CN101637550B - 一种蒲葵子多糖提取物及其制备方法与用途 - Google Patents
一种蒲葵子多糖提取物及其制备方法与用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种蒲葵子多糖提取物及其制备方法与用途。该方法将蒲葵子脱脂后的药渣，水煎提取，提取液经活性炭脱色，过滤浓缩后醇沉，经离心得沉淀，沉淀经冷冻干燥得到蒲葵子多糖粗品；蒲葵子多糖粗品经除蛋白、除单糖和寡糖、凝胶柱纯化得到蒲葵子多糖精品。该多糖提取物中多糖含量在50％以上，且得到的蒲葵子多糖精品通过药剂学上的方法，可制成各种剂型。本发明提供的蒲葵子多糖提取物经抗肿瘤生物活性的筛选实验，证明其对抗肿瘤具有明显的疗效，可以在制备抗肿瘤药物或药物组合物中应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取物，具体涉及一种蒲葵子多糖提取物制备方法及其应用。
背景技术
蒲葵子，为植物棕榈科蒲葵Livistona chinensis R.Br.(别名：扇叶葵子、葵扇木子、蒲葵子)的种子。蒲葵为棕榈科葵属常绿乔木，一种野生或人工栽培的常绿乔木。它主产于福建、台湾、广东等地。秋冬果实成熟时采收、晒干，生用。《岭南采药录》、《广州植物志》、《广西中兽医药植》、《陆川本草》等均有收载，其性味平、淡，具有败毒抗癌、消瘀止血之功效。研究表明已知的化学成分：山萘酚-4′-甲醚、牡荆素、β-谷甾醇、豆甾醇、正二十六碳醇(刘志平等，广西植物，2007，27(1)：140-142)。薯蓣皂苷元、β-胡萝卜苷、小麦黄素、芹菜素(刘志平等，中草药，2007，38(2)：178-180)。陈屏等人首次分离得到以下五种化合物：表缅茄儿茶精、表儿茶素、正三十一烷醇、去氢紫堇碱(陈屏等，中草药，2007，38(5)：665-667)。
目前蒲葵子多糖的研究尚未见报道，存在物质基础不明确，质量不可控等弊端，缺乏多糖活性成分含量高，成分明确，药效活性显著的文献及专利报道。而且，市面上也未见关于蒲葵子的药物或药物组合物的出现。
发明内容
本发明旨在提供一种蒲葵子多糖提取物。
本发明的另一目的是提供一种上述蒲葵子多糖提取物的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种含有以上蒲葵子多糖提取物的药物或药物组合物。
本发明还提供了含有该蒲葵子多糖提取物的制剂及该提取物的用途。
本发明提供了如下技术方案：
本发明的蒲葵子多糖提取物中主要含有多糖。其中，以重量百分比计，多糖的含量为50％以上，优选的，多糖的含量为53％-55％。
本发明所述蒲葵子多糖的制备方法，包括以下步骤：(1)脱脂：将自然晾干的蒲葵子粉碎后，用8～15倍量有机溶剂浸泡后回流1～3次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；将蒲葵子提取后的药渣，100℃水煎提取，提取液过滤得滤液；(2)活性炭脱色：往上述滤液中加入0.5～2.0％的活性炭，40～80℃水浴保温15～50分钟，过滤并浓缩至总体积的1/10～1/3；(3)醇沉：向上述浓缩液中加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I；(4)除蛋白：取上述多糖提取物粗品I适量溶于水中，加入适量氯仿及正丁醇，搅拌后分层，上层重复操作4～8次后，加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II；(5)除单糖及寡糖：取上述多糖提取物粗品II适量溶于水中，用透析膜(截止分子量：8000-14000)透析2天后，取出透析袋内液体加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品III；(6)凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品III用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得蒲葵子多糖精品。所述步骤(1)中的有机溶剂为石油醚，乙酸乙酯，乙醇或高浓度乙醇水溶液；所述步骤(1)中水煎提取加水量为4-10倍量，优选的为8-10倍量；所述步骤(3)-(6)中，加入乙醇后乙醇含量为60％-85％，优选的乙醇含量为70％-85％；所述步骤(3)-(6)中，离心转速为3000～10000r/min 。
本发明所述蒲葵子多糖提取物可以作为活性成分，加入药剂学上可以接受的辅料，按照药剂学上记载的制剂的制备方法制成制剂。
本发明所述蒲葵子多糖提取物还可以作为活性成分之一，加入药剂学上接受的辅料，按照药剂学上记载的制剂的制备方法制成制剂。
所述的制剂包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、散剂、口服剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩剂、微丸等。
本发明的蒲葵子多糖提取物及其制剂可在制备抗肿瘤药物中应用。
本发明具有的有益效果是：提取精制方法是一种工艺简单易行、提取率高、能规模化生产。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例一蒲葵子多糖提取物的制备
