CN101095706A - 含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗肿瘤药物 - Google Patents
含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗肿瘤药物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101095706A CN101095706A CNA2007100439945A CN200710043994A CN101095706A CN 101095706 A CN101095706 A CN 101095706A CN A2007100439945 A CNA2007100439945 A CN A2007100439945A CN 200710043994 A CN200710043994 A CN 200710043994A CN 101095706 A CN101095706 A CN 101095706A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ilex cornuta
- cornuta lindl
- extract
- water extract
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
一种以枸骨水提取物或枸骨醇提取物作为有效成分的抗肿瘤药物，可制成口服液及注射液。药理试验效果证明：枸骨水提取物或枸骨醇提取物对29种肿瘤细胞株的细胞毒性试验结果显示有广谱的抗肿瘤作用；枸骨水提取物能抑制肿瘤细胞生长停留在G1期，并具有极强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力；在人肿瘤移植裸鼠模型试验中，枸骨水提取物显示出对人前列腺癌LnCAP、人肺癌细胞NCI-H23、人结肠癌细胞HCT-116和人子宫内瘤细胞MES-SA有强烈的抑制肿瘤生长的作用，同时未有明显的副作用；对小鼠的急性毒理试验也显示无毒性。因此枸骨水提取物或枸骨醇提取物是具有很大开发前景的广谱抗肿瘤新药。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物，具体是关于一种含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗肿瘤药物。
背景技术
枸骨，是为常绿灌木或小乔木，生于山坡、谷地、溪边杂木林及灌丛中，分布于长江中下游。 学名：llex comuta Lindl，英文名：Horny Holly；Chinese Holy Leaf，科名：冬青科Aquifoliaceae，别名：鸟不宿，功劳叶、苦丁茶、八角刺，猫儿刺，枸骨刺，八角茶，老鼠刺，老虎刺，狗青竻，羊角刺。
从枸骨中分离得到的化合物分别为枸骨甙1(坡摸酸3-β-O-α-L-吡喃阿拉伯糖甙)，枸骨甙2(3-β-O-D-吡喃葡萄糖基坡摸酸-β-28-O-D-吡喃葡萄糖酯)，枸骨甙3(3-β-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-α-L-吡喃葡萄糖基坡摸酸-β-28-O-D-吡喃葡萄糖酯的类似物)，枸骨甙4(3-β-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-α-L-吡喃葡萄糖基坡摸酸-β-28-O-D-吡喃葡萄糖酯)，枸骨甙5(坡摸酸3-β-O-α-L-2′-乙酰氧基吡喃阿拉伯糖基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯)，枸骨甙6(3-β-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-α-L-4-乙酰氧基吡喃阿拉伯糖基坡摸酸-β-28-O-D-吡喃葡萄糖酯)；枸骨甙7(3-β-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯)，胡萝卜甙，4-二羟基苯甲酸，4-二羟基桂皮酸，长链脂肪酸或醇5个，羽扇豆醇，11-酮基-α-香树脂醇棕榈酸酯，α-香树脂醇棕榈酸酯，3，28-乌索酸二醇，熊果酸，30-醛基羽扇豆醇，30-酮基降羽扇豆醇，链状倍半萜，甾醇β-谷甾醇，正二十二烷酸，正二十六烷酸，七叶内酯，槲皮素，异鼠李素，金丝桃苷，3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖-28-O-6′-O-甲基葡萄糖坡摸醇酸苷，23-羟基乌索酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖(1→2)β-D-葡萄糖醛酸-28-O-β-D-葡萄糖苷，6、7-二甲氧基香豆素，咖啡碱，皂甙，鞣质和苦味质(李维林等，植物资源与环境学报，2003年02期，45-57；吴弢等，中国药学杂志，2005年，19期，67-72)。
