CN1752207A - 绵羊冷冻精液稀释液及生产高品质冻精的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种绵羊冷冻精液稀释液及生产高品质冻精的方法。稀释液是由基础液加2.5673g蔗糖和0.75g乳糖，配制获得稀释液II。在稀释液II中，分别加12mlV_B6、12mlV_E、0.3g甘氨酸、140g山梨醇、2ml板蓝根、12mlV_B6+12mlV_E+2ml板蓝根获得稀释液III、IV、VI、VII、VIII、IX。配制步骤是：将①原精液分别与稀释液按1∶3稀释→②二次稀释法：38℃下用不含甘油的稀释液稀释原精液，200ml体积水浴2.5h进行水浴平衡至4℃，4℃下再在已稀释的精液中加入配方规定的甘油量→③－110℃～－120℃下滴冻→④38℃水浴中每2粒冻精中加50μ IV_B12解冻。大量的试验表明，本发明与国内目前普遍使用的配方相比，在冻后活率、生存指数、顶体完整率、GOT释放量、LDH释放量和ALP释放量等重要指标方面均有显著优势，其对于确保精子的活力，提高生存指数，提高情期配种产羔母羊率产生很好的效果。

Description

绵羊冷冻精液稀释液及生产高品质冻精的方法

技术领域

本发明涉及一种新研制的绵羊冷冻精液稀释液及生产高品质冻精的方法，属于动物繁殖领域。

背景技术

建国50多年来，我国养羊业的发展取得了长足的进步，但是，若与养羊业发达的国家相比，在品种良种化，养羊业主要产品(羊毛、羊肉等)的产量和品质方面还有很大的距离，要改变这种状况，关键的问题还是迅速提高良种化程度和改善饲养管理条件，特别是需要有大批的、不同生产方向的优良种公羊。利用人工授精技术可以充分发挥优良种公羊的作用，但是，用鲜精输精，受到很多因素的制约，亦不能充分发挥每只种羊的潜力。而将其鲜精制成冻精，则不受时间、不受地域和不受种公羊生命的限制。若能在国内普遍推广用冻精配种，将会迅速改造我国低产养羊业的面貌，保存羊种遗传资源，增加广大农牧民的收入，节约购买和饲养大批优良种公羊所需的经费，给广大的农村牧区，广大农牧民带来巨大的经济效益。但是，绵羊冻精品质和受胎率低的问题，至今没有很好解决，属于世界性难题，一旦获得突破，则将对我国、对世界养羊业的发展起着重大的推动作用，作出重大的贡献，产生很大的经济和社会效益。

绵羊精液的超低温(-196℃)冷冻保存及其利用技术，始于上世纪五十年代。1950年英国的Smith和Polge，首次研究绵羊精液冷冻保存技术，配种受胎产羔母羊率5％，开创了冷冻精液的应用，至此绵羊冻精及其输精技术的研究工作从未间断。在研究过程中，由于羊精子，特别是绵羊精子的特异性及其在冷冻和解冻过程中，很多问题和影响因素尚未研究清楚，故至今使用冻精配种的情期受胎母羊率仍处在30-50％的水平，而且还很不稳定，因此未能在生产实践中大面积推广应用。目前，国外着重研究在超低温情况下，绵羊精子在超微结构、生理生化等方面的变化、活性物质损失、以及在生物学上和功能上的损伤、研究理想稀释液配方及输精方法等，以期获得突破。

我国绵羊冷冻精液保存技术的研究始于1974年。三十多年来，在精子的冻前处理、不同配方稀释液试验、冷冻和解冻程序、输精技术和方法、精子形态和超微结构、生理生化等变化进行了程度不同的研究。中国农业科学院研制的“葡3-3高渗稀释液”、新疆农垦科学院《绵羊冻精技术科研协作组》研制的“9-2脱脂牛奶复合糖稀释液”(颗粒精液配方)、青海畜牧科学院研制的“8012弱酸抑制稀释液”、全国绵羊精液冷冻技术科研协作组北京试验小组，在“葡3-3稀释液”的基础上研制的“葡3-3+硒稀释液”(冷冻细管配方)，在生产实践中、在小范围内使绵羊冻精情期配种受胎产羔母羊率达到40-50％，但还是很不稳定，再加上其它种种原因，研究工作未能持续深入下去，存在的问题也没有获得有效的解决，因而在生产实践中至今也未能在大面积范围内推广应用。

