CN101787361A - 芦丁水解酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种芦丁水解酶，是以苦荞麦种子为材料，通过去壳，粉碎，醋酸缓冲液提取，Resource Q阴离子交换和Sephacryl S-200凝胶层析分离纯化制得。SDS-PAGE分析显示其分子量约为70kD。本发明提供的芦丁水解酶可以将芦丁特异性地水解为槲皮素。水解反应体系为低浓度的乙醇溶液，制备的产物槲皮素由于和芦丁溶解度的不同而被沉淀析出。本发明制备的槲皮素纯度达到98％，制备方法简单易行，成本低廉，反应条件温和，适合大规模生产，适于将不同来源的芦丁水解为槲皮素。

Description

芦丁水解酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及水解酶，具体属于一种芦丁水解酶及其制备方法和应用。
背景技术
芦丁是一种黄酮类化合物，在自然界的植物中根，茎，叶，花，果实中都有存在，分布非常广泛，常用中药如槐米、银杏、荞麦，柴胡等的含量都比较高。槲皮素是芦丁的疳元形式，化学名为3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮，是芦丁除去糖苷的产物，槲皮素和芦丁相比有更强的生理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗自由基以及保护血管等，常被用作食品添加剂或者辅助药物给药。然而槲皮素在植物中的含量只有千分之几到万分之几，以往槲皮素的制备都是直接从植物中提取，产量和回收率都较低，而且使用有机溶剂提取，很难实现产业化生产。中国专利申请200610065217.6以芦丁制备槲皮素及异槲皮苷的方法所获产物为槲皮素和异槲皮素的混合物，这给后期分离、纯化带来了困难，不易实现规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种芦丁水解酶及其制备方法，以及芦丁水解酶在制备槲皮素中的应用。
本发明提供的一种芦丁水解酶，是将苦荞麦(tartary buckwheat)脱壳粉碎，经过pH 5.0的20mM醋酸盐缓冲液抽提，Resource Q阴离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析，得到的一种分子量为70kD的水解酶，其可以将芦丁特异性地水解为槲皮素。
本发明提供的芦丁水解酶的制备方法，包括如下步骤：将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，按每克荞麦粉加入10-15ml 10-50mM pH 5.0的醋酸盐缓冲液，4℃抽提10-30小时，离心，除去沉淀，上清液中加入硫酸铵至60-80％的饱和度，在4℃搅拌2-4小时，离心，收集沉淀，用少量10-50mM pH 7.0Tris-HCl缓冲液重新溶解沉淀，并用同样缓冲液对样品进行透析，除去硫酸铵，得到荞麦蛋白粗提物；将蛋白粗提物先用Resource Q阴离子交换柱分离纯化，再用Sephacryl S-200凝胶柱进一步纯化；收集活性峰，真空冷冻干燥，得到芦丁水解酶。SDS-PAGE分析显示其分子量约为70kD。
本发明提供的芦丁水解酶可在制备槲皮素中应用。具体制备方法：是将芦丁在20％-30％的乙醇中完全溶解后，加入权利要求1所述的芦丁水解酶，在37℃水浴中保温30-60min，室温下冷却，待黄色物质充分析出后，离心收集沉淀，干燥，所得水解物即为槲皮素。槲皮素的鉴定采用高效液相色谱法，与槲皮素标准品比对，保留时间相同，且显示单一峰，产品纯度达到了98％，说明得到的产品即为槲皮素。
本发明制备芦丁水解酶的方法简单，底物转化效率较高，用本发明制备的芦丁水解酶能将芦丁专一性的水解为活性更强的槲皮素，在酶法制备槲皮素方面具有应用价值。这为槲皮素的制备提供了新的方法，也为植物体内的小分子化合物的次生代谢途径提供一个参考。
附图说明：
图1.本发明制备的芦丁水解酶的SDS-PAGE分析图
Mr：低分子量标准蛋白。泳道1：荞麦蛋白粗提物；泳道2：纯化的芦丁水解酶。
图2芦丁水解酶水解产物(槲皮素)HPLC鉴定图
A：槲皮素标准品鉴定图
B：芦丁水解酶水解产物(槲皮素)鉴定图
具体实施方式：
实施例1：芦丁水解酶的制备：将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，秤取荞麦粉10g，按每克荞麦粉加入10ml 20mM pH 5.0的醋酸盐缓冲液，4℃抽提24小时，12000rpm离心20min除去沉淀，上清中加入(NH4)2SO4，至80％的饱和度，在4℃搅拌2小时。离心，收集沉淀，用10ml 20mM Tris-HCl pH7.0缓冲液重新溶解沉淀，并用同样缓冲液对样品进行透析，除去(NH4)2SO4，得到荞麦蛋白粗提物。取蛋白粗提物1ml，上样到Resource Q柱(柱体积为1ml)，平衡缓冲液为20mmol/L，pH7.0的Tris-HCl，洗脱液为20mmol/LTris+0.5mol/LNaCl，流速0.5ml/min，0.5mol/L NaCl梯度洗脱，收集活性洗脱峰。进一步用Sephacryl S-200凝胶层析分离。取阴离子交换层析收集的活性蛋白样品0.5ml，上样到Sephacryl S-200凝胶柱，控制流速为0.5ml/min，采用10mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.0包含0.15mol/LNaCl)，进行洗脱。收集活性洗脱峰对纯水透析，真空冷冻干燥，得到芦丁水解酶。本发明制备的芦丁水解酶经12.5％SDS-PAGE分析显示分子量约为70kD(见图1)。
实施例2：芦丁水解酶的应用：将芦丁用30％乙醇溶解，配制成0.5mg/mL的芦丁溶液。取500μl芦丁溶液，再加入本发明制备的芦丁水解酶(0.2mg/ml)50μl，将反应混合物在37℃水浴保温30min，待室温冷却并析出黄色物质后，静置20分钟，12000rpm离心，收集沉淀，干燥，得到槲皮素产品。取少许产品用无水乙醇溶解，HPLC法鉴定产品纯度，流动相为：甲醇-0.4％磷酸(50∶50)，流速0.6ml/min，进样体积20μl，检测波长360nm。以标准槲皮素为对照，根据峰面积计算本发明制备获得的槲皮素纯度达到98％以上。(见图2)