文献报道整个枸骨植物是堕胎药、驱风剂，避孕药、退热药和补药；能治疗关节炎，肺结核，淋巴结核和腰痛；叶能补肝肾，养气血，祛风湿，用于肺痨咳嗽、劳伤失血、腰膝痿弱、风湿痹痛、跌打损伤，肺结核潮热和咯血；枸骨茎是滋补药；果实常用于白带过多和慢性腹泻；根常用治风湿痛和黄疽肝炎(阎玉凝等，中国药学杂志，2000年z1期，25-38；王亚娜等，中草药，1997，28(Suppl.)：117；李维林等，中药材，2003，26(8)：595-598)；枸骨叶脂溶性化学成分具有抗动脉粥样硬化作用(吴弢等，中国药学杂志，2005年，19期，67-72)。枸骨的水及醇浸液或其他有关制剂给小鼠灌胃，皆可使之减少怀孕，抑孕率为80～100％；阴道涂片法证明，枸骨能使小鼠正常性周期发生改变，主要是使休息期延长，其次是超越或缩短动情期；枸骨叶的醇提物(绿色粉状物，有甙的反应)有避孕作用，组织切片未发现子宫及卵巢的病理变化，故认为是生理性避孕(魏成武，中药通报，1988，13(5)：48)。枸骨叶的醇提物I、乙酸乙酯萃取物II、正丁醇萃取物III具有明显抑制ConA刺激T淋巴细胞增殖反应的作用；枸骨叶醇提物I与乙酸乙酯萃取物II能明显抑制ConA刺激T淋巴细胞CD69分子的表达；枸骨叶水提物无免疫抑制作用；结论是枸骨叶脂溶性萃取物具有较强抑制T淋巴细胞活化、增殖的化学成分(林晨等，暨南大学学报；自然科学版，2006 Vol.27 No.2 P.199-203)。枸骨叶不同溶剂提取物的体外抑菌活性结果表明枸骨叶中的3种溶剂组分均显示一定的抑菌效果，其乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的抑菌效果最为显著；醇提取物和正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌也显示较好的抑菌效果；枸骨叶脂溶剂萃取物成分对病原性念珠菌的生长有一定的抑菌活性(邢莹莹等，暨南大学学报：自然科学版，2004，25(1)：119-121；张晶等，中国病理生理杂志，2003，19(11)；1562；林晨等，中国人兽共患病杂志，2005年09期，186)。
本发明人在研究中发现，枸骨水提取物或枸骨醇提取物具有抗肿瘤的活性，能开发成新的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明提供一种含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗肿瘤药物，它是以枸骨水提取物或枸骨醇提取物作为有效成分的抗肿瘤药物。抗肿瘤药物中含有抗肿瘤有效量的枸骨水提取物或枸骨醇提取物及可药用载体和/或赋形剂。可药用载体和/或赋形剂可以是PBS、生理盐水、玉米油、5-30％Captisol等。
本发明人通过试验证明枸骨水提取物或枸骨醇提取物能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡。在人肿瘤异种移植模型研究中，枸骨水提取物或醇提取物被证明是一种有效的抗肿瘤剂，能强烈抑制人子宫肉瘤，前列腺癌，肺癌和结肠癌细胞在体内生长。枸骨水提取物或枸骨醇提取物具有被开发成为新的广谱抗肿瘤药物的巨大潜力。
枸骨水提取物或枸骨醇提取物的制备方法(参见秦文娟等，中草药，1988，19(10)：2)。
药物原材料采集枸骨全株植物，包括有枸骨叶，枸骨茎和枸骨根。将枸骨全株植物洗净，晒干，切片和粉碎，粉碎后达100-500目。然后取粉碎的枸骨全株植物500克，分别采用水提和醇提方法对所述枸骨生药进行加工处理：
枸骨水提取物的制备：用水提法，将粉碎的枸骨生药500克，在(5-20升)蒸馏水中浸泡过夜，第二天将该浸泡的枸骨液煮沸提取5小时，然后用多层(4-12层)纱布过滤水提液，并将水提液加热浓缩到50-200毫升体积后，离心(10000g)去渣，上清液通过0.2微米孔径的滤膜过滤，然后将滤液经低温干燥(-140℃)或热喷雾(150℃-190℃)干燥，即得水提取物。枸骨水提取物为绿色粉末，在水中溶解度为500mg/ml。
枸骨醇提取物的制备：用醇提法，同样取上述粉碎好的枸骨生药500克浸泡在5升(2-10升)95％医用乙醇(酒精)中，浸泡(3小时-5天)后，将乙醇浸泡液用多层(4-12层)纱布过滤，滤液经减压蒸馏回收乙醇，当乙醇提取物浓缩到100-200毫升体积后，离心(10000g)，上清液通过0.2微米孔径滤膜过滤，然后将滤液低温干燥(-140℃)即得醇提取物。枸骨醇提取物为深绿色粉末，在乙醇中溶解度为80mg/ml。
枸骨水提取物或枸骨醇提取物的药理试验
1.体外试验
(1)使用人肿瘤细胞系进行细胞毒性试验
在含有不同浓度枸骨水提取物或枸骨醇提取物的正常培养基中培养29种肿瘤细胞株，3天后应用MTT法测定细胞存活情况。结果(表1)显示大多数人体肿瘤细胞对枸骨水提取物或枸骨醇提取物敏感。有些肿瘤细胞对枸骨水提取物或枸骨醇提取物的EC50低于0.1mg/ml。但是，正常人乳腺上皮细胞(MCF10a)对枸骨水提取物或枸骨醇提取物不敏感，即便枸骨水提取物或枸骨醇提取物的浓度高达10mg/ml，这些细胞仍然生长良好。体外试验证明枸骨水提取物或枸骨醇提取物能广泛抑制人体肿瘤细胞生长，但对正常细胞株没有作用。
表1 枸骨水提取物或枸骨醇提取物体外抑制人肿瘤细胞生长
| 人肿瘤细胞株 | 细胞类型 | 枸骨水提取物半数致死量(mg/ml) | 枸骨醇提取物半数致死量(mg/ml) |
| LnCAP | 前列腺 | 0.03 | 0.00375 |
| D145 | 前列腺 | 0.065 | 0.0081 |
| PC3 | 前列腺 | 0.069 | 0.0086 |
| HCT-116 | 结肠 | 0.098 | 0.0123 |
| Widr | 结肠 | 0.059 | 0.0074 |
| HT29 | 结肠 | 0.063 | 0.0079 |
| LoVo | 结肠 | 0.082 | 0.0103 |
