CN1988911A - 一种从野山参中制备有抗癌活性的纯化提取物的方法及含有其的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备具有抗癌活性的野山参纯化提取物的方法，所述抗癌活性例如抑制癌细胞黏附，抑制癌细胞转移和免疫刺激效应，本发明还涉及含有根据发明的方法制备的提取物的组合物。组合物具有有效的抗癌活性，因此，可以作为治疗药物被用于治疗和预防各种癌症疾病。

Description

一种从野山参中制备有抗癌活性的纯化提取物的方法及含有其的组合物
技术领域
本发明涉及一种从野山参(wild ginseng)中制备有抗癌活性的纯提取物的方法以及含有其的组合物。
背景技术
癌症是由在细胞周期中紊乱而导致的通过启动，促进和演进这三个阶段，异常分化和发育产生的恶性肿瘤。癌症的启动可能主要由于足够量的致癌物质而发生，而小量的启动子导致细胞突变，突变细胞数量的增殖和最终对肿瘤启动子的刺激而促进异常细胞的分化导致癌症组织的形成。
至今，在开发用于治疗癌症的抗癌药物上已经有大量的尝试和方法，例如，近来集中地研究了用于筛选直接作用于癌症细胞的细胞毒性物质的方法，用于筛选机体免疫调节物质的方法，用于筛选癌症细胞转移的抑制物质的方法，用于筛选抑制血管生成的物质的方法等等。
常规应用的抗癌药物可以分成三类：即，生物药物，例如基因或者酶制剂，疫苗等；化学治疗药剂(纯合成抗癌药物)，例如紫杉醇，长春碱等；以及来源于自然资源的天然产物药物。然而，生物药物尚未达到临床使用的要求。而且，化学治疗药剂尽管具有有效的抗癌活性，但由于它们多种副作用而被限制使用，这些副作用例如对特异抗癌药剂发生不能耐受，骨髓功能障碍，胃功能紊乱例如呕吐，恶心，脱发(Gillman et al.，Maxwell Macmillan.，18，pp1202，1986；Chung et al.，J.Wonkwang Medical Sci.，3，pp13-34，1987)。有报道称因为大多数抗癌类药物的抗癌药物分子量小，抗癌药物可以渗入到正常细胞，特别是活跃的分化细胞以及癌细胞而导致正常细胞的损伤并轻易地通过尿素排泄，而这需要相当量的药物(Yamazaki et al.，Biosci，Biotech.Biochem.，56(1)，pp149，1992；Tompson et al.，Exp.Cell Res.，41，pp411-427，1996；Ellem et al，Devel.Biol.，118，pp311-330，1968)。
近来，在从生药或天然产物中开发具有预防和治疗癌症疾病的抗癌药剂方面有大量的尝试。
因此，至今迫切地需要从自然资源中找到可提供功效被证实的以及低的或者最小毒性的有效物质。近来，替代医学，尤其地，基于免疫增强机制的中药疗法作为传统西药的替代方法以消除化学治疗的副作用被关注。在这些中药疗法中，联合使用从表现出免疫增强活性和低毒性的中药中提取的植物提取物以及使用有效提取物的针灸疗法在韩国逐渐被关注，这一疗法由下述步骤组成：选择对于单个疾病具有最有效活性的植物或者其他天然资源；从具有最大功效且最低毒性的提取物中提取有效成分；接种或者注射上述成分到适宜针灸的位置或者身体疼痛部位并且由于针灸的作用和成分的药理作用而因此赋予其协同效应。然而，生药可以在注射或者针灸时将其毒性表现出来，例如发烧，疼痛，水肿等等，故而还需要获得更多具有比生药形式毒性更低的纯化的提取物。
对于从有抗癌活性的野山参中制备纯化的提取物的方法以及含有其的组合物，在上述引用文献中尚没有报道或者公开，对于他们的公开在此被整体引用作为参考。
为了调查利用本发明的方法从野山参中制备的纯化提取物对于癌症和肿瘤细胞的作用效果，本发明的发明人集中地开展了一些体内和体外模型实验，并且最终通过确认纯化的提取物表现出抗癌活性和免疫刺激效应而完成了本发明。
本发明的目的可以通过本文提供的本发明的具体内容而显而易见。
发明内容
本发明提供了一种用于从对于癌症疾病具有治疗和预防活性的野山参中制备纯化提取物的方法。
本发明提供了一种含有有效量的按上述方法制备的野山参纯化提取物作为活性成分的药物组合物，通过其抗癌活性用于治疗和预防癌症疾病。
