CZ307927B6 - Heterogenní způsob výroby rutinosy - Google Patents
Heterogenní způsob výroby rutinosy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ307927B6 CZ307927B6 CZ2018-352A CZ2018352A CZ307927B6 CZ 307927 B6 CZ307927 B6 CZ 307927B6 CZ 2018352 A CZ2018352 A CZ 2018352A CZ 307927 B6 CZ307927 B6 CZ 307927B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- quercetin
- rutinose
- rutin
- reaction
- rutinosidase
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 14
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 180
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 claims abstract description 90
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 claims abstract description 90
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 89
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 89
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 89
- OVVGHDNPYGTYIT-VHBGUFLRSA-N Robinobiose Natural products O(C[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C)O1 OVVGHDNPYGTYIT-VHBGUFLRSA-N 0.000 claims abstract description 67
- JMGZEFIQIZZSBH-UHFFFAOYSA-N Bioquercetin Natural products CC1OC(OCC(O)C2OC(OC3=C(Oc4cc(O)cc(O)c4C3=O)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C2O)C(O)C(O)C1O JMGZEFIQIZZSBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 66
- FDRQPMVGJOQVTL-UHFFFAOYSA-N quercetin rutinoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=O)O1 FDRQPMVGJOQVTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 66
- OVVGHDNPYGTYIT-BNXXONSGSA-N rutinose Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 OVVGHDNPYGTYIT-BNXXONSGSA-N 0.000 claims abstract description 66
- 229960004555 rutoside Drugs 0.000 claims abstract description 66
- IVTMALDHFAHOGL-UHFFFAOYSA-N eriodictyol 7-O-rutinoside Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC=2C=C3C(C(C(O)=C(O3)C=3C=C(O)C(O)=CC=3)=O)=C(O)C=2)O1 IVTMALDHFAHOGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 65
- IKGXIBQEEMLURG-BKUODXTLSA-N rutin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OC[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](OC=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=O)O1 IKGXIBQEEMLURG-BKUODXTLSA-N 0.000 claims abstract description 65
- 235000005493 rutin Nutrition 0.000 claims abstract description 65
- ALABRVAAKCSLSC-UHFFFAOYSA-N rutin Natural products CC1OC(OCC2OC(O)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1OC3=C(Oc4cc(O)cc(O)c4C3=O)c5ccc(O)c(O)c5 ALABRVAAKCSLSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000010908 decantation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 64
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 20
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 18
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 13
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 13
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 claims description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 12
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 8
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 8
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 claims description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 5
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 claims description 2
- 241000187844 Actinoplanes Species 0.000 claims description 2
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 claims description 2
- 241000235395 Mucor Species 0.000 claims description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 41
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 9
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 8
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 7
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 7
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 7
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 7
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 6
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 6
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 5
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000219051 Fagopyrum Species 0.000 description 4
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 4
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000001767 chemoprotection Effects 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 3
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 3
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 2
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 2
- 102000042092 Glucose transporter family Human genes 0.000 description 2
- OVSQVDMCBVZWGM-IDRAQACASA-N Hirsutrin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)C1=C(c2cc(O)c(O)cc2)Oc2c(c(O)cc(O)c2)C1=O OVSQVDMCBVZWGM-IDRAQACASA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FVQOMEDMFUMIMO-UHFFFAOYSA-N Hyperosid Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2OC1C1=CC=C(O)C(O)=C1 FVQOMEDMFUMIMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 2
- GXMWXESSGGEWEM-UHFFFAOYSA-N isoquercitrin Natural products OCC(O)C1OC(OC2C(Oc3cc(O)cc(O)c3C2=O)c4ccc(O)c(O)c4)C(O)C1O GXMWXESSGGEWEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 2
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- OVSQVDMCBVZWGM-QSOFNFLRSA-N quercetin 3-O-beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=CC=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O OVSQVDMCBVZWGM-QSOFNFLRSA-N 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- 239000001100 (2S)-5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 description 1
- 229910003208 (NH4)6Mo7O24·4H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010953 Ames test Methods 0.000 description 1
- 231100000039 Ames test Toxicity 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010007191 Capillary fragility Diseases 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 206010008132 Cerebral thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 241001479482 Datisca glomerata Species 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N Hesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(COC4C(C(O)C(O)C(C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000001429 Intracranial Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 238000005684 Liebig rearrangement reaction Methods 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000018656 Mitogen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010052006 Mitogen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 241000985535 Penicillium decumbens Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- LUJAXSNNYBCFEE-UHFFFAOYSA-N Quercetin 3,7-dimethyl ether Natural products C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2OC)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 LUJAXSNNYBCFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PUTDIROJWHRSJW-UHFFFAOYSA-N Quercitrin Natural products CC1OC(Oc2cc(cc(O)c2O)C3=CC(=O)c4c(O)cc(O)cc4O3)C(O)C(O)C1O PUTDIROJWHRSJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 description 1
- 241001406782 Rhamnosa Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 235000021068 Western diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- OXGUCUVFOIWWQJ-XIMSSLRFSA-N acanthophorin B Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=CC=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O OXGUCUVFOIWWQJ-XIMSSLRFSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N alpha-D-glucopyranose Natural products OCC1OC(O)C(O)C(O)C1O WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N aurantiamarin Natural products COc1ccc(cc1O)[C@H]1CC(=O)c2c(O)cc(O[C@@H]3O[C@H](CO[C@@H]4O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]4O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)cc2O1 QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical group OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 229940124444 chemoprotective agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N clematine Natural products COc1cc(ccc1O)[C@@H]2CC(=O)c3c(O)cc(O[C@@H]4O[C@H](CO[C@H]5O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]5O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]4O)cc3O2 APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N flavonol Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)=C1C1=CC=CC=C1 HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007946 flavonol Chemical class 0.000 description 1
- 235000011957 flavonols Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N hesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]4[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N 0.000 description 1
- 229940025878 hesperidin Drugs 0.000 description 1
- VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N hesperidin Natural products COc1cc(ccc1O)C2CC(=O)c3c(O)cc(OC4OC(COC5OC(O)C(O)C(O)C5O)C(O)C(O)C4O)cc3O2 VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010030923 hesperidinase Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- 108010001078 naringinase Proteins 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N neohesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)OC3C(C(O)C(O)C(C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013615 non-nutritive sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical group 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 150000003243 quercetin Chemical class 0.000 description 1
- OEKUVLQNKPXSOY-UHFFFAOYSA-N quercetin 3-O-beta-D-glucopyranosyl(1->3)-alpha-L-rhamnopyranosyl(1->6)-beta-d-galactopyranoside Natural products OC1C(O)C(C(O)C)OC1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=CC=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O OEKUVLQNKPXSOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVXVTYYCCQZUKK-UHFFFAOYSA-N quercetin 3-rutinoside Natural products CC1OC(OCC2OC(OC3=C(Oc4ccc(O)c(O)c4C3=O)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1O VVXVTYYCCQZUKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QPHXPNUXTNHJOF-UHFFFAOYSA-N quercetin-7-O-beta-L-rhamnopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(O)=C(C=3C=C(O)C(O)=CC=3)OC2=C1 QPHXPNUXTNHJOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXGUCUVFOIWWQJ-HQBVPOQASA-N quercitrin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=CC=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O OXGUCUVFOIWWQJ-HQBVPOQASA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 230000037373 wrinkle formation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/165—Yeast isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/12—Disaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01168—Hesperidin 6-O-alpha-L-rhamnosyl-beta-D-glucosidase (3.2.1.168)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/66—Aspergillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/66—Aspergillus
- C12R2001/685—Aspergillus niger
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
Abstract
Předmětem tohoto řešení je heterogenní způsob výroby rutinosy z rutinu v heterogenním systému, kdy se rutin ve formě suspenze ve vodném prostředí při pH v rozmezí od 2,05 do 10,1 a při teplotě od 10 do 70 °C, podrobí působení enzymu rutinosidasy za vniku rutinosy a kvercetinu, následně se kvercetin z reakční směsi oddělí centrifugací, filtrací nebo dekantací, a rutinosa se získá krystalizací nebo odpařením reakční směsi po oddělení pevných složek.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká heterogenní enzymové přípravy rutinosy (a-L-rhamnopyranosid-(l—>6)-Dglukopyranosy) z výchozí látky rutinu pomocí glykosidas, získaných z mikroorganismů rodu Aspergillus. Ceněným vedlejším produktem reakce je kvercetin (2-(3,4-dihydroxyfenyl)-3,5,7trihydroxy-4H-chromen-4-on) o vysoké čistotě, který je účinným antioxidantem a je využitelný v nutraceutikách a dalších ochranných přípravcích (např. kosmetice, chemoprotektivních látkách a funkčních potravinách).
