CN105340877A - 一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液、细胞制剂及制备方法 - Google Patents
一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液、细胞制剂及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液、细胞制剂及制备方法。所述细胞冷冻保护液是包含有人血白蛋白和CryoSure-DEX40冻存液的混合液体。所述细胞制剂包括如前面所述的细胞冷冻保护液和细胞。所述制备方法是,先将CryoSure-DEX40冻存液与人血白蛋白混匀形成如前面所述可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,再将该细胞冷冻保护液缓慢注入洗涤好的细胞沉淀中,边注入边混匀,最后形成所述细胞制剂。使用本发明的制备方法制备出的细胞制剂经过长时间的冷冻保存或长途运输后,细胞的存活率仍然很高,具有临床级别的应用价值,突破了以往细胞制剂只能现制备现回输的局限性,扩大了细胞制剂使用的地理范围。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,尤其涉及一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液、细胞制剂及制备方法。
背景技术
二十一世纪是细胞治疗的时代。目前的细胞治疗主要分为两大类:免疫细胞治疗和干细胞治疗。目前细胞治疗领域采取的模式一般都是在医院就近建设实验室,进行细胞制剂的就近制备,细胞制剂制备完毕后最好在4小时之内输注完毕。这样的细胞制剂主要是由:90%(v/v)0.9%生理盐水+10%(v/v)人血白蛋白(其浓度没有严格限制)+一定数量的细胞(干细胞或免疫细胞)组成,细胞均是以未冻存状态存在。鉴于将细胞从培养液中直接过渡到主要以0.9%生理盐水为主的溶剂中,营养成分相对之前的培养基来讲大大减少(因为培养基是不能直接用于回输人体,只能将细胞收获后放在0.9%生理盐水中,加上一定浓度的营养液,进行回输治疗。),故细胞制剂制备完毕后需要尽快输注,这样才能保证细胞的活性和治疗的有效性。虽然这种形式细胞制剂的细胞相对“新鲜”,但是也存在很大的局限性。比如:细胞制剂制备完毕后最好在4小时之内使用,否则细胞活率会急剧下降,影响回输治疗的效果;同时开展细胞治疗的科室必须投入巨资进行相应细胞培养GMP实验室的建立(前提必须是有相应的建设实验室的场地),再招聘相关技术人员,就近进行细胞制剂的制备,这样不仅耗费大量人力物力成本,也极大地限制了细胞制剂的使用方式:只能是在制剂制备完毕后4小时之内尽快使用,不能提供给有需求的、路途较远的外单位使用。所以,如何扩大细胞制剂应用的地理范围,细胞制剂的长途运输问题就成为细胞治疗领域需要解决的首要问题。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,用该细胞冷冻保护液制备的细胞制剂经过长时间的存放或运输后,细胞的存活率仍然很高,细胞复苏后可直接用于人体回输,不但适用于临床治疗,也可用于医学科研实验。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种可使细胞长时间存活的细胞制剂,该细胞制剂经过长时间的存放或运输后,细胞的存活率仍然很高,细胞复苏后可直接用于人体回输,不但适用于临床治疗,也可用于医学科研实验。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种可使细胞长时间存活的细胞制剂的制备方法,使用该制备方法制备出的细胞制剂经过长时间的存放或运输后,细胞的存活率仍然很高,细胞复苏后可直接用于人体回输,不但适用于临床治疗,也可用于医学科研实验。
就保护液而言,为了解决上述第一个技术问题,本发明提供了一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,所述细胞冷冻保护液是包含有人血白蛋白和CryoSure-DEX40冻存液的混合液体。
所述人血白蛋白的浓度为≥0.2g/ml。
所述人血白蛋白的浓度为0.2g/ml-0.25g/ml。(目前本申请人所查文献中,0.25g/ml的浓度已经算是高浓度,人血白蛋白浓度太高对人体也不好,即人血白蛋白的浓度和人体体液间的渗透压太大,也会对病人产生很大的副作用;但是理论上浓度越高对细胞保护效果越好。我们选择人血白蛋白作为冷冻保护剂,需要从这两个方面权衡,不能一味强调高浓度,而忽略了高浓度对人体体液渗透压的负影响。)
