CN104122132A - 胸腹水恶性细胞的包埋方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胸腹水恶性细胞的包埋方法。该方法包括以下步骤：首先将胸腹水分别置于若干50ml离心管内，并将分析纯乙醇分别加入离心管中，混匀、静置2-4小时，得到沉淀物；将沉淀物中的水份吸取，将其采用固定模具包裹得到标本并置于取材盒中；将得到的标本进行脱水，脱水剂为乙醇；将脱水后的标本透明,透明剂为二甲苯；将透明处理后的标本在70℃恒温箱内浸蜡,包埋剂是石蜡；将浸蜡处理后的标本在包埋工作站中采用石蜡包埋，将标本和石蜡倒入包埋盒中，待包埋盒表面的石蜡凝固后，将包埋盒置于冷水中使得石蜡快速凝固，最后从包埋盒中取出蜡块并保存。本方法可以极大地提高脱落细胞阳性检出率，可进一步进行后续的分子、基因及免疫组化等诊断。

Description

胸腹水恶性细胞的包埋方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种胸腹水恶性细胞的包埋方法。

背景技术

诊断恶性胸腹腔腔积液的金标准是在胸腹水中找到癌细胞。

胸腹水脱落细胞诊断因具有快速、简便以及患者痛苦少等优点,在临床上已被广泛应用,并成为诊断疾病的重要手段之一，尤其对良恶性疾病的鉴别起关键性作用，可以为临床提供非常有价值的，因此胸腹水脱落细胞学检查已经成为早期筛查恶性肿瘤的重要手段。

但目前往往胸腹水诊断阳性率很低。原因之一就是检测方法的选择。目前许多大型医院病理科常用的脱落细胞学检查方法依然是细胞离心沉渣后直接涂片法。但是这种方法收集到的细胞数量少，常需多次送检才能得到满意的结果；制作的涂片质量受标本的新鲜程度、血细胞含量、细胞分布情况、涂片厚薄及染色等因素的影响，使得漏诊率和误诊率较高，恶性肿瘤细胞检出率极低。

但是由于送检脱落细胞学的取材方便、简单，快捷，临床医生常常选择此种辅助检查方法，正是因为这样，造成了临床与病理科之间因肿瘤细胞检出率过低而带来的诊疗方面的困惑，临床医生强烈要求寻找新的方法和技术提高脱落细胞的阳性检出率。

近年来，随着液基薄层制片技术的普及，大大提高了标本涂片质量，其利用流体动力学原理可制备厚薄均匀的涂片，并可减少涂片上血细胞、粘液等因素的影响。但其受标本及涂片数量的限制，不能进一步进行后续的分子及基因等诊断。特别是对细胞形态不典型的间皮细胞、转移癌细胞的鉴别等，仅仅用涂片法是难以胜任的，常需做免疫细胞化学染色检查才能确诊。

对此，病理科在长期的工作中提出来琼脂细胞包埋和凝血酶细胞包埋方法，极大的提高了脱落细胞阳性检出率，并可进一步进行后续的分子、基因及免疫组化等诊断。

因此，寻找一种新的细胞包埋技术是亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种胸腹水恶性细胞的包埋方法，可以极大地提高脱落细胞阳性检出率，可进一步进行后续的分子、基因及免疫组化等诊断。

为实现上述目的，本发明提供了一种胸腹水恶性细胞的包埋方法，其包括步骤首先将胸腹水分别置于若干50ml离心管内，并将分析纯乙醇分别加入离心管中，混匀、静置2-4小时，得到沉淀物；将沉淀物中的水份吸取，将其采用固定模具包裹得到标本并置于取材盒中；将得到的标本进行脱水，脱水剂为乙醇；将脱水后的标本透明,透明剂为二甲苯；将透明处理后的标本在70℃恒温箱内浸蜡,包埋剂是石蜡；将浸蜡处理后的标本在包埋工作站中采用石蜡包埋，将标本和石蜡倒入包埋盒中，待包埋盒表面的石蜡凝固后，将包埋盒置于冷水中使得石蜡快速凝固，最后从包埋盒中取出蜡块并保存。

通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：

a.取材方便、简单；

b.收集到的有核细胞多，切片质量好，细胞结构清晰，大大提高了阳性检出率，特别是对细胞量较少的标本，意义更大；

c.制成的蛋白质蜡块可以长期保存，可以连续切片，克服了以往涂片法标本有限的缺点；

d.本发明主要是利用改变电解质平衡进行自体蛋白质骨架结构的原理，没有加入任何外来物质，利于进一步的分子诊断及基因检测等，同时克服了琼脂和凝血酶等细胞包埋技术因加入了外源性物质而不利于进一步的分子诊断及基因检测等缺点。

附图说明

图1为采用本方法的胸腹水自体蛋白质骨架包埋切片的示意图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如图1所示，在血性背景下，红细胞裂解破碎，肿瘤细胞密集，分布均匀，瘤细胞胞膜结构清晰，核染色质嗜碱性，粗颗粒，核仁清楚，并可见病理性核分裂象。该片可直接诊断为恶性肿瘤，但为何种肿瘤需做免疫组织化学染色进一步确认。

首先将200ml胸腹水置于8个50ml离心管内，并将分析纯的乙醇分别加入离心管中，混匀、静置2-4小时，得到沉淀物；若为血性胸腹水，需要在其中加入等量的50％乙醇混匀。在加入分析纯的乙醇放置一段时间后，胸腹水开始出现沉淀，原因是胸腹水是等电子胶体，加入的乙醇是正电子液体，它会与胸腹水中负电子的细胞任意比结合，从而改变胸腹水的电解质平衡，胸腹水中有用的蛋白成份将会聚集，形成豆腐渣样沉淀物；