Dosavadní stav techniky
Flavonoidy, které se hojně vyskytují v rostlinách, jsou obecně považované za účinné antioxidanty a chemoprotektivní látky. Typickými komponenty přírodních flavonoidů jsou jejich polyfenolické aglykony a glykosidické substituenty. Mezi nejběžnější glykony v přírodních flavonoidech patří D-glukosa, L-rhamnosa, D-galaktosa, D-xylosa, L-arabinosa, a to jak ve formě monoglykosidů, diglykosidů a vzácněji i komplexnějších oligoglykosidů. Jedním z nejhojnějších polyfenolických aglykonů je kvercetin (viz dále).
Typickými reprezentanty rutinosylovaných flavonoidů jsou např. rutin a hesperidin, které se ve značném množství nacházejí v citrusech, pohance a mnoha jiných rostlinných zdrojích. Rutin je vyráběn v multi-tunových množstvích a je široce využíván v léčivech a potravních doplňcích. Obě komponenty rutinu - kvercetin a rutinosa - mají rozsáhlé použití a velmi zajímavé biologické aplikace. Technologicky jednoduchá, biokompatibilní a vysoce výnosná výroba obou těchto komponent (ideálně v jednokrokové reakci) by byla značným technologickým pokrokem.
Rutinosa
Rutinosa (a -L-rhamnopyranosid-(l—>6)-D-glukopyranosa, vázaná na polyfenol β-glykosidickou vazbou, patří mezi často se vyskytující disacharidy ve flavonoidech. Zatímco kvercetin (viz níže) je velmi dobře prozkoumán a jeho využití je rozsáhlé a dobře dokumentované, pak druhá komponenta rutinu - rutinosa - na svoje využití ve velkém rozsahu zatím čeká. Jedním z hlavních důvodů limitovaného využití rutinosy je její špatná dostupnost - v katalozích renomovaných chemických firem je nabízena v miligramových množstvích za excesivní ceny jako analytický standard, což vůbec neumožňuje praktickou aplikaci (25 mg á 10 000 CZK, Sigma-Aldrich).
Největší potenciál pro využití rutinosy je v kosmetickém průmyslu. Rhamnosa, která se nachází na neredukujícím konci rutinosy, je již široce využívána v kosmetice, např. v přípravcích firmy LOreal, pro odstranění nebo omezení tvorby vrásek. Mechanismus účinku rhamnosy a rhamnooligosachaidů, složených z rhamnosy, glukosy, fukosy a dalších sacharidů je založen na principu inhibice elastasy a dalších metaloproteinas ve fibroblastech. Rozsah tzv. „anti-aging“ účinku závisí na struktuře vybraných rhamnooligosacharidů. Je doloženo, že zcela zásadním strukturálním elementem nutným pro účinek na fibroblasty, snížení degradace elastinu a další komplex efektů, je L-rhamnosa vázaná α-glykosidickou vazbou na různé cukerné struktury (jako též i v rutinose). Dále je známo, že derivatizace rhamnosy na redukujícím konci zlepšuje její biodostupnost při topické aplikaci přes epidermis do buněk keratinocytů, kde pak působí. LRhamnosa je sacharid běžný v rostlinné říši, avšak u obratlovců se nevyskytuje. Interaguje však s některými lektinovými receptory v buňkách epidermis na bázi lektinových interakcí (působí výše uvedený „anti-aging“ efekt), avšak do buněk není aktivně transportována. Naopak D-glukosa je základem energetického metabolismu buněk a nej lepším energetickým zdrojem a prakticky
- 1 CZ 307927 B6 všechny buňky ji velmi aktivně importují pomocí série glukosových transportérů. Tento efekt je známý i u glukosidů, které jsou aktivně importovány do buněk výše uvedenými glukosovými transportéry, přičemž do buněk se pak dostane celý glukosid, a to v mnohem vyšší koncentraci, a tedy umožňující i zásadní zvýšení účinku. Glukosidy se též vyznačují obecně nižší toxicitou a tím se podstatně snižuje možnost vzniku vedlejších negativních účinků.
V literatuře jsou popsány poměrně komplikované metody přípravy rutinosy chemickou syntézou. Jedna z prvních prací na toto téma prakticky jen ukazuje přítomnost rutinosy v rutinu komplikovanou sekvenční chemickou degradací rutinu (J.H. Looker et al. Carbohydrate Reseach 13, 179, 1970). Dále sérii (regio)isomerů rutinosy připravili komplexní vícekrokovou chemickou syntézou s nízkými celkovými výtěžky, postačujícími pro spektrální charakteristiku produktů v roce 1959 P.A.J. Gorin a A.S. Perlin (Canadian Journal of Chemistry 37, 1930, 1959) a poté později jinou totální syntézou L. Birkofer et al. (Justus Liebigs Annalen der Chemie 1973, 731, 1973). Malé množství rutinosy vedle methylrutinosidu bylo připraveno jako nové látky extrakcí z rostliny Datisca glomerata a následnou vícekrokovou izolací, zahrnující kolonovou chromatografii a další procedury autory M. Schubert et al. (Planta 231, 507, 2010). V této práci bylo ukázáno, že rutinosa má u některých rostlin podobně důležitou roli ve skladování a přenosu energetických substancí jako mnohem běžnější sacharosa.
Dále je popsáno několik pokusů o přípravu rutinosy pomocí enzymového štěpení, které jsou však komplikovány nutností přídavku toxických organických rozpouštědel, jako např. postup popsaný v práci Simčíková et al. (Advanced Synthesis Catalysis 357, 107 až 117, 2015) - zde byl rutin rozpuštěn ve směsi dimethylsulfoxidu a pufiru a po působení rutinosidasy bylo nutno odštěpenou rutinosu čistit kolonovou chromatografii na silikagelu s použitím organických rozpouštědel s celkovým výtěžkem 63 %.
Celkově je tedy možno shrnout, že žádná publikovaná metoda nepopisuje přímou přípravu čisté rutinosy bez nutnosti např. kolonové chromatografie. Metody totální syntézy jsou mnohakrokové a poskytují rutinosu v nízkých výtěžcích, popsané enzymové metody používají buď organické kosolventy, nebo komplexní enzymové preparáty z pohanky, které kvůli kontaminaci dalšími monoglykosidasami poskytují nečistý preparát, typicky obsahující kontaminující monosacharidy, který je nutno dále chromatografovat. Všechny popsané metody pracují výlučně s roztokem rutinu ve velmi nízkých koncentracích (do 5 g/L) a nadto vůbec neřeší paralelní získání kvercetinu. Žádná z popsaných metod kvůli inherentním důvodům neumožňuje recyklaci enzymu.
Kvercetin
Flavonol kvercetin patří mezi nejběžnější a nejhojnější flavonoidy v rostlinné říši. Mnoho flavonoidů je v přírodních zdrojích přítomno ve formě glykosidů. Kvercetin a jeho glykosidy kvercetin-3-3-D-glukopyranosid (isoquercitrin) a kvercetin-3-rutinosid (rutin) mají širokou škálu pozitivních účinků na lidský organismus. Struktura kvercetinu je zcela unikátní: katecholová část (ort/zo-dihydroxybenzen) spolu s volnou hydroxyskupinou na uhlíku C-3, která je v konjugaci se 4-oxo skupinou a zajišťuje delokalizaci elektronové hustoty z kruhu B a dále konfigurace hydroxyskupin na C-3, -5 a -7 spolu se 4-oxoskupinou činí z kvercetinu unikátní antioxidant. Právě volná C-3 hydroxyskupina, která je velmi často glykosylována v přírodních derivátech kvercetinu (např. rutin, kvercitrin, isokvercitrin) má pro antioxidační aktivitu kvercetinu zásadní důležitost, proto má obecně aglykon kvercetin vyšší antioxidační účinky než jeho glykosidy. Vzhledem k faktu, že kvercetin se v přírodních zdrojích vyskytuje prakticky výhradně ve formě výše zmíněných i dalších glykosidů je nezbytné pro dosažení nejvyšších antioxidačních, chemoprotektivních a dalších prospěšných účinků tento aglykon z příslušných glykosidů uvolnit. Kvercetin byl dříve považován i za potenciálně škodlivý vzhledem k pozitivní reakci v Amesově testu, která implikuje mutagenitu a případnou karcinogenitu této látky (Manach et al., Nutr. Res. 16, 517, 1996). Nicméně tyto pochyby byly v nedávné době rozptýleny a Federal Drug Agency (USA) vydala pro kvercetin tzv. GRAS Notice No. GRN 000341 (2010) - Generally Recognized
-2CZ 307927 B6 as Safe. Tato certifikace pak umožnila značný rozmach komerčního využití této látky v mnoha různých preparátech, nejen pro speciální lidskou výživu, ale i ve veterinárních preparátech.
