CZ2009720A3 - Zpusob výroby quercetin-3-beta-D-glukopyranosidu za vzniku L-rhamnosy - Google Patents

Abstract

Zpusob výroby quercetin-3-.beta.-D-glukopyranosidu (isoquercitrinu) enzymovým štepením rutinu za vzniku L-rhamnosy jako vedlejšího produktu. Na roztok ci suspenzi rutinu ve vodném roztoku, v koncentraci 11 až 350 g/l, se pusobí enzymem zvoleným ze skupiny glykosidas, zahrnující .alfa.-L-rhamnosidasu a naringinasu, pri teplotách 60 až 90 .degree.C a pri pH v rozmezí od 8,05 až 10,1. Po skoncení reakce se isoquercitrin oddelí, prípadne precistí rekrystalizací ze silne bazických roztoku, napr. roztoku hydroxidu sodného. Po oddelení isoquercitrinu lze zbylý reakcní roztok obsahující L-rhamnosu dále použít pro prípravu enzymu .alfa.-L-rhamnosidasy submerzní kultivací mikroorganismu rodu Aspergillus nebo Penicillium a s výhodou druhou Aspegillus terreus v mediu, vyžadujícím L-rhamnosu jako induktor. Krome toho lze zbylý reakcní roztok obsahující stále aktivní glykosidasu, po naredení a úprave pH, opetovne použít prímo k další konverzi rutinu na isoquercitrin. Použitou glykosidasou je s výhodou .alfa.-L-rhamnosidasa, a to jak komercne dostupná, tak submerzne pripravená.

Description

Způsob výroby quercetin-3-P-D-glukopyranosidu za vzniku L-rhamnosy

Oblast techniky

Vynález se týká enzymové přípravy quercetin-3-p-D-glukopyranosidu (isoquercitrínu) s velmi nízkým obsahem rutinu i quercetinu z výchozí látky rutinu pomocí glykosidas, získaných z mikroorganismů rodu Aspergillus a Pemcillium. Ceněným vedlejším produktem reakce je L-rhamnosa.

Quercetin-3-P-D-glukopyranosid je účinný antioxidant a je využitelný v nutraceutikách a dalších ochranných přípravcích (např, kosmetice, chemoprotektivních látkách a funkčních potravinách).

Dosavadní stav techniky

Flavonoidy, které se hojně vyskytují v rostlinách, jsou obecně považované za účinné antioxidanty a chemoprotektivní látky. Mnoho flavonoidů je v přírodních zdrojích přítomno ve formě glykosidů. Quercetin a jeho glykosidy quercetin-j-jŮD-glukopyranosid (isoquercitrin) a quercetin-3-p-D-rutinosid (rutin) mají širokou škálu pozitivních účinků na lidský organismus. Konkrétně všechny tyto látky vykazují díky přítomnosti aglykonu quercetinu silné antioxidační účinky (Bors et al., Methods Enzymol. 186, 343, 1990). Quercetin se v přírodních zdrojích vyskytuje prakticky výhradně ve formě výše zmíněných i dalších glykosidů. Samotný tento aglykon má také významné negativní účinky, především pozitivní reakci v Amesově testu, která implikuje mutagenitu a případnou karcinogenitu této látky (Manach et al., Nutr. Research 16, 517, 1996). Popsaná mutagenita quercetinu je mj. způsobena inhibicí enzymu topoisomerasy II (Webb & Ebeler, Biochem. J. 384, 527, 2004), schopnou vyvolat chybný přepis DNA a tím i mutace.

Nadto je quercetin velmi málo rozpustný ve vodě. Oproti tomu glykosidy quercetinu nereagují v Amesově testu (tj. nejsou mutagenní). Jsou podstatné lépe rozpustné ve vodě a tedy lépe biologicky dostupné (Webb & Ebeler, viz výše).

-2Rutin je běžně připravován extrakcí z přírodních materiálů a rozsáhle využíván v mnoha terapeutických aplikacích, např. při léčbě křehkosti cévních kapilár, cerebrální trombosy, retinitidy a jako systémový chemprotektant (Pisha & Pezuto, Economic and Medical Plant Research 6, 189, 1994; Yildzole-Ari et. al., Phytotherapy Res. 5, 9, 1991). Quercetin-3-P-D-glukopyranosid (isoquercitrin), hlavní zdroj antioxidantu quercetinu, je typicky přítomný v běžných plodinách západní diety (např. cibuli, jablkách), avšak přímo z přírodních zdrojů se dá získat jen velmi obtížně a v nedostatečné čistotě, takže jej pro výrobu funkčních potravin prakticky nelze využít. Vzhledem kvýše uvedeným nežádoucím účinkům quercetinu je cílem získat quercetin-3-P-D-glukopyranosid s co nejnižším obsahem kontaminujícího volného aglykonu.

