CN104004108B - 一种酶解制备锁阳多糖的方法 - Google Patents
一种酶解制备锁阳多糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种酶解制备锁阳多糖的方法。本发明公开的一种制备锁阳多糖的方法，包括如下步骤：在脱脂的锁阳粉末中加入占脱脂的锁阳粉末质量百分含量0.5％-3％的胃蛋白酶，得混合粉末；在混合粉末中加入盐酸水溶液，酶解，得酶解液；将酶解液微沸回流，使酶解液中的胃蛋白酶失活，冷却，离心得上清液；将上清液用Sevage法脱除蛋白，弃去下层有机相，得上层水溶液；将上层水溶液加入无水乙醇醇沉，即得所述的锁阳多糖。本发明公开的方法工艺简单，提取成本低，适合于工业化大量生产，同时由于本制备方法得到的锁阳多糖相较于传统工艺脱色效果良好，颜色呈浅粉色，为开发观感要求高的新产品奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种锁阳多糖的制备方法；特别涉及一种酶解制备锁阳多糖的方法，属于中药制备领域。
背景技术
锁阳是一种根寄生肉质草本种子植物，俗称不老药，其干燥肉质茎可作为传统中医、蒙医、维吾尔医药材。中华人民共和国药典2010年版一部记载，锁阳用作补肾阳，益精血，润肠通便，主治肾阳不足，精血亏虚，腰膝痿软，阳痿滑精，肠燥便秘。近代研究发现锁阳水提液具有抗氧化、抗缺氧、抗癫痫、提高免疫、延缓衰老、增强耐力、延长抗应激存活时间等方面的重要医疗价值。
多糖是许多中草药的重要成分，在传统热水煎服途径，水煎液中必然含有大量的多糖类组分。近年研究表明锁阳多糖具有多种生物活性，包括抗氧化、增强免疫、抗衰老、抗疲劳、抗急性胃溃疡、促进小肠推进功能等，具备了锁阳水提液大部分重要的生物活性。因此，提高锁阳多糖的提取率，对充分利用锁阳资源、开发锁阳多糖产品很有价值。
锁阳多糖的提取制备方法一般采用水提醇沉法，按照料液比、提取时间、提取次数三个因素的最佳工艺条件进行提取制备，经减压烘干后所得锁阳多糖样品溶于蒸馏水中，经苯酚-硫酸法测定其中所含多糖质量，并计算出锁阳(产地：甘肃张掖市)多糖得率为43.46mg/g；不同产地的锁阳，其多糖得率也有差别，经测量甘肃地区不同产地锁阳多糖得率为37.05mg/g-68.50mg/g(罗光宏等，2011，甘肃河西沙区锁阳多糖提取工艺优化及含量测定，食品科学，32(10):79-83。)近年已公布的相关专利中锁阳多糖提取率较高的方法为：采用酶辅助提取法，相对于传统方法可使锁阳多糖提取率提高10-65％，锁阳多糖含量提高5-40％。(甘肃凯源生物技术开发中心，2013，酶处理提取锁阳多糖的方法及锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备，CN103145863A。)
锁阳是全寄生植物，采收后干燥肉质茎全部入药，味微苦涩。市售锁阳多糖多为棕色或棕红色粉末，含有大量鞣质花青素类成分，其颜色严重影响锁阳多糖剂型的应用，需要发明一种多糖提取率高、多糖得率也高，并具有脱色效果好、利于多种剂型应用的锁阳多糖制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶解制备锁阳多糖的方法，本发明提供的制备方法有效提高了锁阳多糖提取率和得率，分别比传统方法提高了114％-242％和95％-273％；并通过胃蛋白酶酶解作用，分解了部分细胞间蛋白质，大大改善了锁阳多糖的溶出和提取，制备的锁阳多糖纯度高，颜色浅，水溶性好，可用于直接制备锁阳多糖制剂，或用于高品质锁阳多糖药品保健品的原料。
本发明提供一种制备锁阳多糖的方法，包括如下步骤：在脱脂的锁阳粉末中加入占脱脂的锁阳粉末质量百分含量0.5％-3％的胃蛋白酶，得混合粉末；在混合粉末中加入盐酸水溶液，酶解，得酶解液；将酶解液微沸回流，使酶解液中的胃蛋白酶失活，冷却，离心得上清液；将上清液用Sevage法脱除蛋白，弃去下层有机相，得上层水溶液；将上层水溶液加入无水乙醇醇沉，即得所述的锁阳多糖。
上述方法中，所述脱脂的锁阳粉末按照如下方法制备：将锁阳的肉质茎自然干燥，粉碎，过筛，得粉末；将粉末脱脂干燥，得脱脂的锁阳粉末。
上述方法中，所述筛为30目-80目筛，具体为30目筛。
上述任一所述的方法中，所述脱脂干燥的步骤如下：采用脱脂有机溶剂按(5ml-20ml)：1g的比例加入所述粉末，浸泡，抽滤，得滤饼，并将滤饼重复上述操作，将滤饼烘干；
所述脱脂有机溶剂具体按10ml：1g的比例加入所述粉末；
所述脱脂有机溶剂按照如下方法制备：将二氯甲烷和甲醇按照体积比(1-3):1混匀；
所述二氯甲烷和甲醇的体积比具体为2:1；
所述浸泡的时间为4-24小时，具体为12小时；
所述重复的次数为2-4次，具体为3次。
上述任一所述的方法中，所述胃蛋白酶占所述脱脂的锁阳粉末质量百分含量为1％-3％。
上述任一所述的方法中，所述混合粉末与所述盐酸水溶液的比例为1g：(40ml-140ml)；
所述盐酸水溶液的pH为1.3-2.0，具体为1.3-1.5；
所述酶解的温度为30℃-45℃；
所述酶解的时间为3h-7h，具体为4h-7h；
所述回流的时间为0.5h-2h，具体为1h-2h。
上述任一所述的方法中，所述胃蛋白酶占所述脱脂的锁阳粉末质量百分含量为2％；
所述混合粉末与所述盐酸水溶液的比例为1g：80ml；
所述盐酸水溶液的pH为1.5；
所述酶解的温度为40℃；
所述酶解的时间为5h；
所述回流的时间为1h。
上述任一所述的方法中，所述离心的条件为3000-10000r/min，10-30min，2-25℃，具体为5000r/min，20min，4℃。
上述任一所述的方法中，所述用Sevage法脱除蛋白的次数为2-4次，具体为3次；
所述Sevage法中氯仿:正丁醇体积比为4:1；