Rutin je běžně připravován extrakcí z přírodních materiálů. Tato látka je běžnou farmaceutickou komoditou a je rozsáhle využívána v mnoha terapeutických aplikacích, např. při léčbě křehkosti cévních kapilár, cerebrální trombosy, retinitidy a jako systémový chemoprotektant. Kvercetin je typicky přítomný v běžných plodinách západní diety (např. cibuli, jablkách), a to převážně ve formě různých glykosidů, avšak přímo z přírodních zdrojů se dá získat jen velmi obtížně a v nedostatečné čistotě, takže tyto zdroje pro výrobu funkčních potravin prakticky nelze využít.
Extrakce samotného kvercetinu z přírodních zdrojů (např. z cibule - KR 2003016191-A) je ekonomicky zcela nekompetitivní především vzhledem k nízkým výtěžkům a náročnosti procedur; další popsanou metodou v ruských patentech (RU 2182906-C1) je oxidace taxifolinu (dihydrokvercetinu), který je získáván extrakcí z některých sibiřských dřevin a následnou oxidací dusitanem sodným. 1 tato vícestupňová metoda neposkytuje příliš čistý preparát, používá jedovaté chemikálie a není ekonomická.
Kvercetin se v současnosti běžně připravuje chemickou hydro lýzou rutinu, typicky několikahodinovým varem se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou (ca 1 %) nebo i jinými anorganickými kyselinami (Wang et al. Afričan J. Biotechnol. 10, 1460, 2011; CN 104387357-A, 2011). Při tomto procesu za vzniku aglykonu (kvercetinu) odpadají hydrolyzované monosacharidy D-glukosa a L-rhamnosa, protože diglykosid rutinosa vázaná β-glykosidickou vazbou na C-3 kvercetinu je kompletně rozštěpen (nelze ji tedy získat). Dále varem v silné kyselině může docházet k částečnému rozkladu všech reaktantů, včetně kvercetinu, což zhoršuje kvalitu produktu a snižuje výtěžek. Pro hydrolýzu rutinu se využívá i vysokotlaká hydrolýza samotnou vodou (0,2 až 0,8 MPa), kde vzniká směs kvercetinu a isokvercitrinu a uvolněné monosacharidy (CN 1817876-A).
V akademické i patentové literatuře jsou popsány i enzymatické metody přípravy kvercetinu z rutinu. Např. Wang et al. (Afričan J. Biotechnol. 10, 1460, 2011) testoval enzymy hesperidinasu, snailasu a cellulasu-T2440, což jsou směsné preparáty obsahující a-Lrhamnosidasu, β-Dglukosidasu a i další hydrolytické enzymy v různých poměrech. Výtěžky kvercetinu byly pak 30 až 60 % a přitom vznikaly částečně deglykosylované produkty (např. isoquercitrin) a směs monosacharidů (rutinosu tedy nebylo možno získat). Patentový dokument WO 2006/105843 A2 využívá pro deglykosylaci rutinu různých kvasinek, které mají glykosidasovou aktivitu. Z uvolněných monosacharidů je glukosa utilizována in šitu metabolizujícími kvasinkami, takže zůstává čistá L-rhamnosa (kterou kvasinky nemetabolizují) a uvolněný kvercetin. Nevýhodou metody je nízká objemová produktivita a přítomnost kvasinek ve výsledném preparátu, což komplikuje izolaci produktu (např. nelze použít prostou filtraci a promytí, protože kvasinky jsou nerozpustné partikule a zůstávají v preparátu). Patentový dokument CN 101787361-A využívá pro deglykosylaci rutinu enzymu extrahovaného ze semen pohanky, kdy vlastní reakce probíhá ve směsi vody a etanolu (20 až 30 %) a enzym je při reakci inaktivován. Nam et al. (Biotechnol. Lett. 34, 483, 2012) využívá pro štěpení rutinu β-glukosidasu z extremofilního mikroorganismu Pyrococcus furiosus. Konverze rutinu proběhla pouze za přítomnosti kosolventu v roztoku, kterým byl dimethylsulfoxid s koncentrací rutinu 10 mM (ca 6 g/L). Tento enzym je sice deklarován jako rutinosidasa, avšak při hydrolýze rutinu vznikají i monosacharidy, vzhledem k tomu, že enzym má i samotnou glukosidasovou a rhamnosidasovou aktivitu, tj. jde zřejmě o směs různých enzymů. Touto metodou nelze prakticky získat čistou rutinosu.
Problémem existujících postupů je velmi nízká rozpustnost rutinu, která vede k nutnosti použití buď velmi nízkých koncentrací reaktantů nebo přídavku organických rozpouštědel (např. etanolu, dimethylsulfoxidu a dalších) pro zlepšení rozpustnosti (viz výše). Nízké koncentrace substrátu limitují objemovou produktivitu procesu a přídavky organických rozpouštědel kromě jiného částečně inhibují použité enzymy a snižují jejich stabilitu. Dosavadní způsoby, které vždy pracují s rozpuštěným rutinem, mají nejen velmi nízkou objemovou produktivitu, ale nadto neumožňují
-3 CZ 307927 B6 ani vícenásobné použití enzymu, s výjimkou jeho případné imobilizace, která však vyžaduje další výrobní náklady, dochází ke snížení celkové aktivity enzymu a výsledný kvercetin, který je prakticky nerozpustný ve vodě se špatně od imobilizovaného enzymu odstraňuje. Organické kosolventy velmi komplikují nebo prakticky znemožňují přímé získání rutinosy, která je s nimi v roztoku. V případě použití netěkavých rozpouštědel pak nezbývá než použít kolonovou chromatografii. Další je problém možných reziduí kosolventů v rutinose (ale i v kvercetinu), což pak znemožňuje použití v kosmetice nebo dokonce pro perorální podání.
Samotné enzymy pro konverzi lze získat buď komerčně (např. naringinasu, která je směsí a-Lrhamnosidasy, β-D-glukosidasy a dalších hydrolytických enzymů, z mikroorganismu Penicillium decumbens) nebo fermentací příslušných mikroorganismů. Tyto enzymy se dají použít pouze jednou (při izolaci produktu se inaktivují), nebo v imobilizované formě, což však vyžaduje úplné rozpuštění rutinu. Hrubé enzymové preparáty typu pohanková mouka jsou pro paralelní výrobu kvercetinu a rutinosy absolutně nevhodné. Úplného rozpuštění rutinu je dosaženo při použití velmi nízké koncentrace substrátu nebo přidáním organických rozpouštědel, která jsou těkavá, hořlavá, toxická, zvyšují náklady na proces, a navíc enzymy denaturují.
Z výše popsaného je zřejmé, že dosavadními metodami nelze ekonomicky výhodným způsobem z přírodního materiálu přímo izolovat rutinosu ani kvercetin. Vhodným komerčně dostupným prekursorem rutinosy a kvercetinu je rutin. Chemická hydrolýza rutinu ovšem není vhodná, vzhledem k nutnosti využití agresivních chemikálií a dále vzhledem k tomu, že rutinosa je rozložena na monosacharidy. Dále použití agresivní kyseliny ve výrobě může mít negativní komerční konotaci - proti tomu využití enzymů zakládá možnost deklarovat výsledný produkt jako biotechnologicky připravený preparát (bio-produkt). Popsané enzymové nebo jiné biologické metody (kvasinky) pracují s využitím vysokých koncentrací kosolventů, které snižují aktivitu použitého enzymu, nižší objemovou produktivitou a uvolněná rutinosa je částečně nebo úplně rozštěpena na monosacharidy, takže ji není možné získat.