Quercetin-3-P-D-glukopyranosid, dále uváděný jako isoquercitrin, lze připravit enzymovým štěpením komerčně dostupného rutinu za použití např. naringinasy, což je směs glykosidas, obsahující hlavně α-L-rhamnosidasu a β-D-glukosidasu. Tento enzym odštěpuje Lrhamnosu za vzniku isoquercitrinu, zároveň však přítomná β-glukosidasa tento produkt dále hydrolyzuje na nežádoucí quercetin; viz Obr. la. β-Glukosidasa je navíc nežádoucí příměsí téměř všech preparátů samotné α-L-rhamnosidasy. Proto jsou preparáty flavonoidů, připravované k obohacení isoquercitrinem tímto způsobem, kontaminovány podstatným množstvím výchozího rutinu a především nežádoucího quercetinu.

Rovněž chemická hydrolýza rutinu na isoquercitrin není použitelná, neboť za odštěpení obou cukerných jednotek vznikne vždy quercetin. (Formica & Regelson, Fd. Chem. Toxic. 33,1061,1995).

β-Glukosidasu, odpovědnou za hydrolýzu isoquercitrinu na quercetin, lze odstranit purifikací enzymového preparátu, např. proteinovou chromatografíí, což je však extréme náročné na přístrojové zařízení, materiál a práci, a tedy pro průmyslovou produkci zcela nevhodné. Další možnosti je inhibice β-glukosidasy in silu glukonolaktonem (Chang & Muir, US patent appl, 2006/0099690), případně jinými inhibitory glukosidas, což znamená nejen další materiálové nároky, ale především tato inhibice není zcela účinná.

Dalším problémem existujích postupů je velmi nízká rozpustnost rutinu (při pH 5 rozpustnost rutinu cca 5 g/1; při pH 8 rozpustnost rutinu cca 15 g/1), která vede k nutnosti a z’ použití buď nízkých koncentrací reaktantu (typicky 5 ;t 10 g/1) nebo přídavku organických

-3rozpouštědel (např. ethanolu) pro zlepšení rozpustnosti (Chang & Muir, viz výše). Nízké koncentrace substrátu limitují objemovou produktivitu procesu a přídavky organických rozpouštědel kromě jiného částečně inhibují použité enzymy a snižují jejich stabilitu. Způsoby, které pracují s rozpuštěným rutinem, mají nejen velmi nízkou objemovou produktivitu ale nadto neumožňují ani vícenásobné použití enzymu, s výjimkou jeho případné imobiíizace (která vyžaduje další výrobní náklady a dochází ke snížení celkové aktivity enzymu).

Existující postup podle přihlášky vynálezu WO 2004/027074 využívá rutin jako substrát pouze v nízké koncentraci, a to 10,9 g v 1 1 reakčního média za podmínek kyselého až slabě alkalického pH (pH 4 až 8) a při teplotě 50 až 55 °C, nebo 27 g v I 1 reakčního média za podmínek kombinace kyselého pH (tj. nižšího než pH 7) a teploty 80 °C. Výše uvedené kombinace podmínek neumožňují dobré rozpuštění substrátu rutinu, ani nezaručují inaktivaci β-glukosidasy, přítomné ve většině preparátů α-L-rhamnosidasy (jako nečistota) i naringinasy.

Samotné enzymy pro konverzi lze získat buď komerčně (např. naringinasu, která je směsí a-L-rhamnosidasy, β-D-glukosidasy a dalších hydrolytických enzymů, z mikroorganismu Penieillium decumbens) _f nebo fermentaci příslušných mikroorganismů. Tyto enzymy se dají použít pouze jednou (při izolaci produktu se zničí), nebo v imobilisované formě, což však vyžaduje úplné rozpuštění rutinu. Úplného rozpuštění rutinu je dosaženo při použiti nízké koncentrace substrátu nebo přidáním organických rozpouštědel, která jsou hořlavá, toxická a zvyšují náklady na proces a navíc enzymy denaturují.

Z výše popsaného je zřejmé, že dosavadními metodami isoquercitrin (quercetin-3-p-D glukopyranosid) nelze ekonomicky výhodným způsobem z přírodního materiálu přímo izolovat. Vhodným komerčně dostupným prekursorem je rutin. Chemická hydrolýza rutinu ovšem není vhodná, protože vznikne výhradně quercetin, který má nevhodné, až zdraví

/./ škodlivé účinky. Selektivním enzymovým štěpením se sice získá isoqercitrin, ale dostupné enzymové preparáty (zejména naringinasa) obsahují i kontaminující β-glukosidasy, katalyzující štěpení produktu opět na nežádoucí quercetin.

-4Podstata vynálezu

Uvedené nevýhody dosavadních metod odstraňuje způsob podle předkládaného vynálezu. Rutin se v koncentraci 11 až 350 g/1 rozmíchá na roztok či suspenzi ve vodném prostředí (pufrované kultivačním médium pro submerzní fermentaci), které obsahuje vhodný enzym a jeho hodnota pH je vyšší než 8,05. Enzymová reakce pak probíhá při teplotě nad 60 °C, přičemž se odštěpí L-rhamnosa za vzniku čistého quercetin-3-p-D-glukopyranosidu, isoquercitrinu (obr. lb). Ten se k ukončení reakce oddělí a supematant, obsahující stále aktivní enzym, se po naředění vodou a úpravě pH na hodnotu 8,05 a vyšší pomocí roztoku hydroxidu, s výhodou hydroxidu draselného, případně použije pro další konverzi. Vhodným enzymem je α-L-rhamnosidasa, připravená submersní kultivací mikroorganismu běžně dostupného rodu Aspergillus nebo Penicillium, s výhodou druhu Aspegillus terreus, v mediu obsahujícím L-rhamnosu jako induktor. L-Rhamnosu je možno do média dodat buď jako komerčně dostupnou chemikálii, nebo lépe přímo ve formě odpadního roztoku z výroby isoquercitrinu, který L-rhamnosu obsahuje.

