JPWO2009057537A1 - ヒト間葉系幹細胞含有医薬組成物 - Google Patents

Abstract

培養後のヒト間葉系幹細胞からの凍結された医薬組成物の製造方法及びヒト間葉系幹細胞含有の医薬組成物が開示されている。当該方法は，（ａ）培養容器中のヒト間葉系幹細胞にトリプシンを添加して細胞を該培養容器の表面から剥離させる工程と，（ｂ）剥離された細胞にヒト血清アルブミンを含む重炭酸リンゲル液を加えてトリプシンの反応を停止させると共に，ヒト血清アルブミンを含む重炭酸リンゲル液により細胞を洗浄する工程と，（ｃ）細胞を，ヒト血清アルブミン及びジメチルスルホキシドを含有する重炭酸リンゲル液に懸濁させる工程と，（ｄ）得られた懸濁液を，内容物の凍結を許容する容器に封入する工程と，そして（ｅ）容器に封入された懸濁液を凍結させる工程とをこの順で含んでなる，ヒト間葉系幹細胞を含んでなる凍結された医薬組成物の製造方法である。

Description

本発明は，ヒト間葉系幹細胞を含有する凍結した医薬組成物及びその製造方法に関する。

間葉系幹細胞は骨髄中で発見された多能性の幹細胞である。間葉系幹細胞は，骨細胞，心筋細胞，脂肪細胞等多くの細胞への分化能を有していることから，生体に投与（注射）し患部に移行させて必要な組織へと分化させるという方式での再生医療への応用が期待されている（特許文献１及び特許文献２参照）。また，間葉系幹細胞は，生体に投与することでＴ細胞を介した免疫反応を制御することができ，移植時における拒絶反応を抑制する薬剤として使用できることも示されている（特許文献３参照）。

このような間葉系幹細胞の多分化能及び拒絶反応を抑制する効果に着目して，ヒト間葉系幹細胞を用いた臨床研究が行われている。例えば，米国を中心にして，骨髄移植の際に起こる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に対する，患者とは遺伝子型の異なる他人から採取され培養されたヒト間葉系幹細胞の治療効果について，臨床試験がおこなわれており，その薬効が証明されつつある（非特許文献１及び非特許文献２参照）。また，ヒト間葉系幹細胞の，心筋梗塞後の心筋再生等への臨床的応用も試みられている（非特許文献３参照）。

ヒト間葉系幹細胞は骨髄液中に存在することが知られているが，その量は極めて少ない。骨髄液中に限らず，ヒト間葉系幹細胞は，脂肪組織（特許文献４参照），歯髄細胞（特許文献５参照），胎盤組織又は臍帯組織（特許文献６参照）等，種々の組織から入手できることが知られているが，いずれもその量はごく僅かである。

上記のように，ヒト間葉系幹細胞は生体内にごく僅かしか存在しない。しかしながら，人工培地を用いて培養し増殖させることにより，骨髄から得られる僅かな個数のヒト間葉系幹細胞から大量のヒト間葉系幹細胞を調製することができる（特許文献７参照）。このようにして大量に調製されたヒト間葉系幹細胞は，他の培養細胞と同様に，凍結状態で保存することができ，凍結保存には例えば，９０％のウシ胎児血清および１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結培地を用い得ることが知られている（特許文献８参照）。ＧＶＨＤ，心筋再生等の治療用にヒト間葉系幹細胞を医薬品として広く医療施設に供給するためには，細胞を使用時まで変質のおそれなくそのまま保存しておくことができるよう，ヒト間葉系幹細胞も，凍結細胞としてパッケージされて医療機関等に搬送されるものと予想される。

従って，ヒト間葉系幹細胞をヒトに非経口直接投与される医薬品として市場に供給するためには，同細胞の増殖に用いた培地を除去するために細胞を洗浄する工程，及び洗浄後の細胞をヒトへの投与に適した溶液中で凍結する工程を経ることが必要である。一般に，細胞の洗浄及び凍結，更にその後の使用に際した解凍は，何れも細胞に大きなストレスを与え，それにより一部の細胞が障害を受けて死滅し易い。ヒト間葉系幹細胞も，これを凍結した状態で医薬品として供給する場合，薬効の発現に必要な生細胞数を維持するために，また医薬品としての品質管理の観点からも，培養後の細胞から医薬品としての凍結細胞が製造されそれが使用に際して解凍されるまでの過程で，細胞の大幅な死滅を生じさせるのは望ましくない。

また，ヒト間葉系幹細胞を静脈内注射により患者に投与する場合，細胞を解凍後に凍結バッグ中の他の点滴液に添加することも想定し得る。従って，解凍後に他の点滴液に添加して希釈した状態で，細胞が安定に保持されることが望ましい。

特表平１０−５１２７５６ 特表２００２−５１１０９４ 米国特許第６３２８９６０号 特開２００４−１２９５４９ 特開２００４−２０１６１２ 特開２００４−２１０７１３ 米国特許第５４８６３５９号 特表平０７−５００００１ Transplantation. 2006; 81(10):1390-7 Br J Haematol. 2007; 137(2):87-98 Arch Iran Med. 2007; 10(4):467-73

