、当技術分野で知られる任意の方
法によって得ることができる。例えば、組換え一本鎖または自己相補的ウイルスおよびヘ
ルパーウイルスは、大きさに基づいて容易に区別することができる。ヘパリン基質に対す
るアフィニティーに基づいて、ヘルパーウイルスからウイルスを分離することもできる（
Zolotukhin et al.(1999) Gene Therapy6:973）。いかなる汚染ヘルパーウイルスも複製
能力がないように、欠失型複製欠陥ヘルパーウイルスを使用することが好ましい。さらな
る代替として、後期遺伝子発現がないアデノウイルスヘルパーを利用することができる。
アデノウイルス初期遺伝子発現のみが、二本鎖ウイルスのパッケージングを媒介するのに
必要とされるからである。後期遺伝子発現に欠陥があるアデノウイルス変異体は当技術分
野で知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。

ヘルパー機能を与えるための１つの方法は、効率よいＡＡＶ生成に必要なヘルパー遺伝
子の全てを有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドを利用する（Ferrari et al.,(
1997) Nature Med.3:1295;Xiao et al.,(1998) J.Virology72:2224）。アデノウイルスミ
ニプラスミドを用いて得るｒＡＡＶ力価は、野生型アデノウイルス感染の従来法を用いて
得るｒＡＡＶ力価より４０倍高い（Xiao et al.,(1998) J.Virology72:2224）。この手法
によって、アデノウイルスとの同時トランスフェクションを実施する必要がなくなる（Ho
lscher et al.,(1994),J.Virology68:7169;Clark et al.,(1995) Hum.Gene Ther.6:1329;
Trempe and Yang,(1993),in Fifth Parvovirus Workshop,Crystal River,Fla.）。

ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を別の発現カセットに分けて複製能力のあるＡＡＶの生成を
妨げる方法（例えば、Allen et al.,(1997) J.Virol.71:6816参照）、パッケージング細
胞系を利用する方法（例えば、Gao et al.,(1998) Human Gene Therapy9:2353;Inoue et
al.,(1998) J.Virol.72:7024、米国特許第５，８３７，４８４号、ＷＯ９８／２７２０７
、米国特許第５，６５８，７８５号、ＷＯ９６／１７９４７を参照）、および他の無ヘル
パーウイルス系（例えば、Colosiへの米国特許第５，９４５，３３５号参照）だけには限
られないが、これらを含めた、ｒＡＡＶストックを生成する他の方法が記載されている。

ヘルペスウイルスは、ＡＡＶパッケージング法中でヘルパーウイルスとして使用するこ
ともできる。ＡＡＶＲｅｐタンパク質（複数可）をコードするハイブリッドヘルペスウイ
ルスは、より定量的なＡＡＶベクター生成スキームを有利に助長することができる。ＡＡ
Ｖ−２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド１型単純ヘルペスウイルス（Ｈ
ＳＶ−１）ベクターが記載されている（Conway et al.,(1999) Gene Therapy6:986および
ＷＯ００／１７３７７）。

要約すると、複製およびパッケージングする遺伝子カセット、パルボウイルスｃａｐ遺
伝子、適切なパルボウイルスｒｅｐ遺伝子、および（好ましくは）ヘルパー機能を細胞（
例えば、複製許容またはパッケージング細胞）に与えて、ベクターゲノムを有するｒＡＡ
Ｖ粒子を生成する。遺伝子カセットおよび／またはパッケージングベクター（複数可）お
よび／または安定的に形質転換されたパッケージング細胞によりコードされるｒｅｐ遺伝
子とｃａｐ遺伝子の組合せ発現は、ウイルスベクターカプシドが本発明によるウイルスベ
クターゲノムをパッケージングした、ウイルスベクター粒子の生成をもたらす。一本鎖ま
たは自己相補的ウイルスベクターが細胞内で構築されるのを可能にし、当業者に知られて
おり実施例中に記載する任意の方法により、次いで回収することができる。例えば、標準
的なＣｓＣｌ遠心分離法（Grieger JC et al 2006）により、または当業者に知られてい
る様々なカラムクロマトグラフィーの方法（Lock M et al(2010),Smith RH et al(2009)
およびVadenberghe LH et al(2010)を参照）により、ウイルスベクターを精製することが
できる。

本明細書に開示する試薬および方法を利用して、好ましくはほぼ野生型の力価で、本発
明のウイルスベクターの高力価ストックを生成することができる。パルボウイルスストッ
クは、少なくとも約１０^５の形質導入単位（ｔｕ）／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約
１０^６ｔｕ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１０^７ｔｕ／ｍｌ、さらにより好ましく
は少なくとも約１０^８ｔｕ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１０^９ｔｕ／ｍｌ
、一層さらにより好ましくは少なくとも約１０^１０ｔｕ／ｍｌ、一層さらにより好ましく
は少なくとも約１０^１１ｔｕ／ｍｌ以上の力価を有することがさらに好ましい。

さらに、本発明のＲＬＢＰ１ウイルスベクターは、従来のＡＡＶベクターに対して改善
された形質導入単位／粒子比を有し得る。ｔｕ／粒子比は、約１：５０未満、約１：２０
未満、約１：１５未満、約１：１０未満、約１：８未満、約１：７未満、約１：６未満、
約１：５未満、約１：４未満、またはそれ未満であることが好ましい。典型的にはｔｕ／
粒子比は約１：１、１：２、１：３または１：４を超える。

２．ウイルスベクターを作製する際に使用するための核酸
本発明はさらに、ウイルスベクターを作製するのに有用な核酸に関する。本発明の特定
の態様では、ウイルスベクターを作製するのに有用な核酸はプラスミドの型であってよい
。ウイルスベクタープラスミドとも呼ばれるウイルスベクターを作製するのに有用なプラ
スミドは、遺伝子カセットを含有することができる。少なくとも、ウイルスベクタープラ
スミドの遺伝子カセットは、異種遺伝子およびその制御エレメント（例えばプロモーター
、エンハンサー、および／またはイントロンなど）、ならびに５’および３’ＡＡＶ逆位
末端配列（ＩＴＲ）を含有する。

異種遺伝子およびその制御エレメントの組成は、生成するベクターが配置される使用に
依存する。例えば、１タイプの異種遺伝子配列には、発現により検出可能なシグナルをも
たらすレポーター配列がある。このようなレポーター配列には、非制限的に、β−ラクタ
マーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナー
ゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む膜結合タンパク質、
インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、およびそれを対象とする高アフィニティー抗
体が存在するかまたは従来手段により生成することができる、当技術分野でよく知られて
いるタンパク質、および抗原タグドメイン、特にヘマグルチニンまたはＭｙｃと適切に融
合した膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列がある。例えば、
レポーター配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを伴うベクターの存在は、β−ガ
ラクトシダーゼ活性に関するアッセイによって検出する。レポーター配列が緑色蛍光タン
パク質またはルシフェラーゼである場合、ルミノメーターにおける色または光の生成によ
り、シグナルを伴うベクターを目視で測定することができる。

異種遺伝子配列は、それらの発現を誘導する制御エレメントと結合すると、酵素、ラジ
オグラフィー、比色定量、蛍光または他の分光アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、
ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）お
よび免疫組織化学法を含む免疫学的アッセイを含めた、従来手段により検出可能なシグナ
ルをもたらす。

異種遺伝子は、生物学および医学において有用な産物、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ
、酵素、ドミナントネガティブ変異体、または触媒ＲＮＡなどをコードする非マーカー配
列であってもよい。望ましいＲＮＡ分子には、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ
、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、
およびアンチセンスＲＮＡがある。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置済み動物における標
的核酸配列の発現を阻害するかまたは消滅させる配列である。

異種遺伝子を使用して遺伝子欠陥を補正または改善することもでき、その欠陥は、正常
遺伝子が正常レベル未満で発現される欠陥、または機能的遺伝子産物が発現されない欠陥
を含み得る。本発明において、異種遺伝子配列がＲＬＢＰ１コード配列であってよいこと
は企図される。ＲＬＢＰ１コード配列の例は表１中に与える、配列番号６、３７、３９、
４１、４３、４５または４７。

異種遺伝子以外に、遺伝子カセットは、異種遺伝子と作動可能に連結した制御エレメン
トを含むことができる。これらの制御エレメントは、適切な転写開始、終結、プロモータ
ーおよびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルな
どの有効なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率
を向上させる配列、タンパク質安定性を向上させる配列、および望ましい場合、コード産
物の分泌を向上させる配列を含むことができる。天然、構成的、誘導的および／または組
織特異的であるプロモーターを含めた多数の制御配列が当技術分野で知られており、それ
らを使用することができる。本発明の制御エレメント配列には、表１中に記載する配列、
例えば配列番号３、４、５、８、１０、１１、１２および２２がある。

遺伝子カセットは、異種遺伝子と作動可能に連結した配列番号３または１０の核酸配列
を有するＲＬＢＰ１プロモーターを含むことができる。特に、ＲＬＢＰ１短鎖プロモータ
ー（配列番号３）はＲＬＢＰ１コード配列（配列番号６、３７、３９、４１、４３、４５
または４７）と作動可能に連結する。あるいは、ＲＬＢＰ１長鎖プロモーター（配列番号
１０）は、ＲＬＢＰ１コード配列（配列番号６、３７、３９、４１、４３、４５または４
７）と作動可能に連結する。

ＡＡＶ血清型２のＩＴＲ（例えば、配列番号２、９、１６、１７、３６）を使用するこ
とができることは企図される。しかしながら、他の適切な血清型由来のＩＴＲを、本明細
書に記載するように、当技術分野で知られる任意のＡＡＶ血清型の中から選択することが
できる。これらのＩＴＲまたは他のＡＡＶ構成成分は、知られている任意のＡＡＶ血清型
または未だ同定されていない血清型から、当業者が利用可能な技法を使用して容易に単離
することができ、例えばＡＡＶ配列は、例えばGenBank,PubMedなどの文献もしくはデータ
ベースにおいて、利用可能な配列などの公開済み配列を参照することにより、合成または
他の適切な手段を介して得ることができる。あるいは、このようなＡＡＶ構成成分は、学
術、市販、もしくは公のソースから単離または入手することもできる（例えば、アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ）。