| CCL-225 | 结肠 | 0.075 | 0.0094 |
| CCL-247 | 结肠 | 0.070 | 0.0088 |
| NCI-H23 | 肺 | 0.093 | 0.013 |
| A549 | 肺 | 0.090 | 0.012 |
| MDA-MB-231 | 乳腺 | 0.089 | 0.012 |
| MDA-MB-435 | 乳腺 | 0.092 | 0.0099 |
| AU-565 | 乳腺 | 0.030 | 0.0039 |
| BT-549 | 乳腺 | 0.039 | 0.0042 |
| MCF-7 | 乳腺 | 0.095 | 0.012 |
| Caki-1 | 肾 | 0.063 | 0.0069 |
| ACHN | 肾 | 0.086 | 0.0091 |
| 786-O | 肾 | 0.093 | 0.0095 |
| SN12C | 肾 | 0.045 | 0.0045 |
| SKOV3 | 卵巢 | 0.078 | 0.0081 |
| IGROV1 | 卵巢 | 0.083 | 0.0093 |
| Mid PaCa-2 | 胰腺 | 0.05 | 0.0054 |
| MES-SA | 子宫肉瘤 | 0.009 | 0.0009 |
| SK-MEL-5 | 皮肤细胞 | 0.075 | 0.0078 |
| Raji | 淋巴瘤 | 0.095 | 0.0099 |
| MCF-10a | 正常细胞 | ＞10 | ＞10 |
| SGC-7901 | 胃 | 0.068 | 0.0073 |
| EC109 | 食管 | 0.079 | 0.0081 |
| CNE-2Z | 鼻咽 | 0.082 | 0.0085 |
(2)枸骨水提取物抑制肿瘤细胞生长周期试验：
为了研究枸骨水提取物是否具有抑制肿瘤生长周期作用，对枸骨水提取物抑制人肺癌细胞A549生长周期作用进行试验。分别加入浓度为0mg/ml，0.033mg/ml或0.1mg/ml枸骨水提取物。试验结果如图1-图3所示，枸骨水提取物能抑制肿瘤细胞生长，并将肿瘤细胞生长停留在G1期。
(3)枸骨水提取物诱导肿瘤细胞凋亡试验
为了研究枸骨水提取物是否具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，采用Annexin V(AV)和7-ADD联合染色法检测枸骨水提取物处理后肿瘤细胞出现的细胞凋亡现象，Annexin V是一种磷脂结合蛋白与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期的细胞的胞膜结合，因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。本发明对枸骨水提取物诱导人肺癌细胞A459细胞凋亡进行试验，分别加入浓度为0毫克/毫升，0.033毫克/毫升，0.1毫克/毫升枸骨水提取物样品，经培养，消化，反应后，在细胞流动仪(FACS)上分析。对照组为未经处理的细胞对照，排除自发凋亡；不加染色剂的对照；只加AV的对照；只加7-ADD的对照。结果判断：正常细胞Annexin V和7-AAD均低染，凋亡细胞Annexin V高染，7-AAD低染，坏死细胞Annexin V和7-AAD均高染。实验结果(图4)显示枸骨水提取物具有极强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
(4)枸骨水提取物含有抗癌活性成分的分析试验
取枸骨水提取物样品上柱葡聚糖凝胶Sephadex LH-20色谱分离柱，共收集16个分离组份(这16个分离组分都是含有不同化合物的混合物)，减压浓缩干燥后，各自用1毫升生理盐水溶解并进行检测是否含有抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的活性成分，结果发现，分离组份3，分离组份7，分离组份9，分离组份11和分离组份13都具有抑制肿瘤细胞的作用，而且还发现这些组份混合在一起具有强大的协同作用。这一结果说明枸骨水提取物含有抗肿瘤活性成分，是一个至少由5种以上的有机化合物所组成的混合物。
(5)枸骨醇提取物含有抗癌活性成分的分析试验
取枸骨醇提取物样品减压浓缩成胶状物，然后逐次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇和乙醇进行抽提，各有机溶剂抽提液(这些抽提液样本也都是含有多种化合物的混合物)减压，浓缩和干燥，并各自用0.5毫升二甲基亚砜溶解，然后检测是否含有抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的活性成分，结果石油醚和乙酸乙酯抽提物都含有抗肿瘤的有效成份，这一结果说明枸骨醇提取物含有抗肿瘤活性成分，是一个至少由2种以上的有机化合物所组成的混合物。
2.应用人肿瘤移植裸鼠模型进行枸骨水提取物的抗肿瘤有效性试验
在枸骨水提取物有效抑制多种肿瘤细胞体外增殖的基础上，应用人肿瘤移植裸鼠(皮下接种)评价枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液的抗肿瘤作用，受试的肿瘤细胞包括人前列腺癌细胞LnCAP，人肺癌细胞NCI-H23，人结肠癌细胞HCT-116和人子宫肉瘤细胞MES-SA。结果(图5-图8)显示，枸骨水提取物注射液强烈抑制这四种肿瘤生长，其TGI值分别为25.8％，37％，40.8％，和19.8％。同样也发现枸骨水提取物口服液能非常有效地抑制这四种肿瘤生长，其TGI值分别为33.8％，48.4％，48.7％，和24.2％。同时未发现枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液具有明显的副作用，包括体重的变化。这些数据明显提示，枸骨水提取物和枸骨醇提取物是开发新的抗肿瘤药物很好的候选物。
