CN101570746B - 一种新型柴胡皂苷糖苷酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，提供了一种新型柴胡皂苷糖苷酶及其制备方法和应用，该酶是能水解柴胡皂苷A、D、B1、B2的3-O上的β-(1→3)-葡萄糖苷键和β-6-脱氧半乳糖糖苷键的新型柴胡皂苷糖苷酶，其酶是由细菌、链霉菌、黑曲霉菌、米曲菌、酵母菌、担子菌发酵，经离子交换树脂柱和/或蛋白制备色谱仪分离提纯，得到在SDS电泳上单一带的纯柴胡皂苷糖苷酶；本发明还提供其酶与柴胡皂苷单体反应，制备相应单糖基柴胡皂苷和苷元方法；与柴胡中提取的混合总皂苷反应，制备单糖基柴胡皂苷和苷元的混合总皂苷；与柴胡药材反应，制备单糖基柴胡皂苷和苷元的混合皂苷含量高的柴胡药材。

Description

一种新型柴胡皂苷糖苷酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种新型酶，尤其是涉及一种柴胡皂苷糖苷酶，利用该酶转化/生物转化法处理柴胡皂苷或柴胡药材方法，以制备单糖基柴胡皂苷及其苷元。 
背景技术
酶作为生物催化剂普遍存在于植物，动物和微生物中，可直接从生物体中分离提纯。酶的生产方法可分为提取法，发酵法以及化学合成法，其中，化学法仍在实验室阶段，提取法是最早采用沿用至今的方法，发酵法是50年依赖酶生产的主要方法。微生物发酵法是利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得人们所需要的酶。目前世界上有100多种酶用微生物发酵生产，应用于不同领域。微生物发酵产酶具有很多优点：微生物种类繁多，酶的品种齐全，凡是动植物内存在的酶，几乎都能从微生物中得到；微生物繁殖快，生产周期短，培养方面，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量，微生物具有较强的适应性而且培养方法也比较简单。 
柴胡始载于《神农本草经》，为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根，性味苦、微寒，归肝、胆经、功能解表退热、疏肝解郁、升举阳气等为我国传统中药。柴胡按照性状分为北柴胡(Bepleurum chinese DC)、红柴胡(和南柴胡)(Bepleurum scorzonerifolium Willd)、长白柴胡(Bepleurum komarovianum Lincz)；黑柴胡(Bepleurum smitii)、其它柴胡变种等。柴胡的化学成分比较复杂，主要成分为柴胡皂苷和挥发油，其中属柴胡皂苷(Saikosaponin)为主要有效成分，药理试验证明柴胡皂苷具有抗炎、抗菌、抗病毒、镇静、解热、保肝、降低胆固醇和调节内分泌等生理活性。目前从柴胡植物中分离的皂苷近100种，其中柴胡皂苷A、D、B1和B2含量比较高，而含有单糖基的柴胡皂苷或苷元比较少，微乎其微。柴胡皂苷的具体化学结构如下： 
Figure G200810052927401D00021
柴胡皂苷A：α-16-OH，R＝β-glc-(1→3)-β-fuc- 
柴胡皂苷D：β-16-OH，R＝β-glc-(1→3)-β-fuc- 
还有含有三个糖基的柴胡皂苷。 
Figure G200810052927401D00022
柴胡皂苷B1：α-16-OH，R＝β-glc-(1→3)-β-fuc- 
柴胡皂苷B2：β-16-OH，R＝β-glc-(1→3)-β-fuc- 
还有含有三个糖基的柴胡皂苷 
近年来，人们研究发现皂苷中的糖链与其生物活性之间有着密切关系，根据柴胡口服后，其皂苷被消化系统的酶和微生物作用，皂苷糖基部分分解后吸收。曾有报道人肠道菌能够水解柴胡皂苷，产生次代谢产物柴胡皂苷单糖基柴胡皂苷或苷元是柴胡皂苷在人血液中发挥药理作用的最终物质，如柴胡皂苷BI的主要代谢产物柴胡皂苷元具有抗炎、镇痛和抗肿瘤等作用。(严梅桢国外医学中医中药分册2001，23(3)：156)。可见多糖基柴胡皂苷的活性较低，而单糖基的柴胡皂苷或苷元的活性却很高。 
现有技术没有多糖基水解的柴胡皂苷糖苷酶制备及应用。国际酶学上规定一种酶只能水解一种糖基或者一种糖苷键，如Recommendation of the Nomenclature Committee of theInternational Union of Biochemistry on the Nomenclature and Classification ofEnzyme-catalysed Reactions编，Enzyme Nomenclature，Academic Press INC，New York， 1984，p206-325。书中3.2Glycosidases部分记载的110种糖苷酶，又Recommendation ofthe Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry on theNomenclature and Classification of Enzyme bythe reactions they catalyse目前的网站：http://w.w.w.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/，Enzyme Nomenclature的EC.3.2的Glycosidase中描述的近160种糖苷酶，都是只水解一种糖基或者一种糖苷键。关于能够同时水解一种以上的糖基或糖苷键的酶研究或报道很少，没有关于能够水解柴胡皂苷的多种糖基、多糖基键的酶相关报道，更没有其酶制备和应用的现有技术。 
