KR20220148550A - Crif1을 유효성분으로 포함하는 루푸스 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Crif1을 유효성분으로 포함하는 루푸스 질환 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

Crif1을 유효성분으로 포함하는 루푸스 질환 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 B 세포에서 Crif1이 결핍되면 루푸스 질환의 발달이 초래되며, B 세포 내 Crif1의 결핍이 IgG, IgG2c 및 IgG3과 각각의 항체 형성을 증가시키고, 염증과 관련된 유전자의 발현을 증가시키며, 기능이상 미토콘드리아의 수를 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, B 세포에서 Crif1의 결핍은 염증 관련 B 세포 및 follicular helper T 세포의 활성을 증가시키고, 염증 관련 사이토카인인 IL-6, IL-17의 양을 증가시키는 것을 확인하였으며, Crif1을 과발현 시키면 루푸스 질환이 개선되고, anti-dsDNA IgG 항체의 양이 감소하는 것을 확인하였다.

Description

CRIF1을 유효성분으로 포함하는 루푸스 질환 치료용 조성물{Composition for treating lupus disease containing CRIF1 as an active ingredient}
본 발명은, CRIF1을 유효성분으로 포함하는 루푸스 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환으로서, 특히 염증성 장애는 전 세계에서 가장 중요한 건강 문제 중 하나이다. 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대해 신체 조직의 국소화된 보호 반응이다. 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품; 알레르기 및 자가면역반응과 같은 면역적 반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태일 수 있다.
염증은 통증, 적화현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실을 그 특징으로 한다. 이들 증상은 면역계의 세포사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 세포의 반응으로 인해 결과적으로 여러 그룹의 염증 매개자의 상호작용 네트워크가 생성된다: 단백질(예를 들면, 사이토카인, 효소(예를 들면 프로테아제, 퍼옥시다제), 주요 염기성 단백질, 접착 분자(ICAM, VCAM), 지질 매개자(예를 들면, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트라이엔, 혈소판 활성화 인자(PAF)), 반응성 산소 종(예를 들면, 하이드로퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드 음이온 O2-, 산화질소(NO) 등). 그러나 염증의 이들 매개자중 대부분은 또한 정상적인 세포 활성의 조절자이다. 따라서 염증 반응의 결핍으로 인해 숙주가 제어되지 않으면서 손상(즉, 감염)되고, 따라서 만성 염증으로 인해 부분적으로는 상기 언급된 매개자 중 여럿이 과다 생성됨으로써 매개되는 염증성 질환이 야기된다. 또한, 면역질환 중 하나인 자가면역 질환은 면역 체계가 그 자신의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이러한 반응들은 T 림프구에 의한 자가항원(auto-antigen)의 인식에 기인하며, 이로 인하여 체액상(자가항원 생성) 및 세포상 (림프구 및 대식세포 세포독성 활성 증가) 면역 반응이 유발된다.
자기 자신의 항원에 대한 비정상적인 면역반응으로 인한 자기세포 및 조직의 파괴에 의하여 유발되는 자가면역질환과 이식된 장기에 대한 면역반응에 의한 장기 이식거부반응의 경우에는 면역세포의 활성화 및 기능을 억제하는 면역억제제를 사용하여야 한다. 면역반응에 대한 분자적 그리고 세포적 기초연구를 기반으로 하여3-4개의 면역억제제가 상당히 오래 전에 개발이 되어 연간 30조에 해당하는 면역억제제 시장을 차지하고 있다. 현재에도 많은 다국적 제약사들이 새로운 면역억제제의 개발을 위하여 많은 노력을 하고 있으나, 몇 몇 개의 mAb가 임상 단계에 있는 것을 제외하고는 신약개발에 큰 성과를 거두지 못하고 있다. 효능, 안전성과 질환 특이성을 고려하여 신약을 개발하는 다른 질환의 신약개발과는 달리, 외부항원에 대한 면역반응을 유지하면서 특정한 면역반응을 억제해야 하는 또 다른 점을 고려해야 하는 면역억제제의 개발은 새로운 신약의 등장을 어렵게 하고 있다.