发明内容

鉴于上述，本发明的目的旨在为绵羊优质冻精生产及成功应用提供新的“绵羊精液冷冻稀释液配方”，它是在对前人研制的数百个绵羊精液冷冻稀释液配方进行认真研究的基础上，根据冷冻生物学原理和绵羊精子特性，以冷冻解冻后的精子活率、生存指数、顶体完整率、和谷氨酸-草酸乙酸转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)释放量等重要客观指标为依据，研制出新的绵羊精液冷冻稀释液6个配方；

本发明的另一目的提供“绵羊精液冷冻和解冻的优化方法”，通过本方法，保证绵羊精液经冷冻、解冻后精子的活率和情期配种受胎产羔母羊率获得显著的提高。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种绵羊冷冻精液稀释液，是由基础液《三基(三羟甲基胺基甲烷)》-3.0285g、柠檬酸-1.6593g、卵黄-15％(v/v)、甘油4.0％(v/v)、青毒素和链毒素各为10万单位)加2.5673g蔗糖和0.75g乳糖，配制获得稀释液II。

由上述稀释液II加12mlV_B6配制获得稀释液III，

由稀释液II加12mlV_E，配制获得稀释液IV，。

由稀释液II加0.3g甘氨酸，配制获得稀释液VI。

由稀释液II加140mg山梨醇，配制获得稀释液VII。

由稀释液II加2ml板蓝根，配制获得稀释液VIII。

由稀释液II加12mlV_B6、12mlV_E和2ml板蓝根，配制获得稀释液IX。

绵羊冷冻精液生产的冷冻解冻方法，其步骤是：

(1)、在38℃下，用不同配方稀释液按1∶3比例将绵羊原精液(密度在20亿个/ml以上、活率在0.7以上、畸形率在15.0％以下)等温稀释于试管中，并将其放入水温为38℃、体积为200ml的水浴烧杯中，然后将其放入普通冰箱冷藏室中进行水浴平衡至4℃(约需2.5h)，4℃下再在已稀释的精液中加入配方规定的甘油量，待用；

(2)、将铜纱网或氟板置于液氮面上约1.5cm处，当铜纱网或氟板温度达到-110℃～-120℃时，用滴管进行颗粒冻精滴冻，每个颗粒体积为0.1～0.2ml，收集冻精颗粒、装袋、标记，并将其浸入液氮中保存贮藏；

(3)解冻方法是在壁薄口径大的解冻管内(38℃水浴中)加入50μl医用VB₁₂(加入量以能润湿管壁为原则)，迅速放入2粒冻精后，立即将其放入45～55℃的水浴中轻轻地摇动，当冻精颗粒基本溶解后，即转入37℃的恒温水浴中，待用。

本发明选用三基、即三羟甲基胺基甲烷(Tris)、柠朦酸、卵黄、甘油、青毒素和链毒素以及蔗糖、乳糖、维生素、甘氨酸、山梨醇、板蓝根进行组合，使得各物料的功效产生协同效应，从而能够有效地保护绵羊精子在冷冻-解冻过程中免受超低温的打击，确保精子的活力，提高生存指数，提高情期配种产羔母羊率。

本发明的优点和产生的有益效果是：

1、绵羊冷冻精液品质的高低，除原精液品质外，关键技术是冷冻稀释液配方和冷冻、解冻程序。本发明对冷冻、解冻程序和方法优化的确立，对提高冻精品质起着重要作用，在研制的6个稀释液配方中，稀释液III、IV、VI、VII、VIII、IX配方与国内目前普遍使用的“葡3-3”、“9-2”、“8012”和“葡3-3+硒”配方相比，在冻后活率、生存指数、顶体完整率、GOT释放量、LDH释放量和ALP释放量等重要指标方面均有显著优势，居国内领先地位；见表1。

