CN107488222A - 一种金针菇凝集素的制备方法 - Google Patents

一种金针菇凝集素的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金针菇凝集素的制备方法，特征是通过浸提、沉淀、透析脱盐、离子交换层析、凝胶层析等过程获得了金针菇凝集素，其制备方法首先将金针菇子实体粉碎，加入磷酸缓冲液低温浸提，然后加入硫酸铵沉淀，再经离心透析脱盐，通过DEAE离子交换层析、SephadexG‑100凝胶层析等纯化步骤获得金针菇凝集素。利用本发明提供的方法制备得到的金针菇凝集素具有抗菌活性，活性成分多。

Description

一种金针菇凝集素的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术中功能蛋白制备方法，具体地说，涉及一种金针菇凝集素的制备方法。
背景技术
金针菇隶属于担子菌亚门、层菌纲、金针菇目、金针菇科、金针菇属（Russula）真菌，是一种美味的野生菌根性食药兼用真菌。该金针菇多年来一直是桂平畅销名产，成为人们馈赠亲朋好友的佳品。由于此菇生境特殊，目前尚未能人工栽培，野生金针菇的价格年年攀升，野生金针菇的开发与利用已成为国内外学者们的研究热点。
凝集素一类具有特异糖结合活性的蛋白，具有一个或多个可以与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化结构域，广泛存在于各种植物、动物、人体的组织器官、真菌和某些病毒中。凝集素最显著的特点是具有细胞凝集能力，不仅能凝集红细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌、病毒等，还能特异性识别并结合细菌、病毒、肿瘤细胞表面的糖结构从而抵制其生长，因此凝集素被广泛用于病原菌的防治、肿瘤的治疗、含糖基生物大分子的检测等方面。
金针菇含有丰富的营养物质和生物活性物质，目前国内外尚未发现有关金针菇凝集素的所道。而本发明通过浸提、沉淀、透析脱盐、离子交换层析、凝胶层析等过程获得了金针菇凝集素并具有抑菌活性，金针菇活性成分多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金针菇凝集素的制备方法，通过浸提、沉淀、透析脱盐、离子交换层析、凝胶层析等过程金针菇凝集素具有抗菌活性，金针菇活性成分多。获得的金针菇凝集素具有抗菌活性，金针菇活性成分多的一种金针菇凝集素的制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种金针菇凝集素的制备方法，其工艺步骤是：
（1）凝集素粗品的提取：金针菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液，于高速组织捣碎机中捣碎，然后加入适量的磷酸盐缓冲液，于8℃中浸提49h，四层纱布过滤，滤液经12500r/min于4℃下离心41min，弃沉淀，收集上清液。加入固体硫酸铵至75%～80%饱和度，4℃下静默25h，于4℃下以12500r/min速度离心61min，收集沉淀物。加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，透析除盐，检测凝血活性，冷冻干燥，得到金针菇凝集素粗制品。
（2）DEAE离子交换层析：取步骤（1）所得的金针菇凝集素粗制品，用磷酸盐缓冲液重新溶解，上样于DEAE-纤维柱，上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积，然后以含有0.5mol/L NaCl的pH值为7.1的磷酸缓冲液以流速为31ml/h速度洗脱，将活力峰部分收集，透析除盐，冷冻干燥。
（3）SephadexG-100凝胶层析：用蒸馏水平衡柱子，洗脱液为pH值为7.1的0.16mol/L的磷酸缓冲液，流速为39ml/h，4ml/tube约6min收集1管。将活力峰部分收集，透析，冷冻干燥得到金针菇凝集素。
上述步骤（1）、（2）所述的磷酸盐缓冲液指的是pH值为7.1的内含0.16mol/L NaCl的0.016mol/L的磷酸缓冲液。
上述步骤（1）中浸提时的液料比为11:1。
上述步骤（2）洗脱峰共有5个，其中活力峰指的是第5个洗脱峰。
上述步骤（3）中将收集到的活力峰经过SephadexG-100分子筛层析后得到4个蛋白峰，其中活力峰指的是第3个蛋白峰。
上述步骤（3）获得的金针菇凝集素具有抑菌活性。冷冻干燥得到金针菇凝集素。
本发明的优点是：将金针菇子实体粉碎，加入磷酸缓冲液低温浸提，然后加入硫酸铵沉淀，再经离心透析脱盐，通过DEAE离子交换层析、SephadexG-100凝胶层析等纯化步骤获得金针菇凝集素。利用本发明提供的方法制备得到的金针菇凝集素具有抗菌活性，金针菇活性成分多。冷冻干燥得到金针菇凝集素。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
（1）凝集素粗品的提取：金针菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液（PBS,0.015mol/L,pH7.2，内含0.15mol/L NaCl），于高速组织捣碎机中捣碎，然后加入磷酸盐缓冲液（液料比为11:1），于2℃中浸提29h，四层纱布过滤，滤液经11000r/min于4℃下离心20min，弃沉淀，收集上清液。加入固体硫酸铵至75%饱和度，5℃下静默11h，于4℃下以8500r/min速度离心46min，收集沉淀物。加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，透析除盐，检测凝血活性，冷冻干燥，得到金针菇凝集素粗制品。
（2）DEAE离子交换层析：取步骤（1）所得的金针菇凝集素粗制品，用磷酸盐缓冲液重新溶解，上样于DEAE-纤维柱，上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积，然后以含有0.5mol/L NaCl的pH值为7.1的磷酸缓冲液以流速为31ml/h速度洗脱，收集第5个洗脱峰部分透析除盐，冷冻干燥。
（3）SephadexG-100凝胶层析：用蒸馏水平衡柱子，洗脱液为pH值为7.1的0.14mol/L的磷酸缓冲液，流速为42ml/h，4ml/tube约6min收集1管。将收集第3个蛋白峰部分透析脱盐，冷冻干燥得到金针菇凝集素。
实施例2
（1）凝集素粗品的提取：金针菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液（PBS,0.015mol/L,pH7.1，内含0.15mol/L NaCl），于高速组织捣碎机中捣碎，然后加入磷酸盐缓冲液（液料比为11:1），于4℃中浸提49h，四层纱布过滤，滤液经8500r/min于4℃下离心42min，弃沉淀，收集上清液。加入固体硫酸铵至80%饱和度，4℃下静默32h，于4℃下以13500r/min速度离心39min，收集沉淀物。加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，透析除盐，检测凝血活性，冷冻干燥，得到金针菇凝集素粗制品。
（2）DEAE离子交换层析：取步骤（1）所得的金针菇凝集素粗制品，用磷酸盐缓冲液重新溶解，上样于DEAE-纤维柱，上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积，然后以含有0.5mol/L NaCl的pH值为7.1的磷酸缓冲液以流速为29ml/h速度洗脱，收集第3个洗脱峰部分透析除盐，冷冻干燥。
（3）SephadexG-100凝胶层析：用蒸馏水平衡柱子，洗脱液为pH值为7.1的0.14mol/L的磷酸缓冲液，流速为39ml/h，4ml/tube约5min收集1管。将收集第1个蛋白峰部分透析脱盐，冷冻干燥得到金针菇凝集素。
用平板培养法对金针菇凝集素进行抑菌活性检测。利用本发明提供的方法制备得到的金针菇凝集素具有抗菌活性，金针菇活性成分多。