3.枸骨水提取物给药后对小鼠的急性毒性试验
受试小鼠处死后，进行病理分析。结果显示，以单次剂量15g/Kg或多次剂量3g/kg(QD×15)灌胃给予枸骨水提取物口服液，或以单次剂量1.5g/kg或多次剂量0.3g/kg(QD×15)尾静脉注射给予枸骨水提取物注射液，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。
4.枸骨醇提取物给药后对小鼠的急性毒性试验
受试小鼠处死后进行病理分析。结果显示，以单次剂量1.5g/kg或多次剂量0.3g/kg(QD×15)给予枸骨醇提取物口服液或枸骨醇提取物注射液，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。
由以上药理试验的效果证明，枸骨水提取物或枸骨醇提取物对29种肿瘤细胞株的细胞毒性试验结果显示有广谱的抗肿瘤作用；枸骨水提取物能抑制肿瘤细胞生长，并将肿瘤细胞生长停留在G1期；枸骨水提取物具有极强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力；在人肿瘤移植裸鼠模型试验中，枸骨水提取物显示出对人前列腺癌细胞LnCAP、人肺癌细胞NCI-H23、人结肠癌细胞HCT-116和人子宫内瘤细胞MES-SA有强烈的抑制肿瘤生长的作用，同时未有明显的副作用；对小鼠的急性毒理试验也显示未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。因此枸骨水提取物或枸骨醇提取物是具有很大开发前景的广谱抗肿瘤新药，枸骨水提取物或枸骨醇提取物可作为抗肿瘤药物的原料药，优先作为抗恶性实体瘤药物的原料药，枸骨水提取物或枸骨醇提取物也可与可药用载体和/或赋形剂制成抗肿瘤药物。所述可药用载体和/或赋形剂例如PBS，生理盐水，玉米油，5-30％Captisol等。
枸骨水提取物或枸骨醇提取物在应用时，可采用常规方法，分别制成口服液或注射液：
枸骨水提取物口服液制备：取制得的枸骨水提取物样品，溶解于蒸馏水中，经0.2微米孔径滤膜过滤，浓缩成每毫升含300毫克干重枸骨根水提取物，灭菌，即为口服液。
枸骨水提取物注射液制备：取制得的枸骨水提取物样品，经多次反复90％酒精沉淀(酒精沉淀的目的是沉淀掉植物粘多糖化合物，植物多肽或植物蛋白，这些物质在配制注射液时都会造成受试动物发生变态反应)，其上清液经减压浓缩回收酒精，最后冷冻(-140℃)干燥，将干燥物溶解在生理盐水中，经0.2微米孔径滤膜过滤，浓缩成每毫升含30毫克干重枸骨水提取物，灭菌，即为注射液。
枸骨醇提取物口服液制备：取制得的枸骨醇提取物样品，用精制玉米油溶解，配制成每毫升精制玉米油含30毫克干重枸骨醇提取物，最后经高温(100℃)消毒30分钟后，即得枸骨醇提取物的口服液。
枸骨醇提取物注射液制备：取制得的枸骨醇提取物样品，溶解于15％Captisol中，经0.2微米孔径滤膜过滤，浓缩成每毫升15％Captisol含30毫克干重枸骨醇提取物，再灭菌消毒，即得枸骨醇提取物的注射液。
枸骨水提取物口服液有效剂量为每天15g干重枸骨水提取物/体表面积m2，连续三周，休息一周为一疗程。枸骨水提取物注射液一般静脉滴注有效剂量为每天1.5g干重枸骨水提取物/体表面积m2，连续三周，休息一周为一疗程。枸骨水提取物口服液或枸骨水提取物注射液每天总剂量一次于早餐后半小时服用或注射用，具体病例可由医师根据病情调整。
附图说明
图1是枸骨水提取物抑制人肺癌细胞A549生长并将肿瘤细胞生长停留在G1期(16小时)的示图。
图2是枸骨水提取物抑制人肺癌细胞A549生长并将肿瘤细胞生长停留在G1期(24小时)的示图。
图3是枸骨水提取物抑制人肺癌细胞A549生长并将肿瘤细胞生长停留在G1期(36小时)的示图。
图4是枸骨水提取物诱导人肺癌细胞A549细胞凋亡(18小时)的示图，
图中R2代表活细胞染色
R3代理凋亡细胞染色。
图5枸骨水提取物口服液组，枸骨水提取物注射液组或对照组治疗皮下接种的人前列腺癌(LnCAP)肿瘤细胞的肿瘤体积一移植后天数曲线图。
图6是枸骨水提取物口服液组，枸骨水提取物注射液组或对照组治疗皮下接种的人肺癌(NCI-H23)肿瘤细胞的肿瘤体积一移植后天数曲线图。
图7是枸骨水提取物口服液组，枸骨水提取物注射液组或对照组治疗皮下接种的人结肠癌(HCT-116)肿瘤细胞的肿瘤体积一移植后天数曲线图。
图8是枸骨水提取物口服液组，枸骨水提取物注射液组或对照组治疗皮下接种的人子宫内瘤(MES-SA)肿瘤细胞的肿瘤体积一移植后天数曲线图。
具体实施方式
实施例1枸骨水提取物的制备(参见秦文娟等，中草药，1988，19(10)：2)
药物原材料采集生长在广东省英德县的枸骨全株植物，包括有枸骨叶，枸骨茎和枸骨根。将枸骨全株植物洗净、晒干，切片和粉碎，粉碎后达300目。然后取粉碎的枸骨全株植物500克，浸泡在10升蒸馏水中过夜，第二天将该浸泡的枸骨液煮沸提取5小时，然后用10层纱布过滤水提液，并将水提液加热浓缩到100ml体积后，经10000g离心速度离心去渣。上清液通过0.2微米孔径的滤膜过滤，然后将滤液经低温干燥(-140℃)12小时或热喷雾法170℃干燥，即得绿色粉末枸骨水提取物15克。