루푸스는 결합 조직을 공격하는 항체와 관련된 자가면역질환으로, 순환성 면역 복합체인 항핵 항체의 생성과 보체 시스템의 활성화와 연관되어 있다. 이 질환은 전신성으로 모든 기관 시스템에서 발생할 수 있고, 중증의 조직 손상을 유발할 수 있다. 루푸스 환자는 항-DNA, 항-Ro, 및 항-혈소판 특이성을 지닌 자기 항체를 생성시키기도 하고, 사구체 신염, 관절염, 장막염, 신생아의 완전 심장차단 또는 혈액학적 이상과 같은 질환의 발생을 야기할 수 있다. 루푸스를 치료하지 않으면 피부와 관절 공격에서부터 내부 장기, 예컨대 폐, 심장 및 신장 공격으로 진행되기 때문에 치명적일 수 있으며, 그 중에서도 신장 질환이 가장 우려된다. 소변중의 단백뇨 양으로 측정된 신장 손상이 루푸스의 병원성과 연관된 급성 손상 부위 중 하나이고, 루푸스 질환 사망률과 발병률의 50％ 이상을 차지한다. 현재로서는 루푸스 환자에 대한 확실한 치유법이 없다. 실제적인 관점에서 보면, 의사들은 일반적으로 수많은 면역억제제, 예컨대 고용량의 코르티코스테로이드, 프레드니손, 또는 아자티오프린 또는 시클로포스파미드를 사용하고 있는데, 이들 약물 상당수는 치료받고 있는 환자에게 잠재적으로 해로운 부작용을 나타내는 문제점이 있다.
한편, CRIF1(CR6 Interacting Factor 1)은 미토콘드리아에 존재하며 폴리펩티드 탈출구(polypeptide exit tunnel) 근처에 위치된, 큰 미토리보솜(mitoribosomal) 서브유닛과 관련되어있다. CRIF1의 결핍은 mtDNA-암호화된 신생 OXPHOS 폴리펩티드의 비정상적인 합성 및 미토콘드리아 내막으로의 결함이 있는 삽입과 같은, 다양한 결함을 초래하는 것으로 알려져 있으며(Ryu MJ, et al. 2013 PLoSGenet 9: e1003356), CRIF1의 결핍은 OXPHOS 복합체 I, III 및 IV에서 결합(assembly)의 실패뿐만 아니라 상당히 낮은 수준의 CCCP(carbonyl cyanide m-chloro phenyl hydrazine)-자극된 미토콘드리아의 산소소비량 및 높은 수준의 미토콘드리아 ROS로 인한 미토콘드리아 기능의 저하를 초래하는 것으로 알려져 있다(Kim SJ, et al. 2012 CellMetab 16: 274-283).
이렇듯 CRIF1은 미토콘드리아의 기능에 영향을 미치는 것이 알려져 있을 뿐, 루푸스 질환과의 관련성에 대해서는 거의 연구된 바가 없다.
본 발명의 목적은, Crif1 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Crif1 단백질을 유효성분으로 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, Crif1(CR6 Interacting Factor 1) 유전자를 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, Crif1(CR6 Interacting Factor 1)을 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 재조합 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명은, Crif1 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Crif1 단백질을 유효성분으로 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, Crif1(CR6 Interacting Factor 1) 유전자를 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은, Crif1(CR6 Interacting Factor 1)을 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 재조합 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 Crif1이 결핍되면 루프스 질환의 발달이 초래되며, Crif1의 결핍이 IgG, IgG2c 및 IgG3과 각각의 항체 형성을 증가시키고, 염증과 관련된 유전자의 발현을 증가시키며, 기능이상 미토콘드리아의 수를 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, Crif1의 결핍은 염증 관련 B 세포 및 follicular helper T 세포의 활성을 증가시키고, 염증 관련 사이토카인인 IL-6, IL-17의 발현을 증가시키는 것을 확인하였으며, Crif1을 과발현 시키면 루프스 질환이 개선되고, anti-dsDNA IgG 항체의 양이 감소하는 것을 확인하여 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 B세포 특이적 Crif1 결핍(Crif1ΔCD19) 마우스에서, 루푸스 질환의 발달을 관련 인자인 IgG, IgG2c 및 IgG3와 각각의 항체량으로 확인한 도이다(A: IgG, IgG2c 및 IgG3 양 확인, B: IgG, IgG2c 및 IgG3 각각의 anti-dsDNA 항체량 확인).
