CN105925634B - 一种生物转化灯盏乙素制备野黄芩素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物转化灯盏乙素制备野黄芩素的方法，所述的方法以黑曲霉JH‑2产酶培养后的发酵液经抽滤获得的滤液为生物催化剂，以灯盏乙素为底物，以甲醇为助溶剂构成转化体系，在30～35℃恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得野黄芩素；在底物投料浓度为2g/L时，野黄芩素的转化总收率85.6％，纯度为82.3％；黑曲霉JH‑2营养要求低、培养时间短、抗污染能力强；生长快，转化效率高；转化过程中不产生有害物质，副产物少；本发明把活性低的灯盏乙素转化活性更好的野黄芩素，可大规模工业化应用，生产工艺具有周期短，转化率高，环境污染小等优点。

Description

一种生物转化灯盏乙素制备野黄芩素的方法
(一)技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体地说，是关于一种生物转化灯盏乙素制备野黄芩素的方法。
(一)背景技术
野黄芩素(scutellarein)，又名高黄芩素、黄芩苷元和黄芩黄素等，CAS号为529-53-3，化学结构为4’,5,6,7-四羟基黄酮(4’,5,6,7-tetrahydroxy-flavone)，分子式为C15H10O6，分子量为286.24，属黄酮类化合物，无旋光性。纯品为浅黄色针状晶体，分子呈平面形，难溶于水，可溶于热甲醇、甲醇-氯仿、二甲基亚砜等溶剂，因含有4个酚羟基，故显弱酸性。野黄芩素的7-O-β-葡萄糖醛酸苷，即灯盏乙素(breviscapine)，又名灯盏花乙素、野黄芩苷和黄芩素苷等，CAS号为27740-01-8，分子式为C21H18O12，分子量为462.36。灯盏乙素具有抗血小板凝聚、抗脑缺血、抗心肌缺血、松弛血管、抑制细胞增殖、抗高血压、抗氧化和抗糖尿病等药理作用，临床可用于治疗心脑血管疾病、胎儿宫内生长迟缓、肺心病、糖尿病、药物性肝损伤等，医疗用途十分广泛；并且，灯盏乙素对羟自由基、超氧阴离子和过氧化氢均有良好的清除作用，可能通过抑制氧化应激和增强机体的抗氧化的防御功能或其他途径来防治糖尿病肾病作用以及抗HIV-1等药理作用。但是，灯盏乙素存在溶解性差、生物利用度低、体内半衰期短等问题。近年来对灯盏乙素的体内代谢研究发现，野黄芩素是灯盏乙素的活性代谢物，具有更强的生物活性，而且它口服易于吸收，体内代谢更稳定，生物利用度是灯盏乙素的3倍多。因此，近年来野黄芩素的研究、开发和利用倍受人们所关注。
野黄芩素的天然来源较为缺乏，仅存在少数几种植物中，且含量极低，直接从植物中提取获得大量野黄芩素难以实现大规模生产；目前已有化学方法全合成野黄芩素，但一般合成步骤较长，收率偏低。相比之下，灯盏乙素在一些植物中含量则较高，如灯盏细辛、小飞蓬、黄芩和侧花黄芩等，可以从这些植物中大量获取，因此，可以通过化学或生物方法水解灯盏乙素为野黄芩素。目前，已有这方面的研究报道和专利申请，但都存在一定的不足，如酸水解法往往对苷元结构造成破坏，分离纯化困难，且转化率低，造成酸排放污染；生物水解法存在底物浓度不高，生产得率低等问题。
为了克服目前现有野黄芩素生产方法的不足，本发明采用生物法转化灯盏乙素为野黄芩素，选择了一株转化能力较高的微生物菌株，经产酶发酵和转化条件优化后，生产效率现有专利有显著提高。
(二)发明内容
本发明目的是提供一种利用黑曲霉(Aspergillus niger)JH-2发酵制备粗酶液生物转化灯盏乙素制备野黄芩素的方法，较好地克服现有酸水解法和生物转化法制备中专一性差和转化得率低的问题，本工艺具有成本低、流程简单、转化得率高和副产物少等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种生物转化灯盏乙素制备野黄芩素的方法，所述的方法是以黑曲霉JH-2产酶培养后的发酵液经抽滤获得的滤液为生物催化剂，以灯盏乙素为底物，以甲醇为助溶剂构成转化体系，在30～35℃恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得野黄芩素。
进一步，所述底物灯盏乙素的终浓度为1～2g/L转化体系，所述助溶剂甲醇的体积终浓度为5％～10％转化体系(优先选用甲醇溶解灯盏乙素，然后再与生物催化剂混合)，所述催化剂用量以抽滤前发酵液中干菌体重量计为7～10g/L转化体系。
进一步，所述的转化反应条件为：在30～35℃、150～200r/min恒温振荡条件下转化6～10h。
所述黑曲霉JH-2菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面培养基活化培养，再经过种子培养基扩大培养，然后用种子液接入发酵培养基进行产酶培养，所述黑曲霉JH-2产酶培养方法为：(1)活化培养：将黑曲霉JH-2菌种孢子接种于斜面培养基，于28～30℃恒温培养2～3天，获得斜面孢子，所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，其终浓度组成为：马铃薯100～200g/L(马铃薯洗净去皮，切成小块，加5倍质量水煮沸20～30min，4层纱布过滤去渣留汁)，蔗糖10～20g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH自然，高压蒸汽121℃灭菌15min；(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉JH-2斜面孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：蔗糖10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 5～6；(3)产酶培养：将种子液以体积浓度5％～10％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖10～20g/L，(NH4)2SO4 3～5g/L，酵母浸出粉2～3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 5-6。
