CN104086638A - 一种苦荞麦凝集素的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种苦荞麦凝集素(Tartaty Buckwheat Lectin，TBL)的制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。其制备方法是将苦荞麦种子粉碎，加入蛋白提取液低温提取，随后加入硫酸铵沉淀蛋白，再经过脱盐,离子交换层析等步骤获得纯的苦荞麦凝集素蛋白。本发明提供的苦荞麦凝集素，可以特异性地杀伤结直肠癌细胞，并且抑制肿瘤的增殖和转移，可以应用在抗肿瘤药物中。

Description

一种苦荞麦凝集素的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物功能蛋白制备和应用，具体属于一种苦荞麦凝集素的制备方法，以及制备的苦荞麦凝集素在制备抗结肠癌药物中的应用。
背景技术
荞麦属双子叶蓼科植物，有2个栽培种，即甜荞麦和苦荞麦。荞麦作为一种传统作物在全世界广泛种植。《本草纲目》记载，荞麦“实肠胃、益气力、续精神、利耳目、炼五脏滓秽”，“降气宽肠、磨积滞、消热肿风痛”等功能。尤其苦荞麦在国外视为野生植物，只在我国云贵高原，喜马拉雅地区以及华北北部有栽培和食用习惯。近年来农业、医学及食品营养学等方面的研究表明，荞麦其营养价值居所有粮食作物之首，不仅营养成分丰富、营养价值高，而且含有其它粮食作物所缺乏和不具有的特种微量元素及药用成分。现代医学研究表明，荞麦中所含的黄酮类物质(主要为芦丁)，具有多方面的生理功能，能维持毛细血管的抵抗力，降低其通透性及脆性，促进细胞增生和防止血细胞的凝集，还具有抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂等方面的作用。国家二类抗癌新药“威麦宁”胶囊是以金荞麦干燥块根有效部位提取开发的药物，该产品既能直接杀癌细胞，又能提高机体免疫力的药物，被美国FDA批准直接进入II期临床试验。因此荞麦也被誉为21世纪的明星作物，受到越来越多人们的关注。
凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白，具有一个或多个可以与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化结构域。凝集素在生物学及医学上有重要用途，在生物鉴定方面主要应用于血型鉴定和微生物的鉴定。凝集素在恶性肿瘤诊断和治疗中的也具有重要的作用。岩藻糖凝集素可以专一性识别甲胎蛋白(AFP)糖链中岩藻糖，如果AFP糖链中岩藻糖增加就可以诊断患者是原发性肝癌。百脉根凝集素在未分化型胃癌中反应降低,而在分化型胃癌中刀豆凝集素反应降低。某些凝集素也可以用于癌症的治疗，如槲寄生凝集素(ML)能使肝癌细胞中端粒酶活性降低，使端粒失去功能，使细胞凋亡，被认为是癌症患者化疗最重要的成分。
II型核糖体失活蛋白是一类兼有细胞凝集和N-糖苷酶活性的凝集素，由于其对肿瘤细胞比对正常细胞更具毒性，而且具有抗病毒、抗肿瘤、抗真菌等功能，引起了人们的广泛关注。早在几百年前，人们就已经知道相思豆种子和蓖麻种子的毒性都是由于一类特殊蛋白的存在，并将来自蓖麻中的毒性蛋白命名为Ricin。1987年，Endo等人发现ricin类蛋白具有N-糖苷酶活性，可特异性的水解大核糖体RNA上的腺嘌呤，从而使核糖体失活，至此就赋予了凝集素新的功能，即核糖体失活蛋白(RIP)的酶性功能。目前，人们已经从大约50多种植物中得到了RIPs，但是II型核糖体失活蛋白，仅仅6科8种植物中发现。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苦荞麦凝集素的制备方法，以及该凝集素在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的一种苦荞麦凝集素，来源于苦荞麦(tartary buckwheat)，其分子量为62 kD。