Claims (4)

1.一种芦丁水解酶，其特征在于，将苦荞麦脱壳粉碎，经过pH 5.0的20mM醋酸盐缓冲液抽提，Resource Q阴离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析，得到的一种分子量为70kD的水解酶，其可以将芦丁特异性地水解为槲皮素。
2.如权力要求1所述的芦丁水解酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将烘干的苦荞麦种子，脱壳粉碎后，按每克荞麦粉加入10-15ml10-50mM pH 5.0的醋酸盐缓冲液，4℃抽提10-30小时，离心，除去沉淀，上清液中加入硫酸铵至60-80％的饱和度，在4℃搅拌2-4小时，离心，收集沉淀，用少量10-50mM pH 7.0Tris-HCl缓冲液重新溶解沉淀，并用同样缓冲液对样品进行透析，除去硫酸铵，得到荞麦蛋白粗提物；将蛋白粗提物先用Resource Q阴离子交换柱分离纯化，再用Sephacryl S-200凝胶柱进一步纯化；收集活性峰，真空冷冻干燥，得到芦丁水解酶。SDS-PAGE分析显示其分子量约为70kD。
3.如权力要求1所述的芦丁水解酶在制备槲皮素中的应用。
4.如权力要求1所述的芦丁水解酶制备槲皮素的方法，包括如下步骤：将芦丁在20％-30％的乙醇中完全溶解后，加入权利要求1所述的芦丁水解酶，在37℃水浴中保温30-60min，室温下冷却，待黄色物质充分析出后，离心收集沉淀，干燥，所得水解物即为槲皮素。
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