实施例2枸骨醇提取物的制备(参见秦文娟等，中草药，1988，19(10)：2)
药材原材料的采集，洗净，晒干，切片和粉碎同实施例1，取粉碎的枸骨全株植物500克，浸泡在5升95％医用乙醇(酒精)中，浸泡2天后将乙醇浸泡液用10层纱布过滤，滤液经减压蒸馏回收乙醇，当乙醇提取物浓缩到150毫升体积后，10000g离心，上清液通过0.2微米孔径滤膜过滤，然后将滤液低温干燥(-140℃)，即得深绿色粉末的枸骨醇提取物2克。
实施例3枸骨水提取物口服液的制备
取实施例1制得的枸骨水提取物样品60克，溶解于300ml蒸馏水中，经0.2微米孔径滤膜过滤，浓缩成每毫升含300mg干重的枸骨水提取物，灭菌，共得200毫升的口服液，分装入瓶。
实施例4枸骨水提取物注射液的制备
取实施例1制得的枸骨水提取物样品60克，经3次(每次1000ml)90％酒精沉淀，其上清液合并，经减压浓缩回收酒精，最后冷冻(-140℃)干燥，将干燥物溶解在30ml生理盐水中，经0.2微米孔径滤膜过滤，浓缩成每毫升生理盐水含30毫克干重枸骨水提取物，灭菌，共得20毫升注射液，分装入安瓿瓶。
实施例5枸骨醇提取物口服液的制备
取实施例2制得的枸骨醇提取物样品30克，用950毫升精制玉米油溶解，配制成每毫升精制玉米油含30毫克干重物枸骨醇提取物，经高温100℃消毒30分钟后，共得1000毫升的口服液，分装入瓶。
实施例6枸骨醇提取物注射液的制备
取实施例2制得的枸骨醇提取物样品30克，用950毫升15％Captisol溶解，经0.2微米孔径滤膜过滤，浓缩成每毫升15％Captisol含30毫克干重枸骨醇提取物，灭菌消毒，共得1000毫升注射液，分装入安瓿瓶。
实施例7细胞毒性试验(参见Carmichael J et al.，Cancer Research，1987，47：943-946)
使用人肿瘤细胞系进行细胞毒性分析。人肿瘤细胞系购自ATCC(美国细胞菌种库)和NCI(美国国立癌症研究所)，用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养液，在含5％CO2的37℃孵箱中培养。用胰蛋白酶消化汇合的细胞，经培养液洗涤后计数。向96孔培养板的每孔中加入3000～6000个细胞，孵育16小时或24小时。然后向孔内加入不同浓度的枸骨水提取物或枸骨醇提取物。继续培养72小时后，对药物处理组细胞和对照组细胞进行MTT试验，结果见表1。
实施例8枸骨水提取物抑制肿瘤细胞生长周期试验(参见Basu S，etal.，Glycoconj J.2004；20(9)：563-77)
首先在6孔细胞培养板每孔种植2×105人体肺癌细胞A549，24小时后，分别加入0mg/ml，0.033mg/ml或0.1mg/ml枸骨水提取物样品，并继续在37℃，5％CO2条件下培养16小时，24小时或36小时，在终止每组培养前4小时，加入BrdU，BrdU最终浓度为20uM，当细胞终止培养后，及时将细胞用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次，然后经胰酶消化收集细胞，再次用PBS洗涤一次，之后用冷却的70％乙醇固定细胞一个小时。固定好的细胞离心收集并悬浮在2N盐酸，在室温温育30分钟，过后这些细胞用PBS洗涤3次，处理好的细胞与1微克抗BrdU抗体反应30分钟(美国肿瘤基因公司购买)，然后用PBS洗涤这些细胞2次，再与2微克异硫氰酸荧光标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体(购买于美国肿瘤基因公司)在室温反应30分钟，二抗反应后用PBS洗涤细胞2次，过后这些细胞与4微克核苷核酸酶A(购买美罗斯应用科技公司)在室温温育30分钟，最后每管样品加入碘化丙啶，最终浓度为每毫升含20微克碘化丙啶，并在室温条件下反应30分钟，这些处理好的细胞马上用美国Becton Dickinson生产的FACscan细胞流动分析仪进行测定分析，其结果量化分析采用美国多功能软件大厦生产的WINLIST软件程序。结果见图1-图3。
实施例9枸骨水提取物诱导肿瘤细胞凋亡试验(参见Wick W，et al.，JPharmacol Exp Ther.1999 Jun；289(3)：1306-12)
采用Annexin V(AV)和7-ADD联合染色法检测枸骨水提取物处理后肿瘤细胞出现的细胞凋亡现象，Annexin V是一种磷脂结合蛋白与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期的细胞的胞膜结合，因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。在进行凋亡实验时，首先在100厘米直径的培养皿中种植1×106人体肺癌A549细胞，24小时后分别加入浓度为0毫克/毫升，0.033毫克/毫升，0.1毫克/毫升枸骨水提取物样品，并继续在37℃，5％CO2条件下培养18小时，然后终止细胞培养，并用PBS洗涤细胞2次，经胰酶消化，离心收集细胞，用冷却的PBS再次洗涤细胞之后用4℃的结合缓冲液(含14mMNaCl和25mM CaCl2的0.01mM，PH7.0，Hepe/NaOH缓冲液)将细胞配制成1×106/ml。取0.1ml细胞悬液置5ml培养管中，加入5微升的AV-FITC，再加5微升7-AAD。稍稍混悬细胞置暗处，室温(20℃-25℃)反应15分钟，加上0.4ml结合缓冲液，终止反应。立即在细胞流动仪(FACS)上分析。结果见图4。对照组为未经处理的细胞对照，排除自发凋亡；不加染色剂的对照；只加AV的对照；只加7-ADD的对照。