Claims (6)

1.一种金针菇凝集素的制备方法，其特征在于以下工艺步骤：
凝集素粗品的提取：金针菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液，于高速组织捣碎机中捣碎，然后加入适量的磷酸盐缓冲液，于8℃中浸提49h，四层纱布过滤，滤液经12500r/min于4℃下离心41min，弃沉淀，收集上清液，加入固体硫酸铵至75%～80%饱和度，4℃下静默25h，于4℃下以12500r/min速度离心61min，收集沉淀物，加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，透析除盐，检测凝血活性，冷冻干燥，得到金针菇凝集素粗制品；
DEAE离子交换层析：取步骤（1）所得的金针菇凝集素粗制品，用磷酸盐缓冲液重新溶解，上样于DEAE-纤维柱，上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积，然后以含有0.5mol/L NaCl的pH值为7.1的磷酸缓冲液以流速为31ml/h速度洗脱，将活力峰部分收集，透析除盐，冷冻干燥；
SephadexG-100凝胶层析：用蒸馏水平衡柱子，洗脱液为pH值为7.1的0.16mol/L的磷酸缓冲液，流速为39ml/h，3ml/tube约5min收集1管，将活力峰部分收集，透析，冷冻干燥得到金针菇凝集素。
2.根据权利要求1所述的一种金针菇凝集素的制备方法，其特征在于步骤（1）、（2）所述的磷酸盐缓冲液指的是pH值为7.1的内含0.16mol/L NaCl的0.016mol/L的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种金针菇凝集素的制备方法，其特征在于步骤（1）中浸提时的液料比为11:1。
4.根据权利要求1所述的一种金针菇凝集素的制备方法，其特征在于步骤（2）洗脱峰共有5个，其中活力峰指的是第5个洗脱峰。
5.根据权利要求1所述的一种金针菇凝集素的制备方法，其特征在于步骤（3）中将收集到的活力峰经过SephadexG-100分子筛层析后得到4个蛋白峰，其中活力峰指的是第3个蛋白峰。
6.根据权利要求1所述的一种金针菇凝集素的制备方法，其特征在于步骤（3）获得的金针菇凝集素具有抑菌活性，冷冻干燥得到金针菇凝集素。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275198A (zh) * 2013-06-13 2013-09-04 石河子大学 一种阿魏菇凝集素分离纯化的方法
CN104086638A (zh) * 2014-07-10 2014-10-08 山西大学 一种苦荞麦凝集素的制备方法和应用
CN104817633A (zh) * 2015-04-25 2015-08-05 玉林师范学院 一种红菇凝集素的制备方法及应用

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