所述人血白蛋白的浓度为0.2g/ml。
所述人血白蛋白的含量和CryoSure-DEX40冻存液的含量按体积份数比为,
人血白蛋白4-9、
CryoSure-DEX40冻存液1。
所述人血白蛋白的含量和CryoSure-DEX40冻存液的含量最佳体积份数比为,
人血白蛋白4、
CryoSure-DEX40冻存液1。
所述细胞冷冻保护液中DMSO的浓度为5%-10%。
所述细胞冷冻保护液中DMSO的最佳浓度为10%。
本发明可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液与现有技术相比具有以下有益效果。
1、本技术方案由于采用了细胞冷冻保护液是包含有人血白蛋白和CryoSure-DEX40冻存液的混合液体的技术手段,其中CryoSure-DEX40冻存液已经应用在脐血造血干细胞的冻存和临床回输上。所以,用该细胞冷冻保护液制备的细胞制剂,可不必经过细胞洗涤去除CryoSure-DEX40冻存液,拿到临床后直接复苏回输即可;同时经过长时间的液氮冷冻保存和长途运输后,细胞的存活率仍然很高。
2、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的浓度为≥0.2g/ml的技术手段,所以,可确保人血白蛋白对细胞冷冻保护的有效性。
3、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的浓度为0.2g/ml-0.25g/ml的技术手段,所以,不仅可确保人血白蛋白对细胞冷冻保护的有效性,也能确保临床回输的有效性和对病人的保护作用。
4、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的浓度为0.2g/ml的技术手段,所以,不但可确保人血白蛋白的有效性,而且,还可以最大限度地降低生产成本。
5、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的含量和CryoSure-DEX40冻存液的含量按体积份数比为,人血白蛋白4-9、CryoSure-DEX40冻存液1的技术手段,所以,可有效确保细胞冻存复苏后的存活率。
6、本技术方案由于采用了所述人血白蛋白的含量和CryoSure-DEX40冻存液的含量按体积份数比为,人血白蛋白悬液4、CryoSure-DEX40冻存液1,所以,可确保细胞冷冻复苏后的存活率最高。
7、本技术方案由于采用了所述细胞冷冻保护液中DMSO的浓度为5%-10%的技术手段,所以,可确保细胞冷冻复苏后的存活率。
8、本技术方案由于采用了所述细胞冷冻保护液中DMSO的浓度为10%的技术手段,所以,可确保细胞冷冻复苏后的存活率最高。
就制剂而言,为了解决上述第二个技术问题,本发明提供了一种可使细胞长时间存活的细胞制剂,所述细胞制剂包括如前面所述的细胞冷冻保护液和细胞。
所述细胞是干细胞或免疫细胞;含有干细胞的所述细胞制剂是干细胞制剂,含有免疫细胞的所述细胞制剂是免疫细胞制剂。
所述干细胞是间充质干细胞,所述免疫细胞是细胞因子诱导的杀伤性细胞或树突状抗原提呈细胞;含有间充质干细胞的所述细胞制剂是间充质干细胞制剂,含有细胞因子诱导的杀伤性细胞的所述细胞制剂是细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂,含有树突状抗原提呈细胞的所述细胞制剂是树突状抗原提呈细胞制剂。
所述间充质干细胞制剂中间充质干细胞的密度为1.25×106个/ml-7.50×106个/ml;
所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂中细胞因子诱导的杀伤性细胞的密度为0.5×108个/ml-1.0×108个/ml;
所述树突状抗原提呈细胞制剂中树突状抗原提呈细胞的密度为1×107个/ml-2×107个/ml。
所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂中细胞因子诱导的杀伤性细胞的密度为0.5×108个/ml。
所述间充质干细胞制剂每一剂的体积为8ml;
所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂每一剂的体积为20ml;
所述树突状抗原提呈细胞制剂每一剂的体积为1ml。
每一剂所述间充质干细胞制剂注入容积为10ml的冻存管内;
每一剂所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂注入容积为25ml的冻存袋内;
每一剂所述树突状抗原提呈细胞制剂注入容积为2ml的冻存管内。