表1              优化稀释液及其组成                                             单位：％U/L

稀释液类型	配方*	优化因子	优化指标
									活率	生存指数	顶体完整率	GOT释放	LDH释放	ALP释放
			稀释液II	2.5673g蔗糖-0.75g乳糖	乳糖	0.45	4.31	45.26							329.57	1462.48	547.35
稀释液III	II+12mlVB6	VB6							0.51	5.85	52.16	246.86	940.51	418.56
			稀释液IV	II+12mlVE	VE	0.50	5.84	50.84							237.67	988.49	482.53
稀释液VI	II+0.3g甘氨酸	甘氨酸							0.49	5.92	49.36	290.59	1028.31	495.36
			稀释液VII	II+140mg山梨醇	山梨醇	0.48	5.72	49.36							258.47	1294.38	440.56
稀释液VIII	II+2ml板蓝根	板蓝根							0.48	6.50	49.83	279.61	1128.37	501.38
			稀释液IX	II+VB6VE各12ml板蓝根2ml	上述所有因子	0.52	6.83	54.59							210.37	932.16	403.47

2、本发明通过对鲜精和冷冻-解冻精子质膜顶体超微结构变化的对比观察揭示，冷冻降低绵羊精子受精力的原因，主要是冷冻损伤了精子的顶体质膜所致。根据绵羊精子头部形态的超微结构特征，可将其划分为5类：质膜顶体无可见变化、质膜膨大顶体无可见变化、质膜丢失顶体膨大、外膜皱褶核质不均和外膜破裂核质外溢。前两类是具有受精能力的精子，后三类是丧失受精能力的精子。本发明研制的稀释液配方IX、III、IV和VIII具有受精能力的精子分别占52.47％、47.05％、45.26％和44.79％，从而为研制的稀释液配方的科学性、可信度提供了充分的依据；

3、在研制期间(1997-2002年)，先后制作萨福克、夏洛来、无角陶赛特波德代四个肉用绵羊品种冻精7万余粒，并出售给甘肃省的临泽、酒泉、永昌、山丹、景泰、广河、会宁县和河南省畜禽改良站种畜调剂服务中心等单位。根据信息反馈，上述单位共授配21000余只，获得杂种羔羊12800余只。凡是经过项目组培训，利用项目组研制的配方和技术生产的冻精，并按操作规程给母羊配种，其情期受胎产羔母羊率均在61.0％以上。

2002年5月检测，研制的冻精冷冻保存409天，解冻后活率在0.5以上。

4、本发明研究影响冻精配种受胎率的重要因素及其对应措施，为在生产实践中，成功、有效地使用绵羊颗粒冷冻精液进行子宫颈型输精提供了理想模式，用本发明研制的稀释液配方及冷冻-解冻优化程序制作的绵羊颗粒冻精，用子宫颈深部输精方法，30天情期受胎产羔母羊率稳定通过65.0％以上。

另外，本发明还就季节因子对肉用型绵羊品种公羊的射精量、原精活率、原精密度、原精畸形率、冻精解冻后活率、精液中睾酮含量、性反应时间和阴囊周径等的影响，进行了系统的研究，这对主动掌握规律，适时应用种羊，充分发挥其作用提供了科学根据。