도 2는 본 발명의 B세포 특이적 Crif1 결핍(Crif1ΔCD19) 마우스에서 야생형 마우스와 차별 발현되는 유전자를 확인한 도이다.
A: Volcano plot 분석 결과
B: Heatmap 분석
C: Bubble plots 분석 결과
D: KEGG pathway 관련 유전자 발현 차이 확인
E: Gene set enrichment analysis
도 3은 본 발명의 B세포 특이적 Crif1 결핍(Crif1ΔCD19) 마우스에서 미토콘드리아 기능이상을 확인한 도이다.
A: 기능 이상 미토콘드리아 계수 확인
B: 미토콘드리아 내의 ROS 수준 확인(mitoSOX 계수)
C: 미토콘드리아 내의 ROS 수준 확인(mitoSOX 정량화)
D: OCR(Oxygen Consumption Rate) 변화 확인
도 4는 본 발명의 B세포 특이적 Crif1 결핍(Crif1ΔCD19) 마우스에서 염증 관련 B 세포의 변화를 유세포분석으로 확인한 도이다.
A: 염증 관련 B 세포 변화 확인(B220+GL7+Fas+ cells 및 B220-CD138+ cells)
B: 염증 관련 B 세포 변화 확인(B220+IL-17+ cells 및 CD19+CD5+CD1d+IL-10+)
C: B 세포 내의 STAT3 인산화 확인
D: B 세포 내의 pNF-kB p65의 발현 확인
도 5는 본 발명의 B세포 특이적 Crif1 결핍(Crif1ΔCD19) 마우스에서 B 세포의 염증성 사이토카인 생성량을 확인한 도이다(A: B220+IL-17+ cells 및 CD19+CD5+CD1d+IL-10+ 세포의 발현 확인, B: IL-6 및 IL-10의 생성량 확인).
도 6은 본 발명의 B세포 특이적 Crif1 결핍(Crif1ΔCD19)마우스에서 여포형성 도움 T 세포(follicular helper T cell)의 활성을 확인한 도이다.
A: CD4+CXCR5+PD-1+세포수 확인
B: CD4+CXCR5+IFN-gamma+ 또는 CD4+CXCR5+IL-17+인 follicular helper T 세포의 수 확인
C: CD4+CXCR5+ IL-21+인 세포의 수와 absolute No의 수 확인
D: follicular helper T 세포 관련 인자인 Slamf5, Ifng, Cxcr3 mRNA 발현 확인
도 7은 본 발명의 Crif1 과발현 벡터의 루푸스 질환 관련 인자인 anti-dsDNA IgG 항체의 양 억제를 확인한 도이다.
도 8은 건강한 성인과, 루푸스 환자에서 분리한 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서의 Crif1 및 IL-21의 발현을 비교한 도이다(A: Crif1 발현 비교, B: IL-21 발현 비교, C: Crif1 및 IL-21의 상관관계 분석).
본 발명은, Crif1 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Crif1 단백질을 유효성분으로 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 “Crif1(CR6 Interacting Factor 1)”은 암화 과정에서 발현이 증가 하는 것으로 밝혀진 단백질로서 CR6(Gadd45gamma) 단백질과 결합하는 단백질이다. CRIF1의 mRNA는 정상 인체로부터 얻은 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서는 그 발현이 관측되지 않는데 비해, 아데노바이러스에 의해 암화된 태아 신장 세포주, 전립선암 세포주, 자궁경부암 세포주, 섬유육종 세포주, 융모암세포주, 인간의 혈액암 세포주, HL-60, K-562, Jurkat, MOLT-4 등에서 그 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 그러나 아직까지 CRIF1에 대한 연구는 많이 미비한 실정이며, 특히 루푸스 질환의 치료제 용도에 대해서는 전혀 연구된 바가 없다.
또한 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 CRIF1 단백질은 상기 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 CRIF1 단백질에는 상기 단백질과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다. 상기“기능적 동등물”에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 CRIF1 단백질과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다. 상기“기능적 유도체”는 상기 CRIF1 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 CRIF1 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.
바람직하게 상기 Crif1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 말한다.
또한 상기 Crif1 유전자는 Crif1 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열을 갖는다.
여기서 상기 유전자, 즉 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 감염(infection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.
