CN103120156A - 大熊猫冷冻精液制备新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大熊猫冷冻精液制备新方法，其在冷冻箱体（5）内放置上、下两层冷冻支架后，往冷冻箱体（5）内倒入液氮（3），当上层冷冻支架（1）顶端面达到-100℃至～-70℃时，将装有成年大熊猫精液的细管（2）依次放置在上、下两层冷冻支架上，各放置30～90秒后，将细管（2）挪入冷冻箱体（5）内的液氮（3）中，待平衡后，将细管（2）再放置在液氮罐内长期保存；由于本发明将大熊猫精液的初次冷冻温度由离液氮面的距离确定改为由低温温度计测定的冷冻面温度范围确定，既简单、快速、经济，还使得不同批次间的冷冻精液因冷冻条件一致，从而实现了高质量的冷冻精液的稳定制备，极大地推动了国宝大熊猫保护工作的进步。

Description

大熊猫冷冻精液制备新方法

技术领域

本发明涉及一种圈养动物精液的冷冻保存，特别是涉及一种大熊猫冷冻精液制备新方法。

背景技术

大熊猫冷冻精液技术首先在1980年由成都动物园建立，当时采用的是颗粒冻精制备技术，所用的方法借鉴了牛冷冻精液制备技术，结果由于存在冷冻精液质量较差，重复性差以及无法直接标记等问题，该方法现在已经被淘汰，从上世纪90年代末期开始大熊猫细管冻精逐渐应用到大熊猫繁殖中，大熊猫细管冻精通常采用手工冷冻、程序降温与液氮运输罐冷冻法制备，具体情况如下：

（1）手工冷冻法

《大熊猫电刺激采精及精液冷冻保存研究》（黄炎等，四川师范学院学报.自然科学版.2000年9月第21卷第3期），采用蔗糖-卵黄-甘油液或者Test液等冷冻稀释液，将精液稀释及平衡好后，用0.25ml细管将精液分装并封口，采用两步法冷冻精液。

第一步：将细管放置在预冷好的冷冻架上层（距液氮面7.5cm），时间1分钟。

第二步：将上层的细管移到冷冻架下层（距液氮面2.5cm）,放置1分钟，然后将细管直接投入液氮完成冷冻过程。

（2）程序降温法

程序降温法与手工细管法的主要区别在于使用的冷冻工具不同。程序降温法采用程序冷冻仪进行冷冻，手工细管法利用简易冷冻架进行冷冻。采用程序降温法，由于同一批次冻精冷冻条件完全一致，稳定性要高于后者，同时可设计不同的冷冻程序冷冻精液，但程序冷冻仪价格昂贵、每次冷冻需耗用大量液氮，冷冻成本较高是其缺点。

（3）液氮运输罐冷冻法

该法利用专门的液氮运输罐中的液氮蒸气进行精液冷冻。操作简单，不需额外添加液氮，只需将平衡并分装好的精液细管直接投入罐内样品筒内即可，特别适合于野外使用。主要缺点在于可制备的冻精数量有限。

以上三种大熊猫细管冻精制备方法中，第一种方法即手工冷冻法以其操作简单，方便，快捷，液氮耗费少，效果良好在生产上得到广泛应用与报道，但是该方法尚存在一些问题：主要问题在于用该方法制备的冻精质量在不同制作批次间重复性较差，原因在于该冻精制备方法主要根据液氮面距离冷冻架的高度来进行冷冻，而液氮面到冷冻架的高度是一个非常粗略的指标，难以确切把握，导致每次冷冻冻精时冷冻面温度实际上是不确定的，而冷冻面温度不确定可直接导致不同批次间冻精冷冻速度差异较大，而冷冻速度差异可直接影响冻精质量，这是导致现报道的大熊猫细管冻精制备方法制作的冻精质量不稳定的重要原因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一种在简单、快速、经济的条件下如何保障各批次间高质量冷冻精液的稳定制备的大熊猫冷冻精液制备新方法。

为解决上述技术问题，本发明一种大熊猫冷冻精液制备新方法，包括以下步骤：

A.采集雄性大熊猫精液，对精液进行稀释，将稀释的精液保存在冷藏装置中；

B.经冷藏平衡数小时后，对稀释的精液进行检查；所述平衡的作用是让甘油充分地渗透到精液中，在冷冻时对精液起到保护作用；

C.将经检查合格的精液吸入细管内，并将细管封口；

D.将至少有上下两层的冷冻支架放入冷冻箱体内，往冷冻箱体内倒入低于下层冷冻支架顶端面的液氮，即在冷冻箱体内，液氮面低于下层冷冻支架顶端面；

E.检测、调整上层冷冻支架顶端面的冷冻面温度，当所述的冷冻面温度为-100℃至～-70℃时，将细管放置在上层冷冻支架顶端面上，用冷冻箱盖封盖冷冻箱体达30～90秒后，揭开冷冻箱盖，将细管挪置下层冷冻支架顶端面上，再次用冷冻箱盖封盖冷冻箱体达30～90秒后，揭开冷冻箱盖，将细管挪入冷冻箱体内的液氮中，待平衡后，将细管从冷冻箱体内的液氮中取出，然后放置在液氮罐内长期保存；所述的平衡是指细管温度与液氮温度相等。

所述的冷冻面是指上层冷冻支架顶端的整个平面；冷冻面的温度用低温温度计检测，检测时，低温温度计探头直接放在上层冷冻支架顶端面上；当冷冻面温度过高时，往冷冻箱体内倒入适当量的液氮，当冷冻面温度过低时，适当敞开冷冻箱体一段时间让液氮自然挥发提高冷冻面温度。