进一步，优选所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖20g/L，(NH4)2SO4 5g/L，酵母浸出粉3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 6。
本发明所述分离纯化的方法为：在生物转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入原转化体系体积1/4的甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，滤液在45℃下减压干燥(优选滤液转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后)，即得野黄芩素。
本发明所述的黑曲霉JH-2菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2014398，保藏日期2014年9月5日。该菌株的分离、鉴定以及保藏已在中国发明专利CN 201410552706.9公开。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种利用黑曲霉JH-2发酵制备粗酶液生物转化灯盏乙素制备野黄芩素的方法。以灯盏乙素为底物，黑曲霉JH-2发酵制备粗酶液为催化剂，在底物投料浓度为2g/L时，野黄芩素的转化总收率为85.6％，纯度为82.3％。相比于现有技术，采用本发明的技术优势有：黑曲霉JH-2营养要求低、培养时间短、抗污染能力强；生长快，转化效率高；转化过程中不产生有害物质，副产物少；本发明把活性低的灯盏乙素转化活性更好的野黄芩素，可大规模工业化应用，生产工艺具有周期短，转化率高，环境污染小等优点。
(三)附图说明
图1灯盏乙素转化为野黄芩素的化学反应式；
图2HPLC法分析野黄芩素浓度的标准曲线；
图3转化样品的HPLC分析图谱，A为标准品灯盏乙素和野黄芩素的HPLC图谱；B为灯盏乙素转化0h的HPLC图谱；C为灯盏乙素经生物转化6h的HPLC图谱(实施例3样品)。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1转化菌种的选择
对实验室已有的3株黑曲霉，包括保藏于中国典型培养物保藏中心的黑曲霉XW-2(保藏编号CCTCC No：M 2011358)、黑曲霉MJ(保藏编号CCTCC NO：M 2013329)和黑曲霉JH-2(保藏编号CCTCC No：M2014398)，以及从土壤中筛选的5株黑曲霉菌株，包括黑曲霉ZC03、ZC04、ZC08、ZC11和ZC14菌株。先从4℃冰箱保存的上述黑曲霉斜面菌种挑取1满环孢子，接种于新鲜斜面培养基，斜面于28℃生化培养箱中培养3天，得活化的黑曲霉斜面。用棉签从活化的菌种斜面中蘸取孢子，接种到装有50mL产酶培养基中，于28℃、200r/min振荡培养3天后(不同菌株培养液的干菌体浓度在6.24g/L～7.65g/L之间不等)，将50mL发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的40mL滤液即为粗酶液。取其中的9.5mL粗酶液于50mL三角瓶中，10mg灯盏乙素用0.5mL甲醇溶解，加入到上述9.5mL粗酶液中构成反应体系(总体积10mL)，于30℃、150r/min恒温振荡水浴中转化10h。转化反应结束后，转化液用50mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用1mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中野黄芩素的浓度。
HPLC分析来自不同菌株发酵制备的粗酶液转化样品中野黄芩素的浓度，结果见表1，由此比较不同菌株产酶转化灯盏乙素为野黄芩素的能力高低。
表1不同黑曲霉菌株来源的粗酶液转化灯盏乙素生成野黄芩素的浓度和得率
由表1可以看出：由黑曲霉JH-2菌株发酵制备的粗酶液转化灯盏乙素，生成野黄芩素的转化得率最高，为56.9％，转化液中浓度为0.352g/L。
所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，按以下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入蔗糖20g、琼脂18g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后分装于试管中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后搁置斜面。
所述的发酵培养基按如下组成和方法配制：蔗糖10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 6，250mL的三角瓶装50mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
所述HPLC分析方法为：LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温为室温；流动相为体积比9:1的甲醇和0.1％的磷酸水溶液混合物；流速0.8mL/min，检测波长335nm，进样量10μL。由相同分析条件下的标准品野黄芩素浓度-峰面积标准曲线(图2)，计算出转化样品中的野黄芩素的浓度。
所述的野黄芩素转化得率按以下公式计算：
式中，286.24为野黄芩素的分子量，462.36为灯盏乙素的分子量。