플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법이다(Nabel, E.G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허 공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
상기 CRIF1을 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “치료”는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 CRIF1을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 루푸스 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 CRIF1의 약학적으로 유효한 양은 각각 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한양은 자가면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에 게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 자가면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, IgG, IgG2c 및 IgG3로 이루어진 군에서 선택된 인자의 양을 감소시키는 것일 수 있으며, 상기 인자들과 결합하는 항체인 anti-dsDNA IgG, anti-dsDNA IgG2c 및 anti-dsDNA IgG3로 이루어진 군에서 선택된 항체의 양을 억제하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 기능 이상 미토콘드리아의 수를 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 염증 관련 B 세포의 수를 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, STAT3의 인산화를 감소시키고, 염증 관련 신호경로인 NF-κB의 신호전달을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 염증성 사이토카인인 IL-6 또는 IL-17의 양을 감소시키고, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생성을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 여포형성 도움 T 세포(follicular helper T cell)의 활성을 억제시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, Crif1(CR6 Interacting Factor 1) 유전자를 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은, Crif1(CR6 Interacting Factor 1)을 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 재조합 펩타이드를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> Crif1 결핍 및 루푸스 질환 동물 모델
<1-1> B 세포 특이적 Crif1 결핍 동물모델에서의 루푸스 질환 발달 확인
본 발명의 루푸스 질환에서 B 세포 내 Crif1의 역할을 확인하기 위하여, CD19-cre 마우스와 Crif1 loxp 마우스(서울대 공영윤 교수 제공)의 교배를 통해 B 세포에서 선택적으로 Crif1이 결핍된 마우스 동물모델(Crif1ΔCD19 마우스)을 구축하였다. 대조군으로는 야생형 마우스를 이용하였다. Crif1ΔCD19 마우스와 야생형 마우스(WT) 각각 7주령과 20주령 시점에 안와채혈을 통해 혈청을 확보하여 각 혈청에서 IgG, IgG2c 및 IgG3의 양과 anti-dsDNA IgG, IgG2c 및 IgG3 각각의 항체의 양을 ELISA 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, Crif1ΔCD19 마우스에서는 IgG, IgG2c 및 IgG3의 양이 증가하였으며(도 1A), 각각에 대한 항체 또한 유의적으로 증가하였다(도 1B).
<1-2> B 세포 특이적 Crif1 결핍 동물모델에서의 염증 반응 확인
상기 실시예 1-1에서 16주령의 WT 및 B 세포 선택적으로 Crif1이 결핍된 Crif1ΔCD19 마우스를 인도적으로 희생하여, 비장을 적출하였다. 적출된 비장에서 B 세포를 분리하고, RNA-sequencing을 시행하여, 야생형 마우스와 비교하여, Crif1ΔCD19 마우스에서 차별 발현을 보이는 유전자를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스와 비교하여 Crif1ΔCD19 마우스의 B 세포에서 특이적으로 발현이 증가, 감소하는 유전자를 확인하였으며(도 2A 및 도 2B) gene ontology term 분석에서 면역 및 사이토카인 등의 활성과 관련된 수용체의 발현이 증가되는 것을 관찰하였다(도 2C). KEGG 경로 분석에서 염증 관련 신호 인자들의 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 2D 및 도 2E).
<1-3> B 세포 특이적 Crif1 결핍 동물모델에서의 미토콘드리아 기능 이상 확인
상기 실시예 1-1에서 18주령의 WT 및 B 세포 선택적으로 Crif1이 결핍된 Crif1ΔCD19 마우스를 인도적으로 희생하여, 비장을 적출하였다. 적출된 비장으로부터 B 세포를 수득하고, B 세포 내의 미토콘드리아를 분석하였다.
우선적으로, Crif1ΔCD19 마우스의 B 세포와 야생형 마우스의 B 세포에 MitoTracker Green과 MitoTracker Red를 형광 염색하여 기능이상 미토콘드리아의 정도를 유세포 분석하였다. 그 결과, WT과 비교하여 Crif1ΔCD19 마우스에서 기능이상 미토콘드리아(MitoTracker Green+high, MitoTrackerRed+low)의 수가 증가한 것을 확인하였다(도 3A).