细胞因子诱导的杀伤性细胞是人外周血和/或脐血源免疫细胞。
所述干细胞制剂中间充质干细胞用于治疗的有效剂量为1×106-2×106/kg,此间充质干细胞是目前已知的所有来源的间充质干细胞(例如:围产期组织来源的间充质干细胞、牙髓/骨髓来源的间充质干细胞等)。
所述细胞制剂处于液氮冷冻状态。
本发明可使细胞长时间存活的细胞制剂与现有技术相比具有以下有益效果。
1、本技术方案由于采用了所述细胞制剂包括如前面所述的细胞冷冻保护液和细胞的技术手段,所以,制剂复苏后可不必经过离心洗涤操作去除CryoSure-DEX40冻存液,直接用于临床人体回输治疗使用;并且该细胞制剂经过长时间的液氮冷冻保存和长途运输后,细胞的存活率仍然很高,突破了之前细胞制剂只能就近使用的局限性。
2、本技术方案由于采用了所述细胞是干细胞或免疫细胞;含有干细胞的所述细胞制剂是干细胞制剂,含有免疫细胞的所述细胞制剂是免疫细胞制剂的技术手段,所以,可针对不同患者制备出不同的细胞制剂。
3、本技术方案由于采用了所述干细胞是间充质干细胞,所述免疫细胞是细胞因子诱导的杀伤性细胞或树突状抗原提呈细胞;含有间充质干细胞的所述细胞制剂是间充质干细胞制剂,含有细胞因子诱导的杀伤性细胞的所述细胞制剂是细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂,含有树突状抗原提呈细胞的所述细胞制剂是树突状抗原提呈细胞制剂的技术手段,所以,可针对不同患者制备出多种细胞制剂。
4、本技术方案由于采用了所述间充质干细胞制剂中间充质干细胞的密度为1.25×106个/ml-7.50×106个/ml;所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂中细胞因子诱导的杀伤性细胞的密度为0.5×108个/ml-1.0×108个/ml;所述树突状抗原提呈细胞制剂中树突状抗原提呈细胞的密度为1×107个/ml-2×107个/ml的技术手段,所以,可确保上述各种细胞制剂具有明显的疗效。
5、本技术方案由于采用了所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂中细胞因子诱导的杀伤性细胞的密度为0.5×108个/ml的技术手段,所以,可确保所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂具有最佳的复苏后细胞活率,从而保证了制剂复苏后的最佳临床疗效。
6、本技术方案由于采用了所述间充质干细胞制剂每一剂的体积为8ml;所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂每一剂的体积为20ml;所述树突状抗原提呈细胞制剂每一剂的体积为1ml的技术手段,此体积设置不仅能够降低液氮库储存的空间及液氮成本,同时能够最大限度地减少DMSO的体积含量,低含量的DMSO也能最大限度地降低对患者回输后的副反应,所以,可适合不同年龄阶段患者的用量。
7、本技术方案由于采用了每一剂所述间充质干细胞制剂注入容积为10ml的冻存管内;每一剂所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂注入容积为25ml的冻存袋内;每一剂所述树突状抗原提呈细胞制剂注入容积为2ml的冻存管内的技术手段,所以,可最大限度地降低液氮储存时细胞制剂所占的空间,有利于细胞制剂的液氮长期冷冻保存和长途运输。
8、本技术方案由于采用了细胞因子诱导的杀伤性细胞是人外周血和/或脐血源免疫细胞的技术手段,所以,可大大扩大细胞因子诱导的杀伤性细胞的制备原料。
9、本技术方案由于采用了所述干细胞制剂中间充质干细胞的来源是目前已知的所有来源的间充质干细胞(例如:围产期组织来源的间充质干细胞、牙髓/骨髓来源的间充质干细胞等),所以,可大大扩大间充质干细胞的制备原料。
10、本技术方案由于采用了所述干细胞制剂中间充质干细胞用于治疗的有效剂量为1×106-2×106/kg的技术手段,所以,可有效地控制细胞制剂中间充质干细胞的密度。
11、本技术方案由于采用了所述细胞制剂处于液氮冷冻状态的技术手段,所以,可大大提高细胞冻存后的复苏活率。
就制备方法而言,为了解决上述第三个技术问题,本发明提供了一种如前面所述可使细胞长时间存活的细胞制剂的制备方法,先将CryoSure-DEX40冻存液与人血白蛋白混匀形成如前面所述可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,再将该细胞冷冻保护液缓慢注入洗涤好的细胞沉淀中,边注入边混匀,最后形成所述细胞制剂。
所述CryoSure-DEX40冻存液与人血白蛋白是在冰上混匀的。