有一报道采用微生物发酵液(说成是柴胡皂苷酶)能够水解柴胡皂苷并能得到有活性的代谢产物，但是该报道记载的酶存在的问题：第一，报道中没有弄清该酶是什么酶，酶催化特性如何，本领域技术人员无法根据报道确认该酶什么样的酶；第二，该篇文章的酶是使用菌种sp.C42、sp.C48、sp.C848发酵液，其安全性有待研究，因为菌种sp.C42、sp.C48、sp.C848，其代号中加冠了sp.是新菌，属于霉菌类，往往新菌在需要做很多安全性试验后方可使用；不同于本发明涉及的微生物；本发明采用的微生物都是公众从中科学院北京微生物研究所菌种保藏所容易得到的。第三，该酶是粗酶，没有经过纯化，活力相对比较低。(富遥遥大连轻工业学院学报，26(2)，136-139，2007)。 
发明内容
为了解决上述问题，本发明做了大量的研究，最终确定水解柴胡皂苷的酶特性为能够水解柴胡皂苷柴胡皂苷A、D、B1、B3的3-O的β-(1→3)-葡萄糖苷键和β-6-脱氧半乳糖糖苷键的、水解多种糖基的新酶；同时采用现有技术的菌种发酵产酶，提高新酶的安全性和活性；并用此酶处理柴胡皂苷制备单糖基皂苷或苷元，处理柴胡药材制备单糖基皂苷或苷元含量高的新型柴胡药材。 
因此，本发明一个目的是提供一种特异的柴胡皂苷糖苷酶，该酶能够水解柴胡皂苷A、D、B1、B2的3-O的β-(1→3)-葡萄糖苷键和β-6-脱氧半乳糖糖苷键的、水解多种糖基。 
本发明另一个目的是提供一种特异的柴胡皂苷糖苷酶的制备方法。 
本发明的还有一个目的是提供一种通过特异的柴胡皂苷糖苷酶而制备单糖基柴胡皂苷或苷元的方法，以及得到含有单糖基皂苷或苷元的混合总皂苷和含有单糖基皂苷或苷元含量高的新型柴胡药材。 
本发明中柴胡皂苷糖苷酶的定义：水解柴胡皂苷A、D、B1、B2的3-O上的β-(1→3)-葡萄糖苷键，生成相应3-O的β-6-脱氧半乳糖(墨角藻糖、Fucose)的单糖基柴胡皂苷，进一 步水解单糖基柴胡皂苷的3-O的β-6-脱氧半乳糖(墨角藻糖、Fucose)基生成相应苷元的、水解柴胡皂苷多种糖苷键新柴胡皂苷糖苷酶 
本发明的技术方案是这样实现的： 
本发明的一种特异柴胡皂苷糖苷酶，由以下步骤得到： 
(1)是以柴胡皂苷、黄酮、异黄酮、含有上述物质的中草药或其提取物中一种或一种以上作为产酶诱导剂；由下述一种或一种以上的微生物：细菌、链霉菌、黑曲霉菌、米曲霉菌、酵母菌、担子菌发酵制备得到的粗酶。 
(2)粗酶经离子交换树脂柱和/或蛋白制备色谱仪分离提纯，得到在SDS电泳上单一带的纯柴胡皂苷糖苷酶。 
所述本发明的酶蛋白质分子量为3.0-9.0万，优选为5.0-8.0万。 
本发明步骤(1)所述微生物菌，优选黑曲霉菌(Aspergillus niger)和米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；所述的链霉菌是指链霉菌属(Streptomyces genus)菌，优先是纤维素链霉菌(Streptomyces cellulosae)；细菌指芽孢杆菌属(Bacillus genus)菌，优先是高温好氧菌Bacillus sp.JF菌；所述的酵母菌包括假丝酵母属(Candida genus)、酿酒酵母属(Sacharomyces genus)，优先是白假丝酵母(Candida albicans)；担子菌类，优先蘑菇菌(Agaricus campestris)。 
所述的步骤(1)中微生物发酵法可以采用液态发酵法或固态发酵法。液态发酵产酶加入培养基0.01％-1％的柴胡皂苷或者大豆异黄酮或者芦丁作产酶诱导物、或者相当于培养基0.1％-3％柴胡或者脱脂大豆或者槐花的提取物，发酵培养2-8天、离心除渣，得到酶液；固态培养时加入培养基1％-30％柴胡或者脱脂大豆或者芦丁，培养2-8天，用缓冲液浸出、离心除渣得粗酶液。 
上述所述的产酶诱导剂优选0.05％-0.3％的柴胡皂苷或者大豆异黄酮或者芦丁；或相当于培养基0.3％-1％柴胡或者脱脂大豆或者槐花的提取物；或10％-20％柴胡或者脱脂大豆或者芦丁药材。 
所述的柴胡皂苷、大豆异黄酮、芦丁市售或自行提取，符合药典规定的纯度即可。所述的提取物制备可以使用现有技术中提取方法：水提醇沉、醇沉水提、萃取法、超声波振荡法、树脂提取法等，还可以在市场上购得。 
上述所述的粗酶液采用如下方法得到浓缩酶：其粗酶液中加入沉淀剂沉淀酶蛋白，沉淀物用pH3～10缓冲液溶解，离心除杂得到粗酶浓缩液。其中所述的沉淀剂包括但不限于硫酸铵或乙醇等，优选60-75％饱和度的硫酸铵。其中所述的缓冲液包括但不限于：Tris、NaCl、 醋酸、磷酸及其盐等，只要满足缓冲液的pH为3-10，浓度0.001-0.5M，均能够作为本发明的缓冲液使用。优选缓冲液的pH为5-8，浓度0.01-0.3M，最佳pH为5，浓度0.02M。 