本发明提供的一种苦荞麦凝集素，可以通过如下方法制得：将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，然后按每克荞麦粉加入10-15mL pH4.0-pH 5.0的醋酸盐缓冲液，4℃抽提4-24小时，8000rpm离心20分钟除去沉淀，收集上清；将上清用纱布过滤，除去麸皮，在上清中加入硫酸铵，至80％的饱和度，在4℃搅拌4小时；8000rpm离心30分钟，收集沉淀；用少量pH7.0的PBS缓冲液重新溶解沉淀，上样于脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋白粗提物；将粗提物上样于HiTrapTM DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集洗脱峰，将收集的洗脱峰蛋白样品再次上样于脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到该分子量为62 kD的苦荞麦凝集素。
采用SDS-PAGE技术分析，通过与标准分子量比对，该苦荞麦凝集素的分子量约为62 kD。
本发明提供的苦荞麦凝集素是一种糖基化蛋白。
本发明提供的一种苦荞麦凝集素可以使人红细胞发生凝集。
经体外抗肿瘤活性检测显示，该苦荞麦凝集素可显著地抑制结肠癌细胞增殖。当用终浓度为40ug/mL的该蛋白处理结肠癌细胞24小时，对该细胞的增殖抑制率达到50％以上，而当作用时间为48小时时，增殖抑制率达到90％以上。而对正常细胞及其它癌细胞生长无明显的抑制作用。
本发明获得的抗肿瘤活性的荞麦凝集素经体外抗肿瘤活性检测，显示出对结肠癌细胞的活性具有明显的抑制作用，对结肠癌具有专一性抑制。该蛋白可以在制备抗肿瘤药物中应用，也可以在保健食品中应用。
与现有技术相比，本发明首次从小杂粮作物，苦荞麦种子中分离纯化出一种苦荞麦凝集素，对结肠癌细胞具有特异的增殖抑制活性，但是对正常细胞及其它肿瘤细胞无毒副作用。这一蛋白的发现，对于荞麦资源的深度开发及有效利用具有巨大的经济价值，同时也为抗肿瘤药物及保健食品的开发提供技术支持。
附图说明
图1是苦荞麦凝集素的SDS-PAGE分析图
图2是苦荞麦凝集素的PAS染色图
图3是苦荞麦凝集素对结直肠癌细胞生长抑制图
具体实施方式
实施例1：苦荞麦凝集素的制备
将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，过40目筛，收集粉末；称取100g粉末，加入1000mL pH4.5的20mM的醋酸盐缓冲液，4℃提取12小时，8000rpm离心20分钟除去沉淀，上清用纱布过滤，然后加入硫酸铵，至80％的饱和度；在4℃搅拌4小时，使蛋白充分沉淀，8000rpm离心30min，收集沉淀，用30mL pH7.0的PBS缓冲液将沉淀重新溶解；将溶解的沉淀上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋白粗提物；将粗提物上样于HiTrapTM DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集氯化钠洗脱峰，将收集的洗脱峰蛋白样品再次上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到苦荞麦凝集素。采用Folin-酚法测定蛋白浓度，经计算采用该方法制得5.4mg苦荞麦凝集素，经SDS-PAGE分析,分子量大小为62 kD(见图1)。
实施例2：苦荞麦凝集素的制备
将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，过40目筛，收集粉末；称取100g粉末，加入1000mL pH4.0的20mM的醋酸盐缓冲液，4℃提取4小时，8000rpm离心20min除去沉淀，上清用纱布过滤，然后加入硫酸铵，至80％的饱和度；在4℃搅拌4小时，使蛋白充分沉淀，8000rpm离心30min，收集沉淀，用30mL pH7.0的PBS缓冲液将沉淀重新溶解；将溶解的沉淀上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋白粗提物；将粗提物上样于HiTrapTM DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集氯化钠洗脱峰，将收集的洗脱峰蛋白样品再次上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到苦荞麦凝集素。采用Folin-酚法测定蛋白浓度，经计算采用该方法制得3.7mg苦荞麦凝集素，经SDS-PAGE分析,分子量大小为62 kD。