Předmětem tohoto vynálezu je tedy způsob výroby quercetin-3-P-D-glukopyranosidu za vzniku L-rhamnosy, jehož podstata spočívá v tom, že na rutin v koncentraci 11 až 350 g/1 ve vodném prostředí se při pH v rozmezí od 8,05 do 10,1 a pri teplotě od 60 do 90 °C působí enzymem zvoleným ze skupiny glykosidas, sestávající z α-L-rhamnosidasy a naringinasy, produkt quercetin-3-3-D-glukopyranosid se z reakční směsi oddělí centrifugací, filtrací nebo dekantací a případně se přečistí rekrystalizací.

Význakem předkládaného způsobu výroby je rovněž skutečnost, že zbylý reakční roztok po odstranění quercetin-3-3-D-glukopyranosidu se použije pro opakovanou výrobu quercetin-3-3-D-glukopyranosidu a/nebo pro submersní fermentační přípravu používaného enzymu.

Význakem předkládaného způsobu výroby je dále skutečnost, že získaný quercetin-3 β-D-glukopyranosid se přečistí rekrystalizací z roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 50 až 500 mmol.r¹ a za teploty v rozmezí od 20 do 100 °C.

I 1

-5t I » <

• 1 Μ -<1

Význakem podle předmětného způsobu výroby je také skutečnost, že se použije a-L· rhamnosidasa.

Význakem podle předmětného způsobu výroby je dále skutečnost, že se použije a-L- rhamnosidasa z mikroorganismu rodu Aspergillus nebo Pemcillium.

Význakem podle předkládaného vynálezu je i skutečnost, že se použije a-L-

- rhamnosidasa z mikroorganismu rodu Aspergillus, připravená submerzní kultivací tohoto mikroorganismu v kapalném médiu s obsahem rhamnosy jako induktoru v koncentraci od 0,5 do 15 g/ml.

Význakem předkládaného způsobu výroby je také skutečnost, že se použije ot-L• rhamnosidasa obsažená ve filtrátu ze submerzní kultivace mikroorganismu rodu Aspergillus, po úpravě pH tohoto filtrátu alkalickým činidlem na hodnotu od 8,05 do 10,1.

Význakem předkládaného způsobu výroby je i skutečnost, že rhamnosa se jako induktor do kaplaného média přidá ve formě reakčního roztoku zbylého po odstraněni quercetin-3 -β-D- glukopyranosidu.

Význakem předkládaného způsobu výroby je rovněž skutečnost, že se použije a-L-

- rhamnosidasa z mikroorganismu Aspergillus terreus.

Předkládaný vynález nárokuje enzymatický způsob výroby za použití zcela neobvyklých reakčních podmínek. Překvapivě bylo zjištěno, že použití kombinace alkalického pH vyššího než pH 8 a zvýšení teploty na 60 až 90 °C vyvolává u použité glykosidasy inaktivaci pouze její β-glukosidasové složky. Každá z uvedených podmínek (tj. i%^r pH 8 a vyšší a teplota 60 x 90 °C) je zcela nefyziologická a proto při práci s enzymy běžně nepoužívaná (viz např. WO 2004/027074); jejich kombinace je pak ještě neobvyklejší. Zcela zásadním poznatkem je tedy skutečnost, že ačkoliv při této kombinaci podmínek dochází k selektivní inhibici a dokonce k následné destrukci nežádoucí β-glukosidasy, aktivita a-L-

- rhamnosidasy je nečekaně pouze snížena.

Nečekané bylo též zjištění, že za podmínek, při nichž je většina substrátu i produktu reakce přítomna v pevné fázi (suspenze), enzymová reakce probíhá zafprůběžného Λ

-6rozpouštění substrátu a precipitace produktu. Jde tedy o nový přístup, kdy se na imobilizovaný substrát (přítomný v reakční směsi převážně jako pevná fáze) působí enzymem v roztoku. Takové uspořádání umožňuje použití vysokých koncentraci substrátu, které jsou o řád a více vyšší než koncentrace v dosud popsaných postupech (pro srovnání viz WO 2004/027074), čímž se objemová produktivita procesu řádově zvyšuje. Tento neobvyklý, ale velmi účinný koncept také umožňuje snadné oddělení velmi čistého produktu od použitého enzymu prostou filtrací a použitý enzym obsažený v (odpadním) roztoku lze navíc, po jednoduché úpravě reakčních podmínek, výhodně opět použít k další reakci.