所述的一种大熊猫冷冻精液制备新方法，其冷冻支架的上下两层的高度差为3cm～8cm。

所述的一种大熊猫冷冻精液制备新方法，其冷冻支架的上下两层分别由两部分单独构成，上层冷冻支架的高度为12cm，下层冷冻支架的高度为6cm。

下面就常规冷冻法和本发明的冷冻面温度冷冻法的详细情况进行说明。

常规冷冻法：第一步：将细管放置在预冷好的冷冻架上层（距液氮面7.5cm），时间1分钟；第二步：将上层的细管移到冷冻架下层（距液氮面2.5cm），放置1分钟，然后将细管直接投入液氮完成冷冻过程。

冷冻面温度冷冻法：第一步调整上层冷冻面温度为-70～-100℃（冷冻面温度用液氮调整）；第二步将细管放置在已调整好冷冻面温度的冷冻架上层，时间1分钟；第二步是将上层的细管移到冷冻架下层（距液氮面1～4cm），放置1分钟，然后将细管直接投入液氮完成冷冻过程。

将采用冷冻面温度作为冷冻指标（方法2）与距离液氮面的高度（方法1）作为冷冻指标的效果进行比较，结果表1：

表1.不同冷冻方法冷冻效果比较

备注：方法1为常规冷冻法，方法2为冷冻面温度冷冻法，**表示差异极显著，N为样本数。

从表1可以看到，采用冷冻面温度冷冻法极显著提高了冻精活力，冷冻后精液活力以及运动状态下降程度极显著低于常规冷冻法（概率P<0.01，表示差异极显著），同时冻精质量更为稳定，冷冻后活力下降及运动状态下降的程度标准差均小于常规冷冻法。因此,采用低温温度计检测冷冻面温度，用冷冻面温度为指标以取代过去报道的采用冷冻面到液氮面深度为指标制作大熊猫冷冻精液,其优点非常明显。

由于本发明将大熊猫精液的初次冷冻温度由离液氮面的距离确定改为由低温温度计测定的冷冻面温度范围确定，既简单、快速、经济，还使得不同批次间的冷冻精液因冷冻条件较为一致，从而实现了高质量的冷冻精液的稳定制备，很好地满足人工授精与其他科学研究的要求，极大地推动了国宝大熊猫保护工作的进步。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明主剖面示意图。

图中标识：1-上层冷冻支架，2-细管，3-液氮，4-下层冷冻支架，5-冷冻箱体，6-冷冻箱盖。

具体实施方式

本发明将雄性成年大熊猫麻醉保定后，利用电刺激采精与直肠按摩技术对雄性大熊猫进行精液采集，将采集到的精液用一定甘油浓度的TEST稀释液对鲜精进行1:2倍的稀释，所述的TEST稀释液由美国Irvine Scientific公司生产；将精液保存在冰箱4℃的环境中平衡4小时，随后对精液的活力、运动状态、顶体完整率进行检查；如图1所示，将经检查合格的精液吸入0.25mL的细管2内，用细管封口胶对细管2进行封口；将高度为12cm的上层冷冻支架1和高度为6cm的下层冷冻支架4分别放入冷冻箱体5内，以此作为冷冻支架的上层与下层，然后往冷冻箱体5内倒入低于下层冷冻支架4顶端面的液氮3，将低温温度计放置在上层冷冻支架1顶端面上进行测温，通过调整箱体内液氮量将冷冻面温度控制在要求范围内；冷冻面温度的调整方式是当冷冻面温度过高时，往冷冻箱体5内倒入适当量的液氮3降温，当冷冻面温度过低时，适当敞开冷冻箱体5一段时间升温；一旦上冷冻支架1顶端面的冻面温度调整为-100℃～-70℃时，将细管2放置在上层冷冻支架1顶端面上，用冷冻箱盖6封盖冷冻箱体5，1分钟后，揭开冷冻箱盖6，将细管2挪置在下层冷冻支架4顶端面上，再次用冷冻箱盖6封盖冷冻箱体5，1分钟后，揭开冷冻箱盖6，将细管2挪入冷冻箱体5内的液氮3中，待细管2温度与液氮3温度相等后，将细管2从冷冻箱体5内的液氮3中取出，然后放置在液氮罐内长期保存。

Claims (3)

1.一种大熊猫冷冻精液制备新方法，包括以下步骤：

A.采集雄性成年大熊猫精液，对精液进行稀释，将稀释的精液保存在冷藏装置中；

B.经冷藏平衡数小时后，对稀释的精液进行检查；

C.将经检查合格的精液吸入细管（2）内，并将细管（2）封口；

D.将至少有上、下两层的冷冻支架放入冷冻箱体（5）内，往冷冻箱体（5）内倒入低于下层冷冻支架（4）顶端面的液氮（3）；

E.检测、调整上层冷冻支架（1）顶端面的冷冻面温度，当所述的冷冻面温度为-100℃至～-70℃时，将细管（2）放置在上层冷冻支架（1）顶端面上，用冷冻箱盖（6）封盖冷冻箱体（5）达30～90秒后，揭开冷冻箱盖（6），将细管（2）挪置下层冷冻支架（4）顶端面上，再次用冷冻箱盖（6）封盖冷冻箱体（5）达30～90秒后，揭开冷冻箱盖（6），将细管（2）挪入冷冻箱体（5）内的液氮（3）中，待平衡后，将细管（2）从冷冻箱体（5）内的液氮（3）中取出，然后放置在液氮罐内保存。

2.根据权利要求1所述的一种大熊猫冷冻精液制备新方法，其特征在于：冷冻支架的上下两层的高度差为3cm～8cm。

3.根据权利要求3所述的一种大熊猫冷冻精液制备新方法，其特征在于：冷冻支架的上下两层分别由两部分单独构成，上层冷冻支架（1）的高度为12cm，下层冷冻支架（4）的高度为6cm。