또한, 비장으로부터 수득된 B 세포의 미토콘드리아에서 활성산소(ROS)를 분석한 결과, Crif1ΔCD19 마우스 B 세포의 미토콘드리아에서 야생형 마우스와 비교하여 활성산소의 수준이 증가한 것을 확인하였다(도 3B 및 도 3C)
추가적으로, 야생형 마우스와 Crif1ΔCD19 마우스 B 세포의 미토콘드리아의 호흡을 측정하기 위하여, oligomycin (10 μM), FCCP (3 μM), rotenone plus antimycin A (10 μM) 처리 후의 OCR(Oxygen Consumption Rate) 변화를 실시간 세포 분석기(extracellular flux analysis)로 조사하였다. 그 결과, 야생형 마우스와 비교하여 Crif1ΔCD19 마우스의 B 세포에서 OCR의 수준이 낮은 것을 확인하였다(도 3D).
<1-4> B 세포 특이적 Crif1 결핍 동물모델에서의 염증 관련 B 세포 확인
상기 실시예 1-1에서 B 세포 특이적 Crif1의 결핍으로 인한 염증과 관련된 B 세포의 변화를 확인하기 위하여, 각각 7주령, 20 주령의 야생형 마우스 및 Crif1ΔCD19 마우스를 인도적으로 희생하고, 비장을 적출하여, 비장에서 GC B cells (B220+GL7+Fas+ cells), plasma cells (B220-CD138+), B220+IL-17+, B10 cells (CD19+CD5+CD1d+IL-10+) 세포의 빈도(frequency)를 유세포 분석기를 이용하여 조사하였다.
그 결과, B 세포에서 Crif1이 결핍된 마우스에서는 염증과 관련된, GC B cells, plasma cells 및 B220+IL-17+이 야생형 마우스와 비교하여 증가하였으며, 항염증과 관련된 B10 cells은 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(도 4A 및 도 4B).
또한, 상기 비장에서 수득된 B 세포 내의 STAT3 인산화 정도를 유세포 분석기를 이용하여 조사한 결과, B 세포에서 Crif1이 결핍된 마우스에서는 B 세포에서 STAT3의 인산화가 증가한 것을 확인하였다(도 4C).
추가적으로, 상기 비장에서 수득된 B 세포에서 염증과 관련된 pNF-kB p65의 발현을 western blot으로 조사하였고, 그 결과, B 세포에서 Crif1이 결핍된 마우스에서는 pNF-kB p65의 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 4D).
<1-5> B 세포 특이적 Crif1 결핍 동물모델에서의 염증 관련 사이토카인의 발현 확인
상기 실시예 1-1에서 B 세포 특이적 Crif1의 결핍으로 인한 염증과 관련된 사이토카인의 변화를 확인하기 위하여, 20 주령의 야생형 마우스 및 Crif1ΔCD19 마우스의 비장으로부터 B 세포를 분리하여, IgM antibody (10 μg/ml), IL-4 (20 ng/ml), soluble CD4 0L (1 μg/ml)을 처리하여 자극하였으며, 자극 후 3일간 배양하였다. 배양 후 B220+IL-17+, B10 cells (CD19+CD5+CD1d+IL-10+) 세포의 빈도(frequency)를 유세포 분석기를 이용하여 조사하였고 이들 세포 배양 상층액에서 염증과 관련된 사이토카인인 IL-6의 생성 및 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생성을 ELISA로 확인하였다.
그 결과, 야생형 마우스와 비교하여, Crif1이 결핍된 마우스의 B 세포에서는 자극으로 인해 생성되는 B220+IL-17+세포의 빈도가 증가된 반면 B10 cells (CD19+CD5+CD1d+IL-10+) 세포의 빈도가 감소하는 것을 관찰하였다(도 5A). 야생형 마우스와 비교하여, Crif1이 결핍된 마우스의 B 세포 배양 상층액에서 IL-6의 양이 증가하였으나, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생성은 감소한 것을 확인하였다(도 5B).