Podstatnou výhodou nárokovaného způsobu je tedy skutečnost, že enzymové štěpení rutinu lze provádět i v heterogenním systému, kdy se výchozí rutin a též produkovaný isoquercitrin nacházejí v suspenzi a vlastní reakce pak probíhá v nasyceném roztoku nebo na mezifázovém prostředí za vzniku ekvímolámího množství L-rhamnosy. Zvýšená rozpustnost substrátu způsobená vyšší teplotou a vyšším pH zvyšuje nepřímo i rychlost reakce, neboť se zvýší termodynamická koncentrace substrátu; celková koncentrace substrátu v reakční směsi je ovšem součtem rozpuštěné a suspendované látky.

Rozpustnost rutinu i isoquercitrinu je zvýšena tím, že se reakce provádí při pH převyšujícím hodnotu 8,05, neboť alkalické pH silně zvyšuje rozpustnost polyfenolů bez nutnosti přídavku organických kosolventů. Dále se rozpustnost a též reakční rychlost podstatně zvýší tím, že se reakce provádí za zvýšené teploty, s výhodou při 70 °C. Při těchto podmínách, především při vyšším pH, je aktivita β-glukosidasy prakticky nulová; její pH optimum se pohybuje kolem hodnoty 4,5 (viz obr. 2a). Naopak α-L-rhamnosidasa, a to jak získaná z komerčních preparátů, tak i připravená způsobem zde popsaným, je při pH 8 a vyšším dostatečně aktivní, i když tato aktivita je nižší než při hodnotě pH optima, které se přibližně rovná pH 5 (viz obr. 2b). β-Glukosidasa je při alkalickém pH a vyšší teplotě nestabilní a rychle se rozkládá, zatímco α-L-rhamnosidasa, která je velmi stabilní, si uchovává i za těchto podmínek aktivitu desítky hodin. Proto při výše popsaných podmínkách reakce prakticky vůbec nedochází k nežádoucímu následnému štěpení isoquercitrinu na quercetin a získaný produkt pak vykazuje vysokou čistotu. Nadto není třeba použité enzymy čistit, ani přidávat inhibitory β-glukosidasy, neboť tato se při přípravě isoquercitrinu podle popsaného způsobu inaktivuje.

• 4 « ·4 * ' · V » ♦ .t ’ 4 bj * 4 * 1 k <« * 4 », · » 4 *

Další významnou výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je jednoduchá izolace produktu, který se z reakční směsi oddělí pouze odstředěním, filtraci nebo dekantací, promyje se vodou a usuší. Filtrát po reakci obsahuje odštěpenou L-rhamnosu, kterou je možno izolovat, nebo se filtrát po příslušných úpravách (pH, naředění, přídavek živných solí) může použít přímo jako medium pro fermentaci mikroorganismu. S výhodou jde o mikroorganismus Aspergillus terreus. který byl rozsáhlým screeningem vybrán jako nejvhodnější, neboť poskytuje nejvyšší poměr produkované α-L-rhamnosidasy vůči β-D- glukosidase (Monti et al., Biotechnol. Bioeng. 87, 763, 2004). Stopy polyfenolů v roztoku (ve filtrátu) při fermentaci nevadí, mikroorganismus je schopen je rozložit a využít. Tím se celá technologie velmi výhodně stává prakticky bezodpadovou a ušetří se náklady za L-rhamnosu, která je nejdražší složkou nredia pro fermentaci.

Filtrát z enzymové reakce rovněž obsahuje stále aktivní α-L-rhamnosidasu, takže ho lze po naředění a úpravě pH znovu použít jako enzymovou složku k opakované konverzi rutinu na isoquercitrin. Tento postup je možné opakovat, přičemž vyprodukovaná L-rhamnosa se z procesu odvětví ředěním filtrátu a využije se k fermentační produkci a-L-rhamnosidasy.

Příprava vysoce čistého isoquercitrinu se provede rekrystalizací hrubého produktu po enzymové konverzi, který obsahuje typicky přes 95 hmotnostních % isoquercitrinu, malou část (přibližně 2 % hmotnostní) nezreagovaného rutinu, stopy quercetinu a další (neidentifikované) nečistoty. Rekrystalizace se provede tak, že se surový isoquercitrin rozpustí za varu v roztoku NaOH o koncentraci 0,1 až 1 mol.l'¹, pH se za tepla upraví na hodnotu pH 9 až 10 a za chladnutí probíhá krystalizace. Výsledný produkt, který má obsah přes 99 % hmotnostních isoquercitrinu, se promyje zředěnou kyselinou sírovou v koncentraci 0,05 mol.!'¹ a poté trojnásobně vodou. Rekrystalizace se může opakovat, čímž se čistota produktu dále zvyšuje.

Jako enzym pro štěpení rutinu je možné použít komerčně dostupné preparáty obsahujících α-L-rhamnosidasu, např. naringinasu. Ekonomicky a technicky výhodnější je však příprava α-L-rhamnosidasy submersní fermentaci běžně dostupných mikroorganismů rodu Aspergillus nebo Penicillium. Nejvhodnějším producentem tohoto enzymu je druh A. terreus, což bylo zjištěno rozsáhlým testováním a screeningem mnoha druhů mikroorganismů rodů Aspergillus nebo Penicillium vzhledem k extracelulámí produkci α-L-rhamnosidasy a β D-glukosidasy (D. Monti et. al., viz výše). Fermentace se provádí sterilně za aerobních

-8podmínek, za mícháni a při teplotě nejlépe 28 °C v třepaných baňkách nebo v míchaném fermentoru. Podstatné je přidání L-rhamnosy do me^?dia, kde v nižších koncentracích působí jako induktor produkce enzymu (Obr. 5). Optimální koncentrace přídavku L-rhamnosy v me^Zdiu činí 15 g/1, Tato koncentrace zvyšuje produkci enzymu více než 10 x oproti mediu bez induktoru. L-Rhamnosa se do media dodá bud’ jako komerčně získaný produkt, nebo se přidá ve formě použitého média po štěpení rutinu.