具体方法是向粗酶液中加入硫酸铵或乙醇而沉淀酶蛋白，收集沉淀再用原酶液的1/5-1/10的浓度0.001-0.5M，pH为3-10的缓冲液溶解，离心除渣得到酶的浓缩液。 
本发明的新型柴胡皂苷糖苷酶的中间体是以柴胡皂苷、黄酮、异黄酮、含有上述物质的中草药或其提取物中一种或一种以上作为产酶诱导剂；由下述一种或一种以上的微生物：细菌、链霉菌、黑曲霉菌、米曲霉菌、酵母菌、担子菌发酵制备得到的粗酶。 
本发明的特异柴胡皂苷糖苷酶的制备方法，包括以下步骤： 
(1)由下述一种或一种以上的微生物：细菌、链霉菌、黑曲霉菌、米曲霉菌、酵母菌、担子菌发酵制备得粗酶； 
(2)粗酶用沉淀剂沉淀酶蛋白，沉淀物用缓冲液溶解，离心除杂得到粗酶浓缩液； 
(3)粗酶浓缩液还经离子交换树脂柱和/或蛋白制备色谱仪分离提纯，得到在SDS电泳上单一带的纯柴胡皂苷糖苷酶。 
本发明所述的步骤(1)中还可以加入产酶诱导剂，提高产酶。所述的诱导剂选自柴胡皂苷、黄酮、异黄酮、含有上述物质的中草药或其提取物中一种或一种以上。本发明所述的步骤(1)微生物发酵方法优选采用液态发酵法或固态发酵法。其中液态发酵法是指产酶时加入培养基0.01％-1％的柴胡皂苷或者大豆异黄酮的诱导物、或者相当于培养基0.1％-3％柴胡或者脱脂大豆的提取物，发酵培养2-8天、离心除渣，得到粗酶液。固态发酵法是加入培养基1％-30％柴胡或者脱脂大豆，培养2-8天，用缓冲液浸出、离心除渣得粗酶液。 
上述所述的产酶诱导剂优选0.05％-0.3％的柴胡皂苷或者大豆异黄酮或者芦丁；或相当于培养基0.3％-1％柴胡或者脱脂大豆或者槐花的提取物；或10％-20％柴胡或者脱脂大豆或者芦丁药材。 
所述的柴胡皂苷、大豆异黄酮、芦丁市售或自行提取，符合药典规定的纯度即可。所述的提取物制备可以使用现有技术中提取方法：水提醇沉、醇沉水提、萃取法、超声波振荡法、树脂提取法等，还可以在市场上购得。 
上述所述的粗酶液中还可以加入沉淀剂沉淀酶蛋白，沉淀物用pH3～10缓冲液溶解，离心除杂得到粗酶浓缩液。其中所述的沉淀剂包括但不限于硫酸铵或乙醇等，优选60-75％饱和度的硫酸铵。其中所述的缓冲液包括但不限于：Tris、NaCl、醋酸、磷酸及其盐等，只要 缓冲液的pH为3-10，浓度0.001-0.5M，均能够作为本发明的缓冲液使用。优选缓冲液的pH为5-8，浓度0.01-0.3M，最佳pH为5，浓度0.02M。 
具体方法是向粗酶液种加入硫酸铵或乙醇而沉淀酶蛋白，收集沉淀再用原酶液的1/5-1/10的浓度0.001-0.5M，pH为3-10的缓冲液溶解，离心除渣得到酶的浓缩液。 
本发明中选用的微生物菌种，除了高温好氧菌Bacillus sp.JF菌(采用文献：金凤燮等、Fengxie Jin et al：J.Gen.Appl.Microbiol.38，293-302，1992)以外，其他包括黑曲霉菌Aspergillus niger、米曲霉菌Aspergillus oryzae、纤维素链霉菌Streptomyces cellulosae、假丝酵母属Candida genus、酿酒酵母属Sacharomyces genus、白假丝酵母Candida albicans、芽孢杆菌属Bacillus genus菌、蘑菇菌Agaricus campestris全部从中国科学院微生物研究所菌种保藏所得到；《中国科学院微生物研究所、中国微生物菌种管理委员会普通微生物中编，菌种目录，科学出版社，1982年出版》。 
在试验过程中发现本发明的一种柴胡皂苷糖苷酶及其中间体都具有水解柴胡皂苷A、D、B1、B2的3-O上的β-(1→3)-葡萄糖苷键和β-6-脱氧半乳糖糖苷键方面的作用，以制备得到的单糖基皂苷或苷元，而且酶解产物具有更好的药理作用。 
所述的β-6-脱氧半乳糖又称墨角藻糖(Fucose)。 
因此，本发明的一种柴胡皂苷糖苷酶酶解代谢产物，其特征在于：所述的代谢产物含有单糖基皂苷或苷元，是底物经过柴胡皂苷糖苷酶酶转化得到的。 
同时本发明发现随着底物的不同，酶解产物也有所不同。一般优选底物浓度0.01％-10％；最优选浓度0.5-4％， 
本发明中优选底物为柴胡皂苷A、D、B1或B2，经过酶解反应后其酶解产物如下： 
本发明的柴胡皂苷A和柴胡皂苷D经过酶催化反应，水解柴胡皂苷A、D的3-O上的β-(1→3)-葡萄糖苷键生成相应的生成相应3-O的β-6-脱氧半乳糖的单糖基柴胡皂苷，该酶进一步水解单糖基皂苷3-O的β-6-脱氧半乳糖糖苷键生成相应的苷元，便于理解将柴胡皂苷A的酶解产物称为柴胡皂苷5，柴胡皂苷D的降解产物称为柴胡皂苷6。具体化学结构式(I) 
Figure G200810052927401D00071
柴胡皂苷A：α-16-OH，R＝β-glc-(1→3)-β-fuc-(I-1) 
柴胡皂苷D：β-16-OH，R＝β-glc-(1→3)-β-fuc-(I-2) 
柴胡皂苷5：α-16-OH，R＝β-fuc-(I-3) 
柴胡皂苷6：β-16-OH，R＝β-fuc-(I-4) 