所述上层水溶液加入无水乙醇醇沉之前还包括如下步骤：将上层水溶液减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液；
所述无水乙醇醇沉时浓缩液与无水乙醇的体积比为1:4；
所述醇沉的条件为4℃静置过夜，离心，得沉淀；
所述醇沉之后还包括如下步骤：用无水乙醇洗涤沉淀，离心得沉淀，将其冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖；
所述离心的条件为3000-10000r/min，10-30min，2-25℃，具体为5000r/min，20min，4℃。
上述任一所述的方法在制备锁阳多糖中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供的方法工艺简单，提取成本低，适合于工业化大量生产，同时由于本制备方法得到的锁阳多糖相较于传统工艺脱色效果良好，颜色呈浅粉色，为开发观感要求高的新产品奠定了基础。
附图说明
图1为实施例15制备的锁阳多糖红外吸收光谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中选用的材料锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.)，为自然干燥肉质茎(购自当地福瑞大药房，产地内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗)，将其粉碎，过30目筛，备用。
下述实施例中锁阳多糖得率参照文献“罗光宏等，2011，甘肃河西沙区锁阳多糖提取工艺优化及含量测定，食品科学，32(10):79-83”、锁阳多糖提取率参照文献“J.PrakashMaran,etal.2013,Box–Behnkendesignbasedstatisticalmodelingforultrasound-assistedextractionofcornsilkpolysaccharide,CarbohydratePolymers,2013(92):604-611.”进行计算，计算公式如下：
下述实施例中脱脂使用有机溶剂的选择：
用有机溶剂对锁阳进行脱除油脂预处理，有利于后续锁阳多糖的提取，能够改善多糖的颜色和提取率。比较了石油醚、正己烷、无水乙醇、95％乙醇的水溶液、甲醇及二氯甲烷+甲醇(体积比2:1)的脱除效果，选择效果最好的有机溶剂体系为二氯甲烷+甲醇(体积比2:1)，油脂脱除率为0.62％。下述实施例中采用脱脂有机溶剂二氯甲烷+甲醇(体积比2:1)按液固比10ml：1g的比例对粉碎过筛后的锁阳自然干燥肉质茎浸泡12小时，然后抽滤，得滤饼，滤饼重复以上操作，共3次，最终将滤饼置于55℃鼓风干燥烘箱中烘干，得脱脂干燥的锁阳粉末。
下述实施例中脱除蛋白方法的选择：由于水提粗多糖常含有游离态和多糖结合态蛋白质需要去除，否则影响多糖的水溶性，对剂型应用也将产生影响。一般选择使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀的化学试剂来处理，比较了常用的Sevage法(Sevage，1938)、三氟三氯乙烷法(Hammond，1971)、三氯乙酸法(Chandrasekaran，1978)三种方法，实施例中选择Sevage法脱除蛋白。Sevage法脱除蛋白条件温和，处理后多糖性质不变，一般需反复处理多次，只能去除游离蛋白质，但与多糖紧密结合的蛋白质无法去除。经实验测定，实施例中处理4次蛋白脱除率分别为12.8％、29.7％、41.9％、51.9％，多糖含量损失率分别为17.0％、29.1％、38.9％、49.7％。脱蛋白处理过程中，多糖含量损失呈线性增加，蛋白脱除率增加率逐渐减小。脱蛋白处理3次后，蛋白脱除率和多糖含量损失率同步增加，表明游离蛋白已经脱除完全，剩余的为多糖结合蛋白，在脱除蛋白的同时多糖也会相应损失。因此，实施例中选择Sevage法脱蛋白处理3次。
下述实施例中酶制剂的选择和使用：经Sevage法脱蛋白处理多次后，锁阳多糖中蛋白的质量百分含量仍有1％以上，表明存在大量多糖结合蛋白，在提取过程中影响锁阳多糖提取率。由于蛋白酶可以作用于蛋白质分子中一定的肽键，使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，有利于将广泛存在于锁阳植物细胞内或细胞壁中的多糖类化合物提取进入水溶液中，提高多糖提取率。生物消化过程主要在胃内进行，胃蛋白酶具有催化蛋白质特定肽键水解的作用，这个催化过程不需要能量，不会使酶失去活力，也不会改变形状和使自身水解。不同组织或细胞对同一种蛋白酶的作用反应也不一样。胃蛋白酶分散细胞的活性还与其浓度、温度、作用时间、pH条件有关，实施例中选用胃蛋白酶。
下述实施例中所述酶用量是指胃蛋白酶占脱脂干燥的锁阳粉末的质量百分含量。
实施例1、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH2.0盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
该方法的锁阳多糖提取率为10.21％±1.79％，锁阳多糖得率为73.29±16.57mg/g，为浅粉白色固体粉末。
实施例2、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为19.53％±1.00％，锁阳多糖得率为201.9±37.2mg/g，为粉白色固体粉末。