Po fermentaci, která trvá typicky 4 až 7 dní, se mycelium mikroorganismu odstraní odstředěním nebo filtrací. Zbylé me^fdium s obsahem α-L-rhamnosidasy se po úpravě pH na hodnotu nejméně 8,05 a ohřátí na reakční teplotu v rozmezí od 60 do 90 °C a s výhodou 70 °C použije přímo pro reakci, tj. rozmíchá se v něm rutin a reakce se za konstantních podmínek a za míchání nechá proběhnout do požadované konverze.

Nejvýhodnějši používaná kultura mikroorganismu Aspergillus terreus byla uložena pod číslem 3059 dne 25. 4. 2008 v České sbírce mikroorganismů (Masarykova universita, Přírodovědecká fakulta, Tvrdého 14,602 00 Brno).

Přehled obrázků na výkresech

Obr. la: Schéma enzymového štěpení rutinu a chemického štěpení rutinu na quercetin.

Obr. lb: Schéma štěpení rutinu působením specifické glykosidasy.

Obr. 2a: Graf závislosti aktivity β-D-glukosidasy z A. terreus na hodnotě pH, měřené při teplotě 35 °C v citrát v citrát-fosfátovém ( -♦- ) a borátovém ( ) pufru. Na ose x jsou vyneseny hodnoty pH, na ose y aktivita enzymu v procentech vzhledem k jeho aktivitě v pH optimu při teplotě 35 °C.

Obr. 2b: Graf závislosti aktivity α-L-rhamnosidasy z A. terreus na hodnotě pH, měřené při teplotě 35 °C v citrát-fosfátovém () a borátovém () pufru. Na ose x jsou vyneseny hodnoty pH, na ose y aktivita enzymu v procentech vzhledem k jeho aktivitě v pH optimu při teplotě 35 °C.

-9Obr. 2c: Poměr aktivit ct-L-rhamnosidasy a β-D-glukosidasy z A. terreus v závislosti na hodnotě pH, měřeno při teplotě 35 °C v citrát-fosfátovém (-♦-) a borátovém () pufru. Na ose x jsou vyneseny hodnoty pH, na ose y poměr aktivit obou enzymů při teplotě 35 °C.

Obr. 3: Graf závislosti aktivity α-L rhamnosidasy () a β-D-glukosidasy () na teplotě reakční směsi. Na ose x je vynesena teplota ve °C, na ose y aktivita enzymů v procentech vzhledem k jejich aktivitě v teplotním optimu při pH 7.

Obr. 4: Příklad průběhu enzymové konverze rutinu na isoquercitrin za použití enzymu a-L- rhamnosidasy z Aspergillus terreus, a výchozí koncentrace rutinu 150 g/1, při teplotě 80 °C a pH 8.1.; (RUT) = rutin, (IQ) = isoquercitrin, -A- (Q) = quercetin. Na ose x je vynesena reakční doba jako čas v minutách a na ose y konverze rutinu, v procentech vzhledem k výchozí koncentraci rutinu v reakční směsi.

Obr. 5: Závislost aktivity α-L-rhamnosidasy na koncentraci L-rhamnosy v mediu jako induktoru při fermentaČní produkci tohoto enzymu. Použité výchozí koncentrace L-rhamnosy v médiu byly 0 g/1 (-), 5 g/I (), 10 g/1 (--), 15 g/1 (-A-), 25 g/1 (-x-), 35 g/1 (-*-), 50 g/1 (-·-), 70 g/1 (-+-). Na ose x je vynesena doba kultivace ve dnech, na ose y aktivita a-Lrhamnosidasy v nkat.

Obr. 6: HPLC chromatogram dokládající průběh enzymového štěpení rutinu.

Kolona Monolithic column Chromolite Speed ROD, RP-18e, 50x4,6mm (Měrek) + předkolona stejného typu; mobilní fáze: A - 80% acetonitril 0,1% kyselina trifluoroctová

Jx' (TFA); B - 5% acetonitril, 0,1% TFA, v H2O (objem/objem); gradientová eluce 0<3 min 20n-(s¹' τζ» . u* % A, 314,5 min 65 % A, 4,5ř5 min 65-20 % A; průtok 1 ml/min; teplota místnosti a detekce při 360 nm.