注入细胞冷冻保护液的速度为0.5ml/min-2ml/min。
注入细胞冷冻保护液的最佳速度为1ml/min。
将所述细胞制剂注入到冻存管或冻存袋中。
将注入细胞制剂的所述冻存管或冻存袋经过程控降温仪进行程控降温后,放在液氮库中进行长时间保存。
将放在液氮库中的细胞制剂取出,放入用于长途运输的液氮罐中。
在使用前,先将所述细胞制剂取出,迅速放入已经预热的水浴锅内,进行快速融化,使细胞复苏。
所述水浴锅的预热温度为36℃-38℃。
所述水浴锅的预热温度为37℃。
在进行快速融化的过程中,边融化边轻轻晃动冻存管或冻存袋。
在进行快速融化的过程中,所述冻存管的管口朝上,融化过程中一直保持冻存管的管口处于水浴锅内的液面之上。
使细胞复苏的整个过程持续0.75min-2min。
使细胞复苏的整个过程持续1min。
本发明可使细胞长时间存活的细胞制剂的制备方法与现有技术相比具有以下有益效果。
1、本技术方案由于采用了先将CryoSure-DEX40冻存液与人血白蛋白混匀形成如前面所述可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,再将该细胞冷冻保护液缓慢注入洗涤好的细胞沉淀中,边注入边混匀,最后形成所述细胞制剂的技术手段,所以,使用该制备方法制备出的细胞制剂经过长时间的液氮冷冻保存和长途运输后,细胞的存活率仍然很高。本技术方案由于采用了所述CryoSure-DEX40冻存液与人血白蛋白按一定配比混合制备成的细胞冷冻保护液,这两种成分都是临床级别的试剂,使用此细胞冷冻保护液冻存细胞,复苏后可直接进行人体回输,不必再进行离心洗涤操作去除冻存液成分,方便了临床医生的操作,也降低了过多体外操作带来细胞制剂污染的风险。
2、本技术方案由于采用了所述CryoSure-DEX40冻存液与人血白蛋白是在冰上混匀的技术手段,所以,可有效地对细胞冷冻保护液起到降温和对细胞的保护作用。
3、本技术方案由于采用了注入细胞冷冻保护液的速度为0.5ml/min-2ml/min的技术手段,所以,可确保细胞均匀地分布在细胞冷冻保护液中,最大限度地降低了冻存液对细胞的伤害,保证了细胞冻存复苏后的高活率。
4、本技术方案由于采用了注入细胞冷冻保护液的速度为1ml/min的技术手段,所以,不但可以确保细胞均匀地分布在细胞冷冻保护液中,而且,还可以保证制备效率。
5、本技术方案由于采用了将所述细胞制剂注入到冻存管或冻存袋中的技术手段,所以,有利于长期液氮冷冻保存和长途运输。
6、本技术方案由于采用了将注入细胞制剂的所述冻存管或冻存袋经过程控降温仪进行程控降温后,放在液氮库中进行长时间保存的技术手段,所以,可有效地保持细胞冻存复苏后的存活率。
7、本技术方案由于采用了将放在液氮库中的细胞制剂取出,放入用于长途运输的液氮罐中的技术手段,所以,有利于细胞制剂的长途运输,突破了之前细胞制剂只能就近使用的局限性。
8、本技术方案由于采用了在使用前,先将所述细胞制剂取出,迅速放入已经预热的水浴锅内,进行快速融化,使细胞复苏的技术手段,所以,可有效地恢复冷冻细胞的活性。
9、本技术方案由于采用了所述水浴锅的预热温度为36℃-38℃技术手段,所以,可以加快细胞的复苏。
10、本技术方案由于采用了所述水浴锅的预热温度为37℃的技术手段,所以,不但可以加快细胞的复苏,而且,还可以防止细胞因温度过高导致复苏活率降低。
11、本技术方案由于采用了在进行快速融化的过程中,边融化边轻轻晃动冻存管或冻存袋的技术手段,所以,有利于细胞制剂均匀地解冻,加快解冻速度。
12、本技术方案由于采用了在进行快速融化的过程中,所述冻存管的管口朝上,融化过程中一直保持冻存管的管口处于水浴锅内的液面之上的技术手段,所以,可防止水浴锅中的水流入冻存管内,造成细胞制剂污染。
13、本技术方案由于采用了使细胞复苏的整个过程持续0.75min-2min的技术手段,所以,可确保细胞制剂完全解冻。
14、本技术方案由于采用了使细胞复苏的整个过程持续1min的技术手段,有利于维持细胞的活性。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液、细胞制剂及制备方法作进一步的详细描述。
1、本实施方式提供了一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,它是一种临床级别的细胞冷冻保护液,用这种冻存保护液制备的细胞制剂主要包括三大类:①干细胞制剂主要包含:80%(v/v)人血白蛋白+20%(v/v)CryoSure-DEX40冻存液+1×107-6×107个间充质干细胞,制剂终体积为8ml。②免疫细胞制剂主要包含:80%(v/v)人血白蛋白+20%(v/v)CryoSure-DEX40冻存液+1×109-2×109个人外周血/脐血源细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK),制剂终体积为20ml。③免疫细胞制剂主要包含:80%(v/v)人血白蛋白+20%(v/v)CryoSure-DEX40冻存液+1×107-2×107个人外周血/脐血源树突状抗原提呈细胞(DC),制剂的终体积为1ml。