本发明还提供了上述提取物通过对哺乳动物或者人类的抗癌活性而在制备用于治疗和预防癌症疾病的药物组合物的应用。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于从野山参中制备纯化提取物的方法，所述方法由下述步骤组成：将野山参材料用提取溶剂反复进行蒸馏提取；冷冻蒸馏制得的提取物以获得冷冻的纯化提取物；溶化提取物并过滤以获得纯化的提取物。
本发明的又一个目的是提供一种含有有效量的按上述方法制备的野山参纯化提取物作为活性成分的药物组合物，通过其抗癌活性用于治疗和预防癌症疾病。
本发明的又一个目的是提供按上述方法制备的野山参纯化提取物通过对哺乳动物或者人类的抗癌活性而在制备用于治疗和预防癌症疾病的治疗药剂的应用。
本发明的又一个目的是提供一种通过对哺乳动物或者人类的抗癌活性而治疗或者预防癌症疾病的方法，所述方法包括：对所述哺乳动物或者人类给予有效量的按上述方法从野山参中制备的纯化提取物，以及其药学上可接受的载体。
本发明公开的术语“提取溶剂”包含水，低级醇，例如甲醇，乙醇，优选水。
本发明公开的术语“野山参材料(wild ginseng material)”包含所有栽培的野山参(wild ginseng cultivated)或在世界上自然生长的野山参(naturallygrown wild ginseng)，例如，韩国，日本，俄罗斯，中国，欧洲，美国等。
本发明的药物组合物可以含有基于组合物总重量的大约按重量计0.01～50％的上述提取物。
一种野山参的纯化提取物可以按照下面优选的实施方式制备。
在下文中，本发明将被具体描述。
一种新发明的野山参纯化提取物可以按照下面步骤具体制备，
所述新发明的野山参纯化提取物可以按照下面步骤制备；
具体地，本发明的一个目的是提供一种用于从野山参中制备纯化提取物的方法，所述方法由下述步骤组成：步骤1：将野山参材料用提取溶剂进行第一次蒸馏提取以获得第一蒸馏物；步骤2：将第一蒸馏物用提取溶剂进行第二次蒸馏提取以获得第二蒸馏物；步骤3：冷冻第二蒸馏物以获得冷冻的纯化提取物；步骤4：溶化提取物并过滤以获得过滤提取物；步骤5：使用双层蒸锅加热过滤物并再次冷冻；步骤6：溶化提取物并灭菌以获得本发明的纯化提取物。
具体地，在步骤1中，优选将野山参材料倒入极性溶剂中，所述极性溶剂选自水，低级醇例如甲醇，乙醇，丙醇以及它们的混合溶剂，更优选水，尤其优选比率为每升水含有1.0～3.0kg的材料并将其独自置于室温1～4小时，优选3小时。随后，在60～120℃使用蒸馏装置加热，优选80～100℃，更优选100℃，加热时间为6～24小时，优选逐渐加热8～10小时，以获得第一蒸馏物。
在步骤2中，优选地将第一蒸馏物加入到装备了蒸馏装置的含有沸石的烧瓶中并在60～120℃加热，优选80～100℃，更优选100℃，加热时间为7～24小时，优选逐渐加热8～12小时并且加热过程持续到浓缩物的体积减小到70～90(v/v)％的程度以获得第二蒸馏物。
在步骤3中，优选地将第二蒸馏物在-5～-15℃进行冷冻，优选-8～-12℃并且该过程持续到未冷冻部分的体积减小到小于总体积5％的程度。移出未冷冻部分并且将余下的蒸馏物进行溶化。可以重复冷冻和移除未冷冻部分的过程，优选重复3～6次，以获得本发明的冷冻纯化提取物。通过步骤3，在步骤1的野山参材料中的毒性物质几乎或者全部被移除而得到纯化的提取物。
在步骤4中，优选地将步骤3冷冻的纯化提取物进行室温溶化处理和随后使用孔径为0.1～0.6μm的滤纸过滤处理，优选0.4μm，以获得滤液。
在步骤5中，使用双层蒸锅在60～120℃对上述步骤制备的滤液加热，优选80～100℃，更优选100℃，加热时间为20～40分钟，优选30分钟，和在-30-10℃进行完全地再冷冻，优选-15℃以获得冷冻的纯化提取物。
在步骤6中，将冷冻的滤液溶化并灭菌以获得本发明的最终纯化提取物。
在上面描述的步骤1中，根据本发明的目的，第一蒸馏物的浓度可以通过改变材料的比率而控制。