- rutin, 2 - isoquercitrin, 3 - neidentifikovaná nečistota, 4 - quercetin. Na ose x je vynesena odezva UV detektoru v m V, na ose y čas v minutách.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1 > t

- 101340 g rutinu bylo za míchání vneseno do předehřátého media (8,941; pH 8,10; 70 °C, složení odpovídalo kultivačnímu nwdiu viz př. 5), obsahujícího α-L-rhamnosidasu získanou submerzní fermentací mikroorganismu Aspergillus ierreus podle příkladu 5 a reakční směs byla dále míchána 24 h^. Průběh reakce (Obr. 4) byl sledován metodou HPLC, prováděnou za následujících podmínek: byla použita kolona Monolithic column Chromolith Speed ROD, RP-18e, 50 χ 4,6mm (Měrek, DE) a předkolona stejného typu. Mobilní fázi A představoval 80% acetonitril a 0,1% trifluorooctová kyselina, mobilní fázi B 5% acetonitril a 0,1% trifluorooctová kyselina; všechny údaje jsou objemová procenta v H2O. Gradientova eluce iz’ li az,^r -w vykazovala následující průběh: 0<3 minuty 20^65 % A, 3*4,5 minuty 65 % A, 4,5x5 min 65xůť 20 % A; průtok 1 ml/ min; teplota místnosti; UV detekce: 360 nm (viz Obr. 6). Reakce byla ukončena oddělením pevné a kapalné fáze filtrací. Filtrační koláč byl promyt vodou (3 χ 101 vody, 40 °C) k odstranění volné L-rhamnosy a dalších nečistot. Poslední promývání bylo provedeno vodou o teplotě 90 A 00 °C pro dokonalé odstranění nečistot a sterilizaci produktu. Filtrační koláč byl poté resuspendován v destilované vodě (20 l) a vysušen ve sprašové sušárně za následujících podmínek: vstupní teplota 230 °C, výstupní teplota 85 °C.

Získaný jemný žlutý prášek (938 g) obsahoval 97,5 % isoquercitrinu; 0,7 % rutinu; 0,2 % quercetinu a 1,6 % neidentifikovaných nečistot (všechny údaje jsou v hmotnostních procentech). Konverze rutinu při zachování reakčních podmínek (teplota, pH, koncentrace rutinu a objemová aktivita enzymu) nezávisí na objemu reakce (testovány byly objemy 0,5^ až 10 1 a počáteční koncentrace rutinu 11 jg/|až 500 g/1, výsledky nejsou uvedeny). Při použití vyšší koncentrace, převyšující 150 g/1 výchozího rutinu, bylo třeba pro dosažení odpovídající, tj. minimálně 95% konverze, sledované analytickým HPLC jak uvedeno výše, prodloužit reakční dobu na 48 až 60 hodin. Molekulární struktura isoquercitrinu byla potvrzena pomocí NMR ^lH a ’³C (v CD3OD) (data viz Tabulka 1: srovnání NMR údajů /300,07 MHz pro 'H, 75,45 MHz pro ¹³C, CD3OD, 24 °C/ pro isoquercitrin získaný podle postupu s údaji publikovanými v literatuře) a pomocí hmotové spektrometrie MALDI MS (data m/z; [M+HJ* C2iH₂|O]2: teoretická hodnota 465,1 a naměřená hodnota 465,4; [M+Na]’ CíTboO^Na: teoretická hodnota 487,1 a naměřená hodnota 487,3; [M+K]' CÁiILóOitK: teoretická hodnota 503,2 a naměřená hodnota 503,3). Čistota produktu byla určena pomocí HPLC výše uvedenou metodou (viz Obr. 6).

- 11 Příklad 2

Použité reakční médium (2 1) po konverzi rutinu a oddělení isoquercitrinu dle příkladu 1 bylo zředěno přídavkem 1 1 vody (ke snížení koncentrace L-rhamnosy přibližně o 30 %, neboť tato ve vyšších koncentracích zpětnovazebně inhibuje α-L-rhamnostdasu), a znovu použito pro konverzi rutinu (210 g), reakční podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Vzhledem ktomu, že objemová aktivita a-L-rhamnosidasy v reakčním médiu byla nižší v důsledku naředění reakčního média, bylo nutno prodloužit reakční dobu na 55 hodin. Po ukončení a zpracování produktu (viz přiklad 1) bylo získáno 165 g žlutého prášku, který obsahoval 85,3 % isoquercitrinu; 12,9 % rutinu; 0,3 % quercetinu a 1,5 % neidentifikovaných nečistot (všechny údaje jsou v hmotnostních procentech), jak bylo určeno pomocí HPLC podle příkladu 1.