Podstata vynálezu
Uvedené nevýhody dosavadních metod přípravy rutinosy a kvercetinu odstraňuje způsob podle předkládaného vynálezu. Předmětem předkládaného vynálezu je heterogenní způsob výroby rutinosy z rutinu za vzniku kvercetinu jako cenného vedlejšího produktu, kdy se rutin ve formě suspenze, při pH v rozmezí od 2,05 do 10,1 a při teplotě od 10 do 70 °C, podrobí působení enzymu rutinosidasy za vniku rutinosy a kvercetinu, a následně se pevný vedlejší produkt kvercetin z reakční směsi oddělí centrifůgací, filtrací nebo dekantací. Enzym rutinosidasa je s výhodou 6-0-a-L-rhamnopyranosyl^-D-glukopyranosidasa. Rutin se, s výhodou v koncentraci 6 až 600 g/L, rozmíchá na suspenzi ve vodném prostředí (vodným prostředím může být například voda, pufir nebo pufirované kultivační médium po submerzní fermentaci produkčního mikroorganismu, který produkuje výše zmíněný enzym rutinosidasu), které obsahuje enzym rutinosidasu a jeho hodnota pH je vyšší než 2,05. Použité vodné prostředí s výhodou neobsahuje žádná organická rozpouštědla, zejména neobsahuje alkoholy a DMSO. Enzymová reakce pak probíhá tak, že se při teplotě nad 10 °C rutin rozštěpí na rutinosu (a-L-rhamnopyranosid-(l —>6)D-glukopyranosa) a kvercetin (Schéma 1) bez tvorby jakýchkoliv monosacharidů.
-4CZ 307927 B6
iwercetífi
Schéma 1: Enzymová deglykosylace rutinu podle vynálezu za vzniku rutinosy a kvercetinu.
Kvercetin, který je v reakční směsi v pevné fázi, se po ukončení reakce oddělí centrifůgací, filtrací nebo dekantací. Reakční směs po zreagování veškerého rutinu a oddělení pevného kvercetinu obsahuje produkt rutinosu, která se z reakčního roztoku získá krystalizací. Takto získaná rutinosa není kontaminována žádnými monosacharidy, protože za výše uvedených podmínek reakce k hydrolýze rutinosy na monosacharidy nedochází. S výhodou probíhá získání rutinosy následovně: pH matečného louhu se upraví, s výhodou pomocí vápenné vody (nasycený roztok Ca(OH)2), na hodnotu pH 7,0 až 8,0, potom se přidá práškové aktivní uhlí (5 g/L) a křemelina (3 g/L) a roztok se uvede k varu, přefiltruje, zkoncentruje a ponechá se krystalizovat (s výhodou za teploty 0 až 5 °C). Rutinosu lze z roztoku získat též odpařením vody, s výhodou lyofilizací, kdy produktem je amorfní rutinosa.
Zbylý reakční roztok se zachovanou enzymovou aktivitou po odstranění pevného kvercetinu se může použít pro opakovanou výrobu rutinosy (a kvercetinu) z rutinu (po úpravě pH na hodnotu 2,05 a vyšší pomocí roztoku hydroxidu, s výhodou hydroxidu draselného), tedy pro suspendování rutinu pro další reakci. Obsah rutinosy v reakční směsi se postupně s probíhající reakcí zvyšuje a po ukončení reakce (například pokud již není enzymová aktivita dostačující), se nejprve odstraní pevný kvercetin a následně se z matečného louhu izoluje rutinosa. Získaná rutinosa i kvercetin mohou být dále přečištěny rekrystalizací.
Zásadním znakem předkládaného vynálezu je pevné skupenství rutinu vstupujícího do reakce a pevné skupenství kvercetinu, vznikajícího jako vedlejší produkt reakce. Reakční směsí je tedy suspenze rutinu ve vodě, pufru nebo pufrovaném kultivačním médiu po submerzní fermentaci produkčního mikroorganismu, který produkuje výše zmíněný enzym rutinosidasu, a reakce probíhá heterogenně v suspenzi za vzniku suspenze kvercetinu v roztoku rutinosy. Zásadním faktorem pro reakci je pevná fáze rutinu, vstupujícího do reakce, a rovněž produkce kvercetinu v pevné fázi, zatímco rutinosa zůstává v roztoku. U reakcí v roztoku platí termodynamická rovnováha, tj. reaktant a produkt reakce jsou v rovnováze. Oproti tomu při reakci v mikroprostředí pevné fáze podle předkládaného vynálezu, kdy je pevná výchozí látka rutin konvertována na rutinosu v roztoku a pevný vedlejší produkt kvercetin, dochází k okamžitému vysrážení kvercetinu a tím k posunu termodynamické rovnováhy směrem k produktům reakce. Vzniklý pevný kvercetin se neúčastní termodynamické rovnováhy v roztoku a nemůže tak probíhat jeho zpětná reakce, srážení nerozpustného kvercetinu tedy vede k reakci dalšího rutinu na rutinosu a kvercetin, aniž by docházelo ke zpětnovazebně inhibici reakce produktem. Výsledkem jsou téměř kvantitativní výtěžky rutinosy a kvercetinu.
Oproti tomu v přítomnosti, byť i jen malého množství organického kosolventu, ve kterém je rutin a zejména kvercetin rozpustný, zůstává produkt i jen částečně v roztoku, termodynamická rovnováha se posouvá směrem k reaktantu a blokuje se tak vlastní reakce. Proto je velmi důležité, aby reakční systém zůstal zcela heterogenní. Rovněž z hlediska využití produktu, např. v potravních doplňcích, je organický kosolvent, např. typu DMSO, zcela kontraindikován, už jen proto, že toto rozpouštědlo prakticky ze směsi nelze odstranit (např. odpařením) kvůli vysokému bodu varu (189 °C za současného rozkladu). Dále je u DMSO prokázána toxicita - je to například vývojový neurotoxin působí alergické reakce a má mnoho jiných toxických reakcí (Hanslick, JL; Lau, K; Noguchi, KK; Olney, JW; Zorumski, CF; Mennerick, S; Farber, NB (2009). Dimethyl sulfoxide (DMSO) produces widespread apoptosis in the developing centrál nervous systém. Neurobiology of disease. 34 (1): 1-10. doi:10.1016/j.nbd.2008.11.006). Použití i stopového množství DMSO při výrobě rutinosy a kvercetinu by kompletně diskvalifikovalo jeho použití v lidské nebo zvířecí výživě z hygienických důvodů. Vůbec by ani nebylo možné pak deklarovat komerčně výhodnou kvalitu produktu jako „bio“.
Ve výhodném provedení je koncentrace rutinu v suspenzi na začátku reakce v rozmezí od 6 g/L do 600 g/L, s výhodou v rozmezí od 9 g/L do 450 g/L, nejvýhodněji 150 g/L až 250 g/L.
V jednom provedení je objemová aktivita rutinosidasy v počáteční reakční směsi v rozmezí od 1,0 do 10 nkat/mL, s výhodou v rozmezí od 2,5 do 7 nkat/mL, výhodněji v rozmezí od 2,5 do 3,3 nkat/mL.
Ve výhodném provedení se získaný vedlejší produkt kvercetin přečistí rekrystalizací, s výhodou rekrystalizací z roztoku NaOH o koncentraci 50 až 500 mmol.L1 za teploty v rozmezí od 20 do 100 °C.
Ve výhodném provedení se rutinosa získá odpařením reakční směsi po oddělení pevných složek. Výhodněji se rutinosa získá lyofilizací reakční směsi po oddělení pevných složek.
V jiném výhodném provedení se rutinosa získá z reakční směsi po oddělení pevných složek způsobem, kdy se pH reakční směsi po oddělení pevných složek (matečného louhu) upraví, s výhodou pomocí vápenné vody (nasycený roztok Ca(OH)2), na hodnotu pH 7,0 až 8,0, potom se přidá práškové aktivní uhlí (s výhodou cca 5 g/L) a křemelina (s výhodou cca 3 g/L) a roztok se uvede k varu, přefiltruje, zkoncentruje a ponechá se krystalizovat (s výhodou za teploty 0 až 5 °C). Vzniklé krystaly rutinosy se oddělí centrifůgací, filtrací nebo dekantací.