在上面描述的纯化过程中，按照具体成分的不同，提取物可以被分成两部分，即冷冻部分和未冷冻部分。因为凝固点低，所以在提取物中带有较大毒性的成分比毒性小的成分冷冻得慢，使得含有绝大部分毒性成分的未冷冻部分可以通过重复上述冷冻过程而被移除。
因此，本发明的一个目的是提供含有有效量的按上述方法制备的野山参纯化提取物作为活性成分的药物组合物，通过其抗癌活性用于治疗和预防癌症疾病。
本发明的一个目的是提供按上述方法制备的野山参纯化提取物通过对哺乳动物或者人类的抗癌活性而在制备用于治疗和预防癌症疾病的治疗药剂的应用。
本发明的又一个目的是提供一种通过保护哺乳动物或者人类的神经元细胞而治疗或预防退化性脑病的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物或者人类有效量的按上述方法从野山参中制备的纯化提取物，以及其药学上可接受的载体。
通过体内和体外模型实验证实了本发明的纯化提取物对于癌症和肿瘤细胞的作用，发明人确信纯化的提取物具有抗癌活性和免疫刺激效果。
因此，本发明的纯化提取物在治疗和预防癌症疾病上是有用的。
除了功效以外，本发明的纯化提取物由于多年前已经被用于商业生药，而可以安全地长期给药。
发明的用于治疗和预防癌症疾病的组合物可以含有基于组合物总重量的按重量计0.01～50％上述提取物。
发明的组合物可以另外包含和本领域公知的使用方法相一致的常规载体，辅料或稀释剂。根据用法优选所述载体作为适宜物质使用，但并不局限于此。Remington’s pharmaceutical Science(Mack Publishing co，Easton PA)记载了适宜的稀释剂。
在本文中，下述的配制方法和赋型剂仅仅作为实例而并不以任何方式限制本发明。
根据本发明的组合物可以作为药物组合物提供，所述药物组合物含有药学上可接受的载体，辅料或稀释剂，例如，乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，洋槐胶，藻酸盐，凝胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，聚乙烯吡咯酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。制剂可以另外含有填充物，抗凝剂，润滑剂，湿润剂，香味剂，乳化剂，防腐剂等等。本发明的组合物可以制成制剂以便于通过任何本领域公知的方法将其给药于患者后提供活性成分的速效，或缓释形式。
例如，本发明的组合物可以溶解于油，丙二醇或者其它用于制造注射剂的溶剂中，适宜的载体实例包括生理盐水，聚乙二醇，乙醇，植物油，十四烷酸异丙酯等，但并不局限于它们。对于局部给药，本发明的提取物可以制成软膏和霜的形式。
含有本发明组合物的药物制剂可以制成任何形式，例如口服剂量形式(粉末，片剂，胶囊，软胶囊，液体药剂，糖浆，酏剂，香粉，小颗粒)，或者局部制剂(霜，软膏，乳液，凝胶，油膏，塞片，喷雾液，气溶胶等)，注射制剂(溶液，悬浮剂，乳剂)或者针灸注射制剂。
药物剂型的本发明组合物可以以其药学上可接受盐的形式使用，也可以单独或者以适宜的结合体，以及与其它药学上的活性化合物结合使用。
发明的提取物或者组合物的期望剂量根据患者的状况和体重，严重性，药物形式，给药途径和时间的变化而不同，并且可以由本领域的技术人员选择。然而，为了获得期望效果，通常建议以10g/kg左右量给药，优选地，按重量/天计为1～3g/kg本发明的提取物或者化合物。所述剂量可以一次或者分成每日多次给药。就组合物而言，本发明的提取物的量按重量计应为基于组合物总重量的0.01～50％，优选按重量计的0.5～40％。
本发明的药物组合物可以通过不同途径给药于患病动物，例如哺乳动物(小鼠，大鼠，家畜或者人)。可以使用所有类型的给药方式，例如可以通过口服，直肠给药或者通过静脉注射，肌肉注射，皮下注射，皮内注射，鞘内注射，硬脑膜外注射，或者脑室内注射或者在适宜针灸的部位进行针灸注射。
本发明的发明提取物无毒性和无副作用，因此可以安全使用。
对于本领域技术人员，很显然可以在不背离本发明的精神或范围下，对本发明的组合物，制备和使用本发明进行各种改变和修饰。
附图说明