2、本实施方式涉及的间充质干细胞制剂,其中治疗的有效剂量为1×106-2×106/kg。
3、将各个浓度的间充质干细胞制剂液氮冻存2周至4周,甚至一个月至六个月,进行复苏后的活率检测,所有样本的细胞活率均在90%以上,具体实验数据如下:
编号 | 每支制剂的细胞数 | 冻存前细胞活率 | 冻存后细胞活率 |
1 | 1.0×107/支 | 99.10% | 93.38% |
2 | 2.0×107/支 | 98.70% | 93.49% |
3 | 4.0×107/支 | 99.30% | 92.05% |
4 | 6.0×107/支 | 98.50% | 92.26% |
注:细胞制剂的终体积均为8ml。即:冻存间充质干细胞无“最佳冻存密度”。
4、调整人血白蛋白和冻存液的比例,使DMSO浓度分别为5%、6%、7%、8%、9%、10%,每份分别冻存1×107个间充质干细胞,冻存2周至4周,甚至一个月至六个月,冻存前活率为95.70%,冻存后活率如下:
DMSO浓度 | 平均活率 |
10% | 91.42% |
9% | 88.24% |
8% | 84.25% |
7% | 81.72% |
6% | 80.91% |
5% | 80.37% |
DMSO浓度为10%时,即人血白蛋白:CryoSure-DEX40冻存液的体积=4:1时,间充质干细胞冻存后的复苏活率较高,是冻存间充质干细胞的最佳DMSO浓度。
5、本发明涉及的细胞因子诱导的杀伤性免疫细胞制剂,按照80%(v/v)人血白蛋白+20%(v/v)CryoSure-DEX40冻存液+1×109-2×109个细胞因子诱导的杀伤性细胞,终体积为20ml。
6、细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂按照细胞密度为5×107个/ml、1×108个/ml、2×108个/ml,DMSO浓度为8%、9%、10%进行细胞冻存,共冻存9支,冻存2周至4周,甚至一个月至六个月,冻存前活率为96.68%,冻存后活率如下:
分组 | 平均活率 |
8%DMSO+5×107个/ml | 75.60% |
8%DMSO+1×108个/ml | 69.01% |
8%DMSO+2×108个/ml | 69.56% |
9%DMSO+5×107个/ml | 79.09% |
9%DMSO+1×108个/ml | 72.10% |
9%DMSO+2×108个/ml | 73.54% |
10%DMSO+5×107个/ml | 87.96% |
10%DMSO+1×108个/ml | 79.14% |
10%DMSO+2×108个/ml | 76.63% |
从实验结果来看,10%DMSO(即人血白蛋白:CryoSure-DEX40冻存液的体积=4:1)+5×107个/ml的密度冻存细胞因子诱导的杀伤性细胞,其复苏后的活率较高,随着细胞浓度的增加及DMSO浓度的降低,细胞冻存复苏后的活率降低。同时,此实验数据与间充质干细胞相比,冻存前后活率下降较快,由此看来细胞因子诱导的杀伤性细胞不建议冻存后复苏回输使用,现培养现回输的方式比较好。但是现在对细胞因子诱导的杀伤性细胞冻存后的复苏活率,并没有明确的质量指标要求,如果复苏后细胞活率能够≥90%,这是最好的实验结果。因此,我们的4份人血白蛋白+1份CryoSure-DEX40冻存液的细胞冷冻保护液(其中DMSO浓度为10%),如果按照复苏后活率≥90%,不适合细胞因子诱导的杀伤性细胞的冻存和长途运输适用;如果按照复苏后活率≥75%,则对细胞因子诱导的杀伤性细胞的冻存和长途运输也是适用的。制备完毕的细胞制剂可放入冻存袋中进行冷冻保存和长途运输。之前我们也曾对细胞因子诱导的杀伤性细胞选择细胞密度为5×107个/ml、1×108个/ml、2×108个/ml,DMSO浓度为5%、6%、7%、8%、9%、10%进行细胞冻存,冻存2周至4周,甚至一个月至六个月后复苏,DMSO浓度范围在5%~7%的样本,复苏后细胞活率均在60%左右,故进行第二次试验时,我们将DMSO浓度范围升高,选择8%、9%、10%三个浓度等级进行细胞冻存及复苏后活率检测的实验。
7、树突状抗原提呈细胞的细胞制剂,不同浓度DMSO活性检测同间充质干细胞制剂。树突状抗原提呈细胞制剂的终体积只有1ml,可放入2ml冻存管内冷冻保存和长途运输。