Ve výhodném provedení je enzymem rutinosidasa 6-č?-a-L-rhamnopyranosyl-3-Dglukopyranosidasa.
Ve výhodnějším provedení je 6-D-a-L-rhamnopyranosyl-3-D-glukopyranosidasa izolovaná z mikroorganismu rodu Aspergillus, Penicillium, Mucor, Chaetomium, Acremonium nebo bakterie rodu Actinoplanes, s výhodou z mikroorganismu rodu Aspergillus. Alternativně může být 6-0-(/.-L-rhamnopyranosyl-P-D-glukopyranosidasa připravená heterologní expresí v průmyslovém produkčním mikroorganismu, například v kvasince Píchla pastoris, s výhodou heterologní expresí 6-O-a-L-rhamnopyranosyl-3-D-glukopyranosidasy z mikroorganismu Aspergillus niger v kvasince Pichia pastoris. Jako induktoru pro heterologní expresi se s výhodou použije metanol v koncentraci 5 % (výsledná koncentrace v roztoku je pak 0,5 %).
V jednom provedení se 6-č?-a-L-rhamnopyranosyl-3-D-glukopyranosidasa připraví submerzní kultivací výše uvedeného mikroorganismu, s výhodou druhu Aspergillus niger, submersní kultivací v kapalném médiu obsahujícím rutin jako induktor.
V jiném provedení se 6-č?-a-L-rhamnopyranosyl-3-D-glukopyranosidasa připraví heterologní expresí v kvasince Pichia pastoris v kapalném médiu. Jako induktoru pro heterologní expresi se s výhodou použije metanol v koncentraci 5 % (výsledná koncentrace v roztoku 0,5 %).
Ve výhodném provedení se pro suspendování rutinu v prvním kroku podle způsobu výroby kvercetinu v heterogenním systému použije voda a/nebo reakční směs obsahující aktivní enzym rutinosidasu, zbylá po oddělení kvercetinu z reakční směsi, a/nebo přefiltrované kapalné médium
-6CZ 307927 B6 po submerzní kultivaci mikroorganismu, produkujícího 6-O-a -L-rhainnopyranosyl-β-Ι)glukopyranosidasu. Ve všech uvedených případech je celý reakční systém heterogenní.
Předkládaný vynález nárokuje enzymatický způsob výroby za použití zcela neobvyklých reakčních podmínek. Nečekané bylo zjištění, že za podmínek, při nichž je většina substrátu i produktu reakce přítomna v pevné fázi (suspenze), enzymová reakce probíhá v mikroprostředí pevné fáze za vzniku roztoku produktu rutinosy a precipitace vedlejšího produktu kvercetinu. Jde tedy o nový přístup, kdy se na imobilizovaný substrát (přítomný v heterogenní reakční směsi jako pevná fáze) působí enzymem v roztoku. Takové uspořádání umožňuje použití velmi vysokých koncentrací substrátu, které jsou o řád a více vyšší než koncentrace v dosud popsaných postupech (pro srovnání viz CN 101787361-A a WO 2006/105843 A2), čímž se objemová produktivita procesu řádově zvyšuje. Tento způsob kromě toho zcela eliminuje nutnost použití kosolventů, jako např. DMSO, které využívají jiné popsané postupy, např. Nam et al. (Biotechnol. Lett. 34, 483, 2012), CN 101787361-A a WO 2006/105843 A2, a proto odpadá i případná nutnost jejich odstranění z výsledného produktu a hygienických problémů s residui toxických kosolventů ve výsledném produktu. Tento neobvyklý, ale velmi účinný postup podle předkládaného vynálezu dále také umožňuje snadné oddělení velmi čistého vedlejšího produktu kvercetinu od použitého enzymu prostou filtrací s promytím přímo na filtru či dokonce dekantací a použitý enzym obsažený v reakční směsi lze navíc, po jednoduché úpravě reakčních podmínek, s výhodou pH, výhodně opět použít k další reakci.
Podstatnou výhodou nárokovaného způsobu je tedy skutečnost, že enzymové štěpení rutinu lze provádět i v heterogenním systému, kdy se výchozí rutin a též produkovaný kvercetin nacházejí v suspenzi a vlastní reakce pak probíhá v nasyceném roztoku nebo na mezifázovém prostředí za vzniku ekvimolámího množství rutinosy. Podmínky reakce jsou mírné a nedochází ke štěpení rutinosy na monosacharidy jako v dosavadním stavu techniky.
Další značnou výhodou nárokovaného způsobuje též skutečnost, že enzymovým preparátem pro konverzi rutinu na rutinosu a kvercetin může být přímo kultivační médium po fermentaci produkčního kmene, s výhodou jde o mikroorganismus Aspergillus niger, který byl rozsáhlým screeningem vybrán jako nejvhodnější, neboť poskytuje nejvyšší aktivitu rutinosidasy, nebo i heterologního produkčního kmene Pichia pastoris, tedy bez nutnosti izolace a čištění enzymu. Fermentační médium se pouze naředí destilovanou vodou na potřebnou aktivitu a pH se upraví na požadovanou hodnotu pomocí anorganické báze či kyseliny, s výhodou hydroxidem sodným/kyselinou fosforečnou.
Další významnou výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je jednoduchá izolace produktu (rutinosy), který krystaluje z reakční směsi po oddělení pevných složek odstředěním, filtrací nebo dekantací.
Filtrát po reakční směsi po reakci obsahuje odštěpenou rutinosu, kterou je možno izolovat a přečistit například krystalizací. Filtrát z enzymové reakce rovněž obsahuje stále aktivní rutinosidasu, takže ho lze po případné úpravě pH znovu použít jako enzymovou složku k opakované konverzi rutinu na rutinosu a kvercetin. Tento postup je možné opakovat, přičemž vyprodukovaná rutinosa se z procesu odvětví ředěním filtrátu a dále se izoluje. Izolace rutinosy, která má potenciál ve využití v kosmetice, je velmi jednoduchá především díky skutečnosti, že při způsobu podle předkládaného vynálezu nejsou přítomny jiné glykosidasy a ani se nepoužívají takové podmínky (např. velmi nízké pH a vysoká teplota), při kterých by mohlo dojít k jejímu štěpení až na monosacharidy. Díky tomu je pak v roztoku pouze rutinosa a stopy anorganických solí z média, které se snadno odstraní, např. fosfáty neutralizací vápennou vodou a dále krystalizací rutinosy ze zahuštěného roztoku.
Příprava vysoce čisté rutinosy a kvercetinu se provede rekrystalizací hrubého produktu po enzymové konverzi. Rekrystalizace rutinosy byla popsána výše. Rekrystalizace kvercetinu se provede tak, že se surový kvercetin rozpustí za varu v roztoku NaOH o koncentraci 0,1 až 1
-7 CZ 307927 B6 mol.L1, pH se za tepla upraví na hodnotu pH 9 až 10 a za chladnutí probíhá krystalizace. Výsledný produkt, který má obsah přes 99 % hmotnostních kvercetinu, se promyje zředěnou kyselinou sírovou v koncentraci 0,05 mol.L1 a poté trojnásobně vodou. Rekrystalizace se může opakovat, čímž se čistota produktu dále zvyšuje.
Fermentace se provádí sterilně za aerobních podmínek, za míchání a při teplotě s výhodou 28 °C v třepaných baňkách nebo v míchaném fermentoru. Po fermentaci, která trvá typicky 4 až 7 dní, se mycelium mikroorganismu odstraní odstředěním nebo filtrací. Zbylé médium s obsahem rutinosidasy se po úpravě pH na hodnotu nejméně 2,05 a ohřátí na reakční teplotu v rozmezí od 10 do 60 °C, s výhodou 40 °C, použije přímo pro reakci, tj. rozmíchá se v něm rutin a reakce se za konstantních podmínek a za míchání nechá proběhnout do požadované konverze. Sekvence proteinu, tj. rutinosidasy z Aspergillus niger je známa a tento enzym byl nakloňován standardním způsobem v expresním mikroorganismu Pichia pastoris (Šimčíková a spol. Adv. Synth. Catal. 357, 107, 2015).