附图说明

图1绵羊鲜精质膜顶体超微结构

图2稀释液I条件下绵羊冷冻-解冻精子质膜顶体超微结构

图3稀释液III条件下绵羊冷冻-解冻精子质膜顶体超微结构

图4稀释液IV条件下绵羊冷冻-解冻精子质膜顶体超微结构

图5稀释液VIII条件下绵羊冷冻-解冻精子质膜顶体超微结构

图6稀释液IX条件下绵羊冷冻-解冻精子质膜顶体超微结构

具体实施方式

以下结合附图，并通过试验来进一步的阐明本发明的技术方案：

供本发明试验用绵羊主要为2000年1月直接从新西兰引入的波德代(Borderdale)品种公羊和无角陶赛特(Poll Dorset)品种公羊，体质健壮，精力充沛、性欲好。波德代公羊剪毛后体重127.86±8.40kg，无角陶赛特品种公羊125.60±11.80kg，年龄均为2-3岁。

绵羊冻精品质的高低，以其冷冻-解冻后精子活力、生存指数、顶体完整率和精子浆中谷氨酸-草酸乙酸转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)释放量等为评价指标。而顶体完整率是评价指标中的关键。

本发明是从波德代和无角陶赛特品种公羊精液与不同稀释液配方稀释后获得的冻精，按配方的不同，鲜精用稀释液I、III、IV、VIII、IX稀释并冷冻解冻后其精子及质膜顶体超微结构变化结果见表2。

              表2             绵羊鲜精和冷冻精子质膜顶体超微结构

稀释液	质膜顶体无可见变化(％)	质膜膨大顶体无可见变化(％)	质膜丢失顶体膨大(％)	外膜皱褶核顶不均(％)	外膜破裂核质外溢(％)
						I	0.47±0.37	35.4±1.40	45.50±1.54	14.3±1.83	4.22±0.77
III	1.93±0.29	45.1±0.97	44.19±1.52	7.241.61±	1.52±0.49
						IV	1.31±0.60	43.9±2.06	44.71±3.25	8.19±3.02	1.84±0.59
VIII	0.86±0.40	43.9±2.62	44.07±1.86	9.56±3.32	1.58±0.55
						IX	6.40±0.84	46.0±2.80	37.56±3.08	8.72±1.47	1.25±0.86
鲜精	16,4±1.76	65.83±0.73	11.79±0.71	5.98±1.91	0.00

根据冷冻解冻过程中顶体的变化将绵羊精子分为5类：第1类：质膜顶体无可见变化；第2类：质膜膨大顶体无可见变化；第3类：质膜丢失顶体膨大；第4类：外膜皱褶核质不均；第5类：外膜破裂核质外溢。大量的实验证实：第1、2类精子质膜与顶体在获能前比较完整对于精子穿过卵丘、识别透明带及结合到透明带表面，受精能力强；而后三类精子已丧失受精能力。

由表2可以看出，第1类精子的比例，鲜精、稀释液I、稀释液III、稀释液IV、稀释液VIII和稀释液IX冷冻精子分别为16.40％、0.47％、1.93％、1.31％、0.85％和6.40％，鲜精与稀释液I、III、IV、VIII和IX冷冻精子差异显著(P＜0.05)，稀释液IX与稀释液I、III、IV、VIII差异显著(P＜0.05)。结果表明稀释液IX冷冻精子显著提高了第1类精子的比例。

鲜精、稀释液I、III、IV、VIII和IX冷冻精子第2类精子的比例分别为65.83％、35.41％、45.12％、43.95％、43.94％和46.07％，鲜精与稀释液I、III、IV、VIII和IX冷冻精子第2类精子差异显著(P＜0.05)，稀释液III、IV、VIII、IX差异不显著(P＞0.05)，但与稀释液I差异显著(P＜0.05)。与稀释液I相比，稀释液冷冻精子显著提高了第2类精子的比例。

鲜精、稀释液I、III、IV、VIII和IX冷冻精子第3类精子的比例分别为11.79％、45.53％、44.19％、44.71％、44.07％和37.56％，鲜精、稀释液I、III、IV、VIII和IX冷冻精子第3类精子差异显著(P＜0.05)，稀释液I、III、IV、VIII差异不显著(P＞0.05)，稀释液I、III、IV、VIII和IX冷冻精子第3类精子的比例差异不显著(P＞0.05)。