本発明の特定の態様において、遺伝子カセットの１つのＩＴＲは、修飾型ＩＴＲ、また
は非分解性ＩＴＲ、末端分解部位（ＴＲＳ）を含まない配列であってよいことは企図され
る。非分解性ＩＴＲを含む遺伝子カセットの複製中、Ｒｅｐタンパク質が非分解性ＩＴＲ
を分解できないことによって、各末端の中央および野生型ＩＴＲに非分解性ＩＴＲ（例え
ばΔＩＴＲ）を有する二量体逆位反復配列（すなわち自己相補的）が生成する。生成する
配列は、カプシドからの切り離しによりゲノムがヘアピン構造を形成し得るような、自己
相補的ウイルスゲノム配列である（ＵＳ７４６５５８３およびMcCarty(2008)も参照）。
非分解性ＩＴＲは、当技術分野で知られている任意の方法により生成することができる。
例えば、ＩＴＲへの挿入によってＴＲＳを置換し非分解性ＩＴＲをもたらす。挿入はＴＲ
Ｓ部位の領域内であることが好ましい。あるいは、ＴＲＳ部位の欠失によりＩＴＲを非分
解性にすることができ、具体例にはΔＩＴＲ（配列番号１）がある。

本発明は、以下のａ）配列番号２、１０、５、６、８および９、ｂ）配列番号２、１１
、５、６、８、１４および９、ｃ）配列番号２、２２、５、６、８、２３および９、ｄ）
配列番号２、３、４、５、６、８、２３および９、ｅ）配列番号２、１０、５、２４、８
、および９、ｆ）配列番号２、１１、２４、８、１４、および９、ならびにｇ）配列番号
２、１２、２４、８、１４、および９から選択される核酸配列を５’から３’方向に含む
、遺伝子カセットを含む核酸に関する。特定の態様では、遺伝子カセットを含む核酸はプ
ラスミドであってよい。特に、プラスミドの配列は配列番号２７、２８、２９、３０、３
２、３３、３４および３５から選択される配列を有することができる。

本発明はさらに、以下のａ）配列番号１、３、４、５、６、８および９、ならびにｂ）
配列番号１、３、４、５、２４、８、および９から選択される核酸配列を５’から３’方
向に含む、遺伝子カセットを含む核酸に関する。特定の態様では、遺伝子カセットを含む
核酸はプラスミドであってよい。特に、プラスミドの配列は配列番号２６、３１および５
０から選択される配列を有することができる。

表２中のエレメントを取り込むための方法は当技術分野でよく知られており、当業者が
表３および実施例中に概略する方法を使用して、本発明の核酸およびプラスミドを作製す
るのを可能にし得る。

３ 医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と共に製剤化した本発明のウイルスベクターを含む
医薬組成物を提供する。これらの組成物は、例えばＲＬＢＰ１関連網膜形成不全、および
／または網膜色素変性症（ＲＰ）を治療または予防するのに適した、１個以上の他の治療
剤を追加的に含有することができる。薬学的に許容される担体によって組成物は向上また
は安定化し、またはそれらを使用して組成物の調製を容易にすることができる。薬学的に
許容される担体には、生理的適合性がある、溶媒、界面活性剤、分散媒、コーティング剤
、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などがある。

本発明の医薬組成物は、当技術分野で知られている様々な方法によって投与することが
できる。投与の経路および／または形態は望む結果に応じて変わる。投与は網膜下である
ことが好ましい。薬学的に許容される担体は、網膜下、硝子体内、静脈内、皮下または局
所投与に適していなければならない。

組成物は滅菌および流体状態でなければならない。例えば、レシチンなどのコーティン
グの使用によって、分散の場合は必要とされる粒径の維持によって、およびサーファクタ
ントの使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張化剤、例
えば糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウム
を組成物中に含むことが好ましい。

本発明の医薬組成物は、当技術分野でよく知られており通常実施される方法に従い調製
することができる。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Pu
blishing Co.,20^th ed.,2000、およびSustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978を参照。医薬組成物はＧ
ＭＰ条件下で製造されることが好ましい。典型的には、治療有効用量または効率よい用量
のウイルスベクターを、本発明の医薬組成物において利用する。ウイルスベクターは、当
業者に知られる従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化することができる
。用量レジメンを調整して最適な望ましい応答（例えば、治療応答）をもたらす。例えば
、単回ボーラス用量を投与することができ、数回分割用量を経時的に投与することができ
、または治療状況の緊急性により示されるのと比例して用量を低減または増大することが
できる。投与の容易性および用量の均一性のため、単位剤形で非経口組成物を製剤化する
ことが非常に有利である。本明細書で使用する単位剤形は、治療する対象の単位用量とし
て適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共に望ましい治療効果
をもたらすよう計算された、所定量の活性化合物を含有する。

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルを変えて、患者に対して毒性がな
い、特定患者、組成物、および投与形態に関する望ましい治療応答をもたらすのに有効な
活性成分の量を得ることができる。選択する用量レベルは、利用する本発明の個々の組成
物の活性、投与の経路、投与の時間、利用する個々の化合物の分泌率、治療の期間、利用
する個々の組成物と組み合わせて利用する他の薬物、化合物および／または物質、治療す
る患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、および以前の病歴、および同様の要
因を含めた、様々な薬物動態学的要因に依存する。

医師または獣医師は、望ましい治療効果を得るのに必要なレベルより低いレベルで、医
薬組成物において利用する本発明のウイルスベクター用量から始め、望ましい効果を得る
まで用量を徐々に増大することができる。一般に、本明細書に記載するＲＬＢＰ１関連網
膜形成不全を治療するのに有効な本発明の組成物の用量は、投与の手段、標的部位、患者
の生理的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与する他の医薬品、および治
療が予防的であるかまたは療法的であるかを含めた、多くの異なる要因に応じて変わる。
治療用量を滴定して安全性と有効性を最適化する。ウイルスベクターを用いた網膜下投与
に関して、用量は眼当たり１×１０^８個のベクターゲノム（ｖｇ）〜眼当たり１×１０^１
２個のｖｇの範囲であってよい。例えば用量は眼当たり１×１０^８個のｖｇ、眼当たり２
．５×１０^８個のｖｇ、眼当たり５×１０^８個のｖｇ、眼当たり７．５×１０^８個のｖｇ
、眼当たり１×１０^９個のｖｇ、眼当たり２．５×１０^９個のｖｇ、眼当たり５×１０^９
個のｖｇ、眼当たり７．５×１０^９個のｖｇ、眼当たり１×１０^１０個のｖｇ、眼当たり
２．５×１０^１０個のｖｇ、眼当たり５×１０^１０個のｖｇ、眼当たり７．５×１０^１０
個のｖｇ、眼当たり１×１０^１１個のｖｇ、眼当たり２．５×１０^１１個のｖｇ、眼当た
り５×１０^１１個のｖｇ、眼当たり７．５×１０^１１個のｖｇ、眼当たり１×１０^１２個
のｖｇであってよい。

本明細書に記載するウイルスベクターは、眼当たりの一回用量として主に使用され、前
述の用量範囲内にない網膜領域を治療するための反復用量である可能性がある。投与の用
量は、治療が予防的であるかまたは療法的であるかに応じて変わり得る。

前述の個々のセクションおよび実施形態で言及した、本発明の様々な特徴および実施形
態は、必要な変更を加えて、他のセクションおよび実施形態に必要に応じて適用すること
ができる。したがって、あるセクションおよび実施形態で特定された特徴は、必要に応じ
て他のセクションおよび実施形態で特定された特徴と組み合わせることもできる。

４．治療用途
本明細書に記載するウイルスベクターは、有効量の本発明のウイルスベクターをそれを
必要とする対象に投与することにより、眼関連疾患を治療するのに治療上有用な濃度で使
用することができる。より具体的には本発明は、ＲＬＢＰ１コード配列を含む有効量のウ
イルスベクターをそれを必要とする対象に投与することによる、ＲＬＢＰ１関連網膜形成
不全の治療法を提供する。

本発明は、対象におけるＲＬＢＰ１関連網膜形成不全の治療において使用するための、
ＲＬＢＰ１コード配列を含むウイルスベクターを提供する。

表Ａ：RLBP1変異およびRLBP1関連網膜形成不全の関連表現型。RLBP1関連網膜形成不全の
疾患表現型には、常染色体劣性網膜色素変性症(AARP)、ボスニアジストロフィー(BD)、ニ
ューファンドランド桿体細胞-錐体細胞ジストロフィー(NFRCD)、白点状網膜炎(RPA)およ
び眼底白点症(FA)がある。

組換えＡＡＶの使用は、網膜疾患の治療に実現可能かつ安全であることは示されている
（例えば、Bainbridge et al.2008,Houswirth et al.2008,Maguire et al.2008参照）。
本発明のウイルスベクターは、特に、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全の進行状態を治療およ
び予防するため、および視力低下を改善するために使用することができる。本発明のウイ
ルスベクターは、他のＲＬＢＰ１遺伝子機能消失変異、例えば常染色体劣性網膜色素変性
症、白点状網膜炎および眼底白点症によって、他の網膜形成不全が引き起こされる患者に
おいて使用することもできる。

本発明はさらに、本発明のウイルスベクターをそれを必要とする対象に投与することに
より、網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞内でＲＬＢＰ１コード配列を発現させる方法
に関する。本発明はさらに、それを必要とする対象の網膜のＲＰＥ細胞および／またはミ
ュラー細胞においてＲＬＢＰ１コード配列を発現させる際に使用するための、本発明のウ
イルスベクターに関する。本発明はさらに、網膜、具体的にはＲＬＢＰ１関連網膜形成不
全を有する対象の網膜内のＲＰＥ細胞および／またはミュラー細胞に、ＲＬＢＰ１コード
配列を送達する方法を企図する。対象の網膜、ＲＰＥ細胞および／またはミュラー細胞と
本明細書に記載するウイルスベクターを接触させることにより、ＲＬＢＰ１コード配列が
それを必要とする対象に送達されることは企図される。あるいは、本明細書に記載するウ
イルスベクターを対象に投与することにより、ＲＬＢＰ１コード配列を対象に送達する。