Objasnění výkresů
Obr. 1 HPLC chromatogram dokumentující průběh enzymového štěpení rutinu. Kolona Chromolith Performance RP-18e, lOOx 3 mm (Měrek); předkolona Chromolith RP-18e, 5x4,6 mm; mobilní fáze [objemová %]: A = 5 % acetonitril, 0,1 % kyselina mravenčí, B = 80 % acetonitril, 0,1% kyselina mravenčí, ve vodě (objem/objem); gradientová eluce 0 až 3 min 7 až 25 % B, 3 až 5 min 30 % B, 5 až 7 min 7 % B; průtok 1,5 mL/min, 25 °C, detekce při 360 nm. A - 0 hodin (počátek reakce), B - 4 hodiny, C - 7 hodin (konec reakce). 1- Rutin, 2- kvercetin. Na ose x vynesena odezva UV detektoru v mV, na ose y čas v minutách.
Obr. 2 Průběh konverze rutinu na rutinosu, vstupní konc. rutinu 200 g/L, objem reakce 10 mL, 40 °C, pH 3, médium obsahující rutinosidasu 4,8 nkat/mL.
Obr. 3 Průběh konverze rutinu na rutinosu při použití různého množství enzymu, vstupní konc. rutinu 200 g/L, objem reakce 3 mL, 35 °C, pH 3,5.
Obr. 4 Průběh konverze rutinu na rutinosu při různém pH, vstupní konc. rutinu 200 g/L, objem reakce 3 mL, 35 °C, množství rutinosidasy 1,11 nkat/mL.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Příprava enzymu rutinosidasy pomocí Aspergillus niger
Enzym rutinosidasa (EC 3.2.1.168) byl připraven submerzní fermentaci mikroorganismu Aspergillus niger v kapalném médiu. Médium pro produkční fermentaci mělo následující složení [g/L]: 5,0 rutin; 15,0 KH2PO4; 4,0 NH4CI; 0,5 KC1; 5,0 kvasinkového extraktu; 1,0 hydrolyzátu kaseinu; 1 mL roztoku stopových prvků, pH bylo upraveno na hodnotu 5,0; po sterilizaci v autoklávu při teplotě 121 °C a po dobu 30 minut pak byly přidány 1,0 mL sterilního 10% (hmotnost/objem) roztoku MgSCL./ILO. Roztok stopových prvků měl následující složení [g/L]: 50,00 EDTA (etylendiamintetraoctová kyselina); 22,00 ZnSCU · 7 ILO; 5,54 CaCl2; 5,06 MnCl2 · 4 H2O; 4,99 FeSO4 · 7 H2O; 1,10 (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O; 1,57 CuSO4 · 5 H2O a 1,61 CoCl2 · 6 H2O, komponenty byly rozpuštěny v destilované vodě a pH bylo upraveno na hodnotu 6,0 40% roztokem KOH. Ke kultuře mikroorganismu narostlé na šikmém agaru [g/L]: 125 glycerol, 45 sladový výtažek, 15 NaCl, 0,44 NH4NO3, 0,06 MgSCU . 7 H2O 0,0015 CuSCfi. 5 H2O, 30 agar; pH 5,5 (HC1) bylo sterilně napipetováno 6 mL 0,1% roztoku Tweenu 80 (polyoxyethylensorbitanmonooleát) a seškrábnutím spor mikroorganismu Aspergillus niger do roztoku byla vytvořena suspenze spor a částí mycelií. Do 200 mL inokulačního média bylo
-8CZ 307927 B6 zaočkováno 1 mL této suspenze (107 spor/mL). Zaočkované inokulační médium bylo kultivováno v Erlenmayerově baňce o objemu 500 mL při teplotě 28 °C po 6 dnů za stálého míchání (200 ot./min.). Šestý den po inokulaci kultivačního média bylo mycelium odseparováno filtrací. Objemová aktivita rutinosidasy na konci fermentace měla hodnotu 0,58 nkat/mL.
Příklad 2: Příprava enzymu rutinosidasy pomocí Pichia pastoris
Rutinosidasu (EC 3.2.1.168) je možné s výhodou též připravit heterologní expresí např. v kvasinkách Pichia pastoris dle následujícího příkladu provedení. Heterologní exprese rutinosidasy v kvasinkách Pichia pastoris KM71H probíhala po dobu 5 dnů. Expresní vektor obsahující gen pro rutinosidasu (pPicZaA-Rut; Šimčíková a spol. Adv. Synth. Catal. 357, 107, 2015), nesoucí rezistenci k antibiotiku zeocin) byl nejprve linearizován a následně elektroporován do buněk P. pastoris KM71H. Transformované buňky byly kultivovány na médiu YPD (Yeast Peptone Dextrose medium) na Petriho miskách (YPD [g/LJ: 10,00 kvasinkový extrakt; 20 pepton; 20 glukosa, 15 agar a antibiotikum zeocin (o finální koncentraci 1 mg/mL). Misky byly inkubovány 3 dny při 28 °C. Narostlé kolonie byly následně použity pro kultivaci v kapalném médiu a pro jejich screening s cílem najít kolonii produkující rutinosidasu v co největším množství. Celý postup byl proveden podle manuálu Easy Select Pichia Expression Kit (Invitrogen, USA). Vybraná kolonie produkující rutinosidasu byla přes noc kultivována v kapalném YPD médiu. Druhý den byla peleta oddělena centrifůgací a následně rozpuštěna v kapalném YPD médiu obsahujícím 15% glycerol. Takto připravené konzervy buněk produkujících rutinosidasu (100 pL) byly uchovány při teplotě -80 °C. Produkce rutinosidasy byla provedena v 1 L média, mající následující složení: 700 mL vody; 100 mL 10% glycerolu; 100 mL 1M draselno-fosfátového pufiru pH 6; 100 mL 13,4% YNB (Yeast Nitrogen Base, ROTH) a 2 mL 0,2 % roztoku biotinu. Do 1 L média byla přidána kryokonzerva transformovaných buněk P. pastoris obsahující 100 pL buněk a takto zaočkované médium bylo kultivováno v Erlenmayerově baňce o objemu 3 L při teplotě 28 °C jeden den za stálého míchání (250 ot/min). Druhý den byly buňky oddělené centrifůgací resuspendovány ve 200 mL média v Erlenmayerově baňce o objemu 1 L, obsahujícího 140 mL vody; 20 mL 1M draselnofosfátového pufru pH 6; 20 mL 13,4% YNB (Yeast Nitrogen Base, ROTH); 400 pL roztoku 0,2% biotinu a 20 mL 5% metanolu ve vodě sterilizovaného ultrafiltrací. Kultivace probíhala 4 dny při teplotě 28 °C za stálého míchání (250 ot/min). Genová exprese byla indukována každý den přídavkem 1 mL 100% metanolu po dobu 4 dnů. Výsledný supematant obsahující rutinosidasu byl od buněk oddělen centrifůgací. Objemová aktivita rutinosidasy na konci fermentace měla hodnotu typicky ca 7 nkat/mL.
Supematant po konci fermentace byl pro účely purifikace dialyzován (dialyzační střevo šíře 33 mm, cut off 10 kDa, Sigma-Aldrich) 2 h proti 10 mM acetátovému pufru pH 3,5. Následně byl supematant 2krát naředěn nanovodou a pH bylo upraveno pomocí kyseliny octové na pH 3,5. Ionexová chromatografie byla provedena na koloně Fractogel EMD SO3 (1,5 x 10,0 cm, Měrek). Jako mobilní fáze použity nanášecí pufr A (10 mM acetátový pufr, pH 3,5) a eluční pufr B (obsahující navíc 1M NaCl). Průtok mobilní fáze byl 2 mL/min a čistá rutinosidasa byla eluována 100% pufrem B. Eluovaný protein byl zakoncentrován pomocí ultrafiltrace na aparatuře Amicon 8400 (Merck-Millipore). Ultrafiltrační membrána měla eut-off 10 kDa. Výtěžek této purifikace činí ca 30 %.
Výsledná aktivita rutinosidasy v reakčním médiu má mít s výhodou pro optimální průběh reakce (tj., délka trvání konverze ca 7 h) hodnotu 2 až 2,8 nkat/mL). Enzymová aktivita rutinosidasy byla měřena spektrofotometricky diskontinuální metodou s použitím chromogenního substrátu pnitrofenyl-rutinosidu (pNP-Rut). Absorbance p-nitrofenolu byla měřena při vlnové délce 420 nm. Reakční směs obsahující 10 pL roztoku s rutinosidasou, 10 pL pNP-Rut (10 mM) a 30 pL citrátfosfátového pufru (pH 5) byla inkubována v termomixeru po dobu 10 minut při 35 °C (600 rpm). Enzymová reakce byla ukončena přídavkem 1 mL Na2CO3 (0,1 M).