实施例10枸骨水提取物含有抗癌活性成分的分析试验(参见李维林等，植物资源与环境学报，2003年02期，45-57)
采用葡聚糖凝胶Sephadex-LH-20对枸骨水提取物根据各化合物分子量的大小进行分离纯化，然后对各分离组分进行抗肿瘤作用试验，本试验取1毫升枸骨水提取物(含有干重300毫克)上柱葡聚糖凝胶Sephadex-LH20色谱分离柱，上样后用甲醇洗脱共收集16个分离组份(这16个分离组份都是含有不同化合物的混合物)，减压浓缩干燥这些分离组份后，各分离组分用1毫升生理盐水溶解并进行前述抗肿瘤作用分析。结果发现，分离组份3，分离组份7，分离组份9，分离组份11和分离组份13都具有抑制肿瘤细胞的作用，而且还发现这些组份混合在一起具有强大的协同作用。这一结果说明枸骨水提取物含有抗肿瘤活性成分，是一个至少由5种以上的有机化合物所组成的混合物。
实施例11枸骨醇提取物含有抗癌活性成分的分析试验(参见吴弢等，中国药学杂志，2005年19期，67-72)
取1毫升枸骨醇提取物样品(每毫升含15毫克干重枸骨醇提取物)减压浓缩成胶状物，然后逐次用4毫升石油醚，4毫升乙酸乙酯，4毫升正丁醇和4毫升乙醇进行抽提，各有机溶剂抽提液减压，浓缩和干燥，最后各自用0.5毫升二甲基亚砜溶解，然后进行肿瘤细胞毒性实验检测各有机溶剂抽提组分是否含有抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的活性成分。结果石油醚和乙酸乙酯抽提物都含有抗肿瘤的有效成份，这一结果说明枸骨醇提取物含有抗肿瘤活性成分，是一个至少由2种以上的有机化合物所组成的混合物。
实施例12枸骨水提取物给药后对小鼠的急性毒性试验(参见GoldbergLE，et al.，Antibiotic Med Biotekhnol.32(12)：910-5)
枸骨水提取物口服液采用灌胃给药，而枸骨水提取物注射液采用尾静脉注射给药。取两组8周龄的BlabC小鼠，每组10只(5只雄性和5只雌性)，分别以单次剂量15g/kg或多次剂量3g/kg(QD×15)灌胃给予枸骨水提取物口服液，或分别以单次剂量1.5g/kg或多次剂量0.3g/kg(QD×15)尾静脉注射给予枸骨水提取物注射液(用无菌生理盐水配制)，然后分别观察1周和4周。每两天称体重。试验结束后，将受试小鼠处死，进行病理分析。结果显示，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。
实施例13枸骨醇提取物给药后对小鼠的急性毒性试验(参见GoldergLE，et al.，Antibiotic Med Biotekhnol 32(12)：910-5)
枸骨醇提取物口服液采用灌胃给药，而枸骨醇提取物注射液采用尾静脉注射给药。取两组8周龄的BlabC小鼠，每组10只(5只雄性和5只雌性)，分别以单次剂量1.5g/kg和多次剂量0.3g/kg(QD×15)灌胃给予枸骨醇提取物口服液(精制玉米油配制)或分别以单次剂量1.5g/kg和多次剂量0.3g/kg(QD×15)尾静脉注射给予枸骨醇提取物注射液(15％Captisol配制)，然后分别观察1周和4周。每两天称体重。试验结束后，将受试小鼠处死，进行病理分析。结果显示，以单次剂量1.5g/kg和多次剂量0.3g/kg(QD×15)给予枸骨醇提取物口服液或枸骨醇提取物注射液，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。
实施例14应用人肿瘤异种移植模型进行枸骨水提取物的抗肿瘤有效性试验
(1)建立人肿瘤移植裸鼠模型(参见Harrison SD Jr et al.，J Natl CancerInst，1991，83(20)：1509
T细胞缺陷裸小鼠(nu/nu)，雄性，6周龄，购自Charles River实验室，按照大学动物饲养和使用委员会指南饲养于无病原体环境。将5×106个LnCAP、NCI-H23、HCT-116，MES-SA细胞分别悬浮于0.2mlHBSS(Hanvs’平衡盐溶液)或基质胶(50∶50，v/v)中，皮下接种到小鼠的侧腹部区域。当肿瘤平均直径达7～8mm时，选出肿瘤大小为100～200mm3的小鼠，分为给予生理盐水配制的枸骨水提取物口服液，枸骨水提取物注射液的处理组和只给予载体(生理盐水)的对照组。为保证枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液处理组和对照组在处理开始时肿瘤体积分布大致相等，将小鼠分成三类：肿瘤体积小(长度＜4mm)，肿瘤体积中等(4～8mm)，肿瘤体积大(＞8mm)。对照组，枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液处理组中来自相同类别的小鼠数目大致相等。
(2)裸小鼠肿瘤移植模型的给药(枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液)：
在口服给药和尾静脉注射给药试验中，用生理盐水配制枸骨水提取物口服液按3g/kg和枸骨水提取物注射液按0.3g/kg给药。每日给予单次剂量200ml药液(含30mg枸骨水提取物口服液和含3mg枸水提取物注射液)，每周5次，持续3周；对照组按同样方法给予载体(生理盐水)。小鼠单独饲养，允许自由采食。
(3)抗肿瘤效应评价
每3～4天沿两个垂直方向对肿瘤进行测量。肿瘤体积根据以下公式计算：
V＝(a2×b)/2