<1-6> B 세포 특이적 Crif1 결핍 동물모델에서의 follicular helper T cell의 활성 증가 확인
B 세포에서 Crif1이 결핍된 마우스에서, 루푸스 질환에 중요한 인자로 알려진 여포형성 도움 T 세포(follicular helper T cell)의 활성이 증가하는지 확인하고자, 야생형 마우스 및 Crif1ΔCD19 마우스의 비장에서, follicular helper T cell 세포의 수를 유세포 분석하였다. 구체적으로는 마우스의 비장에서, CD4+ 세포 중 CXCR5+PD-1+인 세포의 빈도, CD4+ 세포 중 CXCR5+IFN-gamma+ 또는 CXCR5+IL-17+ 인 follicular helper T 세포의 빈도, 및 CD4+ 세포 중 CXCR5+IL-21+인 세포의 빈도 및 absolute No를 유세포 분석하였다. 또한, 야생형 마우스 및 Crif1ΔCD19 마우스의 비장에서 분리한 CD4+ 세포에서 follicular helper T cell와 관련된 인자인 Slamf5, Ifng, Cxcr3 mRNA 발현을 real-time PCR로 확인하였다.
그 결과, Crif1ΔCD19 마우스에서는 야생형 마우스와 비교하여, CD4+ 세포 중 CXCR5+PD-1+인 세포의 빈도(도 6A), CD4+ 세포 중 CXCR5+IFN-gamma+ 또는 CXCR5+IL-17+인 follicular helper T 세포의 빈도(도 6B)가 유의적으로 증가하였으며, 특히 CD4+세포 중 CXCR5+IL-21+인 세포의 빈도 및 absolute No가 증가한 것을 확인하였다(도 6C). 또한, 야생형 마우스와 비교하여 Crif1ΔCD19 마우스의 비장에서 분리한 CD4+ 세포에서 follicular helper T cell과 관련된 인자인 Slamf5, Ifng, Cxcr3의 mRNA 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 6D).
<실시예 2> Crif1 과발현에 따른 루푸스 질환 제어 효과 확인
본 발명자들은 Crif1이 루푸스 질환의 치료 효과가 있는지 확인하기 위해, Crif1을 과발현 시키는 벡터인 p3XFLAG-CMV-10-CRIF1 벡터를 제작하였다. 제작된 Crif1 과발현 벡터 및 Mock 벡터 100 μg을 루푸스 동물모델인 20 주령 Roquin san/san 마우스에 7일마다 총 7주간 정맥 주사하였다. 벡터를 주입한 후 1, 3, 7주차에 마우스로부터 혈청을 채취하고, 채취한 혈청에서 anti-dsDNA IgG 항체의 양을 측정하였다.
그 결과, Crif1 과발현 벡터가 주입된 마우스에서는 Mock 벡터가 주입된 마우스와 비교하여, anti-dsDNA IgG 항체의 양이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(도 7).
<실시예 3> 루푸스 환자에서의 Crif1 발현 조사
본 발명자들은 Crif1이 실제 루푸스 환자에서의 발현과 관련이 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 루푸스 환자의 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 이용한 공개된 microarray 결과(GSE61635)를 재분석하여 Crif1 및 IL-21의 발현을 확인하였다.
그 결과, 루푸스 환자에서 분리된 PBMC에서는 건강한 성인과 비교하여 Crif1의 발현이 감소한 것을 확인하였으며, 염증성 사이토카인인 IL-21의 발현은 증가한 것을 확인하였다. 또한, Crif1의 발현과 IL-21의 발현이 음의 상관관계(negative corrrelation)가 있는 것을 확인하였다(도 8).