本発明は、対象の網膜と本発明のウイルスベクターを接触させることにより、ＲＬＢＰ
１関連網膜形成不全を有する対象の網膜内のＲＰＥ細胞および／またはミュラー細胞にお
いてＲＬＢＰ１コード配列を発現させる方法をさらに含む。特定の態様では、対象の網膜
のＲＰＥ細胞および／またはミュラー細胞を本発明のウイルスベクターを接触させる。

本明細書に記載する方法中で使用するウイルスベクターはＡＡＶ２またはＡＡＶ８カプ
シドを含み、ベクターゲノムは、ＲＬＢＰ１プロモーターおよび配列番号３または１０か
ら選択されるヌクレオチド配列と作動可能に連結したＲＬＢＰ１コード配列を含むことが
さらに企図される。ベクターゲノムは、自己相補的であり得ることがさらに企図される。

一態様では、当業者に知られている方法を使用して、本明細書に記載するウイルスベク
ターを網膜下または硝子体内に投与することができる。

ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全などの眼部疾患の治療および／または予防は、視覚機能お
よび／または網膜構造の臨床関連測定を使用して、眼科医またはヘルスケアの専門家によ
って決定することができる。ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全の治療は、視覚機能および／ま
たは網膜構造を改善または維持することが企図される、任意の操作（例えば、本明細書に
記載するウイルスベクターの投与）を意味する。さらに、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全に
関する予防は、本明細書で定義する、視覚機能、網膜構造、および／またはＲＬＢＰ１関
連網膜形成不全疾患表現型の疾患の悪化を、前記悪化のリスクがある患者において予防ま
たは遅延する、任意の操作（例えば、本明細書に記載するウイルスベクターの投与）を意
味する。

視覚機能は、例えば視力、暗視野を伴う視力、視野、中心視野、周辺視覚、コントラス
ト感度、暗順応、光ストレスからの回復、色の識別、リーディングスピード、補助デバイ
ス（例えば、大きな活字、拡大用デバイス、望遠鏡）に対する依存、顔の認識、乗用車を
操作する技能、１つ以上の日常活動を行う能力、および／または視覚機能に関して患者が
報告する満足度を含むことができる。したがって、網膜色素変性症（ＲＰ）、具体的には
ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全の治療は、所定の暗順応度までの時間の、少なくとも１０％
の低下または１０％以上の増大の欠如を対象が有する場合に、行うことができると言える
。さらに、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全の治療は、有資格者であるヘルスケアの専門家（
すなわち、眼科医）により決定される、法医学的失明につながる、若年で初期の重度の夜
盲症と緩慢な暗順応、次に視力、視野および色覚の進行的消失を対象が示す場合に行うこ
とができると言える(Burstedt and Monestam,2010)。

視覚機能の例示的な測定には、Ｓｎｅｌｌｅｎ視力測定、ＥＴＤＲＳ視力測定、低照度
視力測定、Ａｍｓｌｅｒグリッド測定、Ｇｏｌｄｍａｎｎ視野測定、標準自動周辺視野測
定、マイクロ周辺視野測定、Ｐｅｌｌｉ−Ｒｏｂｓｏｎチャート、ＳＫＩＬＬカード、イ
シハラカラープレート、ＦａｒｎｓｗｏｒｔｈＤ１５またはＤ１００色覚試験、標準網膜
電図検査、多焦点網膜電図検査、リーディングスピード、顔の認識、ドライビングシミュ
レーション、および患者が報告する満足度に関する妥当性試験がある。したがって、ＲＬ
ＢＰ１関連網膜形成不全の治療は、ＥＴＤＲＳスケールでの視野の２ライン以上（または
１０文字）の増加または減少により行うことができると言える。さらに、ＲＬＢＰ１関連
網膜形成不全の治療は、リーディングスピード（１分間当たりのワード数）の、少なくと
も１０％の増大または１０％低下の欠如を対象が示す場合に、行うことができると言える
。さらに、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全の治療は、イシハラ検定において正確に確認され
るプレートの割合またはＦａｒｎｓｗｏｒｔｈ検定において正確に配列決定されるディス
クの、少なくとも２０％の増大または２０％低下の欠如を対象が示す場合に、行うことが
できると言える。したがって、例えばＲＬＢＰ１関連網膜形成不全の治療は、例えば暗順
応の比率の改善、または視力低下率の改善、もしくはその遅延によって決定することがで
きる。

治療または予防することができる網膜構造の望ましくない態様には、例えば網膜萎縮、
網膜色素上皮萎縮、網膜血管の狭窄、色素塊、網膜黄色／白色斑点、網膜下流体がある。

網膜構造を評価する例示的な手段には、眼底鏡検査、眼底写真撮影、フルオレセイン蛍
光眼底造影、インドシアニングリーン蛍光眼底造影、光干渉断層計（ＯＣＴ）、スペクト
ラルドメイン光干渉断層計、走査型レーザー検眼鏡検査、共焦点顕微鏡検査、順応視力測
定、眼底自家蛍光測定、生検、検死、および免疫組織化学的方法がある。したがって、例
えば網膜萎縮の発達の割合の減少により決定して、対象においてＲＬＢＰ１関連網膜形成
不全が治療可能であると言うことができる。

本発明の治療剤を用いて治療する対象に、ビタミンおよびミネラル調製物、視力低下支
援器具、盲導犬、または視力低下がある患者を支援することが知られている他のデバイス
などの、網膜形成不全に関する治療有効性が知られている他の治療剤またはデバイスを施
すこともできる。

現在、ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を治療するための、他の承認済み治療剤は存在しな
い。他の新たな治療剤が出現すると、臨床的に示されるように、２つをいずれかの順序で
連続的にまたは同時に投与することができる。

以下の実施例は、本発明の範囲を限定するためではなく、本発明をさらに例示するため
に提供する。本発明の他の変形は当業者には容易に明らかとなり、添付の特許請求の範囲
によって包含される。

実施例１： ＡＡＶ−ＩＴＲプラスミドの構築
１．１ ＡＡＶ−ＩＴＲプラスミドのクローニング
個々のプラスミドエレメントの核酸配列を表１中に記載する。これらの配列は合成した
か、または市販品を購入したかのいずれかである。表２は、構築した各プラスミド中に存
在したエレメントを記載する。標準的な分子生物学のクローニング技法を、表３中に記載
するプラスミドを作製する際に使用した。アンピシリン耐性またはｐＵＣ５７およびカナ
マイシン耐性を有するプラスミド骨格ｐＡＡＶ−ＭＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商
標））を、骨格および出発材料として使用した。個々の配列エレメントは制限酵素部位で
、または平滑末端クローニングを使用してクローニングした。

プラスミド骨格中に含有される抗生物質耐性遺伝子カセットは、ＡＡＶベクターの生成
において役割を果たすわけではないので、当業者は別のプラスミド骨格および／または抗
生物質耐性遺伝子カセットを使用して、同じウイルスベクターをもたらすことが可能であ
る。本発明者らは、異なる骨格を有するプラスミドを使用して、機能的に同等なＮＶＳ２
ベクターを作製することができることを実証している。例えば、プラスミド配列番号２６
および配列番号５０は機能的に同等なＮＶＳ２ベクターを生成する。

１．２． ｒＡＡＶベクターを生成するためのトリプルプラスミドトランスフェクショ
ン
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスベクターをトリプルトランスフェクション法によっ
て作製した。トリプルトランスフェクションの方法は当技術分野で知られている（Ferrar
i FK et al 1997）。簡単に言うと、（表２中に記載する）ＡＡＶ−ＩＴＲ含有プラスミ
ド、（Ｒｅｐ２およびＣａｐ２またはＣａｐ８を有する）ＡＡＶ−ＲｅｐＣａｐ含有プラ
スミド、および（ＡＡＶ複製サイクルの実行を支援する遺伝子を有する）アデノヘルパー
プラスミドを２９３細胞に同時トランスフェクトした。細胞は４日間培養した。培養期の
最後に細胞を溶解し、培養上清および細胞溶解物中のベクターを標準的なＣｓＣｌ勾配遠
心分離法（Grieger JC et al 2006に基づき改変した方法）によって精製した。精製ウイ
ルスベクターは表４中に記載する。

あるいは、前に記載した細胞トランスフェクションおよび培養法によりＧＭＰ様ｒＡＡ
Ｖベクターを作製した。採取した細胞培養物材料を、次いでLock M et al(2010),Smith R
H et al(2009)およびVadenberghe LH et al(2010)により記載された方法に基づき、カラ
ムクロマトグラフィーにより処理した。

１．３． ５’ＩＴＲ配列の変形
以前に記載されたように（Samulski et al,1983;Muzyczka et al,1984）、ＡＡＶプラ
スミドの末端反復配列内の変異は、機能的ＡＡＶベクターを作製する際に十分許容される
。２つのＩＴＲの１つが欠失したプラスミドでさえ、構築物中に存在するＩＴＲが完全Ａ
ＡＶＩＴＲ配列を含有する限り、ＡＡＶ配列を回復、複製することができ、感染性ビリオ
ンを生成することができる（Samulski et al,1983;Muzyczka et al,1984）。したがって
、配列番号２をこの文書中に記載された全一本鎖ＡＡＶベクターの５’ＩＴＲ配列として
使用する場合でさえ、末端分解部位を有する任意の５’ＩＴＲ配列（すなわち、配列番号
２、１６および１７）が、同じ機能性を有するベクターを生成し得ることが予想される。