其中a是肿瘤宽度(较小直径)，b是长度(较大直径)。每个肿瘤的相对肿瘤体积(RTV)定义为给定时间点的肿瘤体积与处理开始时肿瘤体积的比值。每个处理组均计算平均值。根据以下公式计算肿瘤生长抑制值(TGI)，判断抗肿瘤活性：
TGI(％)＝T/C×100
其中T是处理组试验终点(4周)RTV的平均值，C是对照组试验终点RTV的平均值。采用美国国立癌症研究所的最小抗肿瘤活性标准(T/C≤42％)。试验结束时，将肿瘤切除并在甲醛中固定，进行组织学观察。试验结果见图5-图8。
Claims (3)
1.一种抗肿瘤药物，其特征在于它是以枸骨水提取物或枸骨醇提取物作为有效成分的抗肿瘤药物。
2.如权利要求1所述抗肿瘤药物，其特征在于所述抗肿瘤药物中含有抗肿瘤有效量的枸骨水提取物或枸骨醇提取物及可药用载体和/或赋形剂。
3.如权利要求1或2所述的抗肿瘤药物，其特征在于所述抗肿瘤药物制成枸骨水提取物口服液或注射液，或枸骨醇提取物口服液或注射液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100439945A CN101095706A (zh) | 2007-07-19 | 2007-07-19 | 含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗肿瘤药物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100439945A CN101095706A (zh) | 2007-07-19 | 2007-07-19 | 含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗肿瘤药物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101095706A true CN101095706A (zh) | 2008-01-02 |
Family
ID=39009926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2007100439945A Pending CN101095706A (zh) | 2007-07-19 | 2007-07-19 | 含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗肿瘤药物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101095706A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102188462A (zh) * | 2011-04-25 | 2011-09-21 | 江西本草天工科技有限责任公司 | 枸骨根茎提取物制备方法及制剂以及在制备心血管药物中的应用 |
| CN103800399A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-05-21 | 广东省中医药工程技术研究院 | 枸骨叶配方颗粒及其制备方法和检测方法 |
| US20140234452A1 (en) * | 2010-08-05 | 2014-08-21 | Alpinia Laudanum Institute Of Phytopharmaceutical Sciences Ag | Composition Comprising Retinol, a Precursor or a Reaction Product of it and a Plant Extract from at least one Chamomilla Plant for the Treatment of Cancer |
-
2007
- 2007-07-19 CN CNA2007100439945A patent/CN101095706A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140234452A1 (en) * | 2010-08-05 | 2014-08-21 | Alpinia Laudanum Institute Of Phytopharmaceutical Sciences Ag | Composition Comprising Retinol, a Precursor or a Reaction Product of it and a Plant Extract from at least one Chamomilla Plant for the Treatment of Cancer |
| US10028989B2 (en) | 2010-08-05 | 2018-07-24 | Alpinia Laudanum Institute Of Phytopharmaceutical Sciences Ag | Composition comprising Retinol, a precursor or a reaction product of it and a plant extract from at least one Chamomilla plant for the treatment of cancer |