本发明的柴胡皂苷BI和柴胡皂苷B2的酶催化反应，水解柴胡皂苷B1、B2的3-O上的β-(1→3)-葡萄糖苷键(1→3)-葡萄糖苷键生成相应的3-O的β-6-脱氧半乳糖的单糖基柴胡皂苷，该酶进一步水解单糖基皂苷3-O的β-6-脱氧半乳糖糖苷键生成相应的苷元，便于理解将柴胡皂苷B1的酶解产物称为柴胡皂苷7，柴胡皂苷B2的降解产物称为柴胡皂苷8。具体化学结构式(II) 
Figure G200810052927401D00072
柴胡皂苷B1：α-16-OH，R＝β-glc-(1→3)-β-fuc-(II-1) 
柴胡皂苷B2：β-16-OH，R＝β-glc-(1→3)-β-fuc-(II-2) 
柴胡皂苷7：α-16-OH，R＝β-fuc-(II-3) 
柴胡皂苷8：β-16-OH，R＝β-fuc-(II-4) 
本发明优选底物为柴胡总皂苷，经过酶解反应后，得到单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元的混合柴胡总皂苷。 
本发明优选底物为柴胡药材，经过酶解反应后，得到单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元含量高的新型柴胡药材。
本发明柴胡皂苷糖苷酶酶解产物的制备方法，其具体步骤为：取底物的pH3～9缓冲液与柴胡皂苷糖苷酶混合，在温度4～75℃，反应4～40小时后，提取酶解代谢物。 
本发明中优选单糖基柴胡皂苷或苷元的制备方法，包括以下步骤： 
(1)取柴胡皂苷的pH 3～9缓冲液与柴胡皂苷糖苷酶混合在4～75℃，反应4～40小时； 
(2)离心除酶蛋白，其上清液经树脂或硅胶吸附，提取单糖基柴胡皂苷或苷元。 
所述步骤(1)中优选反应温度35～60℃，pH4～7，反应时间15～24小时；所述的步骤(2)中用50-95％乙醇洗脱提取。 
本发明优选混合柴胡总皂苷的制备方法，包括以下步骤： 
(1)取0.1-6％柴胡总皂苷的pH 3～9缓冲液与柴胡皂苷糖苷酶充分很合，在4～75℃，反应4～40小时 
(2)离心除酶蛋白，其上清液经树脂或硅胶吸附，75-95％乙醇洗脱，洗脱物减压干燥后即得新型柴胡总皂苷。 
所述步骤(1)中优选反应温度55～65℃，pH5～6，反应时间18～28小时；步骤(2)中加入2-4倍体积酒精，沉淀酶蛋白。 
本发明优选一种新型柴胡药材的制备方法，步骤为：取柴胡药材或粉末与酶混合，在4～75℃，反应4～40小时后，离心除酶蛋白，干燥，得单糖基柴胡皂苷含量高的药材。 
优选温度35～60℃，pH4～6，反应时间18～28小时。 
本发明中所涉及的试验例及实施例中采用的分析方法均按照以下文献操作： 
1、柴胡皂苷底物和柴胡皂苷糖苷酶反应物是，按文献：宋海梅等：大连轻工业学院学报，24(1)，15-18，2005；文献：苏晓凤等：大连轻工业学院学报，25(1)，39-42，2006的薄层层系(TLC)和高校液相色谱(HPLC)法测定的。 
2、柴胡皂苷酶分离提纯，按用文献：鱼红闪等：Chem.Pharm.Bull.，50(2)，175-178.的DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪提纯； 
3、分离提纯的柴胡皂苷酶蛋白纯度和分子量，按文献：张龙翔等：升华实验方法和技术，高等教育出版社，1997，p100-111的SDS电泳方法测定。 
试验例：酶活力对比试验 
1、材料：样品酶：本发明酶按照实施例1、2、3或4法制备。 
对照酶：按照文献《发酵产柴胡皂苷酶的研究》富瑶瑶，大连轻工业学院学报26 
(2)：136-139”中制备。 
2、方法 
2.1酶解产物制备：分别取样品酶和对照酶各50ml，与2g下表1中的底物，100ml 0.02M，pH5.0的醋酸缓冲液充分混合，在40℃反应24小时，在100℃加热5分钟，离心除酶蛋白，其上清在40毫升的AB-8树脂上吸附，用200毫升85％乙醇洗脱，减压蒸干即得。 
2.2酶活力测定方法：将酶解产物经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测。 
3.结果见表1 
表1酶活力对比表 
Figure G200810052927401D00091
4、结论：从上表1中可见，本发明的柴胡皂苷糖苷酶的酶活力比较强，反应速度快，底物转化率高，
本发明的有益效果 
1、本发明的酶是一种可以水解柴胡皂苷A、D、B1、B2的3-O上的β-(1→3)-葡萄糖苷键，生成相应3-O的β-6-脱氧半乳糖(墨角藻糖、Fucose)的单糖基柴胡皂苷，进一步水解单糖基柴胡皂苷的3-O的β-6-脱氧半乳糖(墨角藻糖、Fucose)基生成相应苷元的、水解柴胡皂苷多种糖苷键新柴胡皂苷糖苷酶，解决了国际酶学上规定的一种糖苷酶只能水解一种糖基或糖苷键的技术偏见，开创了酶的新用途。 
2、现有技术的中是采用一种新菌进行的微生物产酶，其安全性有待考察，而本发明的柴胡皂苷糖苷酶是用现有技术中已知的微生物发酵得到的，该微生物是本领域常规的菌种，其性能、作用、安全性、有效性已经是被认可的，因而本发明中用该微生物的发酵制备的酶其安全性，有效性，活性是能够得到有效的保障。 
3、本发明的柴胡皂苷糖苷酶是一种纯酶活力强，转化率高，而且操作简单，适用柴胡新皂苷成分的大批量生产，具有良好的工业化前景。 