実施例２： マウスにおけるｒＡＡＶベクターの網膜下注射
２．１ マウスにおけるｒＡＡＶベクターの網膜下注射
ｒＡＡＶベクターの網膜下注射によって、ＲＰＥおよび他の網膜細胞の効率よい形質導
入を行うことができる。網膜下注射が、多量の濃縮ウイルスとＲＰＥ細胞および網膜神経
の完全な接触を誘導するからである。さらに、網膜下空間は比較的高度の免疫特異性を有
し、典型的には、注射部位近辺に炎症の痕跡はほとんど見られない。したがって網膜下注
射は、マウス網膜内にｒＡＡＶベクターを送達するのに好ましい経路であった。しかしな
がら、他の送達経路、例えば硝子体内注射を使用することは可能である。

供給者／試薬：
− ＬｅｉｃａＭ８４４Ｆ４０眼部手術用顕微鏡
− １％シクロペントレート：Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂカタログ番号９６５９１１
− ２．５％〜１０％フェニレフリン：Ａｌｔａｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌｓカタログ番号０５６２６
− ０．５％プロパラカイン：Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂカタログ番号ＮＤＣ５４７
９９−５００−１２
− １０μｌハミルトンシリンジ：ＶＷＲカタログ番号８９１８４−４７６
− ３３Ｇ平滑末端ニードル：Ｈａｍｉｌｔｏｎカタログ番号７８０３−０５
− フルオレセインナトリウム塩：Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｆ６３７７

この実施例中で使用した試験品：
− 眼当たり１×１０^９個のｓｃＡＡＶ８−ｐＲＬＢＰ１（短鎖）−ｅＧＦＰウイルス
ベクター、ｖｇ
− 眼当たり１×１０^９個のＡＡＶ８−ｐＲＬＢＰ１（長鎖）−ｅＧＦＰウイルスベク
ター、ｖｇ
− 眼当たり１×１０^９個のＡＡＶ８−ｐＲＰＥ−ｅＧＦＰウイルスベクター、ｖｇ
− 眼当たり１×１０^９個のＡＡＶ８−ＶＭＤ２−ｅＧＦＰウイルスベクター、ｖｇ

プロトコール：
網膜下注射を両眼、または右眼のみのいずれかで実施した。全ての手順は、無菌条件下
において、滅菌試薬、シリンジおよび適切な身体防御装置を使用して実施した。

網膜下注射の手順：
− マウスの瞳孔を一滴の１％シクロペントレート、および次に一滴の２．５％〜１０
％フェニレフリンによって広げた。
− 腹腔内にアベルチン（２５０ｍｇ／ｋｇ）を使用し、一滴の０．５％プロパラカイ
ンを眼の局所に使用することによって（局所麻酔）マウスに麻酔をかけた。
− 約０．５ｍｍの切込みを、マイクロスカルペルを用いて鼻腔、角膜縁の後部に入れ
た。
− １０μｌハミルトンシリンジの平滑末端ニードルを、強膜の切込みを介し網膜側面
に対して接線方向に挿入した。（１：５０の濃度でフルオロセインを含有する）１μｌの
希釈ｒＡＡＶベクターを次いで網膜下空間にゆっくりと注射し、切込みを介してニードル
を引き抜いた。
− 眼を検査し、網膜下注射の成功はフルオレセインを含有するブレブの視覚化によっ
て確認した。注射の成功および網膜損傷の程度（出血）を記録した。
− 抗生物質軟膏剤を注射直後に眼に施した。

２．２．マウス網膜におけるｒＡＡＶベクター誘導型ＧＦＰ発現およびその細胞型特異
性
マウス網膜におけるｒＡＡＶベクター誘導型遺伝子形質導入およびその細胞型特異性を
試験するため、網膜横断面およびＲＰＥ／網膜フィラメントにおけるｅＧＦＰ発現を調べ
た。ｅＧＦＰ発現細胞型を確認するため使用した一手法は、凍結切片における免疫細胞化
学的染色によって、網膜細胞マーカーでｅＧＦＰ陽性細胞を同時標識することであった。

供給者／試薬：
免疫細胞化学的染色用の一次抗体：
− 抗ＣＲＡＬＢＰ抗体：Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号ＭＡ１−８１３
− 抗ＧＦＡＰ抗体：Ｃｏｖａｎｃｅカタログ番号ＳＭＩ−２１
− 抗オプシンブルー抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＡＢ５４０７
− 抗オプシンレッド抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＡＢ５４０５
− 抗ビメンチン抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚカタログ番号ｓｃ−７５５７
− 抗ＰＫＣα抗体：Ｃ−２０ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚカタログ番号ｓｃ−２０８
免疫細胞化学的染色用の二次抗体：
− ヤギ抗体マウスＩｇＧ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１００５
− ヤギ抗体ラットＩｇＧ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１００７
− ロバ抗ウサギＩｇＧ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ２１２０７

他の供給者／試薬：
− ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティングメディアおよびＤＡＰＩ：Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅカタログ番号Ｈ−１２００
− Ｚｅｉｓｓイメージングシステム、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ
− ＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡、ＺｅｉｓｓソフトウェアのＺＥＮバージョ
ン

プロトコール：
マウスの眼球を除去し、解剖するまで４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）中に２５℃
で２時間、次いでＰＢＳバッファー中に４℃で１〜３日間放置した。角膜、レンズおよび
硝子体を眼球から除去し、網膜およびＲＰＥ／脈絡膜はスライド上のＶｅｃｔａｓｈｉｅ
ｌｄマウンティングメディアにフラットマウントした。フラットマウント中のＧＦＰ発現
はＺｅｉｓｓイメージングシステムによって捕捉し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅを使用して定量化した。イメージング後、網膜フラットマウントを有するスライド
を２５℃で３０分間０．２５％トリトンバッファー中に放置し、次いで網膜フラットマウ
ントをスライドから除去した。網膜フラットマウントのｅＧＦＰ陽性領域を切断し、ＯＣ
Ｔに包埋し次いで凍結切片にした。網膜細胞マーカーを使用した免疫細胞化学的染色を、
凍結切片に施した。イメージはＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡およびＺｅｉｓｓソ
フトウェアのＺＥＮバージョンによって捕捉した。

免疫細胞化学的染色の手順
第１日。
− 室温で１時間切片を空気乾燥させる。
− ＰＢＳ＋０．２５％トリトン中に１５分×２、スライドを放置する。
− １％ＢＳＡ＋ＰＢＳ＋０．２５％トリトン中で９０分間ブロッキングする。
− １％ＢＳＡ＋ＰＢＳ＋０．２５％トリトン中において４℃で一晩、一次抗体とスラ
イドをインキュベートする。
第２日。
− ４℃からスライドを取り出し、それらを２５℃で３０分間放置する。
− ＰＢＳ＋０．２５％トリトン中で１５分×２、スライドを洗浄する。
− ２５℃で９０分間、二次抗体１：８００とスライドをインキュベートする。
− ＰＢＳ＋０．２５％トリトン中で１５分×２、スライドを洗浄する。
− ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティングメディアおよびＤＡＰＩをスライドにマウ
ントする。

結果：
− 試験した全てのウイルスベクターはマウス網膜において機能的であった。
− ｓｃＡＡＶ８−ｐＲＬＢＰ１（短鎖）−ｅＧＦＰベクターは、神経網膜内のＲＰＥ
およびミュラー細胞におけるＧＦＰの選択的発現をもたらす。
− ＡＡＶ８−ｐＲＬＢＰ１（長鎖）−ｅＧＦＰは、神経網膜内のＲＰＥ、ミュラー細
胞および光受容体におけるＧＦＰの発現をもたらす。
− ＡＡＶ８−ｐＲＰＥ６５−ｅＧＦＰとＡＡＶ８−ｐＶＭＤ２−ｅＧＦＰは、神経網
膜内のＲＰＥおよび光受容体におけるＧＦＰ発現をもたらす。

結論
これらの結果は、プロモーター、ＡＡＶゲノム形状およびＡＡＶカプシド配列の組合せ
は特異的細胞型で異なる形質導入性をもたらし、望ましい効果を得ることが可能であるこ
とを実証する。網膜のＲＰＥおよびミュラー細胞におけるＲＬＢＰ１遺伝子産物の発現は
、望ましいオンターゲット細胞型発現を表す。自己相補的ゲノムおよびＡＡＶ８血清型カ
プシドと共にパッケージングされたＲＬＢＰ１短鎖プロモーターは、オフターゲット細胞
型発現なしで、神経網膜内のＲＰＥおよびミュラー細胞における遺伝子発現を誘導する。

一本鎖ゲノムおよびＡＡＶ８血清型カプシドと共にパッケージングされたＲＬＢＰ１長
鎖プロモーターは、オンターゲット細胞型であるＲＰＥおよびミュラー細胞において、お
よびオフターゲット細胞型である光受容体においても遺伝子発現を誘導する。

一本鎖ゲノムおよびＡＡＶ８血清型カプシドと共にパッケージングされたＲＰＥ６５お
よびＶＭＤ２プロモーターは、ＲＰＥ細胞においてだけでなく、オフターゲット細胞型で
ある光受容体においても遺伝子発現を誘導する。

実施例３： 内在マウスＲＬＢＰ１ｍＲＮＡ発現に対する、ヒトＲＬＢＰ１導入遺伝子の
ベクター媒介発現を測定するためのｍＲＮＡベースのアッセイ
ｒＡＡＶ形質導入遺伝子の発現レベルおよび組織特異性は、ベクター血清型、ベクター
ゲノム、使用する組織特異的プロモーターおよび注射用量に応じて変わり得る。遺伝子置
換療法の目的は、毒性レベルまで遺伝子を過剰発現させずに、失われた内在遺伝子発現を
補うのに十分な発現レベルを得ることである。