-9CZ 307927 B6
Příklad 3: Příprava rutinosy a kvercetinu štěpením rutinu
Rutinosu je možné připravit enzymovým štěpením rutinu za vzniku rutinosy a kvercetinu podle následujícího příkladu provedení. 80 mL kultivačního média obsahujícího rutinosidasu získanou heterologní expresí v buňkách P. pastoris podle příkladu 2, jehož pH bylo pomocí kyseliny fosforečné upraveno na hodnotu pH 3,0 (Obr. 4), bylo 2,5krát naředěno nanovodou na celkový objem 200 mL, tak aby aktivita rutinosidasy byla s výhodou v rozmezí 2,5 až 3,3 nkat/mL (Obr. 3). Byly též testovány aktivity enzymu 1,0; 2,0; 5,0 a 10,0 nkat/mL přitom reakce probíhala s uspokojujícím výsledkem. I při nižších koncentracích než 1 nkat/mL reakce probíhá, avšak konverze není úplná. Do takto připraveného roztoku rutinosidasy bylo přidáno 40 g rutinu (finální konc. 200 g/L) a reakční směs byla dále inkubována při 40 °C s výhodou po dobu 7 h (Obr. 2) za stálého míchání. Průběh reakce byl sledován metodou HPLC, prováděnou za následujících podmínek: byla použita Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm (Měrek); předkolona Chromolith RP-18e, 5 x 4,6 mm; mobilní fáze: A = 5% acetonitril, 0,1% kyselina mravenčí, B = 80% acetonitril, 0,1% kyselina mravenčí, ve vodě (objem/objem); gradientová eluce 0 až 3 min 7 až 25 % B, 3 až 5 min 30 % B, 5 až 7 min 7 % B; průtok 1,5 mL/min, 25 °C, UV detekce při 360nm, teplota místnosti (viz Obr. 1). Reakce byla ukončena oddělením pevné a kapalné fáze filtrací. Filtrační koláč byl promyt horkou vodou (3x10 mL vody) k odstranění nečistot. Filtrační koláč obsahující téměř čistý kvercetin byl poté vysušen v sušárně při 50 °C.
Získaný jemný žlutý prášek (19,2 g; 97 %) obsahoval 98 % kvercetinu; 0,4 % rutinu a ca 1,6 % neidentifikovaných nečistot (všechny údaje jsou v hmotnostních procentech). Konverze rutinu při zachování reakčních podmínek (teplota, pH, a objemová aktivita enzymu) nezávisí na objemu reakce (testovány byly objemy 0,5 L až 10 L). Dle výše uvedeného postupu byla reakce provedena pro počáteční koncentrace rutinu 6 g/L až 600 g/L (g/L: 6,4; 128; 256; 320; 450; 600). Při použití vyšší koncentrace, převyšující 150 g/L výchozího rutinu, bylo třeba pro dosažení odpovídající, tj. minimálně 98% konverze, sledované analytickým HPLC jak uvedeno výše, prodloužit reakční dobu na 20 až 60 hodin. Struktura kvercetinu byla potvrzena pomocí NMR II a 13C (v CD3OD) a pomocí hmotové spektrometrie HPLC MS a dále srovnáním s autentickým standardem kvercetinu (Sigma). Čistota produktu byla určena pomocí HPLC výše uvedenou metodou (viz Obr. 1).
Příklad 4: Izolace rutinosy z reakční směsi
Pro získání rutinosy byl zbylý filtrát po odseparování kvercetinu dále zpracován s výhodou následujícím postupem. pH roztoku upraveno pomocí vápenné vody (vodný nasycený roztok Ca(OH)2) na hodnotu pH 7,0 až 8,0, poté bylo přidáno práškové aktivní uhlí (5 g/L) a křemelina (3 g/L, Měrek) a roztok byl uveden k varu, přefiltrován a zakoncentrován na odparce. Takto zakoncentrovaný vzorek rutinosy byl ohřát k varu a po zchladnutí byl vzorek dán do lednice krystalizovat. Pro získání rutinosy je možné krystalizaci obejít a výsledný roztok pouze odpařit ve vakuu na rotační odparce nebo s výhodou i lyofilizací.
Příklad 5: Příprava rutinosy a kvercetinu s opětovným použitím reakčního média
Použité reakční médium (100 mL) po konverzi rutinu a oddělení kvercetinu dle příkladu 3 je možno znovu použít ke štěpení rutinu na rutinosu a kvercetin, protože většina enzymové aktivity rutinosidasy je v roztoku zachována. Do média byl po kontrole pH a případné úpravě s výhodou na hodnotu pH 3 přidán pevný rutin do výsledné koncentrace 200 g/L. Dále bylo postupováno stejně jako v příkladu 3 s tím rozdílem, že bylo nutno prodloužit reakční dobu na 18 hodin (podle průběhu konverze, která byla monitorována pomocí HPLC). Výtěžek a čistota získaného kvercetinu byly stejné jako v příkladu 3. Takovouto recyklaci enzymu je možno provést i vícekrát v závislosti na zbytkové koncentraci enzymu. Rutinosa se ve výsledném filtrátu akumuluje a je možné ji získat postupem, jak je uvedeno v příkladu 4.
- 10CZ 307927 B6
Příklad 6: Rekrystalizace kvercetinu
Kvercetin o čistotě vyšší než 99 % hmotnostních byl získán opakovanou krystalizací produktu získaného dle příkladu 3. Žlutý prášek (140 g, 98 % hmotnostních kvercetinu) byl rozmíchán v 1 litru 0,25 M NaOH. Směs byla za stálého míchání přivedena k varu pro rozpuštění kvercetinu a poté byl horký roztok filtrován. Následovalo pomalé chlazení (20 h při teplotě místnosti, poté 4 h při 5 °C). Vyloučené žluté krystaly kvercetinu byly odfiltrovány, promyty vodou o teplotě 40 °C (500 mL) a rozpuštěny ve 100 mL 1 M NaOH. Následovalo pomalé chladnutí (20 h při teplotě 25 °C) a po dosažení této teploty chlazení (4 h při 5 °C). Vyloučené krystaly byly odfiltrovány a resuspendovány ve vodě. Vodná suspenze byla okyselena zředěnou kyselinou sírovou na pH 3,5 a nerozpustný materiál byl odfiltrován a sušen; při této operaci se ze suspenze kvercetinu oddělily zbytky alkálií (sodné ionty) z předchozí krystalizace. Získaný žlutý prášek (6 g) obsahoval 99,85 % hmotnostních kvercetinu a 0,15 % hmotnostních rutinu, což bylo stanoveno analýzou za využití HPLC podle příkladu 3. Veškeré nečistoty byly takto odstraněny. Kvercetin o nižší čistotě lze získat další precipitací z matečných louhů, a to zvláště dalším stáním v chladu a/nebo okyselením.
Příklad 7: Rekrystalizace rutinosy
Rutinosa získaná podle příkladu 4 se rozpustí v destilované vodě na koncentraci 200 až 400 g/L za zvýšené teploty. Pokud je roztok barevný (např. žlutý) odbarví se přídavkem aktivního uhlí (1 g/L) a křemeliny (1 až 3 g/L) s krátkým povařením a filtrací za horka. Získaný čirý roztok se ponechá vychladnout a poté se nechá přes noc krystalovat při nižší teplotě s výhodou 3 až 7 °C. S výhodou je možno roztok ke krystalizací naočkovat malým množstvím krystalků rutinosy. Krystaly se oddělí filtrací nebo centrifůgací. Na filtru se pouze odsají a bez promytí se suší. Matečný roztok po odpaření poskytne další krystaly rutinosy. Výtěžky rekrystalizace se pohybují mezi 70 až 85 %. Rekrystalizovaná rutinosa je bílý nebo lehce zažloutlý jemný krystalický prášek, který je hygroskopický a je nutno ho uchovávat v dobře uzavřené nádobě.