4、本发明提供了一种新的药用组分，本发明的一种新型柴胡总皂苷，是含有单糖基柴胡皂苷或苷元，能够产生更强的药理作用或发挥更好的药用功效。 
5、本发明提供一种新型柴胡药材原料药或生药材，可以代替原来柴胡药材入药，体现更好的疗效。 
具体实施例 
通过借助以下实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受到这些实施例的限制。 
实施例(一)1黑曲霉菌发酵产酶及其制备单糖基柴胡皂苷 
1、产酶 
黑曲霉菌(Aspegillusniger)在含5％麦麸浸出物、1％柴胡浸出物的培养基中接种，在28～30℃搅拌通风培养50～100小时，离心除菌、用60～75％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白、收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸铵，离心除渣，即为浓缩的柴胡皂苷酶粗酶液。 
其粗酶利用DEAE-cellulose离子交换柱法对进行分离提纯。离子交换柱规格Φ2.0×15cm，DEAE-cellulose柱预先用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液处理平衡过的，DEAE-cellulose的有效体积28mL；粗酶液8mL加入到离子交换柱上吸附，然后用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液中溶解KCl浓度为60～600mM的溶液梯度洗脱分步收集，每管收集3mL，每收集的管酶液与柴胡皂苷反应；结果第31和32号管能水解柴胡皂苷，做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是单带，说明纯酶，其分子量为7.9万。 
2、单糖基柴胡皂苷和苷元 
该酶与含200毫克柴胡皂苷A的5毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)混合，在40℃反应20小时，在100℃加热5分钟，离心除酶蛋白，其上清液在10毫升的AB-8树脂上吸附，用50毫升85％乙醇洗脱，减压蒸干得到150毫克反应物；经薄层层析(TLC)和高校液相色 谱法检测，其中70％为柴胡皂苷5，30％为苷元。 
上述酶再分别与柴胡皂苷D、B1、B2按照上述酶解反应，分别得到70％柴胡皂苷6、7、8，和30％苷元。 
3、新型柴胡总皂苷 
取柴胡皂苷糖苷酶50ml与2克柴胡总皂苷、100毫升0.02M，pH3.0的醋酸缓冲液和50毫升上述酶液混合，在40℃反应24小时，在100℃加热5分钟，离心除酶蛋白，其上清在40毫升的AB-8树脂上吸附，用200毫升85％乙醇洗脱，减压蒸干得到1.46克反应物；经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测，其中80-90％的柴胡皂苷转化为单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元。 
4、新型柴胡药材 
柴胡皂苷糖苷酶50ml与100克柴胡药材片或者粉，加水100毫升，充分混合，在40℃反应24小时，在100℃加热5分钟没酶，干燥，得单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元含量高的药材，经薄层层析(TLC)和高校液相色谱(HPLC)法检测，其柴胡中的60-80％柴胡皂苷转化为单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元。 
实施例(二)黑曲霉菌 
1、产酶 
黑曲霉菌(Aspegillus niger)在含5％麦麸浸出物、0.1％柴胡皂苷的培养基中接种，在28～30℃搅拌通风培养50～100小时，离心除菌、用60～75％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白、收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸铵，离心除渣，即为浓缩的柴胡皂苷酶粗酶液。 
其粗酶利用DEAE-cellulose离子交换柱法对进行分离提纯。离子交换柱规格Φ2.0×15cm，DEAE-cellulose柱预先用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液处理平衡过的，DEAE-cellulose的有效体积28mL；粗酶液8mL加入到离子交换柱上吸附，然后用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液中溶解KCl浓度为60～600mM的溶液梯度洗脱分步收集，每管收集3mL，每收集的管酶液与柴胡皂苷反应；结果第31和32号管能水解柴胡皂苷，做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是单带，说明纯酶，其分子量为8.7万。 
2、单糖基柴胡皂苷和苷元 