鲜精、稀释液I、III、IV、VIII和IX冷冻精子第4类精子的比例分别为5.98％、14.37％、7.24％、8.19％、9.56％和8.72％，鲜精、稀释液ITI、IV和IX冷冻精子第4类精子差异不显著(P＞0.05)，与稀释液I和VIII差异显著(P＜0.05)。稀释液III、IV、IX的冷冻精子比稀释液I显著降低了第4类精子的比例。

鲜精、稀释液I、III、IV、VIII和IX冷冻精子第5类精子的比例分别为0.00％、4.22％、1.52％、1.84％、1.58％和1.25％，鲜精未观察到第5类精子。稀释液III、IV、VIII、IX冷冻精子第5类精子差异不显著(P＜0.05)，与稀释液I相比差异显著(P＜0.05)。稀释液III、IV、VIII、IX的冷冻精子比稀释液I显著降低了第5类精子的比例(P＜0.05)。

本发明观察了稀释液I、III、IV、VIII、IX对上述5类精子顶体在冷冻过程中变化的影响，并与鲜精进行了比较。第1类精子和第2类精子之和的排序为：鲜精＞稀释液IX＞稀释液III＞稀释液IV＞稀释液VIII＞稀释液I(分别为82.23％、52.47％、47.05％、45.26％、44.79％、35.88％)稀释液IX冷冻精子显著提高了第1类精子的比例。与稀释液I相比，稀释液III、IV、VIII和IX冷冻精子显著提高了第2类精子的比例。表明稀释液IX、III、IV、VIII不同程度提高第1类和第2类精子的比例，从而提高绵羊冻精的受精能力。

第3类、第4类和第5类精子比例之和的排序为：鲜精＜稀释液IX＜稀释液III＜稀释液IV＜稀释液VIII＜稀释液I(分别为17.77％、47.26％、52.59％、54.74％、55.21％、64.12％)。这是同一事物的两个方面，稀释液IX、III、IV、VIII通过降低上述三类精子比例而提高绵羊冻精的受精能力。

从以上两个方面的观察及分析，清晰阐明用稀释液IX、稀释液III、稀释液IV、稀释液VIII冷冻-解冻精子授精，30天情期受胎产羔母羊率高于稀释液I的原因是提高第1类和第2类精子的比例，同时降低第3类、第4类和第5类精子的比例。

本发明观察了稀释液I、III、IV、VIII、IX对上述5类精子质膜顶体在冷冻过程中变化的影响，并与鲜精进行了比较。鲜精1-3头部质膜扩大，顶体基本正常×1600～×1300～×2600；4-5中段纵切面，清晰的线粒体内嵴×50000～×26000；6中段至主段过渡的环，清晰的线粒体内嵴×28000；7中、主、末段横切面可见到9+9+2结构，线粒体鞘完整，线粒体内嵴清晰×26000(见图1)。稀释液I：1示正常精子头部纵切面×83000；2-3头部质膜扩大，顶体基本正常×16000～×20000；4质膜扩大，顶体双层外膜一侧皱褶，另一侧假顶体反应的囊泡化×16000；5质膜缺失，双层外膜部分溶解×20000～×26000；6-7双层外膜皱褶或膨大，部分核质外漏×20000；8外膜崩溃，核质不均一，顶体极度膨胀×10000；9示颈部中心粒×20000；10中段纵切面，线粒体部分内嵴消失呈空泡化×33000；11中、主、末段横切面，中段横切面可见到9+9+2结构，线粒体出现空泡化×26000(见图2)。稀释液III：1示质膜扩大，颈部中心粒，中段完整的线粒体鞘×88000，2-3头部质膜扩大，顶体基本正常×18000～×26000；4质膜扩大，顶体膨胀×18000；5中段至主段过渡的环(中段线粒体鞘终止于环处)，清晰的线粒体内嵴×50000；6中、主、末段横切面，中段横切面可见到9+9+2结构，线粒体鞘完整，线粒体内嵴清晰×26000(见图3)。稀释液IV：1-2示头部质膜扩大，顶体基本正常×26000～×22000；3质膜缺失，双层外膜完整×88000；4中段纵切面，线粒体鞘完整，线粒体内嵴清晰×66000；5中段至主段过渡的环，清晰的线粒体内嵴×33000；6中、主、末段横切面，中段横切面可见到9+9+2结构，线粒体鞘完整，线粒体内清晰×26000(见图4)。稀释液VIII：1示头部质膜扩大，顶体基本正常×26000；2头部质膜扩大，顶体膨大×16000；3质膜缺失，双层外膜连续，顶体膨大×10000；4质膜扩大，双层外膜部分破裂，有核质外漏×16000；5-6中段纵切面，清晰的线粒体内嵴×33000～×26000；7中、主、末段横切面，中段横切面可见到9+9+2结构，线粒体鞘完整，线粒体内嵴清晰(见图5)。稀释液IX：1-3头部质膜扩大，顶体基本正常×18000～×26000～×20000；4质膜扩大，顶体双层外膜出现假顶体反应的囊泡化×18000；5-6中段纵切面，清晰的线粒体内嵴×100000～×26000；7中段至主段过渡的环，清晰的线粒体内嵴×26000；8末段纵切面×26000；9中、主、末段横切面，中段横切面可见到9+9+2结构，线粒体鞘完整，线粒体内嵴清晰×26000(见图6)。