| US10369180B2 (en) | 2010-08-05 | 2019-08-06 | Alpinia Laudanum Institute Of Phytopharmaceutical Sciences Ag | Composition comprising retinol, a precursor or a reaction product of it and a plant extract from at least one Chamomilla plant for the treatment of cancer |
| CN102188462A (zh) * | 2011-04-25 | 2011-09-21 | 江西本草天工科技有限责任公司 | 枸骨根茎提取物制备方法及制剂以及在制备心血管药物中的应用 |
| CN103800399A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-05-21 | 广东省中医药工程技术研究院 | 枸骨叶配方颗粒及其制备方法和检测方法 |
| CN103800399B (zh) * | 2014-01-17 | 2016-08-17 | 广东省中医药工程技术研究院 | 枸骨叶配方颗粒及其制备方法和检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pandey et al. | Saussurea costus: Botanical, chemical and pharmacological review of an ayurvedic medicinal plant | |
| CN101254212B (zh) | 美洲大蠊提取物有效部位在制备治疗生殖器疱疹药物中的应用 | |
| CN103127215B (zh) | 具有抗关节炎活性的到手香萃取物 | |
| Rohela et al. | Phytochemical screening and antimicrobial activity of leaf, stem, root and their callus extracts in Rauwolfia tetraphylla | |
| Russo | Headache treatments by native peoples of the Ecuadorian Amazon: a preliminary cross-disciplinary assessment | |
| CN102186485B (zh) | 含有络石藤干燥提取物的乙酸乙酯级分作为有效成分的炎症性疾病预防及治疗用药物组合物与所述级分的制备方法 | |
| Noster et al. | In vitro antimalarial activity of Coutarea latiflora and Exostema caribaeum extracts on Plasmodium falciparum | |
| CN103479963A (zh) | 一种治疗类风湿关节炎的中药胶囊及其制备方法 | |
| Nagarkar et al. | Comparative evaluation of anti-inflammatory potential of medicinally important plants | |
| CN102526573A (zh) | 一种治疗儿童感冒的药物 | |
| EP2260855A1 (en) | Composition containing aqueous extract of ashwaganda leaves as the active ingredient and method of producing the same | |
| CN101095706A (zh) | 含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗肿瘤药物 | |
| CN103830301A (zh) | 一种具有益肝作用的菊花及其应用 | |
| KR0160108B1 (ko) | 조각자나무로부터 추출한 생약 성분으로 된 항암제 | |
| CN101637550B (zh) | 一种蒲葵子多糖提取物及其制备方法与用途 | |
| CN104474021A (zh) | 治疗表热的中药组合物及其制备方法 | |
| CN100546593C (zh) | 一种从野山参中制备有抗癌活性的纯化提取物的方法及含有其的组合物 | |
| CN105079011A (zh) | 一种具有抗肿瘤作用的药物的制备和应用 | |
| CN102697800B (zh) | 繁缕多糖组合物及其在制备抗病毒药物中的应用 | |
| CN106309758A (zh) | 一种抗胃肠癌的药物组合物 | |
| KR20190119020A (ko) | 지칭개 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물 | |
| CN100427099C (zh) | 能够有效治疗脑癌的胡桃楸多糖制剂及其制备方法 | |
| CN101269175B (zh) | 痔舒适洗液的检测方法 | |
| CN101456886B (zh) | 瑞香樱草糖-芫花黄素和瑞香属植物的用途 | |
| CN106572975B (zh) | 基于anthostema senegalense制备的组合物在制备治疗艾滋病的药物中的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080102 |