野生型マウスにおいて異なる用量での様々なＡＡＶベクターの網膜下注射後に、マウス
ＲＬＢＰ１ｍＲＮＡの内在レベルに対するヒトＲＬＢＰ１ｍＲＮＡのベクター媒介発現を
測定するためのアッセイが開発されている。このアッセイは、ヒトまたはマウスＲＬＢＰ
１ｃＤＮＡを特異的に検出するプライマーとプローブを含有する、Ｔａｑｍａｎ（登録商
標）遺伝子発現アッセイを利用した。実験を実施する前に、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）遺
伝子発現アッセイを、ヒトまたはマウスＲＬＢＰ１ｃＤＮＡ配列のいずれかを含有するプ
ラスミドＤＮＡを使用して種特異性に関して試験した。簡単に言うと、Ｔａｑｍａｎ（登
録商標）試薬を使用して、マウスまたはヒトＲＬＢＰ１ｃＤＮＡのいずれかを、内部対照
としてのマウスＧＡＰＤＨｃＤＮＡと同時増幅した。マウスまたはヒトＲＬＢＰ１のレベ
ルを内部ＧＡＰＤＨ対照に標準化し、次いでこれらの標準化レベルを互いに比較した。

供給者／試薬：
− ＲＮＡ抽出
− Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４００
４）
− Ｑｉａｇｅｎ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎカタログ
番号７９２５４）
− β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａカタログ番号６３６８９）
− Ｑｉａｇｅｎステンレススチール製５ｍｍビーズ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号６９
９８９）
− ２．０ｍｌのＳｅａｌ Ｒｉｔｅマイクロ遠心分離チューブ（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃカタログ番号１６２０−２７００）
− Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（カタログ番号８５３００）
− ｃＤＮＡ合成
− ハイキャパシティーｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓカタログ番号４３６８８１４）
− ＲＮａｓｅ阻害剤（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｎ８０８
０１１９）
− ＢｉｏＲａｄサーマルサイクラー
− 相対定量化ＰＣＲ
− ２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３０４４３７）
− ヒトＲＬＢＰ１用の２０×ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３３１１８２：Ｈｓ００１６５６３２．
ｍ１）
− マウスＲＬＢＰ１用の２０ＸＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３３１１８２：Ｍｍ００４４５１２９
．ｍ１）
− ２０×Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）マウスＧＡＰＤ（ＧＡ
ＰＤＨ）内部対照（ＶＩＣ（登録商標）／ＭＧＢプローブ、Ｐｒｉｍｅｒ Ｌｉｍｉｔｅ
ｄ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３５２３３９Ｅ）
− Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲマシーンモデル７９０
０ＨＴ。
− この実施例中で使用した試験品：
− ＮＶＳ８ウイルスベクター
− ＮＶＳ１０ウイルスベクター
− ＮＶＳ４ウイルスベクター
− ＮＶＳ２ウイルスベクター
− ＮＶＳ６ウイルスベクター

プロトコール：
ｉｎ ｖｉｖｏ実験の最後に、網膜神経を眼から切開し、２ｍｌのマイクロ遠心分離チ
ューブ中に置き、ドライアイス上で瞬間凍結させた。（網膜とレンズを含まない）残りの
洗眼コップは別のチューブ内で凍結させた。ＲＮＡを単離するまで、サンプルは−８０℃
で保存した。全てのＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙマイクロキットおよびＤＮａ
ｓｅ処理剤を使用して抽出した。組織均質化および溶解用に、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕ
ｅＬｙｓｅｒを使用した。詳細には、５ｍｍステンレススチール製ビーズを、ドライアイ
ス上のそれぞれの組織含有チューブに加えた。サンプルは室温状態に移し、１％β−メル
カプトエタノールを含有する３５０μｌのバッファーＲＬＴを加えた。２回の２分間サイ
クル３０Ｈｚの撹拌周波数で、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いてサンプルを処理した。Ｒ
ＮＡ抽出およびＤＮａｓｅ処理剤に関する標準Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙマイクロキッ
トプロトコールを、次いで１つのわずかな改変で続けた。溶出前に、ＲＮＡカラムを１０
分間より長く空気乾燥させ残留エタノールの除去を確実にした。全てのＲＮＡは、ｃＤＮ
Ａ合成の準備ができるまで−８０℃で保存した。

Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して全体ＲＮＡ濃度を決定した。それぞれのサンプ
ルは５０ｎｇ／μｌの最終濃度に調整した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのハ
イキャパシティーｃＤＮＡ逆転写酵素キットを使用してｃＤＮＡを作製した。ハイキャパ
シティーｃＤＮＡＲＴキットからの試薬のマスターミックスは、それぞれの１０μｌが、
２μｌの１０×ハイキャパシティーＲＴバッファー、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰ（１０
０ｍＭ）、２μｌの逆転写酵素ランダムプライマー、０．４μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、１
μｌのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素および３．８μｌの無ＲＮＡｓｅ水を含有する
ように調製した。全ＲＮＡ各々の５０ｎｇ／μｌストック１０μｌを９６ウエルＰＣＲ増
幅プレートのウエルに分配し、次いで１０μｌのＲＴマスターミックスを各々のウエルに
加えた。プレートはＢｉｏＲａｄサーマルサイクラー中に放置し、以下のパラメーターを
使用して操作した。２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５分間、次いでプ
ログラム終了まで４℃で保持。相対定量化ＰＣＲ反応設定までｃＤＮＡは−２０℃で保存
した。

ｃＤＮＡ反応の各ウエルに５μｌの無ＲＮＡｓｅ水を加えることにより、ｃＤＮＡ濃度
を２０ｎｇ／μｌの最終濃度に調整した（これは初期の全体ＲＮＡ濃度に基づきｃＤＮＡ
に１００％転換されたと仮定する）。それぞれのｃＤＮＡサンプル用に、２つの異なる多
重ｑＰＣＲ反応を設定する。１つはマウスＲＬＢＰ１ Ｔａｑｍａｎ発現アッセイプロー
ブおよびマウスＧＡＰＤＨ内部対照を使用し、もう１つはヒトＲＬＢＰ１ Ｔａｑｍａｎ
発現アッセイプローブおよびマウスＧＡＰＤＨ内部対照を使用する。この２つの反応はそ
れぞれ、それぞれのサンプルに関して二連で実施した。それぞれのサンプルに関して、２
０ｎｇ／μｌのｃＤＮＡサンプル５μｌを３８５ウエルプレートのウエルに分配した。２
つの別個のマスターミックス、１つはマウスＲＬＢＰ１ Ｔａｑｍａｎアッセイ用、およ
び１つはヒトＲＬＢＰ１アッセイ用を、混合物のそれぞれ１５μｌが、１０μｌの２×Ｔ
ａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス、１μｌのマウス
もしくはヒトＲＬＢＰ１いずれか用の２０×ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセ
イ、１μｌの２０×Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）マウスＧＡＰＤ
（ＧＡＰＤＨ）内部対照、および３μｌの無ＲＮＡｓｅ水を含有するように調製した。１
５μｌの適切なマスターミックスを、ｃＤＮＡを含有するウエルに分配した。プレートは
ＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲマシーン中に放置し、以下のパラメーターを用い
た相対定量化プログラムを使用して実施した。５０℃で２分間の初期インキュベーション
、次いで以下の２ステップ、９５℃で１５秒間、および６０℃で１分間の４０サイクル。

相対定量化プレートの結果は、ＡＢＩ ＲＱ Ｍａｎａｇｅｒ１．２を使用してＲＱ試
験ドキュメントにインポートした。これらのデータは、自動閾値設定を使用して分析し平
均、およびＲＬＢＰ１ｃＤＮＡ（マウスまたはヒト）のＣｔ読み取り値マイナス内部内在
ＧＡＰＤＨのＣｔの差である平均ΔＣｔを生成した。データはマイクロソフトエクセルに
エクスポートし、それらを使用し、それぞれのサンプルに関してヒトＲＬＢＰ１ΔＣｔ値
からマウスＲＬＢＰ１ΔＣｔ値を差し引くことによりΔΔＣｔ値を計算した。マウス内在
ＲＬＢＰ１発現の変化倍率としてヒトＲＬＢＰ１の相対的発現を表す計算値２^{−ΔΔＣｔ}
を使用し、相対的発現を計算した。マウス内在発現のパーセントとして、ヒトＲＬＢＰ１
の発現として結果を示すため、相対的発現値に１００を掛けた。

結果：ｍＲＮＡの発現。
図１Ａは、ＮＶＳ８、ＮＶＳ４、ＮＶＳ２およびＮＳＶ６は後方眼杯における神経網膜
細胞とＲＰＥ細胞の両方に首尾よく形質導入することを例示する。ベクターＮＶＳ１０は
ＲＰＥ細胞には形質導入するが、神経網膜ではかろうじて検出限界レベルである。

図１Ｂは、ＮＶＳ２が眼当たり１×１０^８個のｖｇのベクターゲノムの低用量で、神経
網膜においてｍＲＮＡ発現を示す唯一のベクターであることを例示する。

結論
この驚くべき結果は、プロモーター、ＡＡＶゲノム形状およびＡＡＶカプシド配列の組
合せは、網膜における特異的細胞型で異なる形質導入性をもたらし得ることを実証する。
一般に、試験した全てのベクターが、ベクター媒介のヒトＲＬＢＰ１ｍＲＮＡの発現を首
尾よくもたらした。より詳細には、ＮＶＳ２が、試験した両方の用量（眼当たり１×１０
^９個のｖｇと眼当たり１×１０^８個のｖｇ）で、（後方眼杯中の）ＲＰＥ細胞および神経
網膜でのヒトＲＬＢＰ１ｍＲＮＡの発現における最も強力なベクターであり、一方ＮＶＳ
４およびＮＳＶ６は、眼当たり１×１０^９個のｖｇの用量で、眼当たり１×１０^８個のｖ
ｇの用量ではＲＰＥにおいてのみ、検出可能なベクター媒介のヒトＲＬＢＰ１ｍＲＮＡの
発現をもたらした。ＮＶＳ８およびＮＳＶ１０は、眼当たり１×１０^９個のｖｇの用量で
ＲＰＥおよび神経網膜において検出可能なｍＲＮＡの発現をもたらしたが、眼当たり１×
１０^８個のｖｇの用量ではかろうじて検出限界であった。