从上述鲜精、稀释液I、III、IV、VIII和IX图示比较可以得出：第1类精子和第2类精子之和的排序为：鲜精＞稀释液IX＞稀释液III＞稀释液IV＞稀释液VIII＞稀释液I(分别为82.23％、52.47％、47.05％、45.26％、44.79％、35.88％)。稀释液IX冷冻精子显著提高了第1类精子的比例。与稀释液I相比，稀释液III、IV、VIII和IX冷冻精子显著提高了第2类精子的比例。表明稀释液IX、III、IV、VIII不同程度提高第1类和第2类精子的比例，从而提高绵羊冻精的受精能力。

第3类、第4类和第5类精子比例之和的排序为：鲜精＜稀释液IX＜稀释液III＜稀释液IV＜稀释液VIII＜稀释液I(分别为17.77％、47.26％、52.59％、54.74％、55.21％、64.12％)。这是同一事物的两个方面，稀释液IX、III、IV、VIII通过降低上述三类精子比例而提高绵羊冻精的受精能力。

从以上两个方面的分析，清晰的阐明稀释液IX、稀释液III、稀释液IV、稀释液VIII冷冻-解冻精子授精30天情期受胎产羔母羊率高于稀释液I的原因是提高第1类和第2类精子的比例的同时降低第3类、第4类和第5类精子的比例。

绵羊精子中段中间轴丝是由中央2条单根纤维和四周9条成双纤维组成的9+2结构，在轴丝外面还有9条粗纤维组成的纤维带，与9+2轴丝组成9+9+2结构。最外面是线粒体鞘。本发明观察到粗纤维与轴丝组成9+9+2结构，稀释液I冷冻-解冻精子线粒体基质产生严重损伤，但稀释液IX、稀释液III、稀释液IV、稀释液VIII冷冻-解冻精子线粒体受损程度较轻，内嵴清晰可见。说明稀释液IX、稀释液III、稀释液IV、稀释液VIII对冷冻-解冻精子线粒体有较好的低温保护效果。

本发明研究出生产高品质冻精的生产优化程序：

①原精液(密度在20亿个/ml以上、活率在0.7以上、畸形率在15.0％以下)与稀释液按1∶3稀释→②二次稀释法：38℃下用不含甘油的稀释液稀释原精液，200ml体积水浴2.5h进行水浴平衡至4℃，4℃下再在已稀释精液中加入配方规定的甘油量→③-110℃～-120℃下滴冻→④38℃水浴中每2粒冻精中加50μI V_B12解冻。