따라서, 본 발명의 B 세포에서 Crif1이 결핍되면 루푸스 질환의 발달이 초래되며, B 세포에서 Crif1의 결핍이 IgG, IgG2c 및 IgG3과 각각의 항체 형성을 증가시키고, 염증과 관련된 유전자의 발현을 증가시키며, 기능이상 미토콘드리아의 수를 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, B 세포에서 Crif1의 결핍은 염증 관련 B 세포 및 follicular helper T 세포의 활성을 증가시키고, 염증 관련 사이토카인인 IL-6, IL-17의 양을 증가시키는 것을 확인하였으며, Crif1을 과발현 시키면 루푸스 질환이 개선되고, anti-dsDNA IgG 항체의 양이 감소하는 것을 확인하였다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for treating lupus disease containing CRIF1 as an active ingredient <130> PN2103-102 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crif1 gene sequence <400> 1 atggcggcgc tcgcaatgcg gagtggctat ctcctgcggc tctctgtggc tctgggtccc 60 aggtcccgca gctaccgtgc gcccccgccc ccgcgccgcc gtcccgggcc ccactcgcca 120 gacccggaga acctgctgac cccgcgatgg cagctaacgc cccgctatgt ggccaagcag 180 ttcggacgac atggcgccat ctccggggtg cccccggcct ccctgtggcc caccccagag 240 cagctgcgcg agttggaggc cgaggagcaa gaatggtacc cgagcttagc gaccatgcaa 300 gagtcgctgc gcttgcagca gcaggccttg gaggcaaggc gccaagccag ggagcagcgt 360 atcgcagagt gcatggccaa gatgccacaa atgattgaaa actggcgaaa gcagaagcga 420 gaacgctggg agaaaattca ggctgacaag gagcggaggg cccggttaca ggctgaggcc 480 caggaacgcc tgggctacca cgtggaccca aggagtgctc gcttccagga actattacag 540 gacctagaca agcagcaacg aaagcgccta aaggaagaaa gacaacgaca gaagaaggag 600 gcacgaattg ctgctatggc ctctgctgaa gcccaggact cagcagtgtc tggtgaaccc 660 agctcctga 669 <210> 2 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Crif1 amino acid sequence <400> 2 Met Ala Ala Leu Ala Met Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Arg Leu Ser Val 1 5 10 15 Ala Leu Gly Pro Arg Ser Arg Ser Tyr Arg Ala Pro Pro Pro Pro Arg 20 25 30 Arg Arg Pro Gly Pro His Ser Pro Asp Pro Glu Asn Leu Leu Thr Pro 35 40 45 Arg Trp Gln Leu Thr Pro Arg Tyr Val Ala Lys Gln Phe Gly Arg His 50 55 60 Gly Ala Ile Ser Gly Val Pro Pro Ala Ser Leu Trp Pro Thr Pro Glu 65 70 75 80 Gln Leu Arg Glu Leu Glu Ala Glu Glu Gln Glu Trp Tyr Pro Ser Leu 85 90 95 Ala Thr Met Gln Glu Ser Leu Arg Leu Gln Gln Gln Ala Leu Glu Ala 100 105 110 Arg Arg Gln Ala Arg Glu Gln Arg Ile Ala Glu Cys Met Ala Lys Met 115 120 125 Pro Gln Met Ile Glu Asn Trp Arg Lys Gln Lys Arg Glu Arg Trp Glu 130 135 140 Lys Ile Gln Ala Asp Lys Glu Arg Arg Ala Arg Leu Gln Ala Glu Ala 145 150 155 160 Gln Glu Arg Leu Gly Tyr His Val Asp Pro Arg Ser Ala Arg Phe Gln 165 170 175 Glu Leu Leu Gln Asp Leu Asp Lys Gln Gln Arg Lys Arg Leu Lys Glu 180 185 190 Glu Arg Gln Arg Gln Lys Lys Glu Ala Arg Ile Ala Ala Met Ala Ser 195 200 205 Ala Glu Ala Gln Asp Ser Ala Val Ser Gly Glu Pro Ser Ser 210 215 220

Claims (16)

  1. Crif1(CR6 Interacting Factor 1) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Crif1 단백질을 유효성분으로 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 Crif1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 Crif1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은, IgG, IgG2c 및 IgG3로 이루어진 군에서 선택된 인자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 anti-dsDNA IgG, anti-dsDNA IgG2c 및 anti-dsDNA IgG3로 이루어진 군에서 선택된 항체의 양을 억제하는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 기능 이상 미토콘드리아의 수를 감소시키는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 염증 관련 B 세포의 수를 감소시키는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은, STAT3의 인산화를 감소시키는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은, 염증 관련 신호경로인 NF-κB의 신호전달을 억제하는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은, 염증성 사이토카인인 IL-6 또는 IL-17의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 항염증성 사이토카인인 IL-10의 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 B 세포 매개 여포형성 도움 T 세포(follicular helper T cell)의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. Crif1(CR6 Interacting Factor 1) 유전자를 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 재조합 벡터.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 Crif1 유전자는 서열번호 1의 염기서을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  15. Crif1(CR6 Interacting Factor 1)을 포함하는 루푸스 질환의 예방 또는 치료용 재조합 펩타이드.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 Crif1은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 펩타이드.
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