CN107751186B - 一种快速冻存及复苏细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速冻存及复苏细胞的方法，包括冻存步骤和复苏步骤，所述冻存步骤包括：(1)细胞消化，制备细胞悬液；(2)稀释细胞，分装；(3)梯度降温、升温，再梯度降温至‑120℃～‑180℃，放入液氮中保存；所述复苏步骤包括：液氮中取出的冻存细胞迅速浸入38～40℃的复苏水中，快速摇动至完全融化，无需去除冻存液可直接使用细胞。本发明方法可以保障冻存细胞的批间质量一致性、细胞遗传稳定性；保证细胞复苏成活率稳定提高至98％以上，同时缩短细胞复苏及传代周期50％～60％。

Description

一种快速冻存及复苏细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体地说，涉及快速冻存及复苏细胞的方法。
背景技术
随着细胞生物学应用技术的发展，细胞体外培养技术已被广泛应用到各类生物学研究及工业生产领域，因此细胞冻存与复苏技术是细胞培养技术重点关注环节之一。如何建立一种高效的细胞冻存方法，保障冻存的细胞具有长期生物活性，提高了细胞复苏时细胞成活率，是当下细胞生物学试验和部分工业化生产中常遇到的技术难点。
大量研究表明，将细胞置于-196℃液氮中低温储存，可长期保存细胞特性，使细胞暂时脱离生长状态，之后可复苏细胞投于试验或工业生产使用。工业生产中投入使用细胞时，对细胞代次及遗传稳定性要求较高，原代细胞的量极为有限，用于细胞扩增制成主种子批，主种子批再扩增制成工作细胞库，工作细胞库可直接投入生产使用，此过程中产生的任一类种子批均需低温长期保存，一旦保存方法不理想，细胞复苏成活率低，势必给企业带来严重损失。
细胞低温保存研究中，一般认为造成细胞损伤的主要因素有两种:一种是溶质损伤：在冷冻保存液结冰时细胞内、外液性质改变，即溶质浓集、细胞脱水、pH值变化等，冷冻速度愈慢，这种改变对细胞的损害作用就愈大；另一种是冰晶损伤：细胞内结冰，它对细胞的伤害随冷冻速度的加快和复温速度的减慢而增加。这两种因素均与保存液由液态变为固态的相变(phase change)有关。
目前的细胞冻存技术，常规操作方法为：采用逐级降温法冻存处于37℃生长状态下的细胞，即：制备活性细胞悬液放入-20℃环境中2～4小时后，转至-40℃环境冻存2～4小时，再转至-80℃环境冻存8～16小时，最后浸入液态氮(-196℃)长期保存；冻存时间一般控制在4～24小时，需要不同温度控制的低温设备3台。然而细胞在冻存过程中会因温度变化或多或少产生冰晶或细胞电解质和溶质浓度升高性损伤，在复融(复苏)过程中会因升温方法产生潜热效应性损伤。现有的细胞冻存技术未充分考虑细胞冻存过程中相变点(膜脂发生相态转变的温度)，很多细胞冻存方法在细胞冻存前未明确细胞形态活力对复苏的影响，有些细胞冻存方法耗时较长，不同冻存阶段需要占用不同设备，浪费人力物力，一旦冻存细胞批量增大，难以保证每管冻存细胞的质量稳定性，极不利于工业生产。另外现有的细胞冻存技术受人为影响大，同样的细胞冻存或复苏方法，不同人员操作细胞冻存后复苏率会有较大差异，细胞冻存均一稳定性差，批量冻存受限，分批次冻存的细胞复苏后的细胞活力不能持续稳定在同一水平，不利于工业生产的细胞培养工艺的稳定性。
在复苏时，一般以很快的速度升温，1～2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。
现有技术中细胞复苏技术特点是(1)在低温(37℃水浴)复苏细胞，复苏时间过长，在复温过程中易使细胞受损害。(2)高温(46～67℃水浴)复苏细胞，复苏时间虽减短，在复温过程中易使细胞受损害。(3)细胞复苏过程中未考虑其他溶液温度对复苏成活率的影响。(4)细胞复苏后需经离心机低速离心(800转/分钟，离心5分钟)，去除冻存液，再稀释离心收集的细胞投入使用，易对复苏后细胞产生二次伤害。如中国专利CN102559573A公开的细胞复苏方法：从液氮中取出细胞冻存管，置46～67℃水浴复苏，融化30～70秒，加入适配营养液，800转/分，离心5分，弃上清，得离心后的细胞；离心后的细胞用适配营养液稀释，无菌取样，用1％台盼蓝染色，计数活细胞数和细胞总数，计算复苏率为95～98％；其余细胞加入适配生长液，静止37℃培养5～7小时，至90～95％的细胞贴壁；更换细胞适配生长液继续培养48～72小时，至细胞完全融合生长成单层；按比例传代培养；完成细胞复苏生长繁殖周期。如中国专利CN102559573A公开的细胞复苏方法：从液氮中取出细胞冻存管，置37℃水浴，180-300秒融化，加入适配营养液，800转/分钟离心5分钟，弃上清，加入适配生长液适量，静止37℃培养。
上述方法均符合快速复苏细胞减少细胞内晶体形成的原理，实现了细胞复苏的一般要求，但仍未全面地考虑冷冻速率及复苏速率对细胞产生的影响。细胞复苏后通过离心收集细胞去除冻存液，增加过程操作，既容易对细胞造成二次伤害，又带来了污染风险，因细胞以1:4等比例复苏时，冻存液已被复苏液稀释至较低浓度，完全可以忽略冻存液成分对细胞复苏的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、细胞冻存再复苏后细胞存活率高、稳定性好的快速冻存及复苏细胞的方法。