上記背景の下で，本発明は，培養後のヒト間葉系幹細胞を洗浄し，凍結された医薬組成物とし，そしてそれが使用時に解凍されるまでの過程において，細胞の死滅量を最少にすることができる製造方法，及び細胞の死滅量を最少にすることのできるヒト間葉系幹細胞含有の医薬組成物を提供することを目的とする。また，本発明は，解凍後に他の点滴液に添加して希釈した状態で，細胞を安定に保持することができるヒト間葉系幹細胞含有の医薬組成物を提供することをも目的とする。

本発明者らは，増殖のための培養後のヒト間葉系幹細胞から培地を除去するための洗浄において，ヒト間葉系幹細胞は極めて死滅し易いが，洗浄をヒト血清アルブミンを含有する重炭酸リンゲル液で行うことにより細胞の死滅を防止できることを見出した。更にまた，本発明者らは，ヒト間葉系幹細胞の凍結保存及び解凍に関しても，細胞を懸濁させておく溶液としてヒト血清アルブミンを含有する重炭酸リンゲル液をベースとしこれにジメチルスルホキシドを添加して調製した溶液を用いることにより，細胞の死滅を顕著に抑制することができることを見出した。本発明は，これらの発見に基づくものである。

すなわち，本発明は以下を提供する。
１．ヒト血清アルブミンとジメチルスルホキシドとを含有する重炭酸リンゲル液中にヒト間葉系幹細胞を含んでなる，医薬組成物。
２．該重炭酸リンゲル液が，電解質として重炭酸イオン，ナトリウムイオン，カリウムイオン，カルシウムイオン，及び塩素イオンを含み，ナトリウムイオン濃度が１３０〜１４５ｍＥｑ，生理食塩水に対する浸透圧比が０．９〜１．１であり，そしてｐＨが６．８〜７．８のものである，上記１の医薬組成物。
３．該重炭酸リンゲル液が，２２〜２８ｍＥｑ／Ｌの重炭酸イオンを含有するものである，上記１又は２の医薬組成物。
４．該重炭酸リンゲル液が，電解質としてマグネシウムイオン及びクエン酸イオンを更に含むものである，上記１ないし３の何れかの医薬組成物。
５．該重炭酸リンゲル液が，１２０〜１５０ｍＥｑ／Ｌのナトリウムイオンと，３．６〜４．４ｍＥｑ／Ｌのカリウムイオンと，２．７〜３．３ｍＥｑ／Ｌのカルシウムイオンと，０．９〜１．１ｍＥｑ／Ｌのマグネシウムイオンと，１００〜１２５ｍＥｑ／Ｌの塩素イオンと，２２〜２８ｍＥｑ／Ｌの重炭酸イオンと，４．５〜５．５ｍＥｑ／Ｌのクエン酸イオンを含むものである，上記１ないし４の何れかの医薬組成物。
６．ヒト血清アルブミンの濃度が０．１〜１０Ｗ／Ｖ％である，上記１ないし５の何れかの医薬組成物。
７．ヒト血清アルブミンの濃度が３〜８Ｗ／Ｖ％である，上記１ないし５の何れかの医薬組成物。
８．ジメチルスルホキシドの濃度が８〜１２Ｗ／Ｖ％である，上記１ないし７の何れかの医薬組成物。
９．該ヒト間葉系幹細胞が，ヒト骨髄由来のものである，上記１ないし８の何れかの医薬組成物。
１０．該ヒト間葉系幹細胞を１×１０⁵〜１×１０⁸個／ｍＬの密度で含むものである，上記１ないし９の何れかの医薬組成物。
１１．該ヒト間葉系幹細胞を１×１０⁶〜１×１０⁷個／ｍＬの密度で含むものである，上記１ないし９の何れかの医薬組成物。
１２．内容物の凍結を許容する密封された容器に封入された形態のものである，上記１ないし１１の何れかの医薬組成物。
１３．該容器内に１〜３０ｍＬの体積で封入された形態のものである，上記１ないし１２の何れかの医薬組成物。
１４．凍結された状態のものである，上記１ないし１３の何れかの医薬組成物。
１５．培養容器中で増殖させたヒト間葉系幹細胞を，該培養容器から回収して，培養に用いられた培地を含まないヒト間葉系幹細胞を調製するための方法であって，
（ａ）該培養容器中のヒト間葉系幹細胞にトリプシンを添加してヒト間葉系幹細胞を該培養容器の表面から剥離させる工程と，
（ｂ）剥離されたヒト間葉系幹細胞にヒト血清アルブミンを含む重炭酸リンゲル液を加えてトリプシンの反応を停止させると共に，該ヒト血清アルブミンを含む重炭酸リンゲル液により該ヒト間葉系幹細胞を洗浄する工程と
を含んでなるものである，方法。
１６．該重炭酸リンゲル液が，電解質として重炭酸イオン，ナトリウムイオン，カリウムイオン，カルシウムイオン，及び塩素イオンを含み，ナトリウムイオン濃度が１３０〜１４５ｍＥｑ，生理食塩水に対する浸透圧比が０．９〜１．１であり，そしてｐＨが６．８〜７．８のものである，上記１５の方法。
１７．該重炭酸リンゲル液が，２２〜２８ｍＥｑ／Ｌの重炭酸イオンを含有するものである，上記１５又は１６の方法。
１８．該重炭酸リンゲル液が，電解質としてマグネシウムイオン及びクエン酸イオンを更に含むものである，上記１５ないし１７の何れかの方法。
１９．該重炭酸リンゲル液が，１２０〜１５０ｍＥｑ／Ｌのナトリウムイオンと，３．６〜４．４ｍＥｑ／Ｌのカリウムイオンと，２．７〜３．３ｍＥｑ／Ｌのカルシウムイオンと，０．９〜１．１ｍＥｑ／Ｌのマグネシウムイオンと，１００〜１２５ｍＥｑ／Ｌの塩素イオンと，２２〜２８ｍＥｑ／Ｌの重炭酸イオンと，４．５〜５．５ｍＥｑ／Ｌのクエン酸イオンを含むものである，上記１５ないし１８の何れかの方法。
２０．工程（ｂ）における重炭酸リンゲル液中のヒト血清アルブミンの濃度が０．５〜３Ｗ／Ｖ％である，上記１５ないし１９の何れかの方法。
２１．ヒト間葉系幹細胞を含んでなる凍結された医薬組成物の製造方法であって，
（ｃ）上記１５ないし２０の何れかの方法により調製されたヒト間葉系幹細胞を，ヒト血清アルブミン及びジメチルスルホキシドを含有する重炭酸リンゲル液に懸濁させる工程と，
（ｄ）上記（ｃ）により得られた懸濁液を，内容物の凍結を許容する容器に封入する工程と，そして
（ｅ）上記（ｄ）により該容器に封入された懸濁液を凍結させる工程と
をこの順で含んでなる，製造方法。
２２．工程（ｃ）における重炭酸リンゲル液中のヒト血清アルブミンの濃度が０．１〜１０Ｗ／Ｖ％である，上記２１の製造方法。
２３．工程（ｃ）における重炭酸リンゲル液中のヒト血清アルブミンの濃度が３〜８Ｗ／Ｖ％である，上記２１の製造方法。
２４．工程（ｃ）における重炭酸リンゲル液中のジメチルスルホキシドの濃度が８〜１２Ｗ／Ｖ％である，上記２１ないし２３の何れかの製造方法。
２５．工程（ｃ）においてヒト間葉系幹細胞を１×１０⁵〜１×１０⁸個／ｍＬの密度になるように懸濁させるものである，上記２１ないし２４の何れかの製造方法。
２６．工程（ｃ）においてヒト間葉系幹細胞を１×１０⁶〜１×１０⁷個／ｍＬの密度になるように懸濁させるものである，上記１５ないし２４の何れかの製造方法。