其次将沉淀物置于洁净的滤纸上，吸取多余水份，并将沉淀物靠拢、固定模具包裹后得到标本并置于取材盒内。

将制好的标本进行脱水，常用的脱水剂为乙醇。脱水采用等级脱水，从较低浓度乙醇开始，逐渐替换到高浓度乙醇。一般依次为50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇→95％乙醇→无水乙醇(两次)→95％乙醇，在采用95％乙醇脱水时，可加少许伊红，使组织着色便于包埋时定位；每级脱水处理时间为2-8小时，无水乙醇中处理时间为2-4小时。

将脱水后的标本透明,常用的透明剂为二甲苯，一般采用二甲苯处理两次，每级处理时间为0.5-2小时或更长些。若将标本放入二甲苯中时有白色混浊现象发生，说明标本脱水不彻底，应将其退回至无水乙醇中再进行脱水。

将透明处理后的标本浸蜡,常用的包埋剂是石蜡，浸蜡时间为2-3小时。浸蜡过程中逐渐使二甲苯挥发，并不断加入纯石蜡，直至石蜡饱和为止。整个浸蜡过程需在恒温箱内进行,按需要调整温度。

脱水、透明以及浸蜡的步骤均在脱水机中进行。

将浸蜡处理后的标本在包埋工作站中采用石蜡包埋，浸蜡后再更换两次已熔融的纯石蜡，将标本和石蜡倒入包埋盒中，用加热的镊子迅速将标本按一定的间隔和所需的切面摆放整齐，同时用加热的镊子赶走材料周围的气泡，待包埋盒表面的石蜡凝固后将包埋盒平放入冷水中，使石蜡迅速凝固；最后从包埋盒中取出蜡块，以便保存，同时将样品编号封于蜡块上，以免样品混淆；所述石蜡温度为58-62℃。

人体胸腹水是等渗胶体，电解质正负电子平衡(如：豆浆)，自体蛋白质骨架包埋技术，主要是通过固定液改变细胞电解质平衡，使蛋白质析出，最终形成絮状沉淀，从而制成蛋白质蜡块。

脱水的目的是除去标本中的水份，便于透明、浸蜡、包埋等步骤的进行，因为这些程序中所用的药品都不能与水混合，所以必须脱水。脱水过程应缓慢进行，不能操之过急或时间过长，以免组织变硬变脆或发生收缩现象。

透明的目的是将脱水剂从材料中除去，使材料透明，增加折光系数；同时便于进行下一步的浸蜡和包埋等程序(因为脱水剂不能溶解石蜡)。采用逐级进行的步骤，可减少材料收缩。透明剂是一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的药剂。二甲苯穿透能力强，但又宜使标本收缩变脆，使用时不能在其中停留时间过长。

浸蜡的目的是逐渐除去透明剂,并为包埋剂所代替。一般所用的石蜡分熔点40℃以下的软蜡和熔点62℃以上的硬蜡。浸蜡过程一般是从低温到高温、从低熔点到高熔点逐渐进行，这一过程不能操之过急，否则浸蜡不彻底影响切片。此外，软材料可用熔点较低的石蜡，较硬的材料可用熔点较高的石蜡；冬季可用熔点较低的石蜡，夏季可用熔点较高的石蜡。石蜡需要纯净，不含杂质。浸蜡过程是使石蜡慢慢溶于浸有标本的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡渐渐深入到材料的细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取代，以便切片。

上面已经举例说明了本发明的实施例，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种胸腹水恶性细胞的包埋方法，其特征在于，包括步骤：

步骤1、将胸腹水分别置于若干50ml离心管内，并将分析纯乙醇分别加入离心管中，混匀、静置2-4小时，得到沉淀物；

步骤2、将沉淀物中的水份吸取，将其采用固定模具包裹得到标本并置于取材盒中；

步骤3、采用乙醇作为脱水剂，对所得到的标本进行脱水处理；

步骤4、采用二甲苯作为透明剂，对脱水后的标本进行透明处理；

步骤5、对透明处理后的标本在70℃恒温箱内采用石蜡做浸蜡处理；

步骤6、对浸蜡处理后的标本在包埋工作站中采用石蜡包埋，其中，将标本和石蜡倒入包埋盒中，待包埋盒表面的石蜡凝固后，将包埋盒置于冷水中使得石蜡快速凝固，最后从包埋盒中取出蜡块并保存。

2.根据权利要求1所述的胸腹水恶性细胞的包埋方法，其特征在于，在步骤3中，脱水处理采用等级脱水方式，依次采用50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、无水乙醇，最后采用95％乙醇脱水。

3.根据权利要求2所述的胸腹水恶性细胞的包埋方法，其特征在于，在步骤3中，采用50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇脱水处理时间为2-8小时，在无水乙醇中时间为2-4h。

4.根据权利要求1所述的胸腹水恶性细胞的包埋方法，其特征在于，在步骤4中，所述透明处理采用二甲苯处理两次，每次处理时间为0.5-2小时。

5.根据权利要求1所述的胸腹水恶性细胞的包埋方法，其特征在于，在步骤5中，所述浸蜡处理的时间为2-3小时。

6.根据权利要求1所述的胸腹水恶性细胞的包埋方法，其特征在于，步骤3、步骤4以及步骤5在脱水机中进行。

7.根据权利要求1所述的胸腹水恶性细胞的包埋方法，其特征在于，在步骤6中，所述石蜡温度为58-62℃。