通过下面详细描述并结合附图，可以更清楚地理解本发明的上述和其他目的，特性以及其他优点。
图1：显示HPLC对自然生长的野山参未纯化提取物的分析；
图2：显示HPLC对自然生长的野山参纯化提取物的分析。
具体实施方式
对于本领域的技术人员，很显然可以在不背离本发明的精神或范围下，对本发明的组合物，制备和使用本发明进行各种改变和修饰。
通过下面的实施例更具体的解释了本发明。然而，应当理解为这些实施例并不以任何方式限制本发明。
实施例
下述参考实例，实施例以及试验例均为了进一步阐述本发明而并不限于其范围。
比较例1.从自然生长的野山参中制备未纯化的提取物
将2.5kg源于自然生长野山参的Sangyang野山参用盐水冲洗并撕成宽为3mm的碎片，加入到含有1升水的烧瓶中并于100℃加热8小时。使用孔径大小为0.1～0.6μm的滤纸对蒸馏物进行过滤。室温冷却滤液，灭菌并保存于无菌瓶中以备下面试验中作为样品使用，维持其温度低于4℃。
比较例2.从栽培野山参中制备未纯化的提取物
将2.0kg源于自然生长的野山参的栽培野山参用盐水冲洗并撕成宽为3mm的碎片，加入到含有1升水的烧瓶中并于100℃加热8小时。使用孔径大小为0.1～0.6μm的滤纸对蒸馏物进行过滤。室温冷却滤液，灭菌并保存于无菌瓶中以备下面试验中作为样品使用，维持其温度低于4℃。
实施例1.从自然生长野山参中制备纯化提取物
将2.5kg源于自然生长野山参的Sangyang野山参用盐水冲洗并撕成宽为3mm的碎片，加入到含有1升水的烧瓶中，并在20℃放置3小时。
装备有蒸馏装置的烧瓶在100℃加热8小时以获得第一蒸馏物。将5g沸石连同第一蒸馏物倒入装备有蒸馏装置的烧瓶中，于100℃进一步加热10小时以获得第二蒸馏物。将第二蒸馏物在-10℃冷冻直到未冷冻部分的体积小于总体积的5％的程度，然后废弃未冷冻部分。保留的冷冻部分于室温溶化。上述冷冻和溶化步骤进一步重复2次。当冷冻部分溶化后，使用孔径大小为0.1～0.6μm的滤纸对其进行过滤，并且在90℃于双层蒸锅中将滤液加热30分钟。冷却滤液并在-15℃完全冷冻。冷冻了的纯化提取物于室温溶化，灭菌并保存于无菌瓶中以备下面试验中作为样品使用，维持其温度低于4℃。
实施例2.从栽培野山参中制备纯化提取物
将Kyunghee大学(韩国首尔)提供的2.0kg栽培野山参用盐水冲洗并撕成宽为3mm的碎片，加入到含有1升水的烧瓶中，并在20℃放置3小时。
进一步的步骤按照与实施例1类似的方法进行以获得栽培野山参的纯化提取物，并在下面试验中作为样品使用。
实施例3.对上面比较例1和实施例1的含量分析
使用HPLC对上述比较例1和实施例1中的皂甙含量进行测定(柱：Phenomenex Nuna C18(5μm，150×2.0mm)，流速：0.3ml/min，检测波长：UV203nm，展开剂：起始溶剂；CH3CN∶H2O＝15∶85并且在大于70分钟内，在CH3CH∶H2O＝80∶20中从0％到30％，室温)。
如图1和图2所示，检测到的上述含量分析的结果为上述比较例1和实施例1的皂甙含量显著不同。
参考例1.细胞培养
U937细胞(人白血病细胞系)，A549细胞(人肺癌细胞系)以及MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞系)在含有RPMI1640培养基(Gibco BRLCo.，Ltd.，USA)的直径为100mm的培养皿(TPP Co.，Ltd.，Switzerland)中生长，并追加10％的胎牛血清，于37℃，5％CO2和95％空气的湿度培养箱中培养。
试验例1.细胞毒性测定
通过MTT法(3-[4.5-二甲基噻唑-2-基]-2.5-溴化二苯基四唑)测定U937细胞(人白血病细胞系)，A549细胞(人肺癌细胞系)以及MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞系)中的野山参细胞毒性。
将10mm培养皿中的细胞用500μl胰蛋白酶-EDTA(Gibco BRL Co.，Ltd.，USA)处理以使其从培养皿中分离，然后向其中加入10ml新鲜培养基以中和胰蛋白酶-EDTA溶液并获得悬浮细胞。