本発明の医薬組成物は，凍結保存及び解凍に伴うヒト間葉系幹細胞の死滅を効率的に防止して，高い細胞生存率を達成することができる。このため，本発明の医薬組成物によれば，凍結工程に付されるヒト間葉系幹細胞懸濁液と，凍結保存された本発明の医薬組成物を使用のために解凍した直後のヒト間葉系幹細胞との間で，生細胞数の減少が最小限にくい止められ，医薬品としての品質の維持管理が極めて容易となる。また，本発明の医薬組成物は，解凍後に点滴液に希釈した状態においても，高い細胞生存率を維持することができる。従って，本発明の医薬組成物は，解凍後，点滴バック中の他の点滴液に添加して，希釈してから点滴液と共に患者に投与することもでき，実用性が高い。

また，ヒト血清アルブミン含有の重炭酸リンゲル液を用いる本発明のヒト間葉系幹細胞の調製方法によれば，培養後のヒト間葉系幹細胞の洗浄（培地の除去）に伴う細胞の死滅が確実に防止できる。これは，重炭酸リンゲル液以外の溶液を用いる場合におけるヒト間葉系幹細胞の極めて高い死亡率（低い生存率）とは対照的であり，本発明の方法に際立った利点を与えるものである。更に，同調製方法を含んだ，本発明によるヒト間葉系幹細胞を含んでなる凍結された医薬組成物の製造方法は，培養後のヒト間葉系幹細胞の個数を細胞の死により減少させることなしに，ヒトへの投与に適した医薬組成物を調製できると共に，解凍したときの生細胞数の減少が最小限に止まる医薬組成物を提供することができる，という優れた利点を有する。従って，この製造方法によれば，ヒト間葉系幹細胞含有の，均一な品質の凍結された医薬組成物を安定して製造することができる。

各調製法におけるヒト間葉系幹細胞の生存率の推移を示すグラフ

ヒト間葉系幹細胞は，それが由来するヒトとは遺伝子型の異なる患者に注射によって投与しても，拒絶反応等の免疫反応を惹起することがなく，逆に患者の炎症組織その他傷害のある組織に自ら集積して，亢進した免疫反応を鎮め，或いは欠損した組織で増殖・分化して組織を修復するなど，際立った治療効果をあらわす。患者を治療するために，当該患者以外のヒト由来の間葉系幹細胞を投与できることから，本発明の医薬組成物は，予め特定個人から採取して培養増殖させたヒト間葉系幹細胞を用いて製造し凍結保存しておき，医療施設にて解凍して，当該間葉系幹細胞が由来するドナーとは別人である患者を治療するために投与される。