该酶与含200毫克柴胡皂苷D的5毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH4～7.0)混合，在35～60℃反应15～24小时，在100℃加热5分钟，离心除酶蛋白，其上清液在10毫升的AB-8树脂上吸附，用50毫升85％乙醇洗脱，减压蒸干得到150毫克反应物；经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测，其中70％为柴胡皂苷6，30％为苷元。 
上述酶再分别与柴胡皂苷A、B1、B2按照上述酶解反应，分别得到70％柴胡皂苷5、7、8，和30％苷元。 
3、新型柴胡总皂苷 
取柴胡皂苷糖苷酶50ml与2克柴胡总皂苷、100毫升0.02M，pH3.0的醋酸缓冲液和50毫升上述酶液混合，在40℃反应24小时，在100℃加热5分钟，离心除酶蛋白，其上清在40毫升的AB-8树脂上吸附，用200毫升85％乙醇洗脱，减压蒸干得到1.46克反应物；经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测，其中80-90％的柴胡皂苷转化为单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元。 
4、新型柴胡药材 
柴胡皂苷糖苷酶50ml与100克柴胡药材片或者粉，加水100毫升，充分混合，在40℃反应24小时，在100℃加热5分钟没酶，干燥，得单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元含量高的药材，经薄层层析(TLC)和高校液相色谱(HPLC)法检测，其柴胡中的60-80％柴胡皂苷转化为单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元。 
实施例(三)、米曲霉发酵产酶 
1、产酶 
米曲霉(Aspegillus oryzae)菌在含5％麦麸浸出物、0.05％大豆异黄酮或者芦丁的培养基；或者含5％麦麸浸出物、0.8％脱脂大豆浸出物或者槐花浸出物的培养基中接种，28～30℃搅拌通风培养50～100小时，离心除菌，其上清液中加入三倍体积的酒精沉淀酶蛋白、收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，即为粗酶液。 
其粗酶利用DEAE-cellulose离子交换柱法对进行分离提纯。离子交换柱规格Φ1.6×13.5cm，DEAE-cellulose柱预先用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液处理平衡过的，DEAE-cellulose的有效柱体积27.1ml；粗酶液8mL加入到离子交换柱上吸附，然后用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液中溶解KCl浓度为60～600mM的溶液梯度洗脱分步收集，每管收集3mL，每收集管的酶液与柴胡皂苷反应；结果第31和32号管能水解柴胡皂苷，做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是单带，说明纯酶，其分子量为5.8万。 
2、单糖基柴胡皂苷或苷元 
柴胡皂苷糖苷酶与含200毫克柴胡皂苷B1的5毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)混合，在40℃反应20小时，在100℃加热5分钟，离心除酶蛋白，其上清液在10毫升的AB-8树脂上吸附，用50毫升85％乙醇洗脱，减压蒸干得到150毫克反应物；经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测，其中70％为柴胡皂苷7，30％为苷元。 
取柴胡皂苷糖苷酶分与柴胡皂苷A按照上述酶解反应过程，得到70％的单糖基皂苷5和 30％苷元。 
取柴胡皂苷糖苷酶分与柴胡皂苷D按照上述酶解反应过程，得到70％的单糖基皂苷6和30％苷元。 
取柴胡皂苷糖苷酶分与柴胡皂苷B2按照上述酶解反应过程，得到70％的单糖基皂苷8和30％苷元。 
3、新型柴胡总皂苷 
取柴胡皂苷糖苷酶50ml与2克柴胡总皂苷、100毫升0.02M，pH3.0的醋酸缓冲液和50毫升上述酶液混合，在40℃反应24小时，在100℃加热5分钟，离心除酶蛋白，其上清在40毫升的AB-8树脂上吸附，用200毫升85％乙醇洗脱，减压蒸干得到1.46克反应物；经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测，其中80-90％的柴胡皂苷转化为单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元。 
4、新型柴胡药材 
柴胡皂苷糖苷酶50ml与100克柴胡药材片或者粉，加水100毫升，充分混合，在40℃反应24小时，在100℃加热5分钟没酶，干燥，得单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元含量高的药材，经薄层层析(TLC)和高校液相色谱(HPLC)法检测，其柴胡中的70-80％柴胡皂苷转化为单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元。 