Příklad 3

Isoquercitrin o čistotě vyšší než 99 hmotnostních % byl získán opakovanou krystalizací produktu získaného dle příkladu 1. Žlutý prášek (140 g, 97,5 % hmotnostních isoquercitrinu) byl rozmíchán v 1 litru 0,25 mol.l·¹ NaOH. Směs byla za stálého míchání přivedena k varu pro rozpuštění isoquercitrinu a poté byl horký roztok filtrován. Následovalo pomalé chlazení (20 h^dj při teplotě místnosti, poté při 5 °C). Žluté krystaly, které vypadly, byly odfiltrovány, promyty vodou o teplotě 40 °C (500 ml) a rozpuštěny v 100 ml 1 mol.r¹ NaOH. Následovalo pomalé chladnutí (20 h^dj při teplotě 25 °C) a po dosažení této teploty chlazení (4 h^dj při 5 °C). Vyloučené krystaly byly odfiltrovány a resuspendovány ve vodě. Vodná suspenze byla okyselena zředěnou kyselinou sírovou na pH 3,5 a nerozpustný materiál byl odfiltrován a sušen; při této operaci se ze suspenze isoquercitrinu oddělily zbytky alkálií (sodné ionty) z předchozí krystalizace. Získaný žlutý prášek (6 g) obsahoval 99,85 % hmotnostních isoquercitrinu a 0,15 % hmotnostních rutinu, což bylo stanoveno analýzou za využití HPLC podle příkladu 1. Veškerý quercetin a další neidentifikované nečistoty byly takto odstraněny. Isoquercitrin o nižší čistotě lze získat další precipitací z matečných louhů, a to zvláště dalším stáním v chladu a/nebo okyselením.

-12Příklad 4

Postup byl stejný jako v příkladu 1 s tím, že 1340 g rutinu bylo za míchání vneseno do předehřátého 100 mmol.l·¹ fosfátového pufru (ΚΗίΡΟψ'^ΙΙΡΕΟ, 8,94 1; pH 8,10; 70 °C,) obsahujícího naringinasu z mikroorganismu Penicillium decumbens (Sigma, 89,4 g, výsledná aktivita a-L-rhamnosidasy 33 nkat) reakční směs byla poté míchána 24 h^. Dále bylo postupováno jako v příkladu 1. Byl získán jemný žlutý prášek (927 g), který obsahoval 96,5 % isoquercitrinu; 1,6 % rutinu; 0,2 % quercetinu a 1,6 % neidentifikovaných nečistot (všechny údaje označují hmotnostní procenta). Výsledná konverze tak byla přibližně o 1 % nižší než v příkladu 1.

Příklad 5

Enzym α-L-rhamnosidasa byl připraven submerzní fermentací mikroorganismu Aspergillus terreus v kapalném mediu. Nejdříve bylo připraveno inokulační médium pro hlavní fermentaci o pH = 6,0, mající následující složení (1 1): 15,0 g/1 KH₂PO₄; 4,0 g/1 NH4CI; 0,5 g/1 KC1; 5,0 g/1 kvasinkového extraktu; 1,0 g/1 hydrolyzátu kaseinu; 1 ml roztoku stopových prvků; 10,0 g/1 L-rhamnosy; po sterilizaci v autoklávu pri teplotě 121 °C a po dobu 30 minut pak byly přidány 3,0 ml sterilního 10% (hmotnost/objem) roztoku MgS0₄.7H₂O. (Stopové prvky, tj. 50,00 g/1 EDTA; 22,00 g/1 ZnSO₄ · 7 H₂O; 5,54 g/1 CaCl₂; 5,06 g/1 MnCl₂-4 H₂O; 4,99 g/1 FeSO₄ 7 H₂O; 1,10 g/1 (NH4)₆Mo₇0₂₄ · 4 H₂O; 1,57 g/1 CuSO₄ · 5 H₂O a 1,61 g/1 CoCl₂ · 6 H₂O, byly rozpuštěny v destilované vodě a přidány do nmdia po úpravě pH roztoku prostřednictvím 40% KOH, hmotnost/objem, na hodnotu 6,0). Ke kultuře mikroorganismu narostlé na šikmém agaru (agar se sladinovým extraktem v koncentraci 53,3 g/1) bylo sterilně napipetováno 6 ml 0,1% roztoku polysorbátu 80 a seškrábnutím mikroorganismu Aspergillus terreus do roztoku byla vytvořena suspenze spor a částí mycelií. Do 1 1 inokulačního média bylo zaočkováno 5 ml této suspenze (10⁷ spor/ml). Zaočkované inokulační medium bylo kultivováno v Erlenmayerově baňce o objemu 5 1 při teplotě 28 °C po 4 dny za stálého míchání (200 ot/min). Při fermentaci ve fermentoru o objemu 10 1 byl 1 1 takto získaného inokula použit pro zaočkování produkční fermentace ve fermentoru (objem kultivačního media 8,45 1, složení totožné jako inokulační médium, vzdušnění 10 l/min, otáčky míchadla 150 ot/min, teplota 28 °C). Šestý den po inokulaci

Z kultivačního me'dia bylo mycelium odstraněno filtrací. Přídavkem roztoku 50%

- 13(hmotnost/objem) KOH bylo upraveno pH zfíltrovaného media na pH 8,1 a toto bylo zahříváno 20 min. při teplotě 70 °C pro destrukci nežádoucí β-D-glukosidasy. Takto upravené medium je možno přímo použít pro konverzi rutinu na isoquercitrin podle příkladu 1. Extracelulámí produkce α-L-rhamnosidasy při zachování kultivačních podmínek nezávisela na objemu kultivačního media (testovány byly objemy 50 ml až 10 1); šestý den kultivace měla objemová aktivita α-L-rhamnosidasy v mediu obdobnou hodnotu 33 až 42 nkat/ml ve všech testovaných objemech.