在培养24小时后，向96孔板中加入1×104细胞/孔。用在比较例1，2和实施例1，2中制备的不同浓度的提取物100μl/孔处理上面这些细胞，并再培养48小时，提取物浓度分别即0，125，250，500和1000μg/ml。48小时后，弃培养基并在每个细胞中加入10μl经PBS缓冲液稀释后调整浓度为5mg/ml的MTT溶液，37℃培养4小时。用PBS冲洗培养基以移除残留的MTT试剂并在每孔中滴入100μl的DMSO(二甲亚砜)。室温培养平板20分钟然后用微孔读数板(ELISA reader，DENLEY Co.，Japan)测定样品紫外吸光度以计算570nm处的细胞活性。
将仅仅用培养基处理的阴性对照组的细胞活性率计为100％，并对其他样品和阳性对照的数值进行计算。
作为阳性对照组，将100μl/孔不同浓度的亚德里亚霉素加入到96孔板中，所述浓度即0，3.125，6.25，12.5，25，培养48小时并用稀释后浓度为5mg/ml的MTT处理。
测定的吸光度显示MTT法中现有细胞酶的减少量与存活细胞密度成比例。用于抑制50％癌症细胞存活的样品浓度表示为IC50。
在结果中，对于U937，A549以及MDA-MB-231癌细胞，比较例1，2和实施例1，2处理组(IC50，＞300μl/ml)显示出低细胞毒性效应而亚德里亚霉素处理组显示出相对强的细胞毒性效应(IC50，3μg/ml)(见表1，2，3)。
[表1]
     U937细胞的细胞毒性
  样品    IC50(ul/ml)
  比较例1    ＞300
  实施例1    ＞300
  比较例2    ＞300
  实施例2    ＞300
  亚德里亚霉素    3
[表2]
      A549细胞的细胞毒性
   样品    IC50(ul/ml)
   比较例1    ＞300
   实施例1    ＞300
   比较例2    ＞300
   实施例2    ＞300
   亚德里亚霉素    3
[表3]
  MDA-MB-231细胞的细胞毒性
    样品     IC50(ul/ml)
    比较例1     ＞300
    实施例1     ＞300
    比较例2     ＞300
    实施例2     ＞300
    亚德里亚霉素     3
试验例2.对于癌细胞黏附到细胞质的抑制
如果癌症细胞从首先发生的部位转移到其他组织，癌症细胞需要在细胞质中有对于特异物质的细胞黏着能力，所述细胞物质即胶原，层粘连蛋白，凝胶等或者用于代谢的内皮细胞。
为了测定本发明提取物的对细胞黏着能力的抑制效果，将MDA-MB-231细胞(1×106细胞/孔)加入到由0.1％凝胶包被的96孔板中，并且向其中用不同浓度的比较例1，2以及实施例1，2(0，62.5，125，250和500μg/ml)处理以致各自浓度为100μl/孔。细胞在37℃培养箱中培养直至细胞附着到培养板底部并用PBS缓冲液小心清洗培养板。附着细胞用结晶紫染色试剂染色并用微板读数器(ELISA reader，DENLEY Co.，Japan)测定620nm处的OD值。
在结果中证实，比较例1，2和实施例1，2处理组显示出以剂量依赖方式抑制MDA-MB-231细胞黏附到凝胶上(见表4)。
[表4]
样品     浓度(ul/ml)     黏附抑制(％)
比较例1     62.5     13.32±2.31
    125     17.21±4.38
    250     20.94±2.06
    500     34.84±1.04
实施例1     62.5     15.18±0.74
    125     19.81±2.17
    250     21.32±3.33
    500     38.37±5.43
比较例2     62.5     15.04±3.22
    125     18.90±3.31
    250     20.46±4.46
    500     25.91±6.30
实施例2     62.5     15.54±1.92