本发明提供的一种快速冻存及复苏细胞的方法，包括冻存步骤和复苏步骤，所述冻存步骤包括：(1)细胞消化，制备细胞悬液；(2)稀释细胞，分装；(3)第一次梯度降温、升温、第二次梯度降温至-40℃后，再迅速降温至-120℃～-180℃，放入液氮中保存；
所述复苏步骤包括：液氮中取出的冻存细胞迅速浸入38～40℃的常规复苏用水中，快速摇动至完全融化，无需去除冻存液可直接使用细胞。本发明实施例采用的复苏用水为注射用水。
上述方法中，步骤(1)采用温和消化法消化细胞，具体方法为：待细胞长至致密单层，用胰蛋白酶溶液消化细胞间质呈现针孔状，弃去消化液，置于恒温室或培养箱内36.5±1℃持续消化5～10min。
胰蛋白酶溶液浓度0.25％，控制加量：0.02～0.06ml/cm2；胰蛋白酶溶液浓度0.125％，控制加量：0.05～0.12ml/cm2。
进一步地，加入10％新生牛血清的生长液，制成细胞悬液，分装至离心管(或离心杯)，取细胞悬液0.1ml计数。低速离心5min左右。
步骤(2)采用含有20％新生牛血清及DMSO的冻存液将细胞稀释至细胞浓度为1.0×106-7～1.5×106-7个/ml。
步骤(3)第一次梯度降温的方法是：将步骤(2)分装好的细胞于4℃保存5～15min，按照1～3℃/min迅速降温至-4℃；再以15～25℃/min迅速降温至-40℃。本发明经过试验发现，按照1～3℃/min迅速降温至-4℃后，以15～25℃/min迅速降温至-40℃，过程中，-4～-10℃为大多数细胞冻存的相变点，不可以改变，但可在此温度之后冻存加速，能有效防止细胞产生回温及冰晶，以此方法冻存的样品温度与冻存腔体温度下降趋势图见图1，而以常规方法-1～-3℃/min的速度进行冻存的样品温度与冻存腔体温度下降趋势图见图2。
步骤(3)的升温是指在第一次梯度降温至-40℃后，以5～12℃/min迅速升温至-12℃。此处升温至-12℃，较升温至其他温度可以有效防止冰晶等因素，见图1。
步骤(3)的第二次梯度降温是指升温至-12℃后，以1～3℃/min降温至-40℃，再以10～15℃/min降温至-120℃～-180℃，之后立即放入液氮中保存。
所述复苏步骤中快速摇动至完全融化应当在1分钟内完成。
复苏至完全融化后，还包括将装有复苏后细胞的容器浸入35.5～37.5℃的散热慢、无挥发性的消毒液中消毒。本发明实施例采用0.15％苯扎溴铵溶液对冻存细胞的容器外周进行消毒处理。
本发明提供了上述方法在制备生物制品中的应用。
本发明提供了上述方法在病毒培养中的应用。
本发明的有益效果在于，为防止过度消化影响细胞活力及形态，本发明采用温和消化的方法，在添加胰蛋白酶溶液(浓度0.25％，控制加量：0.02～0.06ml/cm2；浓度0.125％，控制加量：0.05～0.12ml/cm2)后，至细胞间质呈现针孔状，弃去消化液，再36.5±1℃持续消化5～10min，胰蛋白酶消化总时间不超过12min。确保冻存前细胞质量。冻存液(细胞冻存常用含10％～20％牛血清)中牛血清含量及冻存前细胞密度均会影响冻存相变点。本发明的第一次梯度降温再升温的方法，可保障细胞在冻存过程中温度持续下降，有效避免返温对冻存细胞带来的伤害。本发明的第二次梯度降温至-40℃后，以最快速度下降到长期保存温度-120～-180℃，直至放入液氮(-196℃)环境保存，可确保细胞的高活力。本发明的细胞冻存方法操作简便，省时省力，整个过程在1小时左右，可实现批量冻存，降低了人为操作差异，确保任意时间冻存的细胞批次成活率的一致性和细胞遗传稳定性。
本发明的复苏方法克服了现有技术复苏方法繁琐、需要通过离心去除冻存液容易对细胞产生伤害的缺陷，细胞复苏融化后可直接使用。本发明复苏方法无需离心去除冻存液，仍可保证细胞的高存活率和高复苏率，复苏4～6小时候镜检复苏后的细胞状态，可见约90％-95％的细胞贴壁，细胞呈圆形，大小均匀，最终细胞复苏率可达98％以上，培养48小时后，细胞完全贴壁生长，培养3-5天后，细胞可长成致密单层，缩短了细胞复苏的增殖周期(如：人二倍体细胞生长周期一般5-9天，采用本发明的方法能够缩短该细胞生长周期至3-5天)。采用本发明的方法冻存5年后，再采用本发明的方法复苏，复苏后细胞存活数仍可达97％以上。
附图说明
图1为按照本发明梯度降温方法冻存的样品温度与腔体温度随时间变化趋势图。以-1～-3℃/min的速度降低样品所处的冻存环境的温度，在设备腔室温度快达到样品相变点时，迅速降低腔室温度至-40℃，短暂维持一段时间，以确保样品仍以-1～-3℃/min的速度降低温度，再迅速升起腔室温度至-12℃，最终仍以-1～-3℃/min的速度降低腔室的温度。利用此相变点设计设备降温程序，可有效避免样品在冻存过程中返温及迅速降温的问题，减少细胞冻存损伤。