8、医护人员拿到此细胞冷冻保护液制备的细胞制剂后,只需准备一个水浴锅,将水浴锅温度调整到37℃,将其浸入37℃水中快速融化约1min,即可进行临床回输使用,不必再经过体外的细胞洗涤,医护人员操作方便快捷,也减少了过多体外操作带来的污染风险。
间充质干细胞制剂具体操作步骤:
按照人血白蛋白(≥0.2g/ml):CryoSure-DEX40冻存液的体积比为4:1的比例(即DMSO浓度为10%)进行一定量的冷冻保护液的配制,配制完毕后按照1ml/min的速度缓慢加入离心洗涤好的一定数量的间充质干细胞沉淀中,边加边混匀,使细胞能够均匀地重悬于冷冻保护液中。
将加好冻存保护液的间充质干细胞悬液进行分装,按照8ml/支的规格,分装到10ml无菌冻存管中,经过程控降温仪进行程控降温,放在液氮库中进行长期保存。
待临床有使用需求时,将对应细胞数的细胞制剂取出,放在液氮罐中进行长途运输即可。
细胞制剂运输到目的地后,将装有细胞的10ml冻存管细胞制剂取出,迅速放入已经预热为37℃的水浴锅内(注:冻存管管口朝上,融化过程中一直保持冻存管管口处于液面之上),进行快速融化;边融化边轻轻晃动冻存管,加速冻存状态的细胞制剂快速融化。
整个复苏过程大约持续1min左右,待冻存管内的制剂完全融化后,使用注射器将细胞制剂匀速吸出,进行局部注射或是将其打入90ml生理盐水中进行静脉回输治疗均可。
免疫细胞(CIK:细胞因子诱导的杀伤性细胞)制剂具体操作步骤:
1.按照人血白蛋白(≥0.2g/ml):CryoSure-DEX40冻存液的体积比为4:1的比例(即DMSO浓度为10%)进行一定量的冷冻保护液的配制,配制完毕后按照最佳冻存密度为5×107/ml计算出相应的冷冻保护液的体积,以1ml/min的速度缓慢加入离心洗涤好的相应数量的细胞因子诱导的杀伤性细胞中。
2.将加好冻存保护液的细胞悬液进行分装,按照20ml/袋的规格分装到规格25ml的无菌冷冻袋中,经过程控降温仪进行程控降温,放在液氮库中进行长期保存。
3.待临床有使用需求时,将对应细胞数的细胞制剂取出,放在液氮罐中进行长途运输即可。
4.细胞制剂运输到目的地后,将装有细胞的冻存袋细胞制剂取出,迅速放入已经预热为37℃的水浴锅内(注:融化过程中一直保持冷冻袋全部浸入水浴液面之下),进行快速融化;边融化边轻轻晃动冻存袋,加速冻存状态的细胞制剂快速融化。
5.整个复苏过程大约持续1min左右,待冻存袋内的制剂完全融化后,对冻存袋的口部进行消毒后,即可直接进行临床静脉输注。
免疫细胞(DC:树突状抗原提呈细胞)制剂具体操作步骤:
1.按照人血白蛋白(≥0.2g/ml):CryoSure-DEX40冻存液的体积比为4:1的比例(即DMSO浓度为10%)进行一定量的冷冻保护液的配制,按照1×107/ml-2×107/ml的冻存密度,计算出所需冷冻保护液的体积,再将计算好的一定体积的细胞冷冻保护液按照1ml/min的速度缓慢加入离心洗涤好的一定数量的树突状抗原提呈细胞沉淀中,边加边混匀,使细胞能够均匀地重悬于冷冻保护液中。
2.将加好冻存保护液的细胞悬液,按照1ml/支的规格进行分装,分装到2ml无菌冻存管中,经过程控降温仪进行程控降温,放在液氮库中进行长期保存。
3.待临床有使用需求时,将对应细胞数的细胞制剂取出,放在液氮罐中进行长途运输即可。
4.细胞制剂运输到目的地后,将装有细胞的2ml冻存管细胞制剂取出,迅速放入已经预热为37℃的水浴锅内(注:冻存管管口朝上,融化过程中一直保持冻存管管口处于液面之上),进行快速融化;边融化边轻轻晃动冻存管,加速冻存状态的细胞制剂快速融化。
5.整个复苏过程大约持续1min左右,待冻存管内的制剂完全融化后,使用注射器将细胞制剂匀速吸出,进行局部注射或是将其打入90ml生理盐水中进行静脉回输治疗均可。
本实施方式的有益效果如下。
1.本实施方式的细胞冷冻保护液主要适用于间充质干细胞,也适用于人免疫细胞(树突状抗原提呈细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞)的冻存及长途运输。
2.本实施方式的细胞制剂加入了可直接用于临床回输的CryoSure-DEX40冻存液,并且以液氮作为长途运输的媒介,有效地保证了细胞制剂经过长途运输后,其细胞活性不受影响,极大地扩大了细胞制剂应用的地理范围。
3.医护工作者拿到细胞制剂后,只需37℃水浴快速融化后就可直接进行输注,无需将融化后的细胞制剂进行洗涤或其他体外处理,极大地简化了医护工作者的临床操作,也避免了过多的体外操作带来的污染风险。