    125     19.56±3.31
    250     22.32±2.91
    500     30.26±3.30
试验例3.MDA-MB-231细胞转移的抑制效应
为了测定本发明提取物对癌细胞转移的抑制效果，孔径大小为8μm的聚碳酸酯膜被50μg的matrigel充分地包被1小时并在空气中干燥24小时。将含有0.1％BSA的条件培养基各30μ加入到Boyden chamber的下室中。用加入了含有0.1％BSA的RPMI1640(FBS-free)培养基的50μl的MDA-MB-231细胞(1×106细胞/孔)处理50μl由比较例1，2和实施例1，2制备的提取物，并分别加入到Boyden chamber的上室中。在37℃，5％CO2和95％空气的湿度培养箱中培养16小时后，用MeOH固定膜并用Quic溶液(Diffco Co.Ltd.)染色。通过分光法计算从上室进入到下室的细胞数。
在结果中证实，用实施例1和2的提取物的处理组相比于用比较例1和2的提取物处理组，表现出对于MDA-MB-231细胞转移的更强烈的剂量依赖型抑制(见表5)。
[表5]
样品     浓度(ul/ml)   抑制率(％)
比较例1     62.5   36.43±3.08
    125   49.49±5.85
    250   50.06±1.69
    500   69.54±5.35
实施例1     62.5   39.54±4.85
    125   52.94±3.12
    250   58.02±3.59
    500   77.75±6.54
比较例2     62.5   14.11±2.85
    125   38.48±4.22
    250    46.67±5.27
    500    48.05±2.15
实施例2     62.5    38.32±3.86
    125    42.22±3.05
    250    47.36±3.94
    500    50.69±4.21
试验例4.使用Lewis肺癌细胞测定癌细胞体积增加的抑制效应
为了测定对于癌细胞体积增加的抑制效应，通过改变文献中公开的方法(Teruhiro et al.，Cancer Res.，56，pp2809-14，1996)进行了下述试验。
将已经在实验鼠体内继代培养的Lewis肺癌细胞(1×106细胞/孔)调整剑1×106细胞/孔的浓度，然后注射到BDF-1雄性小鼠(6-周-龄)的左腋。24小时后，将浓度为0.5和1mg/小鼠的亚德里亚霉素以及浓度为50和100μl/小鼠的比较例1，2和实施例1，2所制备的提取物腹腔注射到小鼠中。样品注射持续2周直到作为对照的非处理组的肿瘤体积达到2cm3。2周后，使用下述公式1和2计算出肿瘤体积并测定肿瘤体积的抑制率。
[数学公式1]
Tumor volume ( c m 3 ) = L × w 2 2
L(cm)：肿瘤长度
W2(cm2)：肿瘤宽度
[数学公式2]
Inhibition of tumor volume ( % ) = A - B A × 100
A：对照组的肿瘤体积(cm3)
B：样品处理组的肿瘤体积(cm3)
在结果中证实，使用实施例1和2提取物的处理组相比于用比较例1和2的提取物处理组，显示出对Lewis肺癌细胞的体积增长更强烈的剂量依赖型抑制作用(见表6)。
    [表6]
  样品   浓度(ul/小鼠)   抑制效果(％)
比较例1   50   30.05±9.47
  100   48.95±2.87
实施例1   50   75.94±10.70
  100   90.12±11.25
比较例2   50   29.04±10.94
  100   40.38±13.32
实施例2   50   73.05±11.37
  100   88.94±10.83
  亚德里亚霉素   0.5mg   31.20±8.05
试验例5.体重的测定
使用自动重量测量设备(Jenix，Dongsintonsang，Korea)在试验期间对由上述试验例4制备的小鼠的体重进行测定。