实施例3、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量1.5％(质量百分含量)加入30.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.3盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为22.18％±1.43％，锁阳多糖得率为196.7±26.3mg/g，为粉白色固体粉末。
实施例4、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量0.5％(质量百分含量)加入10.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为16.90％±1.38％，锁阳多糖得率为111.2±14.2mg/g，为粉白色固体粉末。
实施例5、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量3％(质量百分含量)加入60.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为18.05％±1.59％，锁阳多糖得率为167.0±15.8mg/g，为粉白色固体粉末。
实施例6、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，30℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为15.78％±0.99％，锁阳多糖得率为162.3±16.7mg/g，为浅橙黄色固体粉末。
实施例7、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，45℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为18.68％±1.54％，锁阳多糖得率为196.1±19.8mg/g，为粉色固体粉末。
实施例8、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解3小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为15.17％±0.77％，锁阳多糖得率为115.5±15.9mg/g，为粉白色固体粉末。
实施例9、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量1％(质量百分含量)加入20.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解7小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为16.14％±1.21％，锁阳多糖得率为129.6±13.0mg/g，为粉白色固体粉末。
实施例10、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解4小时，保持微沸回流0.5小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为15.16％±0.89％，锁阳多糖得率为79.01±14.30mg/g，为粉白色固体粉末。
实施例11、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流1.5小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为20.11％±1.39％，锁阳多糖得率为166.1±16.7mg/g，为粉白色固体粉末。
实施例12、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g：50ml加入100mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流2小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为17.65％±1.64％，锁阳多糖得率为168.6±19.2mg/g，为肉粉色固体粉末。
实施例13、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g:40ml加入80mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为17.64％±0.91％，锁阳多糖得率为201.7±15.5mg/g，为粉白色固体粉末。
实施例14、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g:140ml加入280mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为21.70％±1.58％，锁阳多糖得率为235.8±17.3mg/g，为肉粉色固体粉末。
实施例15、胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％(质量百分含量)加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1g:80ml加入160mlpH1.5盐酸水溶液，40℃酶解5小时，保持微沸回流1小时使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
锁阳多糖提取率为24.30％±0.64％，锁阳多糖得率为248.3±21.4mg/g，为浅橙黄色固体粉末。
实施例15制备得到的锁阳多糖的红外吸收光谱图如图1所示。
图1中，吸收峰说明：
3387.52cm-1，O-H伸缩振动吸收峰；
2927.83cm-1，C-H伸缩振动吸收峰；
1621.38cm-1，1401.82cm-1，C＝O非对称、对称伸缩振动吸收峰；