本发明研究出获得理想的绵羊子宫颈型冻精配种效果的优化模式：

优良的冻精品质(活率在0.4以上，每粒含有效精子5000万个以上)→良好的授配母羊群(膘情在中上等以上、处在发情期的经产母羊)→熟悉冻配操作技术，工作认真负责的技术员→相应配套的输精器材(前端略弯的羊用玻璃输精器、带光源的开膣器)→符合人工授精要求的配种工作室(室温在15～25℃)→适时输精，并实施子宫颈内1.5cm以上深度输精→对被配母羊群给予良好的饲养管理条件。

实施例1：2001年秋季，在甘肃省红光园艺场对214只营养状况良好，膘情在中上等以上的经产土种母羊进行子宫颈深部1.5cm以上输稀释液IX冻配试验，结果30天情期受胎产羔母羊为68.69％(147/214)。

实施例2：2002年秋季，在甘肃省永昌肉用种羊场对300只营养状况良好，膘情在中上等以上的的经产土种母羊进行子宫颈深部1.5cm以上输稀释液III冻配试验，结果30天情期受胎产羔母羊为65.67％(197/300)。

实施例3：2002-2003年，河南省畜禽改良站种畜调剂服务中心用稀释液IX对小尾寒羊进行冻配试验，结果30天情期受胎产羔母羊率为69.96％(3509/5016)。

Claims (8)

1、一种绵羊冷冻精液稀释液，其特征是由基础液《三基(三羟甲基胺基甲烷)》-3.0285g  柠檬酸-1.6593g  卵黄-15％(v/v)  甘油4.0％(v/v)青毒素和链毒素各为10万单位)加2.5673g蔗糖和0.75g乳糖，配制获得稀释液II。

2、根据权利要求1所述的一种绵羊冷冻精液稀释液，其特征是由稀释液II加12mlV_B6，配制获得稀释液III。

3、根据权利要求1所述的一种绵羊冷冻精液稀释液，其特征是由稀释液II加12mlV_E，配制获得稀释液IV。

4、根据权利要求1所述的一种绵羊冷冻精液稀释液，其特征是由稀释液II加0.3g甘氨酸，配制获得稀释液VI。

5、根据权利要求1所述的一种绵羊冷冻精液稀释液，其特征是由稀释液II加140mg山梨醇，配制获得稀释液VII。

6、根据权利要求1所述的一种绵羊冷冻精液稀释液，其特征是由稀释液II加2ml板蓝根，配制获得稀释液VIII。

7、根据权利要求1所述的一种绵羊冷冻精液稀释液，其特征是由稀释液II加12mlV_B6、12mlV_E和2ml板蓝根，配制获得稀释液IX。

8、一种绵羊冷冻精液稀释液冷冻解冻的方法，其步骤是：

(1)、在38℃下，用不同配方稀释液按1∶3比例将绵羊原精液(密度在20亿个/ml以上、活率在0.7以上、畸形率在15.0％以下)等温稀释于试管中，并将其放入水温为38℃、体积为200ml的水浴烧杯中，然后将其放入普通冰箱的冷藏室中进行水浴平衡至4℃(约需2.5h)，4℃下再在已稀释的精液中加入配方规定的甘油量，待用；

(2)、将铜纱网或氟板置于液氮面上约1.5cm处，当铜纱网或氟板温度达到-110℃～-120℃时，用滴管进行颗粒冻精滴冻，每个颗粒体积为0.1～0.2ml，收集冻精颗粒、装袋、标记，并将其浸入液氮中保存贮藏；

(3)解冻方法是在壁薄口径大的解冻管内(38℃水浴中)加入50μl医用VB₁₂(加入量以能润湿管壁为原则)，迅速放入2粒冻精后，立即将其放入45～55℃的水浴中轻轻地摇动，当冻精颗粒基本溶解后，即转入37℃的恒温水浴中，待用。

Images