(1)脱脂：将自然晾干的蒲葵子粉碎后，用8倍量乙醇浸泡后回流2次，过滤，挥干乙醇得药渣；将蒲葵子提取后的药渣，加入10倍量水，100℃水煎提取3次，每次1小时，提取液过滤得滤液；(2)活性炭脱色：往上述滤液中加入0.5％的活性炭，40～80℃水浴保温20分钟，过滤并浓缩至总体积的1/5；(3)醇沉：向上述浓缩液中加入适量乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I；(4)除蛋白：取上述多糖提取物粗品I适量溶于水中，加入适量氯仿及正丁醇，搅拌后分层，上层重复操作5次后，加入适量乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II；(5)除单糖及寡糖：取上述多糖提取物粗品II适量溶于水中，用透析膜(截止分子量：8000-14000)透析2天后，取出透析袋内 液体加入适量乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品III；(6)凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品III用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得蒲葵子多糖精品。苯酚硫酸法测定多糖的含量为51％。
实施例二蒲葵子多糖提取物的制备
(1)脱脂：将自然晾干的蒲葵子粉碎后，用12倍量80％乙醇浸泡后回流2次，过滤，挥干乙醇得药渣；将蒲葵子提取后的药渣，加入8倍量水，100℃水煎提取3次，每次1小时，提取液过滤得滤液；(2)活性炭脱色：往上述滤液中加入1％的活性炭，40℃水浴保温20分钟，过滤并浓缩至总体积的1/3；(3)醇沉：向上述浓缩液中加入适量乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I；(4)除蛋白：取上述多糖提取物粗品I适量溶于水中，加入适量氯仿及正丁醇，搅拌后分层，上层重复操作8次后，加入适量乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II；(5)除单糖及寡糖：取上述多糖提取物粗品II适量溶于水中，用透析膜(截止分子量：8000-14000)透析2天后，取出透析袋内液体加入适量乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品III；(6)凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品III用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得蒲葵子多糖精品。苯酚硫酸法测定多糖的含量为53％。
实施例三蒲葵子多糖提取物的制备
(1)脱脂：将自然晾干的蒲葵子粉碎后，用8倍量80％乙醇(W/V)浸泡后回流3次，每次2小时，过滤，挥干乙醇得药渣；将蒲葵子提取后的药渣，加15倍量蒸馏水(W/V)，100℃水煎提取2小时，2次，四层纱布布氏漏斗过滤，收集滤液，合并，于60℃旋转蒸发浓缩至3000ml；(2)活性炭脱色：往上述滤液中加入1.0％的活性炭，60℃水浴保温30分钟，过滤并浓缩至总体积的1/3；(3)醇沉：向上述浓缩液中加入适量无水乙醇至乙醇含量为80％，，置冰箱中冷藏过夜，出现絮状沉淀，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I；(4)除蛋白：称取上述多糖提取物粗品I 4.0g，溶于400ml蒸馏水中，加入CHCl390ml，正丁醇16ml，电动搅拌30分钟，分液漏斗静置20分钟，分离弃去下层液，上层液重复脱蛋白操作7次。上层液加无水乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II；(5)除单糖及寡糖：取上述多糖提 取物粗品II适量溶于200ml蒸馏水中，用透析膜(截止分子量：8000-14000)透析，透析袋外用磁力搅拌子匀速搅拌，每2小时换水1次，透析2天。2天后，取出透析袋内液体加无水乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得灰白色沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品III；(6)凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品III用Deae sepharose FF凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇至乙醇含量为80％，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得蒲葵子多糖精品。苯酚硫酸法测定多糖的含量为55％。
实施例四：
抗肿瘤生物活性筛选试验：
将对数生长的肿瘤细胞(人肝癌细胞HepG-2、人白血病HL60、宫颈癌细胞Hela、人鼻咽癌细胞CNE-2、人乳腺癌细胞MCF-7)用0.25％的胰蛋白酶消化，然后用含10％(体积百分含量)小牛血清的RPMI1640培养基悬浮细胞，制成细胞悬液，并分别将各肿瘤稀释至1.0×105个/ml，再将其接种至96孔培养板中，每孔200ul，于37℃，5％CO2的培养箱内培养24h，然后倾去各孔培养液。
将实施例1制得的蒲葵子多糖提取物配成终浓度为50，100，200ug/ml，同时设实验组和空白对照组进行实验。将以上各组的培养板同时置于37℃，5％CO2的培养箱内培养2天。2天后向每孔加入50ul新鲜配制的1mg/ml四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液，并在37℃，5％CO2的条件下继续培养4h；小心弃上清，加入溶剂，充分溶解MTT还原产物；在酶标仪上测定各孔在波长492nm处的光密度值(OD值)，按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。抑制率(％)＝1-(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％。蒲葵子多糖提取物对人不同肿瘤细胞HepG-2、HL60、Hela、CNE-2、MCF-7的抑制作用的结果如表1所示。
表1蒲葵子多糖提取物对不同癌细胞株细胞生长的影响(X±s，n＝10)
与空白对照组比较，**P＜0.01