图2为现有技术中以-1～-3℃/min的速度进行冻存的样品温度与冻存腔体温度下降趋势图。以常规方法-1～-3℃/min的速度降低样品所处的冻存环境(即设备腔体)的温度(理论上，样品以每分钟1～3℃的稳定速度平稳的降到-50℃以下受到损失最小)，在持续降温冻存过程中，样品会在相变点附近发生急速升温至0℃的情况，样品温度在0℃维持一段时间后迅速降温。这一冻存过程与实际要求样品以-1℃/min的速度不符，样品极易在急速升温及快速降温过程中受损害，从而降低细胞复苏存活率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1快速冻存和复苏人二倍体细胞(2BS、MRC-5、KMB17、WI-38)
1、人二倍体细胞的消化：向1个已形成致密单层细胞的CF10中加入250ml 0.25％胰蛋白酶溶液，待细胞间质呈现针孔状时，弃去培养瓶内消化液，置于恒温室内36.5±1℃持续消化5～10min。
制备细胞悬液：向已消化好的CF10加入500ml含有10％新生牛血清的生长液，制成人二倍体细胞悬液，分装至50ml离心管。以800～1000 r/min离心5min，弃去上清液；
2、冻存前稀释人二倍体细胞：
依据第二步细胞计数，分别向10支50ml离心管中加入10ml细胞冻存液，轻轻吹打至沉淀细胞均匀分散，收集分散细胞至无菌盐水瓶内，取细胞悬液0.1ml计数后，继续添加细胞冻存液调整细胞密度，密度在1.0×106-7～1.5×106-7个/ml之间，共获得250ml冻存前细胞悬液；分装：细胞悬液按1ml/管分装。
3、程序降温冻存：将完成分装的冻存管整齐码放至程序降温冻存设备抽屉内，设置程序如下：
第一次梯度降温：4℃保存5～15min，1～3℃/min迅速降温至-4℃；15～25℃/min迅速降温至-40℃；
升温：5～12℃/min迅速升温至-12℃；
第二次梯度降温：1～3℃/min降温至-40℃；10～15℃/min降温至-120℃～-180℃；完成冻存，取出冻存管，迅速放入液氮罐-196℃长期保存。
4、冻存6个月、1年后、2年、5年后细胞复苏方法
(1)冻存6个月后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值99％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第3～4天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(2)冻存1年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值98％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第3～4天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(3)冻存2年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值98％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第3～4天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(4)冻存5年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃注射用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值98％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第3～4天，细胞长成致密的单层，形态较好。本实施例方法与现有技术方法与效果比较见表1。
实施例2快速冻存及复苏非洲绿猴肾细胞
1、非洲绿猴肾细胞的消化：
向10个已形成致密单层细胞的175cm2培养瓶中加入7ml 0.25％胰蛋白酶溶液，待细胞间质呈现针孔状时，弃去培养瓶内消化液，置于恒温室内36.5±1℃持续消化5～10min。
制备细胞悬液：向已消化好的175cm2培养瓶中加入15ml含有10％新生牛血清的生长液，制成非洲绿猴肾细胞悬液，分装至50ml离心管。以800～1000r/min离心5min，弃去上清液；
2、冻存前稀释非洲绿猴肾细胞：
依据第二步细胞计数，分别向3支50ml离心管中加入10ml细胞冻存液，轻轻吹打至沉淀细胞均匀分散，收集分散细胞至无菌盐水瓶内，取细胞悬液0.1ml计数，继续添加细胞冻存液调整细胞密度，共获得80ml冻存前细胞悬液；分装：细胞悬液按1ml/管分装。
3、程序降温冻存：将完成分装的冻存管整齐码放至程序降温冻存设备抽屉内，设置程序如下：
第一次梯度降温：4℃保存5～15min，1～3℃/min迅速降温至-4℃；1025℃/min迅速降温至-40℃；
升温：5～12℃/min迅速升温至-12℃；