实施例3：苦荞麦凝集素的制备
将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，过40目筛，收集粉末；称取100g粉末，加入1500mL pH4.5的20mM的醋酸盐缓冲液，4℃提取12小时，8000rpm离心20min除去沉淀，上清用纱布过滤，然后加入硫酸铵，至80％的饱和度；在4℃搅拌4小时，使蛋白充分沉淀，8000rpm离心30min，收集沉淀，用30mL pH7.0的PBS缓冲液将沉淀重新溶解；将溶解的沉淀上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋白粗提物；将粗提物上样于HiTrapTM DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集氯化钠洗脱峰，将收集的洗脱峰蛋白样品再次上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到苦荞麦凝集素。采用Folin-酚法测定蛋白浓度，经计算采用该方法制得4.3mg苦荞麦凝集素，经SDS-PAGE分析,分子量大小为62 kD。
实施例4：苦荞麦凝集素的PAS染色
实施例1制备的苦荞麦凝集素，经SDS-PAGE(浓缩胶浓度：4％，分离胶浓度：12.5％)分离后，转移到固相支持物PVDF膜上。将PVDF膜放置于含有Schiff试剂的培养皿中避光染色30min，将膜用蒸馏水漂洗3次，可以看到苦荞麦凝集素可以被Schiff试剂染色，呈现玫红色，说明苦荞麦凝集素是一种糖基化蛋白(见图2)。
实施例5：苦荞麦凝集素对结直肠癌细胞生长抑制作用
应用MTT法，检测苦荞麦凝集素对正常细胞株HL7702和HEK293以及其它肿瘤细胞株Hep G2，HeLa，MCF-7，QBC939，SGC7901，SW480，HCT116，DLD1等的生长抑制作用。取对数生长期的细胞，以1-5×103个/孔传入96孔培养板，37℃含5％的CO2细胞培养箱中孵育24小时后，分别加入实施例1中的苦荞麦凝集素蛋白，使其终浓度分别为40ug/mL,20ug/mL,10ug/mL,5ug/mL,每组浓度设5个复孔，并用等体积的pH7.0的20mM/L PBS缓冲液作为对照，分别孵育24h和48h后，每孔加入20uL MTT试剂(5mg/mL)，继续孵育4小时后，终止培养，弃去孔内培养上清，每孔加入150uL DMSO,振荡10分钟，使结晶物充分溶解，在酶标仪上490nm波长处测定其光吸收值。本发明所得的荞麦凝集素，对人结肠癌细胞，SW480，HCT116和DLD1具有显著的抑制增殖作用(见图3)。用终浓度为40ug/ml的该蛋白处理结肠癌SW480细胞24小时，对该细胞的增殖抑制率达到50％以上，而当作用时间为48小时时，增殖抑制率达到90％以上。而对正常细胞及其它肿瘤细胞无明显的抑制增殖作用。

Claims (2)

1.一种苦荞麦凝集素，其特征在于，通过如下方法制得：将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，然后按每克荞麦粉加入10-15mL pH4.0-pH5.0的醋酸盐缓冲液，4℃抽提4-24小时，8000rpm离心20分钟除去沉淀，收集上清；将上清用纱布过滤，除去麸皮，在上清中加入硫酸铵，至80％的饱和度，在4℃搅拌4小时；8000rpm离心30分钟，收集沉淀；用少量pH7.0的PBS缓冲液重新溶解沉淀，上样于脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到荞麦蛋白粗提物；将粗提物上样于HiTrapTM DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集洗脱峰，将收集的洗脱峰蛋白样品再次上样于脱盐柱，收集蛋白峰，真空冷冻干燥，得到该分子量为62kD的苦荞麦凝集素。
2.如权利要求1所述的苦荞麦凝集素在制备抗结肠癌药物中的应用。
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