本発明の医薬組成物は，ヒト血清アルブミンとジメチルスルホキシドとを含有する重炭酸リンゲル液中にヒト間葉系幹細胞を含んでなる。本発明の医薬組成物は，医療施設での長期間にわたり得る保管期間中の組成物の安定性を確保するため，通常，凍結させた状態で医療市場に供給される。

本発明において，重炭酸リンゲル液とは，重炭酸イオンを含有するタイプの電解質液たる輸液（リンゲル液）である。ヒト間葉系幹細胞は，本発明において，アルブミンとジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とを含有する重炭酸イオン中に，懸濁された状態で（通常，凍結物として）提供され，例えば，液体窒素などを用いて，凍結させた状態（例えば，約−１３０℃）のまま使用時まで保管される。細胞一般と同様，そのような凍結状態では，本発明の医薬組成物中においてヒト間葉系幹細胞も，半永久的に維持できる。

本発明において重炭酸リンゲル液は，好ましくは，電解質として重炭酸イオン，ナトリウムイオン，カリウムイオン，カルシウムイオン，及び塩素イオンを含み，ナトリウムイオン濃度が１３０〜１４５ｍＥｑ，生理食塩水に対する浸透圧比が０．９〜１．１である。重炭酸リンゲル液のｐＨは，６．８〜７．８であることが好ましい。また，重炭酸イオンの濃度は，特に好ましくは，２２〜２８ｍＥｑ／Ｌであるが，必ずしもこれに限定されず，これの範囲より幾分低い又は幾分高い濃度としてもよい。

また，上記において，重炭酸リンゲルは，マグネシウムイオンを含有していてもよく，及び／又は，クエン酸イオンを含有していてもよい。重炭酸リンゲル液として取分け好ましい一例は，次の組成ＰＰのものである。

＜組成ＰＰ＞
ナトリウムイオン・・・・・・・１２０〜１５０ｍＥｑ／Ｌ
カリウムイオン・・・・・・・・３．６〜４．４ｍＥｑ／Ｌ
カルシウムイオン・・・・・・・２．７〜３．３ｍＥｑ／Ｌ
マグネシウムイオン・・・・・・０．９〜１．１ｍＥｑ／Ｌ，
塩素イオン・・・・・・・・・・１００〜１２５ｍＥｑ／Ｌ，
重炭酸イオン・・・・・・・・・２２〜２８ｍＥｑ／Ｌ
クエン酸イオン・・・・・・・・４．５〜５．５ｍＥｑ／Ｌ

また，そのような重炭酸リンゲル液の一具体例として，次の組成Ｅのものを挙げることができる。
＜組成Ｅ＞
ナトリウムイオン・・・・・・・１３５ｍＥｑ／Ｌ
カリウムイオン・・・・・・・・４ｍＥｑ／Ｌ
カルシウムイオン・・・・・・・３ｍＥｑ／Ｌ
マグネシウムイオン・・・・・・１ｍＥｑ／Ｌ
塩素イオン・・・・・・・・・・１１３ｍＥｑ／Ｌ
重炭酸イオン・・・・・・・・・２５ｍＥｑ／Ｌ
クエン酸塩イオン・・・・・・・５ｍＥｑ／Ｌ

本発明の医薬組成物において，ヒト血清アルブミンの濃度は０．１〜１０Ｗ／Ｖ％とするのが好ましく，３〜８Ｗ／Ｖ％とするのが更に好ましい。濃度の好適な一例は，５Ｗ／Ｖ％である。ヒト血清アルブミンは，ヒト血清から調製されたものであってよいが，これに限らず，遺伝子組換え体ヒト血清アルブミンでもよい。

本発明の医薬組成物において，ジメチルスルホキシドの濃度は，８〜１２Ｗ／Ｖ％とするのが好ましく，濃度の好適な一例は，１０Ｗ／Ｖ％である。

本発明の医薬組成物において，ヒト間葉系幹細胞は，骨髄，脂肪組織，歯髄細胞，胎盤組織，臍帯組織等，如何なる組織から取得されたものでも使用することができる。このうち，入手の容易さなどの観点から，骨髄由来のものが好ましい。また，ヒト間葉系幹細胞の生細胞の濃度は，１×１０⁵〜１×１０⁸個／ｍＬとするのが好ましく，１×１０⁶〜１×１０⁷個／ｍＬとするのが更に好ましい。密度の好適な一例は，７．７×１０⁶個／ｍＬである。

また，上記発明の医薬組成物は，密封容器に封入して凍結することができる。これに用いられる密封容器は，細胞を封入してこれを凍結保存することができるものである限り特に限定はなく，適宜の形態であってよい。例えば，医療分野で広く用いられている点滴バッグと同様の素材，形態のものを用いることができる。１つの容器に封入される当該医薬組成物の体積も，治療目的に合わせて適宜設定すればよいが，重症度を異にする種々の疾患に対して本発明の医薬組成物が広く用いられ得ることを考慮すれば，例えば１〜３０ｍＬとしておくことができ，また，過度に多くの製品ラインを取り揃えることによる余分なコストを考慮すれば，例えば１０〜２０ｍＬ，或いは１５ｍＬ等としておくことができる。このようにして密封容器に封入され凍結状態で医療機関に搬入された本発明の医薬組成物は，医療機関において解凍されて患者に非経口的に（例えば，注射あるいは点滴静注により）投与される。投与経路としては，静脈内，筋肉内，皮下，粘膜下，腹腔内，眼内その他適宜の部位への注射が可能である。このとき，本発明の医薬組成物をそのまま患者に投与してもよく，また点滴バック中の他の点滴液に添加して，希釈してから点滴液と共に投与してもよい。