在结果中，实施例1和2处理组表现出体重的显著增加而大多数的常规抗癌药物由于其副作用而表现出体重减少。
试验例6.B16-F10黑色素瘤细胞转移的抑制效应
为了测定对于癌细胞转移的抑制效应，将B16-F10黑色素瘤细胞(2.5×lO5细胞/孔)注射到C57BL/6小鼠的尾部侧静脉。24小时后，以浓度为100μl/小鼠/天分别注射由比较例l，2和实施例1，2制备的提取物。注射14天后，杀死上述试验小鼠并用肉眼观察从小鼠中转移的肺转移性肿瘤细胞的菌落。
在结果中证实，由实施例1和2制备的提取物相比于由比较例l和2制备的提取物表现出对B16-F10黑色素瘤细胞转移的更强烈抑制作用(见表7)。
[表7]
    样品   菌落数  抑制率(％)
    比较例1   47.02±13.83  42
    实施例1   33.96±10.48  58
  比较例2   65.51±11.32   18
  实施例2   52.23±18.46   35
  未处理   80.4±17.81   0
试验例7.BALB.c小鼠脾脏白细胞的免疫刺激效应
为了测定本发明提取物的免疫刺激效应，将BALB.c小鼠的脾脏白细胞(1×106细胞/ml)悬浮于加入了100μg/ml链霉素，100U/ml青霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培养基中(Gibco BRL Co.，Ltd.，USA)，并用其处理各200μl/ml的比较例1，2和实施例1，2的提取物。将溶液在37℃，5％CO2和95％空气的湿度培养箱中培养3天并用流式细胞仪测定白细胞的形成。使用经200μg/ml亚德里亚霉素处理组作为对照组。
在结果中证实，亚德里亚霉素处理组使得免疫力下降了26.1％，而实施例1和2以及比较例1和2处理组表现为白细胞合成增加，并且实施例1和2处理组的增加更多(见表8)。
[表8]
  样品   浓度(ug/ml)    白细胞增长率(％)
  亚德里亚霉素   200    -21.6
  比较例1   200    30.6
  实施例1   200    57.2
  比较例2   200    32.1
  实施例2   200    54.3
试验例8.毒性试验
方法(1)
对ICR小鼠(平均体重25±5g)和Sprague-Dawley大鼠(235±10g，Jung-Ang Lab Animal Inc.)使用实施例1的提取物进行急性毒性试验。对4组含有10只大鼠或小鼠的试验组分别口服或腹腔注射给予250mg/kg，500mg/kg，1000mg/kg和5000mg/kg的测试样品或溶剂(0.2ml i.p.)并观察2周。
方法(2)
对ICR小鼠和Sprague-Dawley大鼠使用实施例2的提取物进行急性毒性试验。对4组含有10只大鼠或小鼠的试验组分别腹腔注射给予25mg/kg，250mg/kg，500mg/kg和725mg/kg的测试样品或溶剂(0.2mli.p.)并观察24小时。
结果
在任何的组或者性别中，对于死亡率，临床症状，体重变化以及总重的结果部没有和处理相关的效应。这些结果表明本发明的提取物是有效并安全的。
在下文中，将对制备方法和各种赋形剂进行描述，但是本发明并不局限于它们。典型的制剂实例如下所述。
粉剂制备
实施例1的干燥粉末50mg
乳糖100mg
滑石10mg
通过混合上述组分并装入密封包中制备粉末制剂。
片剂制备
实施例1的干燥粉末50mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
通过混合上述组分并压片制备片剂。
胶囊制备
实施例1的干燥粉末50mg
乳糖100mg
玉米淀粉100mg
硬脂酸镁2mg
通过混合上述组分并用常规的胶制备方法装入胶质胶囊中制备胶囊。
注射剂制备
实施例2的干燥粉末50mg
注射用蒸馏水适量
pH调节剂适量
通过溶解活性组分，控制pH到大约7.5并将所有组分加入到2ml安瓿中，使用常规的注射剂制备方法灭菌而制备注射剂。
液体制备