实施例2：黑曲霉JH-2转化稳定性验证
以黑曲霉JH-2为产酶菌种，在50mL摇瓶发酵规模下，增加了种子扩大培养步骤，发酵制备粗酶液转化灯盏乙素，验证菌种的转化稳定性，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉JH-2斜面菌种接种于新鲜PDA斜面培养基，斜面于30℃恒温培养2天，所述的PDA斜面培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用棉签蘸取步骤(1)活化培养后黑曲霉JH-2孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为6.48g/L的种子液。所述种子培养基终浓度组成为：蔗糖10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 6，250mL的三角瓶装50mL种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度5％(即2.5mL)的接种量接种至50mL发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3天，得干菌体浓度为7.27g/L的发酵液。所述的发酵培养基终浓度组成如下：蔗糖10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO40.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 6，250mL的三角瓶装50mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
(4)产酶培养结束后，将步骤(3)获得发酵液50mL用布氏漏斗抽滤，收集的40mL滤液即为粗酶液。取其中的9.5mL粗酶液置于50mL三角瓶中，10mg灯盏乙素用0.5mL甲醇溶解，加入到上述9.5mL粗酶液中构成反应体系(总体积10mL)，于30℃、150r/min恒温振荡条件下转化10h。转化反应结束后，转化液用50mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用1mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中野黄芩素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉JH-2菌株制备的粗酶液转化处理灯盏乙素，转化样品中野黄芩素浓度为0.366g/L，转化得率为59.1％。实施例2转化方法重复实验3批次，3批次实验结果无显著性差异，表明黑曲霉JH-2菌株制备的粗酶液转化灯盏乙素为野黄芩素的转化性能稳定。
实施例3：优选转化工艺
在实施例2的基础上，优化了产酶培养基组成、发酵培养条件、转化底物浓度、转化时间等，黑曲霉JH-2发酵制备粗酶液转化灯盏乙素，野黄芩素的转化得率显著提高。优选的生物转化法制备野黄芩素的工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉JH-2斜面菌种接种于新鲜斜面培养基，斜面于30℃恒温培养2天，所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用棉签蘸取步骤(1)活化培养后黑曲霉JH-2孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为6.51g/L的种子液。所述种子培养基组成和配制方法同实施例2。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即5mL)的接种量接种至50mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为9.87g/L的发酵液。所述的发酵培养基终浓度组成如下：蔗糖20g/L，(NH4)2SO4 5g/L，酵母浸出粉3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO40.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 5，250mL的三角瓶装50mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
(4)产酶培养结束后，将步骤(3)获得发酵液50mL用布氏漏斗抽滤，收集的40mL滤液即为粗酶液。取其中的9mL粗酶液置于50mL三角瓶中，20mg灯盏乙素用1mL甲醇溶解，加入到上述9mL粗酶液中构成反应体系(总体积10mL)，于35℃、200r/min恒温振荡条件下转化6h。转化反应结束后，转化液用50mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用1mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中野黄芩素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉JH-2菌株制备的粗酶液转化处理灯盏乙素，转化样品中野黄芩素浓度为1.16g/L，转化得率为93.7％，较实施例2提高了35.4个百分点。
实施例4：黑曲霉JH-2产酶培养放大