Průmyslová využitelnost
Rutinosa má potenciální využití v kosmetice a jako nízkokalorické sladidlo, vedlejší produkt kvercetin je účinný antioxidant s vysokým chemoprotektivním potenciálem a je využitelný v nutraceutikách, funkčních potravinách, pro zlepšení nutriční hodnoty potravin a dále např. v kosmetických přípravcích.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (10)
1. Způsob výroby rutinosy z rutinu v heterogenním systému, vyznačující se tím, že rutin ve formě suspenze ve vodném prostředí při pH v rozmezí od 2,05 do 10,1 a při teplotě od 10 do 70 °C, se podrobí působení enzymu rutinosidasy za vzniku rutinosy a kvercetinu, následně se kvercetin z reakční směsi oddělí centrifůgací, filtrací nebo dekantací, a rutinosa se získá krystalizací nebo odpařením reakční směsi po oddělení pevných složek.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vodným prostředím je voda, pufr nebo pufrované kultivační médium po submerzní fermentaci produkčního mikroorganismu, který produkuje enzym rutinosidasu.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že koncentrace rutinu v suspenzi na začátku reakce je v rozmezí od 6 g/L do 600 g/L, s výhodou od 9 g/L do 450 g/L, ncjvýliodnčji od 150 g/L do 250 g/L.
- 11 CZ 307927 B6
4. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že objemová aktivita rutinosidasy v počáteční reakční směsi je v rozmezí od 1,0 do 10 nkat/mL, s výhodou v rozmezí od 2,5 do 7 nkat/mL, výhodněji v rozmezí od 2,5 do 3,3 nkat/mL.
5. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že enzymem rutinosidasou je ó-O-a-L-rhamnopyranosyl-P-D-glukopyranosidasa.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že 6-O-a-L-rhamnopyranosyl-3-Dglukopyranosidasa je izolovaná z mikroorganismu rodu Aspergillus, Penicillium, Mucor, Chaetomium, Acremonium nebo Actinoplanes; nebo je připravená heterologní expresí v průmyslovém produkčním mikroorganismu, s výhodou je 6-O-a-L-rhamnopyranosyl-3-Dglukopyranosidasa z mikroorganismu rodu Aspergillus, nejvýhodněji z mikroorganismu Aspergillus niger, připravená heterologní expresí v kvasince Pichia pastoris.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se 6-O-a-L-rhamnopyranosyl-3-D- glukopyranosidasa připraví submerzní kultivací mikroorganismu v kapalném médiu.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se 6-O-a-L-rhamnopyranosyl-3-D- glukopyranosidasa připraví heterologní expresí v kvasince Pichia pastoris v kapalném médiu.
9. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se pH reakční směsi po skončení reakce a po oddělení pevných složek upraví na hodnotu pH 7,0 až 8,0, potom se do roztoku přidá práškové aktivní uhlí a křemelina a výsledná směs se uvede k varu, přefiltruje, zkoncentruje a ponechá se krystalizovat za vzniku krystalické rutinosy.
10. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že vzniklý kvercetin se přečistí rekrystalizací, s výhodou rekrystalizací z roztoku NaOH o koncentraci 50 až 500 mmol.L1 za teploty v rozmezí od 20 do 100 °C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-352A CZ2018352A3 (cs) | 2018-07-11 | 2018-07-11 | Heterogenní způsob výroby rutinosy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-352A CZ2018352A3 (cs) | 2018-07-11 | 2018-07-11 | Heterogenní způsob výroby rutinosy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ307927B6 true CZ307927B6 (cs) | 2019-08-28 |
| CZ2018352A3 CZ2018352A3 (cs) | 2019-08-28 |
Family
ID=67686313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2018-352A CZ2018352A3 (cs) | 2018-07-11 | 2018-07-11 | Heterogenní způsob výroby rutinosy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2018352A3 (cs) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101787361A (zh) * | 2010-01-11 | 2010-07-28 | 山西大学 | 芦丁水解酶及其制备方法和应用 |
-
2018
- 2018-07-11 CZ CZ2018-352A patent/CZ2018352A3/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101787361A (zh) * | 2010-01-11 | 2010-07-28 | 山西大学 | 芦丁水解酶及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Amaretti, Alberto et al. "Hydrolysis of the Rutinose-Conjugates Flavonoids Rutin and Hesperidin by the Gut Microbiota and Bifidobacteria." Nutrients (2015); ISSN 2072-6643 * |
| BASSANINI, Ivan, et al. A Sustainable One‐Pot, Two‐Enzyme Synthesis of Naturally Occurring Arylalkyl Glucosides. ChemSusChem, 2017, 10.9: 2040-2045; ISSN: 1864-5631 * |
| Ivan Bassanini, Jana Krejzová, Walter Panzeri, Daniela Monti, Vladimir Křen and Sergio Riva, A Sustainable One‐Pot, Two‐Enzyme Synthesis of Naturally Occurring Arylalkyl Glucosides, ChemSusChem, 10, 9, (2040-2045), (2017). * |
| Nam, HK., Hong, SH., Shin, KC. et al. Biotechnol Lett (2012) 34: 483. https://doi.org/10.1007/s10529-011-0786-2; Online ISSN 1573-6776 * |
| ŠIMČÍKOVÁ, Daniela, et al. α‐L‐Rhamnosyl‐β‐D‐glucosidase (Rutinosidase) from Aspergillus niger: Characterization and Synthetic Potential of a Novel Diglycosidase. Advanced Synthesis & Catalysis, 2015, 357.1: 107-117; ISSN: 1615-4150 * |
| WEIZ, Gisela, et al. Enzymatic deglycosylation of flavonoids in deep eutectic solvents-aqueous mixtures: Paving the way for sustainable flavonoid chemistry. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2016, 130: 70-73; ISSN: 1381-1177 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2018352A3 (cs) | 2019-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100923665B1 (ko) | 유효 물질의 추출방법 및 정제방법 | |
| EP1838862B1 (en) | Manufacturing method of kaempferol | |
| CN107201331A (zh) | 表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌及构建方法及应用 | |
| Bassanini et al. | A Sustainable One‐Pot, Two‐Enzyme Synthesis of Naturally Occurring Arylalkyl Glucosides | |
| US4758283A (en) | Process for preparing L-rhamnose | |
| US6048712A (en) | Process for producing α-monoglucosyl hesperidin-rich substance | |
| US6420142B1 (en) | Method for enzymatic splitting of rutinosides | |
| Křen et al. | Rutinosidase and other diglycosidases: Rising stars in biotechnology | |
| Nakagawa et al. | Anomer-selective glucosylation of l-menthol by yeast α-glucosidase | |
| CZ307927B6 (cs) | Heterogenní způsob výroby rutinosy | |
| JPH0710898A (ja) | 水難溶性フラボノイドの改質方法 | |
| US8580955B2 (en) | Purification method and production method for cellobiose | |
| US2950974A (en) | Conversion of flavonoid glycosides | |
| Lundt et al. | 1, 5-Anhydro-D-fructose: biocatalytic and chemical synthetic methods for the preparation, transformation and derivatization | |
| CN103014076B (zh) | 一种利用棘孢曲霉制备甜菊醇和纯化莱鲍迪苷a的方法 | |
| CN113754626B (zh) | 一种酶法制备漆黄素的方法 | |
| JP4023539B2 (ja) | 有効物質の抽出方法および精製方法 | |
| David et al. | Biotransformations in carbohydrate synthesis. N-Acetylgalactosaminyl and N-acetylglucosaminyl transfer onto methyl α-and β-glucosides catalysed by the β-N-acetylhexosaminidase from Aspergillus oryzae | |
| KR101315942B1 (ko) | 아스트라갈린의 제조 방법 | |
| US20220389043A1 (en) | Improved isolation of steviol glycosides | |
| JP4699661B2 (ja) | Ｒｕｓｃｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓステロイド配糖体の誘導体の製造方法 | |
| KR101525956B1 (ko) | 베타-글루코시데이즈를 이용한 퀘세틴 또는 이소퀘시트린의 제조방법 | |
| CZ2009720A3 (cs) | Zpusob výroby quercetin-3-beta-D-glukopyranosidu za vzniku L-rhamnosy | |
| Park | The Preparation of Crystalline β-1, 4-Mannotriose from Poonac Using the Enzyme System and Yeast Fermentation | |
| JP2003501045A6 (ja) | Ｒｕｓｃｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓステロイド配糖体の誘導体の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20230711 |