蒲葵子多糖提取物对多种肿瘤细胞的抑制作用实验结果表明(表1)，蒲葵子多糖提取物对人肝癌细胞HepG-2、人白血病HL60、宫颈癌细胞Hela、人鼻咽癌细胞CNE-2、人乳腺癌细胞MCF-7均有一定程度的抑制作用，且存在一定的量效关系。因此，蒲葵子多糖提取物可以用于制备肝癌、白血病、宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌的药物。
实施例五滴丸剂的制备
取蒲葵子多糖提取物0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6-8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。
实施例六冻干粉针剂的制备
取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤液低温干燥得降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉术。除上述降香油合羟丙基β-环糊精的包合物粉术外，再取蒲葵子多糖提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装300支，即得。
实施例七冻干粉针剂的制备
取蒲葵子多糖提取物0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。
Claims (6)
1.一种蒲葵子多糖提取物，其特征在于所述多糖提取物是以蒲葵子脱脂后的药渣作为起始原料提取的，其中多糖的含量为53％-55％，其制备方法包括以下步骤：(1)脱脂：将自然晾干的蒲葵子粉碎后，用8～15倍量有机溶剂浸泡后回流1～3次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；将蒲葵子提取后的药渣，100℃水煎提取，提取液过滤得滤液；(2)活性炭脱色：往上述滤液中加入0.5～2.0％的活性炭，40～80℃水浴保温15～50分钟，过滤并浓缩至总体积的1/10～1/3；(3)醇沉：向上述浓缩液中加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I；(4)除蛋白：取上述多糖提取物粗品I适量溶于水中，加入适量氯仿及正丁醇，搅拌后分层，上层重复操作4～8次后，加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II；(5)除单糖及寡糖：取上述多糖提取物粗品II适量溶于水中，用截止分子量：8000-14000的透析膜，透析2天后，取出透析袋内液体加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品III；(6)凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品III用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得蒲葵子多糖精品，其中所述步骤(1)中的有机溶剂为石油醚，乙酸乙酯，乙醇或80％乙醇水溶液；所述步骤(1)中水煎提取加水量为8-10倍量；所述步骤(3)-(6)中，加入乙醇后乙醇含量为70％-85％；所述步骤(3)-(6)中，离心转速为3000～10000r/min。
2.一种如权利要求1所述的蒲葵子多糖提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)脱脂：将自然晾干的蒲葵子粉碎后，用8～15倍量有机溶剂浸泡后回流1～3次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；将蒲葵子提取后的药渣，100℃水煎提取，提取液过滤得滤液；(2)活性炭脱色：往上述滤液中加入0.5～2.0％的活性炭，40～80℃水浴保温15～50分钟，过滤并浓缩至总体积的1/10～1/3；(3)醇沉：向上述浓缩液中加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I；(4)除蛋白：取上述多糖提取物粗品I适量溶于水中，加入适量氯仿及正丁醇，搅拌后分层，上层重复操作4～8次后，加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II；(5)除单糖及寡糖：取上述多糖提取物粗品II适量溶于水中，用截止分子量：8000-14000的透析膜，透析2天后，取出透析袋内液体加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品III；(6)凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品III用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇，置冰箱中冷藏过夜，经离心得沉淀，沉淀冷冻干燥，得蒲葵子多糖精品，其中所述步骤(1)中的有机溶剂为石油醚，乙酸乙酯，乙醇或80％乙醇水溶液；所述步骤(1)中水煎提取加水 量为8-10倍量；所述步骤(3)-(6)中，加入乙醇后乙醇含量为70％-85％；所述步骤(3)-(6)中，离心转速为3000～10000r/min。
3.一种含有蒲葵子多糖提取物的抗肿瘤药物，其特征在于该药物包括一定量的权利要求1所述的蒲葵子多糖提取物与药学上可接受的载体。
4.一种含有蒲葵子多糖提取物的抗肿瘤药物组合物，其特征在于该药物组合物包括一定量的权利要求1所述的蒲葵子多糖提取物与其他药物及药学上可接受的载体。
5.根据权利要求3所述的药物或权利要求4所述的药物组合物，其特征在于该药物或药物组合物可制成任一种药学上可接受的制剂。
6.权利要求1所述蒲葵子多糖提取物或权利要求3所述的药物或权利要求4所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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