第二次梯度降温：1～3℃/min降温至-40℃；10～15℃/min降温至-120℃～180℃；完成冻存，取出冻存管，放入液氮罐-196℃长期保存。4、冻存6个月、1年后、2年、5年后细胞复苏方法
(1)冻存6个月后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值99％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第2～3天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(2)冻存1年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值99％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第2～3天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(3)冻存2年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值98％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第2～3天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(4)冻存5年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值97％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第2～3天，细胞长成致密的单层，形态较好。与现有技术的方法与效果比较见表2。
实施例3快速冻存及复苏乳仓鼠肾细胞
1、乳仓鼠肾细胞的消化：
向10个已形成致密单层细胞的175cm2培养瓶中加入7ml 0.25％胰蛋白酶溶液，待细胞间质呈现针孔状时，弃去培养瓶内消化液，置于恒温室内36.5±1℃持续消化10min。
制备细胞悬液：向已消化好的175cm2培养瓶中加入15ml含有10％新生牛血清的生长液，制成乳仓鼠肾细胞悬液，分装至50ml离心管。以800～1000r/min离心5min，弃去上清液；
2、冻存前稀释乳仓鼠肾细胞：
依据第二步细胞计数，分别向10支50ml离心管中加入10ml细胞冻存液，轻轻吹打至沉淀细胞均匀分散，收集分散细胞至无菌盐水瓶内，取细胞悬液0.1ml计数，继续添加细胞冻存液调整细胞密度，共获得70ml冻存前细胞悬液；分装：细胞悬液按1ml/管分装。
3、程序降温冻存：
将完成分装的冻存管整齐码放至程序降温冻存设备抽屉内，设置程序如下：
4℃保存5～15min,1～3℃/min迅速降温至-4℃；15～25℃/min迅速降温至-40℃；5～12℃/min迅速升温至-12℃；1～3℃/min降温至-40℃；10～15℃/min降温至-120℃～180℃；完成冻存，取出冻存管，放入液氮罐-196℃长期保存。
4、冻存6个月、1年后、2年、5年后细胞复苏方法
(1)冻存6个月后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值99％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第3～4天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(2)冻存1年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值98％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第3～4天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(3)冻存2年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值98％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第3～4天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(4)冻存5年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值97％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第3～4天，细胞长成致密的单层，形态较好。与现有技术的方法与效果比较见表3。
实施例4快速冻存及复苏肿瘤细胞(如MCF-7、CNE、RKO等)
1、肿瘤细胞的消化：
向10个已形成致密单层细胞的175cm2培养瓶中加入7ml 0.25％胰蛋白酶溶液，待细胞间质呈现针孔状时，弃去培养瓶内消化液，置于恒温室内36.5±1℃持续消化5～10min。