本発明の医薬組成物を製造は，培養容器中で増殖させたヒト間葉系幹細胞を，該培養容器から回収して，培養に用いられた培地を含まないヒト間葉系幹細胞を調製し，これをヒト血清アルブミン及びジメチルスルホキシドを含有する重炭酸リンゲル液に懸濁させて，容器に封入し，凍結させることによって行われる。

培養容器中で増殖させたヒト間葉系幹細胞は，培養容器の表面に接着しており，これを容器表面から剥離させるためには培養容器中のヒト間葉系幹細胞にトリプシンが添加される。トリプシンの添加により，細胞を培養容器壁から剥離させる方法は周知であり，トリプシンの添加量は当業者が適宜設定できる事項である。例えば，０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いることができる。トリプシンの添加により容器表面から剥離されたヒト間葉系幹細胞には，次いで，ヒト血清アルブミンを含む重炭酸リンゲル液が加えられ，それによりトリプシンの反応が停止され，続いて，細胞は，ヒト血清アルブミンを含む重炭酸リンゲル液により洗浄される。この洗浄工程は，培養して増殖させたヒト間葉系幹細胞の懸濁液に含まれる培養用培地やトリプシン等の夾雑物を除去するための工程である。洗浄工程は，上記の夾雑物が実質的に除去されるものであれば適宜の装置を用いて適宜の手順で行えばよく，例えば市販の閉鎖系自動細胞洗浄装置を用いて，及び／又は遠心により行うことができるが，これらに限られない。また，洗浄工程における洗浄効率〔（洗浄工程後の夾雑物の濃度／洗浄工程前の夾雑物の濃度）倍〕は所望により，１００〜１００万倍に調整することができる。この洗浄工程により，細胞を増殖させるのに用いた培地及び添加されたトリプシン等の夾雑物が実質的に除去され，それら夾雑物を含まないヒト間葉系幹細胞が調製される。この洗浄工程において，ヒト血清アルブミンを含む重炭酸リンゲル液の使用は，生細胞数を減少させないためには必須である。ここにおけるヒト血清アルブミンの濃度は，０．１〜１０Ｗ／Ｖ％の範囲であればよい。濃度は，後述の凍結時に用いるアルブミン及びジメチルスルホキシドを含有する重炭酸リンゲル液中のアルブミン濃度よりも低くてよいが，同じであってもよく，それによっても余分なコストが掛かることを除き，特段の支障はない。より好ましくは，この洗浄段階におけるヒト血清アルブミンの濃度は０．５〜３Ｗ／Ｖ％，更に好ましくは０．５〜２Ｗ／Ｖ％であり，濃度の好適な一例は，１．２Ｗ／Ｖ％である。なおヒト血清アルブミンは，ヒト血清から調製されたものであってよいが，これに限らず，遺伝子組換え体ヒト血清アルブミンでもよい。

上記において調製された，細胞の増殖に用いた培地（及び後に添加されたトリプシン）を含まないヒト間葉系幹細胞を凍結させて，本発明の凍結された医薬組成物を製造するに当たっては，同細胞を，ヒト血清アルブミン及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する重炭酸リンゲル液中に懸濁させる。この工程において用いる重炭酸リンゲル液中のヒト血清アルブミンの濃度は，０．１〜１０Ｗ／Ｖ％とすることができるが，３〜８Ｗ／Ｖ％であることがより好ましい。濃度の好適な一例は，５Ｗ／Ｖ％である。また，この工程におけるジメチルスルホキシドの好ましい濃度は，８〜１２Ｗ／Ｖ％であり，濃度の好適な一例は，１０Ｗ／Ｖ％である。

上記で得られたヒト間葉系幹細胞を含んだ懸濁液の凍結は，細胞の凍結保存において一般に行われているところに従って行うことができる。例えば，−６℃までは1分当たり１℃ずつ下げ，その後は急速冷凍し，−１３０℃で凍結保存する等の手順を用いることができる。凍結保存には，液体窒素を用いることができる。

以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。

〔ヒト間葉系幹細胞の培養〕
凍結保存したヒト間葉系幹細胞（約２×１０⁸個）を，３７℃の恒温槽中で融解させ，予め３７℃に加温しておいた１．５Ｌの培養用培地〔４ｍｍｏｌ／Ｌ のＬ−アラニルＬ―グルタミン及び１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（HyClone Laboratories, Inc.）〕に懸濁させた後，培養容器（培養面積６３００ｃｍ²）に播種した。３〜４日毎に培養用培地を交換しながら，５％ＣＯ₂存在下，３７℃で細胞がコンフルエントになるまで培養した。