実施例４： 網膜電図検査ベースの暗順応アッセイ
視サイクルを変える処置を評価するための一手法は、露光後の暗所における視覚機能の
回復（すなわち、暗順応）を定量化することである。長時間露光後の暗順応は、視サイク
ルを介して光色素を再生する眼の能力により大部分は誘導される。したがって、処置を介
して得られる視サイクルの改変は暗順応動態の変化をもたらす。

網膜電図検査（ＥＲＧ）を使用した暗順応の定量化に基づき、マウスにおける視覚機能
の回復をモニタリングするアッセイが開発されている。典型的には、ＥＲＧベースのアッ
セイは初期ベースラインおよび後のフォローアップ測定で２日間進め、一部の光色素を退
色する露光（光退色）後の回復を評価する。本発明の試験用に開発したこの手順は、ＥＲ
Ｇトレースのａ−波長部分中での閃光後５ｍｓにおけるそれぞれの眼の最大電気応答を最
初に決定する。この試験は、光退色後４時間での５ｍｓのａ−波長幅を後に比較して、そ
の時間内に回復した最大幅の割合を評価する。視サイクルが正常に機能する場合、ＥＲＧ
幅は４時間でベースライン値に近づく。視サイクルの遅延は、光色素の回復の低下、およ
び光退色後の対応するＥＲＧａ−波長幅回復の低下をもたらす。

供給者／試薬：
− ＥＲＧシステム：Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ、Ｅｓｐｉｏｎ Ｅ２コンソールおよびＣｏ
ｌｏｒＤｏｍｅ全視野スティミュレーター
− ケタミン
− キシラジン
− ２．５％フェニレフリン
− １％シクロペントレート
− ０．５％プロパラカイン
− 活性電極：金縁コンタクトレンズ電極（Ｍａｙｏ、部品番号Ｎ３０）
− 参照電極：鼻咽腔用電極（Ｇｒａｓｓ、部品番号Ｆ−ＥＲＧ−Ｇ）
− 基底電極：白金ニードル電極（Ｇｒａｓｓ、部品番号Ｆ−Ｅ２）
− 水和滴剤：Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｅｎｔｅａｌ Ｍｉｌｄ ｔｏ Ｍｏｄｅｒａｔ
ｅ
− シリンジポンプ：Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、部品番号Ｐｕｍｐ１１Ｐ
ｌｕｓ

プロトコール：
ベースラインＥＲＧを記録するまで、マウスを一晩約２０時間暗所に置く。記録直前に
、瞳孔を１〜２滴の１％シクロペントレート、および１〜２滴の２．５％フェニレフリン
によって広げる。１〜２滴の０．５％プロパラカイン（局所麻酔）も施す。次いでマウス
に、ケタミンとキシラジンのカクテル（それぞれ１００〜１５０ｍｇ／ｋｇと５〜１０ｍ
ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔をかける。次いで３本の電極を配置して、マウス当たり１
個の眼からのＥＲＧの記録を可能にする。眼の上の活性電極は金縁コンタクトレンズ電極
であり、参照電極は口腔内に配置した鼻咽腔用電極であり、基底電極は頭部直後に配置し
た皮下白金ニードル電極である。眼は潤いを保ち、水和滴剤とシリンジポンプの連続施用
（３００μｌ／時間）を介して電気的接触を維持する。全視野ドームにおけるキセノンラ
ンプにより送達された３回の白色フラッシュ（２．７ｌｏｇ暗順応カンデラ毎平方メート
ル）に対する電気応答を平均することによってＥＲＧ幅を記録する。報告されたａ−波長
幅は、この目的のため開発されたソフトウェア解析ルーティーン（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、
Ｍａｔｌａｂ）を使用して評価した、キセノンフラッシュ後５ｍｓで測定した電圧である
。

光退色後４時間でＥＲＧａ−波長幅を定量化することによって、暗順応を評価する。こ
れらの実験は、典型的にはベースライン決定後４８時間で行う。ベースライン測定と同様
に、ＥＲＧ記録を約２０時間後に行うように、最初にマウスを一晩暗所に収容する。光退
色の直前に、瞳孔を１〜２滴の２．５％フェニレフリンおよび１〜２滴の１％シクロペン
トレートによって広げる。一連の１６閃光（３．７ｌｏｇ暗順応カンデラ毎平方メートル
）を次いで眼に送達し光色素退色をもたらす。マウスは４時間暗所に戻して視覚機能を回
復させる。次いでＥＲＧを、ベースライン決定に使用したのと同じプロトコールを利用し
て記録する。それぞれの眼に関する視覚機能の回復は以下のように定義する：

図２は、ＲＬＢＰ１−／−およびＲＬＢＰ１＋／＋マウスに施用したときのアッセイの
結果を例示する。ＲＬＢＰ１＋／＋マウスは、光退色後４時間で（最大９６％の）ほぼ完
全な回復を示す。対照的にＲＬＢＰ１−／−マウスは、視サイクル動態の著しい遅延のた
め同じ時間地点で視覚機能の回復が最小である（１１％）（Saari et al 2001）。ＲＬＢ
Ｐ１＋／＋マウスとＲＬＢＰ１−／−マウスの間のこの８〜９倍の幅は、ＲＬＢＰ１−／
−マウスに注射するベクターを試験するのに利用可能なアッセイ幅である。

前に記載したＥＲＧベースの暗順応アッセイを使用して、暗順応有効性の改善をＲＬＢ
Ｐ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおいて試験し、この場合治療用ベクターは網膜下に導
入する。網膜下注射はＲＰＥからの神経網膜の排除を含むので、神経網膜がＲＰＥに再接
着し、ＥＲＧアッセイ中で試験品に関する偽陰性の結果を回避するかどうかを決定するこ
とは重要である。マウスの眼へのウイルスベクターの網膜下注射後一週間で、光干渉断層
計検査（ＯＣＴ）を実施して網膜の状態を視覚化する。未検出の網膜剥離がある眼はＥＲ
Ｇ測定から除外した。

それぞれの時間地点で、マウスは一晩（１２時間より長く）暗順応させ、それぞれの眼
からのＥＲＧのａ−波長幅は光に対する最大暗順応応答（１００％）として確定した。完
全に暗順応した眼は次いで（前項に記載したように）一連の閃光に曝し、ａ−波長幅は４
時間後に定量化した。用語「正常百分率」は、最大ａ−波長幅回復測定から得た値に対す
る第二のａ−波長幅回復測定の百分率として定義する。

プラスの有効性、または有効効果は、注射後の所与の時間地点で統計学的に有意な、試
験測定と陰性（非投薬）対照の間の差として定義する。

この実施例中で使用した試験品には以下のものがある：
− ＮＶＳ１ウイルスベクター
− ＮＶＳ２ウイルスベクター
− ＮＶＳ３ウイルスベクター
− ＮＶＳ４ウイルスベクター
− ＮＶＳ５ウイルスベクター
− ＮＶＳ１１ウイルスベクター

図３Ａ〜Ｄは、ＲＬＢＰ１を発現するウイルスベクターは、ＲＬＢＰ１ＫＯマウスにお
いて暗順応率を改善することを例示する。一元配置ＡＮＯＶＡおよびＮｅｗｍａｎ−Ｋｅ
ｕｌｓの多重比較検定を使用して計算した統計値を用いて、各群および非投薬対照に関し
て有効性評価を実施した。全ての関連試験に関する非投薬状態（非注射状態の）眼および
眼当たり１×１０^９個ｖｇの陰性対照ＡＡＶヌルベクター（ＮＶＳ１１）を与えた眼の平
均＋３標準偏差（ＳＤ）は、有効性に関するおよその閾値を示す（このラインを超えるａ
−波長幅回復は、典型的には統計学的に有意な有効性を示す）。有効度を示すためのこの
手法は、遺伝子療法に関する刊行物中に示された手法と同様である（Jacobson et al.200
6およびRoman et al.2007）。

図３Ａは、眼当たり３×１０^８個ｖｇの用量で、ＮＶＳ２は治療後１４日で早くも暗順
応率を改善するのに有効であり、有効性は少なくとも３５０日間持続することを示す。眼
当たり３×１０^８個ｖｇの用量のＮＶＳ４も、治療後少なくとも３０〜２０４日間有効で
ある。眼当たり約３×１０^８個ｖｇの用量で、３回の独立実験でＲＬＢＰ１ＫＯマウスモ
デルにおいてＮＶＳ２を試験した。それぞれの実験において、注射後３５０日までの試験
した全ての時間地点で、ベクターは有効性を示した。

図３Ｂは、同じ用量（眼当たり３×１０^８個のｖｇ）でＮＶＳ１は注射後８４日から有
効性を示し、有効性は少なくとも３５０日間持続したことを示す。同じ用量においてＮＶ
Ｓ５およびＮＶＳ３は、薬物投与後１５４日まで有効性を示さなかった。図３Ａおよび３
Ｂ中に示すデータは、ウイルスベクターゲノムが同等である場合でさえ、異なるＡＡＶカ
プシド血清型でパッケージングされたときベクターは異なる有効性であり得ることを示唆
した（ＮＶＳ１およびＮＶＳ２）。さらに、ベクター血清型、プロモーター、およびベク
ターゲノム形状の特異的組合せは、ベクターの有効性に影響を与える可能性がある（ＮＶ
Ｓ１は自己相補的ゲノムを有し、一方ＮＶＳ３およびＮＶＳ４は一本鎖ゲノムを有し、い
ずれも異なるプロモーター配列を有する）。この結果によって、ゲノム形状とカプシド血
清型の組合せが、回復結果の有効性に影響を与える可能性があることをさらに確認する。