制备细胞悬液：向已消化好的175cm2培养瓶中加入15ml含有10％新生牛血清的生长液，制成肿瘤细胞悬液，分装至50ml离心管。以800～1000r/min离心5min，弃去上清液；
2、冻存前稀释肿瘤细胞：
依据第二步细胞计数，分别向10支50ml离心管中加入10ml细胞冻存液，轻轻吹打至沉淀细胞均匀分散，收集分散细胞至无菌盐水瓶内，取细胞悬液0.1ml计数，继续添加细胞冻存液调整细胞密度，共获得70ml冻存前细胞悬液；分装：细胞悬液按1ml/管分装。
3、程序降温冻存：
将完成分装的冻存管整齐码放至程序降温冻存设备抽屉内，设置程序如下：
4℃保存5～15min,1～3℃/min迅速降温至-4℃；15～25℃/min迅速降温至-40℃；5～12℃/min迅速升温至-12℃；1～3℃/min降温至-40℃；10～15℃/min降温至-120℃～180℃；完成冻存，取出冻存管，放入液氮罐-196℃长期保存。
4、冻存6个月、1年后、2年、5年后细胞复苏方法
(1)冻存6个月后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值99％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第2～3天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(2)冻存1年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值99％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第2～3天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(3)冻存2年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值98％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第2～3天，细胞长成致密的单层，形态较好。
(4)冻存5年后，将冻存管从液氮中取出，迅速浸入39±1℃复苏用水中，手指并拢捏住冻存管管身，60秒内顺时针方向快速摇动直至细胞完全融化，迅速转移至36.5±1℃除菌过滤后0.15％苯扎溴铵溶液(此处消毒剂不可用酒精)中消毒。无菌滤纸吸干外表面后，吸取0.1ml用于台盼蓝染色活细胞计数，细胞复苏成活率均值98％。培养48小时后，细胞完全贴壁生长，36.5±1℃培养第2～3天，细胞长成致密的单层，形态较好。与现有技术的方法与效果比较见表4。
结合4个实施例结果表明：本发明冻存批量及复苏后细胞复苏率明显高于传统方法，细胞冻存批间质量一致性高，冻存后5年内复苏稳定性高。
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Figure BDA0001445501100000201

Claims (5)

1.一种快速冻存及复苏细胞的方法，其特征在于，包括冻存步骤和复苏步骤，所述冻存步骤包括：(1)细胞消化，制备细胞悬液；(2)用含有20％新生牛血清及DMSO的冻存液稀释细胞至浓度为1.0×106-7～1.5×106-7个/ml，分装；(3)第一次梯度降温、升温、第二次梯度降温是以1～3℃/min降温至-40℃后，再以10～15℃/min迅速降温至-120℃～-180℃，放入液氮中保存；
所述第一次梯度降温的方法是：将步骤(2)分装好的细胞于4℃保存5～15min，按照1～3℃/min迅速降温至-4℃；再以15～25℃/min迅速降温至-40℃；所述升温是指在第一次梯度降温至-40℃后，以5～12℃/min迅速升温至-12℃；所述温度均为冻存设备控制腔室的温度；
其中，所述方法中，所述复苏步骤包括：液氮中取出的冻存细胞迅速浸入38～40℃的常规复苏用水中，快速摇动至1分钟内完全融化，在复苏步骤无需离心去除冻存液直接使用细胞，仍可保证细胞的高存活率和高复苏率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)采用温和消化法消化细胞，具体方法为：用胰蛋白酶溶液消化细胞间质呈现针孔状，弃去消化液，置于恒温室或培养箱内36.5±1℃持续消化5～10min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，胰蛋白酶溶液浓度0.25％，控制加量：0.02～0.06ml/cm2；胰蛋白酶溶液浓度0.125％，控制加量：0.05～0.12ml/cm2。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，复苏至完全融化后，还包括将装有复苏后细胞的容器浸入35.5～37.5℃的散热慢、无挥发性的消毒液中消毒。
5.权利要求1-3任一所述的方法在制备生物制品中的应用。
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