〔ヒト間葉系幹細胞の洗浄〕
培養容器から培地を除去し，４００ｍＬの０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（インビトロゲン社）を細胞に接触させて３７℃で１５分間静置し，細胞を培養容器から剥離させた。１００ｍＬの細胞洗浄液〔１．２％のヒト血清アルブミン（献血アルブミン−ニチヤク，日本製薬）を含む酢酸リンゲル液（PlasmaLyteA，バクスター社）〕を添加して酵素反応を停止させ，約５×１０⁷個ずつに分割した。分割後の細胞を一部採取し生存率の測定に供した（洗浄工程前）。分割した細胞懸濁液（約５×１０⁷個の細胞を含む）を，それぞれ表1の調製法１〜３に示した洗浄液を用いて，下記の手法で洗浄した。

細胞懸濁液を分割し，閉鎖系自動細胞洗浄装置（CytoMate Cell Processing System, 4R9860，バクスター社）に移し，洗浄効率を３００倍に設定して，表１に示した洗浄液でそれぞれ洗浄した。洗浄後の細胞を一部採取し生存率の測定に供した（洗浄工程後）。調製法１及び２では酢酸リンゲル液〔それぞれPlasmaLyteA（バクスター社），フィジオ140（大塚製薬）〕を，調製法３では重炭酸リンゲル液〔ビカーボン注（味の素）〕を用い，それぞれにヒト血清アルブミン１．２Ｗ／Ｖ％を添加して調製した溶液を洗浄液とした。表２に各洗浄液の組成を，表３に各洗浄液の電解質濃度をそれぞれ示す。

〔遠心〕
上記「ヒト間葉系幹細胞の洗浄」の工程における閉鎖系自動細胞洗浄装置による細胞の洗浄終了後，細胞懸濁液を遠心（１５００ｒｐｍ，１０分）し上清を除去した。細胞を洗浄液で懸濁し，再度遠心（１５００ｒｐｍ，１０分）し上清を除去した。遠心後の細胞を一部採取し生存率の測定に供した（遠心工程後）。

〔ヒト間葉系幹細胞の凍結保存〕

生細胞の濃度が１．５３×１０⁷個／ｍＬとなるように各洗浄液で細胞を懸濁させ，更にこれに表１に示した凍結保存液〔２０％ＤＭＳＯ（Edwards Lifescience Rsearch Medical Inc.），８．８％ヒト血清アルブミン（日本製薬）を含むリンゲル液〕を等量加えて混和し，１ｍＬのチューブに分注した。調製法１〜３によるヒト間葉系幹細胞含有凍結保存液の最終組成を表４に示す。

上記調製法１〜３で調製されチューブ内に分注されたヒト間葉系幹細胞含有凍結保存液を，−６℃までは１分当たり１℃の速度で温度を低下させ，その後は急速冷凍し，−１３０℃で凍結保存した。

上記により凍結保存したヒト間葉系幹細胞（約２×１０⁸個）を，３７℃の恒温槽中で融解させた後，予め３７℃に加温した１０倍容の培養用培地で希釈し，一部を生存率の測定に供した（凍結−解凍後）。

〔ヒト間葉系幹細胞の生存率の測定〕
上記の洗浄工程前，洗浄工程後，遠心工程後，及び凍結−解凍後にサンプリングした細胞の生存率を，細胞機能解析装置（Guava EasyCyte，GEヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて測定した。ここに，「生存率」は，サンプリングされた細胞中の生存細胞の比率（％）として示される値である。

サンプリングした細胞の生存率を図１に示した。洗浄工程前（すなわち培養容器から剥離し回収した直後）の細胞の生存率は，調製法１〜３の何れにおいても，約９６％であった。

調製法１及び２では，洗浄工程後の細胞の生存率は，それぞれ７５％，７３％と，洗浄工程前の生存率と比較して２０％を越えて低下した。一方，調製法３では，洗浄工程後の細胞の生存率は，９７．２％と洗浄前の生存率が維持され，調製法３によれば，閉鎖系自動細胞洗浄装置による洗浄において，細胞の生存率の低下を防止できることがわかった。この結果は，洗浄工程におけるヒト間葉系幹細胞の生存率の低下を防止するために，洗浄工程における細胞の洗浄液として，重炭酸リンゲル液を用いることが極めて効果的であることを示している。

遠心工程後の細胞の生存率は，調製法２及び３でそれぞれ７０．２％，９４．９％と，洗浄工程後の細胞の生存率と比較して２〜３％低下した。一方，調製法１では，遠心工程後の細胞の生存率が８１．９％と，洗浄工程後の細胞の生存率（７５％）と比較して上昇した。これは遠心時に多くの死細胞が沈殿せずに上清中に残り，その結果上清と共に除去された（データ示さず）ことによる，見かけ上の生存率上昇であった。調製法２でも，調製法１と同様に遠心時にかなりの死細胞が沈殿せずに上清と共に除去された（データ示さず）が，それでもなお沈殿した細胞中に依然多くの死細胞が存在したため生存率は７０．２％へと低下した。これらとは対照的に，調製法３では，遠心工程における細胞死が実際に抑制されており，その結果生存率が９４．９％に維持された。

凍結−解凍後の細胞の生存率は，調製法１及び２ではそれぞれ７５．１％，５９．９％であった。一方，調製法３では，細胞の生存率が９０％と極めて高値に維持された。この結果は，ヒト間葉系幹細胞の凍結時において，重炭酸リンゲル液を含む凍結保存液を用いることにより，細胞の生存率を高値に維持をすることができることを示す。