4.按照人血白蛋白(≥0.2g/ml):CryoSure-DEX40冻存液的体积比范围为4:1-9:1的比例(即DMSO浓度范围为5%-10%)进行冷冻保护液的配制,配制完毕后按照1ml/min的速度缓慢加入离心洗涤后的细胞沉淀中,边加边混匀,使细胞能够均匀地重悬于冷冻保护液中。并且CryoSure-DEX40冻存液已经用于脐血造血干细胞的冷冻储存和临床直接回输治疗(冻存后的脐血终体积为25ml,脐血造血干细胞悬液:CryoSure-DEX40冻存液的体积比=4:1,即:CryoSure-DEX40冻存液的体积含量为5.0ml,DMSO终浓度为10%),患者几乎无副反应或是副反应极少,并且副反应可尽快恢复。脐带血造血干细胞的临床应用,已经证实CryoSure-DEX40冻存液对人体无害,可直接用于临床回输。
5.使用此细胞冷冻保护液制备的间充质干细胞制剂单份的终体积只有8ml,所冻存的细胞数范围为:1×107-6×107,合适的冻存密度为:1.25×106/ml-7.50×106/ml,在此密度范围内的细胞,细胞冷冻保护液的制备按照人血白蛋白:CryoSure-DEX40冻存液的体积比为4:1-9:1进行配制(即:CryoSure-DEX40冻存液的体积含量为0.8ml~1.6ml,DMSO的浓度为5%-10%),复苏后的活率均≥80%,大于目前要求的间充质干细胞复苏活率≥75%的质量标准;若按照人血白蛋白:CryoSure-DEX40冻存液的体积比为4:1-5:1进行配制(即:CryoSure-DEX40冻存液的体积含量为1.3ml~1.6ml,DMSO的浓度为8%-10%),复苏后的细胞活率均≥90%。
6.使用此细胞冷冻保护液制备的人外周血/脐血免疫细胞(主要是细胞因子诱导的杀伤性细胞)制剂的终体积为20ml,所冻细胞数范围为:1×109-2×109,合适冻存密度为:0.5×108/ml-1.0×108/ml,最佳冻存密度为0.5×108/ml;按照人血白蛋白:冻存液的体积比为4:1-5:1进行冷冻保护液的配制(即:CryoSure-DEX40冻存液的体积含量为3.3ml~4.0ml,DMSO的浓度为8%-10%),配制完毕后缓慢加入离心洗涤后的细胞沉淀中,边加边混匀,使细胞能够均匀地重悬于冷冻保护液中,复苏后的活率均≥70%。
7.用此冻存液制备的人外周血/脐血免疫细胞(主要是树突状抗原提呈细胞)制剂的终体积为1ml,所冻存的细胞数范围为:1×107-2×107,合适的冻存密度为:1×107/ml-2×107/ml,最佳冻存密度为1×107/ml;在此密度范围内的细胞,细胞冷冻保护液的制备按照人血白蛋白:CryoSure-DEX40冻存液的体积比为4:1-9:1进行配制(即:CryoSure-DEX40冻存液的体积含量为0.1ml~0.2ml,DMSO的浓度为5%-10%),复苏后的活率均≥80%;若按照人血白蛋白:CryoSure-DEX40冻存液的体积比为4:1-5:1进行配制(即:CryoSure-DEX40冻存液的体积含量为0.17ml~0.2ml,DMSO的浓度为8%-10%),复苏后的细胞活率均≥90%。
Claims (10)
1.一种可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,其特征在于:所述细胞冷冻保护液是包含有人血白蛋白和CryoSure-DEX40冻存液的混合液体。
2.根据权利要求1所述的可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,其特征在于:所述人血白蛋白的浓度为≥0.2g/ml。
3.根据权利要求1所述的可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,其特征在于:所述人血白蛋白的含量和CryoSure-DEX40冻存液的含量按体积份数比为,
人血白蛋白4-9、
CryoSure-DEX40冻存液1。
4.根据权利要求1所述的可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,其特征在于:所述细胞冷冻保护液中DMSO的浓度为5%-10%。
5.一种可使细胞长时间存活的细胞制剂,其特征在于:所述细胞制剂包括如权利要求1至4之一所述的细胞冷冻保护液和细胞。
6.根据权利要求5所述的可使细胞长时间存活的细胞制剂,其特征在于:所述细胞是干细胞或免疫细胞;含有干细胞的所述细胞制剂是干细胞制剂,含有免疫细胞的所述细胞制剂是免疫细胞制剂;所述干细胞是间充质干细胞,所述免疫细胞是细胞因子诱导的杀伤性细胞或树突状抗原提呈细胞;含有间充质干细胞的所述细胞制剂是间充质干细胞制剂,含有细胞因子诱导的杀伤性细胞的所述细胞制剂是细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂,含有树突状抗原提呈细胞的所述细胞制剂是树突状抗原提呈细胞制剂。