図３Ｃは、眼当たり１×１０^９個ｖｇの用量で、ＮＶＳ２は治療後１８日で早くも有効
であり、有効性は少なくとも３７５日間持続することを示す。眼当たり１×１０^９個ｖｇ
の用量で、陰性対照ＡＡＶヌルベクターであるＮＶＳ１１は、非注射対照と比較したとき
、暗順応率の改善の有意な差は示さなかった（個々のデータポイントは示さないが、従来
の平均＋３ＳＤラインは比較用に示す）。眼当たり１×１０^９個ｖｇの用量のＮＶＳ４も
、治療後少なくとも３０〜２０４日間有効である。

図３Ｄは、眼当たり３×１０^９個ｖｇの用量で、ＮＶＳ３およびＮＶＳ５はそれぞれ、
治療後２６日で早くも暗順応率を改善するのに有効であり、有効性は少なくとも３７１日
間持続することを示す。

図４Ａは、ＮＶＳ２は多用量で、注射後少なくとも９４日間、暗順応率を改善する際に
有効であることを実証する。眼当たり３×１０^８個ｖｇと眼当たり１×１０^９個ｖｇの両
群は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓの多重比較に基づくと、非投
薬対照と比較して有効であった。図４Ｂは、図４Ａからのデータを異なる形式で示す。こ
の場合プロットは、数回の実験からの非投薬群の平均＋３ＳＤによって定義されるより高
いａ−波長幅回復がある眼／群の百分率を示す。これらの結果は、ＮＶＳ２に関して、眼
当たり３×１０^７個ｖｇで処置した眼の５０％、および眼当たり３×１０^８個ｖｇおよび
１×１０^９個ｖｇで処置した眼の１００％が有効なａ−波長幅回復を実証したこと、およ
び用量応答曲線が確立されたことを示す。

図５Ａは、ＮＶＳ４は多用量で、注射後少なくとも９３日間、暗順応率を改善する際に
有効であることを実証する。眼当たり３×１０^８個ｖｇと眼当たり１×１０^９個ｖｇの両
群は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓの多重比較に基づくと、非投
薬対照と比較して有効であった。図５Ｂは、図５Ａからのデータを異なる形式で示す。こ
の場合プロットは、数回の実験からの非投薬群の平均＋３ＳＤによって定義されるより高
いａ−波長幅回復がある眼／群の割合を示す。これらの結果は、ＮＶＳ４に関して、眼当
たり３×１０^８個ｖｇおよび１×１０^９個ｖｇで処置した眼の８５％以上が暗順応率の増
大を示したことを示唆する。

図６は、様々な生成法により作製したベクターＮＶＳ２を用いて得た、暗順応率の増大
を実証する。ＮＶＳ２とＮＶＳ２ａはいずれも２つの異なるＣｓＣｌ勾配遠心分離法を使
用して生成し、一方ＮＶＳ２ｂはカラムクロマトグラフィーを使用して精製した。全３個
の精製法を用いて注射後８４日で得た有効性は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびターキーの検
定に基づいて区別できない。この結果は、２つの独立した研究室でのＮＶＳ２の３つの独
立した生成法は、ＲＬＢＰ１ＫＯマウスにおいて同様の有効性をもたらす機能性材料を与
えたことを示す。

実施例４の結果の要約：
− ウイルスベクターＮＶＳ２を注射した眼は、眼当たり３×１０^７個のｖｇから眼当
たり１×１０^９個のｖｇの範囲の用量で暗順応率が増大し、有効性はＲＬＢＰ１ＫＯマウ
スモデルにおいて注射後少なくとも３５０日持続する。
− ウイルスベクターＮＶＳ４を注射した眼は、眼当たり３×１０^８個のｖｇから眼当
たり１×１０^９個のｖｇの範囲の用量で暗順応率が増大し、有効性は両方の用量で少なく
とも２０４日持続する。
− ウイルスベクターＮＶＳ１を注射した眼は、眼当たり３×１０^８個のｖｇの用量で
暗順応率が増大し、有効性は少なくとも３５０日持続する。
− ウイルスベクターＮＶＳ３およびＮＶＳ５を注射した眼は、眼当たり３×１０^９個
のｖｇの用量で暗順応率が増大し、有効性は少なくとも３７１日持続する。ＮＶＳ３およ
びＮＶＳ５の有効性は、試験したいかなる時間地点でも眼当たり３×１０^８個のｖｇの用
量では観察されなかった。

結論：
ウイルスベクターＮＶＳ２は、試験した等量の他のベクターより高い最大回復を示す。
さらに、ＣｓＣｌまたはカラムクロマトグラフィー精製を使用して調製すると、ＮＶＳ２
ベクター媒介の有効性は区別できないと思われる。

結果の要約：
これらの結果は、自己相補的ＡＡＶ８−ｐＲＬＢＰ１（短鎖）−ｅＧＦＰベクター、レ
ポーター遺伝子代替バージョンの治療用ベクターＮＶＳ２は、検出可能なオフターゲット
発現なしでＲＰＥおよびミュラー細胞型特異的発現をもたらし、この場合治療用ベクター
ＮＶＳ２は、眼当たり３×１０^７個のｖｇから眼当たり１×１０^９個のｖｇの範囲の用量
でＲＬＢＰ１マウスにおけるａ−波長幅回復により測定して、少なくとも３５０日間の視
覚機能回復をもたらすことを実証した。この特異的遺伝子カセットは、一本鎖ゲノム内に
パッケージングされ同一血清型カプシド８でパッケージングされると、ｍＲＮＡ発現レベ
ルの測定により実証して、マウスにおいて有意に低いレベルの遺伝子発現を示す。ＮＶＳ
２と同じでＡＡＶ２カプシド内にパッケージングされた自己相補的ゲノム、ＮＶＳ１は、
少なくとも３５０日間眼当たり３×１０^８個のｖｇの用量で有効なａ−波長幅回復（すな
わち暗順応率の増大）を示した。この結果はＮＶＳ２がＮＶＳ１より強力なウイルスベク
ターであることを示唆し、これはおそらく、標的細胞型に対してＡＡＶ２カプシドより有
効なＡＡＶ８カプシドの感染が原因である。

これらの結果は、ＡＡＶ８−ｐＲＬＢＰ１（長鎖）−ｅＧＦＰベクター、レポーター遺
伝子代替バージョンの治療用ベクターＮＶＳ４はＲＰＥおよびミュラー細胞の発現だけで
なく、光受容体の発現ももたらすことをさらに実証した。治療用ベクターＮＶＳ４は、眼
当たり３×１０^８個のｖｇから眼当たり１×１０^９個のｖｇの範囲の用量で少なくとも２
０４日間の有効性をもたらす。ＮＶＳ４と同じただしＡＡＶ２カプシド内にパッケージン
グされたゲノム、ＮＶＳ３は、試験した低用量（眼当たり３×１０^８個のｖｇ）ではなく
３×１０^９の用量で有効なａ−波長幅回復をもたらす。これらの結果は、ＡＡＶ８−ｐＲ
ＰＥ６５−ｅＧＦＰベクター、レポーター遺伝子代替バージョンの治療用ベクターＮＶＳ
６は、長期の光受容体オフターゲット発現でＲＰＥ細胞型発現ことを実証した。ＮＶＳ６
と同じゲノムを有するがＡＡＶ２カプシド内にパッケージングされた治療用ベクターＮＶ
Ｓ５はＲＬＢＰ１ＫＯマウス有効性モデルにおいて試験し、これらの結果はＮＶＳ５が、
試験した低用量（眼当たり３×１０^８個のｖｇ）ではなく眼当たり３×１０^９個のｖｇの
用量でプラスのａ−波長幅回復有効性を持続することを実証した。