〔ヒト間葉系幹細胞の回収率〕
次に，ヒト間葉系幹細胞の培養をスケールアップして行い，上記実施例の調製法１〜３により取得される間葉系幹細胞の生細胞の回収率を測定した。洗浄工程前の生細胞数を約２．５×１０⁹個とし，洗浄工程後，遠心工程後，および凍結−解凍後の生細胞数を測定し各工程における生細胞の回収率を求めた。

その結果，調製法３では，洗浄工程前の生細胞数との比較で，洗浄工程後，遠心工程後，および凍結−解凍後の生細胞の回収率は，それぞれ７８．９％，８０．４％，および７４．８％と高値を示した（表５）。一方，調製法１での洗浄工程後，遠心工程後，および凍結−解凍後の生細胞の回収率は，それぞれ６４．９％，５８．１％，および５１．２％であり，また調製法２でのそれは，それぞれ５９．９％，５８．０％，および５２．３％であった（表５）。すなわち，調製法３と比較して，調製法１および２における回収率は低値を示した。この結果は，調製法３によれば，ヒト間葉系幹細胞を生細胞として効率よく回収できることを示す。

〔凍結―解凍後の細胞の安定性〕
凍結保存したヒト間葉系幹細胞は，解凍後，点滴バック中の他の点滴液に添加して，希釈してから点滴液と共に患者に投与される可能性がある。そこで，凍結した細胞を解凍後，点滴液で２．６７倍に希釈した後，室温で放置し，希釈直後の生存率を１００％として，希釈後３，６および２４時間経過した細胞の生存率を測定した。測定は，調製法１および３により調製した細胞のみについて実施した。このときの希釈には，調製法１で調製した細胞についてはPlasmaLyteAを，調製法３で調製した細胞についてはビカーボンを希釈液として用いた。

希釈後６時間までの生存率を比較すると，調製法３で調製した細胞が，調製法１で調製した細胞に比較して若干高い生存率を示したものの，いずれも８５％以上の高い生存率を保持し，その差は大きなものではなかった（表６）。しかし，２４時間後で比較すると，調製法３では生存率が５５．８％に保持され半数以上の生細胞が残存していたのに対し，調製法１では生存率は２６．７％に留まった（表６）。この結果は，調製法３により調製した細胞は，凍結−解凍後の安定性が，点滴バック中で他の点滴液に添加して希釈して長時間保持したような状況においても，高いことを示す。

〔製剤実施例１〕
ヒト間葉系幹細胞・・・・・７．６５×１０⁶個
ヒト血清アルブミン・・・・５％
ジメチルスルホキシド・・・１０％
重炭酸リンゲル液・・・・・全量１５ｍＬ
ヒト間葉系幹細胞を懸濁させ透析バック中に封入し，凍結保存し，凍結状態で医療機関に搬送する。使用時に解凍し患者に投与する。

本発明の医薬組成物によれば，凍結保存及び解凍に伴うヒト間葉系幹細胞の死滅を効率的に防止して，高い細胞生存率を達成することができる。このため，本発明の医薬組成物は，ヒト間葉系幹細胞を含有する医薬品としての品質の維持管理を極めて容易にする。また，本発明の医薬組成物は，解凍後に点滴液に希釈した状態においても，高い細胞生存率を維持することができる。従って，本発明の医薬組成物は，解凍後，点滴バック中の他の点滴液に添加して，希釈してから点滴液と共に患者に投与することもでき，実用性が高い。また，本発明のヒト間葉系幹細胞の調製方法は，洗浄に伴う細胞の死滅を確実に防止できるため，ヒト間葉系幹細胞含有医薬組成物の製造に有用である。更に，当該方法を含んだ，本発明の医薬組成物の製造方法は，ヒト間葉系幹細胞含有の凍結された医薬組成物を安定した品質で製造する上で有用である。

Claims (26)