Příklad 6

Pro kultivaci mikroorganismu A. terreus podle příkladu 5 byla optimalizována koncentrace L-rhamnosy (induktoru). Přídavek L-rhamnosy do výsledné koncentrace 1 až 15 g/1 media zvýšil produkci α-L-rhamnosidasy až desetkrát (Obr, 5). Vyšší koncentrace l rhamnosy (25 až 70) g/1 vedla k snížení aktivity α-L-rhamnosidasy a poklesu pH (počáteční hodnota pH 6,0 poklesla 7. až 8, den kultivace na pH 2,5).

Příklad 7

Reakční medium (2 1) po konverzi rutinu dle příkladu 1 bylo k dosažení finální koncentrace L-rhamnosy 15 g/1 zředěno přídavkem destilované vody (přibližně 21). Do tohoto roztoku bylo přidáno 20 g kvasinkového extraktu, hodnota pH byla upravena 20% (hmotnost/objem) roztokem NaOH na pH 6 a po sterilizaci vautoklávu při teplotě 121 °C po dobu 30 minut byly přidány 3,0 ml sterilního 10% (hmotnost/objem) roztoku MgSOi.71LO na litr media. Výsledný roztok byl znovu použit jako kultivační medium podle příkladu 5. Šestý den kultivace A. terreus na tomto médiu měla objemová aktivita α-L-rhamnosidasy v médiu hodnotu 31 až 40 nkat/ml.

Příklad 8

Enzym a-L-rhamnosidasa byl připraven submerzní fermentací mikroorganismu Aspergillus nidulans v kapalném mediu způsobem popsaným v příkladu 5 s tím, že šestý den kultivace měla objemová aktivita α-L-rhamnosidasy v médiu hodnotu 25 až 37 nkat/ml.

- 14Pří klad 9

Enzym α-L-rhamnosidasa byl připraven submerzní fermentací mikroorganismu

Aspergillus aculeatus v kapalném mediu způsobem popsaným v příkladu 5 s tím, že šestý den kultivace měla objemová aktivita α-L-rhamnosidasy v mediu hodnotu 23 až 35 nkat/ml.

Průmyslové využití

Isoquercitrin je účinný antioxidant s vysokým chemoprotektivním potenciálem a je využitelný v nutraceutikách, funkčních potravinách, pro zlepšení nutriční hodnoty potravin a dále např. v kosmetických přípravcích.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby quercetin-3-p-D-glukopyranosidu za vzniku L-rhamnosy, vyznačující se t í m, že na rutin v koncentraci 11 až 350 g/1 ve vodném prostředí se při pH v rozmezí od 8,05 do 10,1 a při teplotě od 60 do 90 °C působí enzymem zvoleným ze skupiny glykosidas, sestávající z α-L-rhamnosidasy a naringinasy.a produkt quercetin-3-β-θ-

   - glukopyranosid se z reakční směsi oddělí centrifugací, filtrací nebo dekantací; případně se přečistí rekrystalizací.
2. 2. Způsob výroby quercetin-3-|3-D-glukopyranosidu podle nároku 1,vyznačující se t í m , že zbylý reakční roztok po odstranění quercetin-3-p-D-glukopyranosidu se použije pro opakovanou výrobu quercetin-3-P-D-glukopyranosidu a/nebo pro submersní fermentační přípravu používaného enzymu.
3. 3. Způsob výroby quercetin-3-3-D-glukopyranosidu podle nároku 1, vyznačující se t i m, že získaný quercetin-3-p-D-glukopyranosid se přečistí rekrystalizací z roztoku NaOH o koncentraci 50 až 500 mmol.f¹ za teploty v rozmezí od 20 do 100 °C.
4. 4. Způsob výroby quercetin-3-P-D-glukopyranosidu podle nároku 1,vyznačující se t í m, že se použije a-L-rhamnosidasa.
5. 5. Způsob výroby quercetin-3-P-D-glukopyranosidu podle nároků 1 a 4, vyznačují c í se t í m , že se použije α-L-rhamnosidasa z mikroorganismu rodu Aspergillus nebo Penicillium.
6. 6. Způsob výroby quercetin-3-p-D-glukopyranosidu podle nároků 1,4a 5, vyzná čující se tím, že se použije α-L-rhamnosidasa z mikroorganismu rodu Aspergillus, připravená submerzní kultivací tohoto mikroorganismu v kapalném médiu s obsahem rhamnosy jako induktoru v koncentraci 0,5 až 15 g/ml.
7. 7. Způsob výroby quercetin-3-P-D-glukopyranosidu podle nároku 6, vyznačující se t í m , že se použije α-L-rhamnosidasa obsažená ve filtrátu ze submerzní kultivace po úpravě pH tohoto filtrátu alkalickým činidlem na hodnotu 8,0 až 10, l.
8. 8. Způsob výroby quercetin-3-P-D-glukopyranosidu podle nároku 6 nebo 7, v y z n a č u j í c í se t i m , že rhamnosa se jako induktor přidá do kapalného média ve formě zbylého reakčního roztoku z nároku 2.
9. 9. Způsob výroby quercetin-3-p-D-glukopyranosidu podle nároků 1 a 4 až 8, vyznáč uj i c í se t í m, že se použije a-L-rhamnosidasa z mikroorganismu Aspergillus terreus.