（参考文献）
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
レチンアルデヒド結合タンパク質１（ＲＬＢＰ１）コード配列を含むベクターゲノムを
有するウイルスベクターであって、網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞およびミュラー細
胞におけるＲＬＢＰ１コード配列の発現を誘導するように適合されたウイルスベクター。
［２］
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２または８カプシドを含む、上記
［１］に記載のウイルスベクター。
［３］
前記ベクターゲノムが５’から３’方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ、
（ｉｉ）ＲＬＢＰ１コード配列を含む組換えヌクレオチド配列、および
（ｉｉｉ）３’ＩＴＲ
を含む、上記［２］に記載のウイルスベクター。
［４］
組換えヌクレオチド配列が５’から３’方向に（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）ＲＬＢＰ
１コード配列、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０ポリＡ配列を含む、上記［３］に記載のウイル
スベクター。
［５］
前記プロモーターのヌクレオチド配列が配列番号３および１０から選択される、上記［
４］に記載のウイルスベクター。
［６］
ベクターゲノムが５’から３’方向に、
ａ）配列番号２、１０、５、６、８および９、
ｂ）配列番号２、１１、５、６、８、１４、９、
ｃ）配列番号２、２２、５、６、８、２３および９、ならびに
ｄ）配列番号２、３、４、５、６、８、２３および９
からなる群から選択される核酸配列を含む、上記［４］に記載のウイルスベクター。
［７］
前記ベクターゲノムが５’から３’方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ、
（ｉｉ）第１の組換えヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）非分解性ＩＴＲ、
（ｉｖ）第２の組換えヌクレオチド配列、および
（ｖ）３’ＩＴＲ
を含み、第１と第２の組換えヌクレオチド配列が自己相補的である、上記［２］に記載
のウイルスベクター。
［８］
第２の組換えヌクレオチド配列が５’から３’方向に（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）Ｒ
ＬＢＰ１コード配列、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０ポリＡ配列を含む、上記［７］に記載の
ウイルスベクター。
［９］
前記プロモーターのヌクレオチド配列が配列番号３を含む、上記［８］に記載のウイル
スベクター。
［１０］
ベクターゲノムが５’から３’方向に配列番号３６、６２、６３、６４、６５、６６、
１、３、４、５、６、８、および９の核酸配列を含む、上記［８］に記載のウイルスベク
ター。
［１１］
網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞において異種遺伝子を発現させることが可能なベ
クターゲノムを含むウイルスベクターであって、前記ベクターが、ａ）ＡＡＶ８またはＡ
ＡＶ２カプシドと、ｂ）異種遺伝子と作動可能に連結したＲＬＢＰ１プロモーターを含む
前記ベクターゲノムとを含み、前記ＲＬＢＰ１プロモーターが配列番号３および１０から
選択される配列を有する、ウイルスベクター。
［１２］
ベクターゲノムが自己相補的である、上記［１１］に記載のウイルスベクター。
［１３］
上記［１］から［１２］のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む組成物。
［１４］
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む上記［１３］に記載の組成物。
［１５］
網膜細胞において異種遺伝子を発現させる方法であって、
ａ）ＡＡＶ２またはＡＡＶ８カプシドと、ｂ）異種遺伝子と作動可能に連結した配列番
号３または配列番号１０のＲＬＢＰ１プロモーターを含むベクターゲノムとを含むウイル
スベクターと前記網膜細胞を接触させる工程を含む、方法。
［１６］
網膜細胞がＲＰＥ細胞およびミュラー細胞である、上記［１５］に記載の方法。
［１７］
ベクターゲノムが自己相補的ゲノムである、上記［１６］に記載の方法。
［１８］
異種遺伝子がＲＬＢＰ１である、上記［１５］から［１７］のいずれか一項に記載の方
法。
［１９］
遺伝子カセットを含む核酸であって、前記遺伝子カセットが５’から３’方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲまたは非分解性ＩＴＲ、
（ｉｉ）ＲＬＢＰ１コード配列を含む組換えヌクレオチド配列、および
（ｉｉｉ）３’ＩＴＲ
を含む核酸。
［２０］
プラスミドである上記［１９］に記載の核酸。
［２１］
（ｉ）前記５’ＩＴＲまたは前記非分解性ＩＴＲがそれぞれ配列番号２または１の核酸
配列を有し、
（ｉｉ）前記組換え核酸配列が、配列番号３の核酸配列を有する前記ＲＬＢＰ１コード
配列と作動可能に連結した配列番号３、１０、１１、１２および２２から選択される核酸
配列を有するプロモーターを含み、または
（ｉｉ）前記３’ＩＴＲが配列番号９の核酸配列を有する、上記［１９］に記載の核酸
。
［２２］
遺伝子カセットが配列番号５１、５２、５３、５４および５５から選択される核酸配列
を含む、上記［１９］に記載の核酸。
［２３］
配列番号２６、２７、２８、２９、３０および５０から選択される核酸配列をさらに含
む、上記［１９］に記載の核酸。
［２４］
遺伝子カセットが５’から３’方向に、
ａ）配列番号２、１０、５、６、８および９、
ｂ）配列番号２、１１、５、６、８、１４および９、
ｃ）配列番号２、２２、５、６、８、２３および９、
ｄ）配列番号２、３、４、５、６、８、２３および９、または
ｅ）配列番号１、３、４、５、６、８、および９
から選択される配列を含む、上記［１９］に記載の核酸。
［２５］
ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象を治療する方法であって、
上記［１３］に記載の組成物を対象に投与する工程を含む方法。
［２６］
ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象における暗順応の比率を改善する方法であっ
て、
上記［１３］に記載の組成物を対象に投与する工程を含む方法。
［２７］
ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象の網膜においてＲＰＥ細胞およびミュラー細
胞内でＲＬＢＰ１コード配列を発現させる方法であって、
上記［６］または［１０］に記載のウイルスベクターと前記対象の網膜を接触させるス
テップ
を含む方法。
［２８］
ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象の治療において使用するための、上記［１３
］に記載の組成物。
［２９］
ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象における暗順応の比率の改善において使用す
るための、上記［１３］に記載の組成物。
［３０］
ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象の網膜におけるＲＰＥ細胞およびミュラー細
胞内でのＲＬＢＰ１コード配列の発現において使用するための、上記［６］または［１０
］に記載のウイルスベクター。

Claims (30)

1. レチンアルデヒド結合タンパク質１（ＲＬＢＰ１）コード配列を含むベクターゲノムを
   有するウイルスベクターであって、網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞およびミュラー細
   胞におけるＲＬＢＰ１コード配列の発現を誘導するように適合されたウイルスベクター。
2. 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２または８カプシドを含む、請求
   項１に記載のウイルスベクター。
3. 前記ベクターゲノムが５’から３’方向に、
   （ｉ）５’ＩＴＲ、
   （ｉｉ）ＲＬＢＰ１コード配列を含む組換えヌクレオチド配列、および
   （ｉｉｉ）３’ＩＴＲ
   を含む、請求項２に記載のウイルスベクター。
4. 組換えヌクレオチド配列が５’から３’方向に（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）ＲＬＢＰ
   １コード配列、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０ポリＡ配列を含む、請求項３に記載のウイルス
   ベクター。
5. 前記プロモーターのヌクレオチド配列が配列番号３および１０から選択される、請求項
   ４に記載のウイルスベクター。
6. ベクターゲノムが５’から３’方向に、
   ａ）配列番号２、１０、５、６、８および９、
   ｂ）配列番号２、１１、５、６、８、１４、９、
   ｃ）配列番号２、２２、５、６、８、２３および９、ならびに
   ｄ）配列番号２、３、４、５、６、８、２３および９
   からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項４に記載のウイルスベクター。
7. 前記ベクターゲノムが５’から３’方向に、
   （ｉ）５’ＩＴＲ、
   （ｉｉ）第１の組換えヌクレオチド配列、
   （ｉｉｉ）非分解性ＩＴＲ、
   （ｉｖ）第２の組換えヌクレオチド配列、および
   （ｖ）３’ＩＴＲ
   を含み、第１と第２の組換えヌクレオチド配列が自己相補的である、請求項２に記載の
   ウイルスベクター。
8. 第２の組換えヌクレオチド配列が５’から３’方向に（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）Ｒ
   ＬＢＰ１コード配列、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０ポリＡ配列を含む、請求項７に記載のウ
   イルスベクター。
9. 前記プロモーターのヌクレオチド配列が配列番号３を含む、請求項８に記載のウイルス
   ベクター。
10. ベクターゲノムが５’から３’方向に配列番号３６、６２、６３、６４、６５、６６、
    １、３、４、５、６、８、および９の核酸配列を含む、請求項８に記載のウイルスベクタ
    ー。
11. 網膜のＲＰＥ細胞およびミュラー細胞において異種遺伝子を発現させることが可能なベ
    クターゲノムを含むウイルスベクターであって、前記ベクターが、ａ）ＡＡＶ８またはＡ
    ＡＶ２カプシドと、ｂ）異種遺伝子と作動可能に連結したＲＬＢＰ１プロモーターを含む
    前記ベクターゲノムとを含み、前記ＲＬＢＰ１プロモーターが配列番号３および１０から
    選択される配列を有する、ウイルスベクター。
12. ベクターゲノムが自己相補的である、請求項１１に記載のウイルスベクター。
13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む組成物。
14. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む請求項１３に記載の組成物。
15. 網膜細胞において異種遺伝子を発現させる方法であって、
    ａ）ＡＡＶ２またはＡＡＶ８カプシドと、ｂ）異種遺伝子と作動可能に連結した配列番
    号３または配列番号１０のＲＬＢＰ１プロモーターを含むベクターゲノムとを含むウイル
    スベクターと前記網膜細胞を接触させる工程を含む、方法。
16. 網膜細胞がＲＰＥ細胞およびミュラー細胞である、請求項１５に記載の方法。
17. ベクターゲノムが自己相補的ゲノムである、請求項１６に記載の方法。
18. 異種遺伝子がＲＬＢＰ１である、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 遺伝子カセットを含む核酸であって、前記遺伝子カセットが５’から３’方向に、
    （ｉ）５’ＩＴＲまたは非分解性ＩＴＲ、
    （ｉｉ）ＲＬＢＰ１コード配列を含む組換えヌクレオチド配列、および
    （ｉｉｉ）３’ＩＴＲ
    を含む核酸。
20. プラスミドである請求項１９に記載の核酸。
21. （ｉ）前記５’ＩＴＲまたは前記非分解性ＩＴＲがそれぞれ配列番号２または１の核酸
    配列を有し、
    （ｉｉ）前記組換え核酸配列が、配列番号３の核酸配列を有する前記ＲＬＢＰ１コード
    配列と作動可能に連結した配列番号３、１０、１１、１２および２２から選択される核酸
    配列を有するプロモーターを含み、または
    （ｉｉ）前記３’ＩＴＲが配列番号９の核酸配列を有する、請求項１９に記載の核酸。
22. 遺伝子カセットが配列番号５１、５２、５３、５４および５５から選択される核酸配列
    を含む、請求項１９に記載の核酸。
23. 配列番号２６、２７、２８、２９、３０および５０から選択される核酸配列をさらに含
    む、請求項１９に記載の核酸。
24. 遺伝子カセットが５’から３’方向に、
    ａ）配列番号２、１０、５、６、８および９、
    ｂ）配列番号２、１１、５、６、８、１４および９、
    ｃ）配列番号２、２２、５、６、８、２３および９、
    ｄ）配列番号２、３、４、５、６、８、２３および９、または
    ｅ）配列番号１、３、４、５、６、８、および９
    から選択される配列を含む、請求項１９に記載の核酸。
25. ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象を治療する方法であって、
    請求項１３に記載の組成物を対象に投与する工程を含む方法。
26. ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象における暗順応の比率を改善する方法であっ
    て、
    請求項１３に記載の組成物を対象に投与する工程を含む方法。
27. ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象の網膜においてＲＰＥ細胞およびミュラー細
    胞内でＲＬＢＰ１コード配列を発現させる方法であって、
    請求項６または１０に記載のウイルスベクターと前記対象の網膜を接触させるステップ
    を含む方法。
28. ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象の治療において使用するための、請求項１３
    に記載の組成物。
29. ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象における暗順応の比率の改善において使用す
    るための、請求項１３に記載の組成物。
30. ＲＬＢＰ１関連網膜形成不全を有する対象の網膜におけるＲＰＥ細胞およびミュラー細
    胞内でのＲＬＢＰ１コード配列の発現において使用するための、請求項６または１０に記
    載のウイルスベクター。