1153.20cm-1，1080.20cm-1，1025.78cm-1，多糖特征吸收峰；
933.08cm-1，849.17cm-1，α-糖苷键特征吸收峰。
实施例1-实施例14制备得到的锁阳多糖的红外吸收光谱图与图1类似。
对比例1、传统方法最佳工艺条件制备锁阳多糖
参照文献“罗光宏等.2011.甘肃河西沙区锁阳多糖提取工艺优化及含量测定，食品科学，32(10):79-83”的方法，改进最佳工艺条件，锁阳多糖制备方法如下：取脱脂干燥的锁阳粉末2.00g于圆底烧瓶中，按料液比1g：30ml的比例加入蒸馏水，保持微沸回流提取3次，每次2小时，趁热抽滤，合并滤液，按Sevage法(氯仿:正丁醇体积比4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，沉淀经冷冻干燥得锁阳多糖。
冻干锁阳多糖并称量质量计算锁阳多糖提取率。准确称取100mg冻干的锁阳多糖溶于适量蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容至刻度，取样采用苯酚-硫酸法测锁阳多糖含量，并计算得率。实验设三次重复。
该方法的锁阳多糖提取率为7.10％±1.23％，锁阳多糖得率为66.61±14.53mg/g，为棕色固体粉末。
Claims (14)
1.一种制备锁阳多糖的方法，包括如下步骤：在脱脂的锁阳粉末中加入占脱脂的锁阳粉末质量百分含量0.5％-3％的胃蛋白酶，得混合粉末；在混合粉末中加入盐酸水溶液，酶解，得酶解液；将酶解液微沸回流，使酶解液中的胃蛋白酶失活，冷却，离心得上清液；将上清液用Sevage法脱除蛋白，弃去下层有机相，得上层水溶液；将上层水溶液加入无水乙醇醇沉，即得所述的锁阳多糖；
所述混合粉末与所述盐酸水溶液的比例为1g：(40ml-140ml)；
所述盐酸水溶液的pH为1.3-1.5；
所述酶解的温度为30℃-45℃；
所述酶解的时间为3h-7h；
所述回流的时间为1h-2h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脱脂的锁阳粉末按照如下方法制备：将锁阳的肉质茎自然干燥，粉碎，过筛，得粉末；将粉末脱脂干燥，得脱脂的锁阳粉末。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述筛为30目-80目筛。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述筛为30目筛。
5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：所述脱脂干燥的步骤如下：采用脱脂有机溶剂按(5ml-20ml)：1g的比例加入所述粉末，浸泡，抽滤，得滤饼，并将滤饼重复上述操作，将滤饼烘干；
所述脱脂有机溶剂按照如下方法制备：将二氯甲烷和甲醇按照体积比(1-3):1混匀；
所述浸泡的时间为4-24小时；
所述重复的次数为2-4次。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述脱脂有机溶剂按10ml：1g的比例加入所述粉末；
所述二氯甲烷和甲醇的体积比为2:1；
所述浸泡的时间为12小时；
所述重复的次数为3次。
7.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述胃蛋白酶占所述脱脂的锁阳粉末质量百分数为1％-3％。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述酶解的时间为4h-7h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述胃蛋白酶占所述脱脂的锁阳粉末质量百分数为2％；
所述混合粉末与所述盐酸水溶液的比例为1g：80ml；
所述盐酸水溶液的pH为1.5；
所述酶解的温度为40℃；
所述酶解的时间为5h；
所述回流的时间为1h。
10.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述离心的条件为3000-10000r/min，10-30min，2-25℃。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述离心的条件为5000r/min，20min，4℃。
12.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述用Sevage法脱除蛋白的次数为2-4次；
所述Sevage法中氯仿:正丁醇体积比为4:1；
所述上层水溶液加入无水乙醇醇沉之前还包括如下步骤：将上层水溶液减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液；
所述无水乙醇醇沉时浓缩液与无水乙醇的体积比为1:4；
所述醇沉的条件为4℃静置过夜，离心，得沉淀；
所述醇沉之后还包括如下步骤：用无水乙醇洗涤沉淀，离心得沉淀，将其冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖；
所述离心的条件为3000-10000r/min，10-30min，2-25℃，具体为5000r/min，20min，4℃。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述用Sevage法脱除蛋白的次数为3次；
所述离心的条件为5000r/min，20min，4℃。
14.权利要求1-13任一所述的方法在制备锁阳多糖中的应用。
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