以黑曲霉JH-2为产酶菌种，在实施例3的基础上，将产酶培养放大到500mL摇瓶发酵规模，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉JH-2斜面菌种接种于新鲜斜面培养基，斜面于30℃恒温培养2天，所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用棉签蘸取步骤(1)活化培养后黑曲霉JH-2孢子3次至80mL种子培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为6.47g/L的种子液。所述种子培养基组成同实施例3，250mL的三角瓶装80mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即50mL)的接种量接种至500mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为9.64g/L的发酵液。所述的发酵培养基组成同实施例3，2L的三角瓶装500mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)产酶培养结束后，将步骤(3)获得发酵液500mL用布氏漏斗抽滤，收集的400mL滤液即为粗酶液。取其中的9mL粗酶液置于50mL三角瓶中，20mg灯盏乙素用1mL甲醇溶解，再加入到上述9mL粗酶液中构成反应体系(总体积10mL)，于35℃、200r/min恒温振荡条件下转化6h。转化反应结束后，转化液用50mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用1mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中野黄芩素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉JH-2菌株制备的粗酶液转化处理灯盏乙素，转化样品中野黄芩素浓度为1.14g/L，转化得率为92.1％。
实施例5：生物转化工艺放大
在实施例4的基础上，将生物转化体系放大到400mL规模，具体工艺步骤如下：
(1)按实施例4方法，制备黑曲霉JH-2发酵得到的粗酶液400mL。取其中的360mL粗酶液置于2L三角瓶中，0.8g灯盏乙素用40mL甲醇溶解，加入到上述360mL粗酶液中构成反应体系(总体积400mL)，于35℃、200r/min恒温振荡条件下转化6h。
(2)上述转化液400mL用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入100mL甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加10mL甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后得0.474g野黄芩素。
称取步骤(2)制备的野黄芩素1mg溶解于5mL甲醇中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中野黄芩素的浓度。
HPLC分析结果表明，按本实施例方法，制备的野黄芩素纯度为82.3％，转化总收率为85.6％。

Claims (7)

1.一种生物转化灯盏乙素制备野黄芩素的方法，其特征在于所述的方法以黑曲霉(Aspergillus niger)JH-2产酶培养后的发酵液经抽滤获得的滤液为生物催化剂，以灯盏乙素为底物，以甲醇为助溶剂构成转化体系，在30～35℃恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入原转化体系体积1/4的甲醇溶解残留物；甲醇溶解后过滤后，滤液在45℃下减压干燥，获得野黄芩素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化剂用量以抽滤前发酵液中干菌体重量计为7～10g/L转化体系。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述底物灯盏乙素的终浓度为1～2g/L转化体系。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述助溶剂甲醇的体积终浓度为5％～10％转化体系。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的转化反应条件为：在30～35℃、150～200r/min恒温振荡条件下转化6～10h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化剂制备方法为：(1)活化培养：将黑曲霉JH-2菌种孢子接种于斜面培养基，于28～30℃恒温培养2～3天，获得斜面孢子，所述的斜面培养基为终浓度组成为：马铃薯100～200g/L，蔗糖10～20g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH自然；(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉JH-2斜面孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：蔗糖10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 5～6；(3)产酶培养：将种子液以体积浓度5％～10％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖10～20g/L，(NH4)2SO4 3～5g/L，酵母浸出粉2～3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 5-6。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖20g/L，(NH4)2SO4 5g/L，酵母浸出粉3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，pH 5。
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