实施例(四)、细菌发酵产酶 
以高温好氧菌Bacillus sp.JF菌在含3％玉米粉、0.3％柴胡浸出物或0.05％的大豆异黄酮/芦丁、0.01％MgSO4培养基中，温度60℃通风培养30～60小时，离心除菌、用三倍体积的酒精沉淀酶蛋白，冻干，得到粗柴胡皂苷酶。 
其粗酶利用DEAE-cellulose离子交换柱法对进行分离提纯。离子交换柱规格Φ1.6×13.5cm，DEAE-cellulose柱预先用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液处理平衡过的，DEAE-cellulose的有效柱体积27.1ml；粗酶液8mL加入到离子交换柱上吸附，然后用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液中溶解KCl浓度为60～600mM的溶液梯度洗脱分步收集，每管收集3mL，每收集管的酶液与柴胡皂苷反应；结果第31和32号管能水解柴胡皂苷，做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是单带，说明纯酶，酶的分子量为5.0万。 
其纯酶分别与柴胡皂苷A、D、B1、B2分别反应，经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测反应物，分别得到单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和相应的苷元。 
柴胡皂苷糖苷酶10g与30g柴胡混合总皂苷，1500毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)和150毫升乙醇混合均匀，在温度60℃搅拌反应16～28小时。反应後加入6000毫升酒精，过滤除去 蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到22克低糖基皂苷粗品；经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法分析反应物检测结果，80％以上的柴胡皂苷转化成单糖基柴胡皂苷和苷元。 
实施例(五)、链霉菌产酶 
取维素链霉菌Streptomyces cellulosae菌在含3％玉米粉、0.3％柴胡浸出物、0.01％MgSO4培养基中，温度60℃通风培养30～60小时，离心除菌、用三倍体积的酒精沉淀酶蛋白，冻干，得到粗柴胡皂苷酶。 
其粗酶利用DEAE-cellulose离子交换柱法对进行分离提纯。离子交换柱规格Φ1.6×13.5cm，DEAE-cellulose柱预先用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液处理平衡过的，DEAE-cellulose的有效柱体积27.1ml；粗酶液8mL加入到离子交换柱上吸附，然后用0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液中溶解KCl浓度为60～600mM的溶液梯度洗脱分步收集，每管收集3mL，每收集管的酶液与柴胡皂苷反应；结果第31和32号管能水解柴胡皂苷，做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是单带，说明纯酶，酶的分子量为3.5万。 
其纯酶分别与柴胡皂苷A、D、B1、B2分别反应，经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测反应物，分别得到单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和相应的苷元。 
柴胡皂苷糖苷酶10g与30g柴胡混合总皂苷，1500毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)和150毫升乙醇混合均匀，在温度60℃搅拌反应16～28小时。反应後加入6000毫升酒精，过滤除去蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到22克低糖基皂苷粗品；经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法分析反应物检测结果，80％以上的柴胡皂苷转化成单糖基柴胡皂苷和苷元。 
实施例(六)、酵母菌产酶 
白假丝酵母(Candida albicans)在10％的含柴胡粉麦麸培养基(干物1000克)上接种，分装在茄子瓶中30℃、培养3～6天，收集培养物加入6000毫升的生理盐水，浸泡2小时，离心取上清，加入饱和度60～75％的硫酸按，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升的pH5、0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析出去硫酸铵，离心除渣，即得500毫升左右的酶液。 