7.根据权利要求6所述的可使细胞长时间存活的细胞制剂,其特征在于:
所述间充质干细胞制剂中间充质干细胞的密度为1.25×106个/ml-7.50×106个/ml;
所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂中细胞因子诱导的杀伤性细胞的密度为0.5×108个/ml-1.0×108个/ml;
所述树突状抗原提呈细胞制剂中树突状抗原提呈细胞的密度为1×107个/ml-2×107个/ml。
8.根据权利要求7所述的可使细胞长时间存活的细胞制剂,其特征在于:
所述间充质干细胞制剂每一剂的体积为8ml;
所述细胞因子诱导的杀伤性细胞制剂每一剂的体积为20ml;
所述树突状抗原提呈细胞制剂每一剂的体积为1ml。
9.一种如权利要求5至权利要求8之一所述可使细胞长时间存活的细胞制剂的制备方法,其特征在于:先将CryoSure-DEX40冻存液与人血白蛋白混匀形成如权利要求1至4之一所述可使细胞长时间存活的细胞冷冻保护液,再将该细胞冷冻保护液缓慢注入洗涤好的细胞沉淀中,边注入边混匀,最后形成所述细胞制剂。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于:所述CryoSure-DEX40冻存液与人血白蛋白是在冰上混匀的;注入细胞冷冻保护液的速度为0.5ml/min-2ml/min;将所述细胞制剂注入到冻存管或冻存袋中;将注入细胞制剂的所述冻存管或冻存袋经过程控降温仪进行程控降温后,放在液氮库中进行长时间保存。
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN107751186A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-03-06 | 北京科兴生物制品有限公司 | 一种快速冻存及复苏细胞的方法 |
CN110338189A (zh) * | 2019-07-09 | 2019-10-18 | 浙江优牙生物科技有限公司 | 一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103563888A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-02-12 | 北京永泰免疫应用科技有限公司 | 细胞冻存液 |
CN105076116A (zh) * | 2015-09-17 | 2015-11-25 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法 |
CN105132370A (zh) * | 2015-09-28 | 2015-12-09 | 丛秀丽 | 一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法 |
-
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103563888A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-02-12 | 北京永泰免疫应用科技有限公司 | 细胞冻存液 |
CN105076116A (zh) * | 2015-09-17 | 2015-11-25 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法 |
CN105132370A (zh) * | 2015-09-28 | 2015-12-09 | 丛秀丽 | 一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107751186A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-03-06 | 北京科兴生物制品有限公司 | 一种快速冻存及复苏细胞的方法 |
CN107751186B (zh) * | 2017-10-25 | 2021-01-22 | 北京科兴生物制品有限公司 | 一种快速冻存及复苏细胞的方法 |
CN110338189A (zh) * | 2019-07-09 | 2019-10-18 | 浙江优牙生物科技有限公司 | 一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液 |
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