1. ヒト血清アルブミンとジメチルスルホキシドとを含有する重炭酸リンゲル液中にヒト間葉系幹細胞を含んでなる，医薬組成物。
2. 該重炭酸リンゲル液が，電解質として重炭酸イオン，ナトリウムイオン，カリウムイオン，カルシウムイオン，及び塩素イオンを含み，ナトリウムイオン濃度が１３０〜１４５ｍＥｑ，生理食塩水に対する浸透圧比が０．９〜１．１であり，そしてｐＨが６．８〜７．８のものである，請求項１の医薬組成物。
3. 該重炭酸リンゲル液が，２２〜２８ｍＥｑ／Ｌの重炭酸イオンを含有するものである，請求項１又は２の医薬組成物。
4. 該重炭酸リンゲル液が，電解質としてマグネシウムイオン及びクエン酸イオンを更に含むものである，請求項１ないし３の何れかの医薬組成物。
5. 該重炭酸リンゲル液が，１２０〜１５０ｍＥｑ／Ｌのナトリウムイオンと，３．６〜４．４ｍＥｑ／Ｌのカリウムイオンと，２．７〜３．３ｍＥｑ／Ｌのカルシウムイオンと，０．９〜１．１ｍＥｑ／Ｌのマグネシウムイオンと，１００〜１２５ｍＥｑ／Ｌの塩素イオンと，２２〜２８ｍＥｑ／Ｌの重炭酸イオンと，４．５〜５．５ｍＥｑ／Ｌのクエン酸イオンを含むものである，請求項１ないし４の何れかの医薬組成物。
6. ヒト血清アルブミンの濃度が０．１〜１０Ｗ／Ｖ％である，請求項１ないし５の何れかの医薬組成物。
7. ヒト血清アルブミンの濃度が３〜８Ｗ／Ｖ％である，請求項１ないし５の何れかの医薬組成物。
8. ジメチルスルホキシドの濃度が８〜１２Ｗ／Ｖ％である，請求項１ないし７の何れかの医薬組成物。
9. 該ヒト間葉系幹細胞が，ヒト骨髄由来のものである，請求項１ないし８の何れかの医薬組成物。
10. 該ヒト間葉系幹細胞を１×１０⁵〜１×１０⁸個／ｍＬの密度で含むものである，請求項１ないし９の何れかの医薬組成物。
11. 該ヒト間葉系幹細胞を１×１０⁶〜１×１０⁷個／ｍＬの密度で含むものである，請求項１ないし９の何れかの医薬組成物。
12. 内容物の凍結を許容する密封された容器に封入された形態のものである，請求項１ないし１１の何れかの医薬組成物。
13. 該容器内に１〜３０ｍＬの体積で封入された形態のものである，請求項１ないし１２の何れかの医薬組成物。
14. 凍結された状態のものである，請求項１ないし１３の何れかの医薬組成物。
15. 培養容器中で増殖させたヒト間葉系幹細胞を，該培養容器から回収して，培養に用いられた培地を含まないヒト間葉系幹細胞を調製するための方法であって，
    （ａ）該培養容器中のヒト間葉系幹細胞にトリプシンを添加してヒト間葉系幹細胞を該培養容器の表面から剥離させる工程と，
    （ｂ）剥離されたヒト間葉系幹細胞にヒト血清アルブミンを含む重炭酸リンゲル液を加えてトリプシンの反応を停止させると共に，該ヒト血清アルブミンを含む重炭酸リンゲル液により該ヒト間葉系幹細胞を洗浄する工程と
    を含んでなるものである，方法。
16. 該重炭酸リンゲル液が，電解質として重炭酸イオン，ナトリウムイオン，カリウムイオン，カルシウムイオン，及び塩素イオンを含み，ナトリウムイオン濃度が１３０〜１４５ｍＥｑ，生理食塩水に対する浸透圧比が０．９〜１．１であり，そしてｐＨが６．８〜７．８のものである，請求項１５の方法。
17. 該重炭酸リンゲル液が，２２〜２８ｍＥｑ／Ｌの重炭酸イオンを含有するものである，請求項１５又は１６の方法。
18. 該重炭酸リンゲル液が，電解質としてマグネシウムイオン及びクエン酸イオンを更に含むものである，請求項１５ないし１７の何れかの方法。
19. 該重炭酸リンゲル液が，１２０〜１５０ｍＥｑ／Ｌのナトリウムイオンと，３．６〜４．４ｍＥｑ／Ｌのカリウムイオンと，２．７〜３．３ｍＥｑ／Ｌのカルシウムイオンと，０．９〜１．１ｍＥｑ／Ｌのマグネシウムイオンと，１００〜１２５ｍＥｑ／Ｌの塩素イオンと，２２〜２８ｍＥｑ／Ｌの重炭酸イオンと，４．５〜５．５ｍＥｑ／Ｌのクエン酸イオンを含むものである，請求項１５ないし１８の何れかの方法。
20. 工程（ｂ）における重炭酸リンゲル液中のヒト血清アルブミンの濃度が０．５〜３Ｗ／Ｖ％である，請求項１５ないし１９の何れかの方法。
21. ヒト間葉系幹細胞を含んでなる凍結された医薬組成物の製造方法であって，
    （ｃ）請求項１５ないし２０の何れかの方法により調製されたヒト間葉系幹細胞を，ヒト血清アルブミン及びジメチルスルホキシドを含有する重炭酸リンゲル液に懸濁させる工程と，
    （ｄ）請求項（ｃ）により得られた懸濁液を，内容物の凍結を許容する容器に封入する工程と，そして
    （ｅ）請求項（ｄ）により該容器に封入された懸濁液を凍結させる工程と
    をこの順で含んでなる，製造方法。
22. 工程（ｃ）における重炭酸リンゲル液中のヒト血清アルブミンの濃度が０．１〜１０Ｗ／Ｖ％である，請求項２１の製造方法。
23. 工程（ｃ）における重炭酸リンゲル液中のヒト血清アルブミンの濃度が３〜８Ｗ／Ｖ％である，請求項２１の製造方法。
24. 工程（ｃ）における重炭酸リンゲル液中のジメチルスルホキシドの濃度が８〜１２Ｗ／Ｖ％である，請求項２１ないし２３の何れかの製造方法。
25. 工程（ｃ）においてヒト間葉系幹細胞を１×１０⁵〜１×１０⁸個／ｍＬの密度になるように懸濁させるものである，請求項２１ないし２４の何れかの製造方法。
26. 工程（ｃ）においてヒト間葉系幹細胞を１×１０⁶〜１×１０⁷個／ｍＬの密度になるように懸濁させるものである，請求項１５ないし２４の何れかの製造方法。

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