实施例2的干燥粉末0.1～80g
蔗糖 5～10g
柠檬酸 0.05～0.3％
焦糖 0.005～0.02％
维生素C 0.1～1％
蒸馏水79～94％
CO20.5～0.82％
通过溶解活性组分，装入所有组分，并用常规液体制剂制备方法灭菌制备液体制剂。
显而易见，本发明如此的描述，可以以多种方式变化。这些变化不被认为背离本发明的精神和范围，并且这些对于本领域技术人员显见的改变包括在本发明权利要求的范围内。
产业利用性
正如本发明所描述，根据发明的方法制备的野山参纯化提取物具有抗癌活性效力，例如抑制癌细胞黏附，抑制癌细胞转移和免疫刺激效应，因此，其可以作为治疗药物被用于治疗和预防各种癌症疾病。

Claims (17)

1、一种从野山参中制备纯化提取物的方法，所述方法由下述步骤组成：
将野山参材料用提取溶剂反复进行蒸馏提取；冷冻蒸馏制得的提取物以获得冷冻的纯化提取物；溶化提取物并过滤以获得纯化的提取物。
2、根据权利要求1的方法，所述提取溶剂选自水，C1-C4低级醇或者它们的混合物。
3、根据权利要求2的方法，所述提取溶剂为水。
4、根据权利要求1的方法，所述野山参包括栽培参和天然生长的野山参。
5、一种用于从野山参中制备纯化提取物的方法，所述方法由下述步骤组成：步骤1：将野山参材料用提取溶剂进行第一次蒸馏提取以获得第一蒸馏物；步骤2：将第一蒸馏物用提取溶剂进行第二次蒸馏提取以获得第二蒸馏物；步骤3：冷冻第二蒸馏物以获得冷冻的纯化提取物；步骤4：溶化提取物并过滤以获得过滤提取物；步骤5：使用双层蒸锅加热过滤物并再次冷冻；步骤6：溶化提取物并灭菌以获得本发明的纯化提取物。
6、根据权利要求5的方法，所述步骤1由下述步骤组成：将水以每升水含有1.0～3.0kg的材料的比率加入到所述材料；独自置于室温1～4小时；随后，在低于100℃使用蒸馏装置加热6～24小时，以获得第一蒸馏物。
7、根据权利要求5的方法，所述步骤2由下述步骤组成：将第一蒸馏物加入到装备有蒸馏装置的含有沸石的烧瓶中；100℃逐渐加热7～24小时，直至浓缩物的体积减小到70～90(v/v)％的程度以获得第二蒸馏物。
8、根据权利要求5的方法，所述步骤3由下述步骤组成：将第二蒸馏物在-5～-15℃进行冷冻直到未冷冻部分的体积减小到小于总体积5％的程度；移出未冷冻部分；溶化余下蒸馏物；重复冷冻和移除未冷冻部分的过程3～6次，以获得本发明的冷冻纯化提取物。
9、根据权利要求5的方法，所述步骤4由下述步骤组成：将步骤3冷冻的纯化提取物于室温溶化；和随后使用孔径为0.1～0.6μm的滤纸过滤以获得滤液。
10、根据权利要求5的方法，所述步骤4由下述步骤组成：用双层蒸锅在100℃对上述步骤制备的滤液加热20～40分钟；和再冷冻以获得冷冻的纯化提取物。
11、一种药物组合物，所述组合物含有有效量的根据权利要求1所述方法制备的野山参纯化提取物作为活性成分，通过其抗癌活性治疗并预防癌症疾病。
12、根据权利要求11的药物组合物，其中所述组合物包括口服剂量形式，例如粉末，片剂，胶囊，软胶囊，液体药，糖浆，酏剂，香粉，小颗粒或气溶胶。
13、根据权利要求11的药物组合物，其中所述组合物包括局部用药制剂，例如霜，软膏，乳液，凝胶，油膏，塞片，喷雾液，气溶胶，以及注射制剂，例如针灸注射制剂。
14、根据权利要求13的药物组合物，其中所述组合物通过口服给药，直肠给药或者通过静脉，肌肉，皮下，皮内，鞘内，硬脑膜外，或者脑室内注射或者在适宜针灸的部位进行针灸注射。
15、根据权利要求14的药物组合物，其中所述组合物通过在适宜针灸的部位进行针灸注射给药。
16、根据权利要求1的方法制备的野山参纯化提取物通过对人类或哺乳动物的抗癌活性在制备用于治疗和预防癌症疾病的药物上的应用。
17、一种利用对人类或哺乳动物具有抗癌活性治疗或者预防癌症疾病的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物或人类有效量的根据权利要求1制备的野山参提取物，以及其药学上可接受的载体。
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