2克柴胡总皂苷、100毫升0.02M，pH4～6.0的醋酸缓冲液和50毫升上述酶液混合，在35～60℃反应18～28小时，在100℃加热5分钟，离心除酶蛋白，其上清在40毫升的AB-8树脂上吸附，用200毫升85％乙醇洗脱，减压蒸干得到1.10克反应物；经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测，其中50-70％的柴胡皂苷转化为单糖基柴胡皂苷5、6、7、8和苷元。 
实施例(七)、担子菌产酶 
蘑菇菌(Agaricus campestris)培养在柴胡粉和稻皮各10％的麦夫培养基上、在25℃培养8-15天收集培养物加入6000毫升的生理盐水，浸泡2小时，离心取上清，加入饱和度60～ 75％的硫酸按，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升的pH5、0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析出去硫酸铵，离心除渣，即得500毫升左右的酶液。 
2克柴胡总皂苷、100毫升0.02M，pH4～6.0的醋酸缓冲液和50毫升上述酶液混合，在35～60℃反应18～28小时，在100℃加热5分钟，离心除酶蛋白，其上清在40毫升的AB-8树脂上吸附，用200毫升85％乙醇洗脱，减压蒸干得到1.10克反应物；经薄层层析(TLC)和高校液相色谱法检测，其中60-70％的柴胡皂苷转化为单糖基柴胡皂苷5和苷元。分离提纯和检测酶反应产物，70％柴胡皂苷转化成低糖基皂苷，产物有柴胡皂苷5、6、7、8和少量苷元。 

Claims (10)

1.一种柴胡皂苷糖苷酶的酶解代谢产物的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵方法：采用液态发酵法或固态发酵法，其中所述液态发酵法是指产酶时加入相当于培养基0.01％-1％的柴胡皂苷诱导物、或者相当于培养基0.1％-3％柴胡提取物，发酵培养2-8天、离心除渣，得到粗酶液；固态发酵法是加入培养基1％-30％柴胡，培养2-8天，用缓冲液浸出、离心除渣得粗酶液；所述微生物为链霉菌；
(2)向粗酶液中加入60-75％饱和硫酸铵沉淀酶蛋白，收集沉淀再用原酶液的1/5-1/10的浓度0.001-0.5M，pH为3-10的缓冲液溶解，离心除渣得到酶的浓缩液；
(3)粗酶浓缩液还经离子交换树脂柱和/或蛋白制备色谱仪分离提纯，得到在SDS电泳上单一带的纯柴胡皂苷糖苷酶，所述柴胡皂苷糖苷酶的蛋白质分子量为3.0-9.0万；
(4)上述柴胡皂苷糖苷酶与0.01％-10％底物的pH3～9缓冲液混合在4～75℃，反应4～40小时后，提取酶解代谢产物。
2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述液态发酵法是指产酶时加入相当于培养基0.05％-0.3％的柴胡皂苷；或相当于培养基0.3％-1％柴胡提取物；固态发酵法是加入培养基10％-20％柴胡药材。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的柴胡皂苷糖苷酶的蛋白质分子量为5.0-8.0万。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的底物浓度为浓度0.5-4％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述底物为柴胡总皂苷，酶解代谢产物为含有单糖基柴胡皂苷或苷元的混合柴胡总皂苷。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)取0.1-6％柴胡总皂苷的pH5～6缓冲液与柴胡皂苷糖苷酶充分混合，在55～65℃，反应时间18～28小时，加入2-4倍体积酒精，沉淀酶蛋白，离心除酶蛋白，其上清液经树脂或硅胶吸附，75-95％乙醇洗脱，洗脱物减压干燥后即得柴胡总皂苷。
7.如权利要求1所述代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述底物为柴胡皂苷，酶解代谢产物为单糖基柴胡皂苷或苷元。
8.权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)取柴胡皂苷pH4～7缓冲液与柴胡皂苷糖苷酶混合在35～60℃，反应15～24小时；离心除酶蛋白，其上清液经树脂或硅胶吸附，用50-95％乙醇洗脱提取，提取单糖基柴胡皂苷或苷元。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述底物为柴胡药材，酶解代谢产物为含有单糖基柴胡皂苷或苷元含量高的柴胡药材。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)取柴胡药材或粉末与酶混合，在35～60℃，pH4～6，反应18～28小时后，离心除酶蛋白，干燥，得单糖基柴胡皂苷含量高的药材。
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