CN102485741A - 降甲基齐墩果烷型三萜类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及降甲基齐墩果烷型三萜类化合物及其制备方法和应用。本发明通过用水或不同浓度的有机溶剂对选定的中药进行提取，过滤，回收溶剂得浓缩液，浓缩液经大孔吸附树脂，用水和有机溶剂进行洗脱，回收溶剂得降甲基齐墩果烷型三萜类化合物，或采用萃取的方法从正丁醇层中得到粗总皂苷，再进一步使用正相硅胶柱、反相柱或快速中低压反相柱和制备高效液相系统对总皂苷进行分离和纯化，最终得到降甲基齐墩果烷型三萜类化合物。本方法所制备的降甲基齐墩果烷型三萜类成分纯度高，药理作用显著，方法简便、实用、廉价、安全、适合工业化生产。降甲基齐墩果烷型三萜类化合物可用于制备抗肿瘤、抗炎、利尿的药物。

Description

降甲基齐墩果烷型三萜类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及降甲基齐墩果烷型三萜类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

降甲基齐墩果烷型三萜基本母核为C-20位亚甲烯基取代或只有一个甲基取代的齐墩果烷型三萜。到目前为止，发现了大量的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物，已经分离出的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物主要来自植物界，如木通科的野木瓜属（Stauntonia ）、木通科的木通属（Akeb）、苋科的珐菲亚属(Pfaffia)等。

据文献报道，含有降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的植物提取物具有一系列生物活性，如文献报道从野木瓜中分离得到一系列降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物具有保肝抗炎的作用；有学者研究发现唐松草中的总皂苷具有抗肿瘤活性；肉桂酰基取代的降甲基齐墩果烷型三萜单体化合物能够抑制自由基和环氧化酶I的活性；有学者从五叶木通中提取的皂苷类有清热利尿的功效；有报道从Pfaffia paniculata Kuntze中提取的皂苷类有抗癌的作用；文献报道从Akebiae Caulis中提取的皂苷类化合物有利尿的作用等。

为了能更充分的研究这类天然产物的药理活性，我们总结发现了一种快速、大量从植物界分离制备降甲基齐墩果烷型三萜类化合物并检测其抗肿瘤、抗炎和利尿活性的方法。

发明内容

本发明的目的是提供了降甲基齐墩果烷型三萜类化合物及其制备方法和应用。

本发明提供了降甲基齐墩果烷型三萜类化合物，该类化合物具有如下结构通式：

降甲基齐墩果烷三萜基本母核为上式两种；其中在C-2，C-3，C-7，C-16， C-21位可为α-OH或β-OH 取代；C-2，C-3，C-17位可为α-OAC或β-OAC取代； C-4,C-17， C-27位可为-CH₃，-CHO，-CH₂OH，-COOH取代；C-7位可为酮基取代；在C-3，C-23，C-28位连接糖片段，糖的数目为1-8个，糖的种类为呋喃糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，甘露糖，岩藻糖，阿洛糖，来苏糖，核糖，果糖，糖的类型是呋喃糖或吡喃糖，糖之间的连接方式有1-2位连接，1-4位连接，1-3位连接和1-6位连接；呋喃糖上可有一个或二个酰基取代，酰基取代类型主要为乙酰基和/或当归酰基和/或惕恪酰基。另外在C-11,C-13位上可有羟基取代时，12位双键开裂且与C-11位羟基缩合形成环氧取代，C-13位羟基与C-28位羧酸基缩合形成内酯。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，可以通过以下两种方法中任意一种制备降甲基齐墩果烷型三萜类化合物，

方法一：

(1)粉碎选定的中药（木通科植物或富含一系列以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的药材），然后利用闪式提取技术，溶剂提取法或超声提取法，采用20%-95%的乙醇提取，过滤，合并滤液, 减压回收提取液至醇浓度低于5％，得总提取液；

(2)总提取液经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，各洗脱部位利用薄层色谱和HPLC 技术（210nm检测），筛选富集以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效部位，得到10％ -100％醇洗脱下来的流分为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效部位，即得粗总皂苷；

(3)上述粗总皂苷采用正相硅胶柱色谱法分离，以不同比列的氯仿/二氯甲烷-甲醇-水，石油醚-丙酮或氯仿/二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂洗脱，或反相柱色谱分离，或快速中低压反相柱色谱分离，以甲醇-水或乙醇-水梯度洗脱，减压回收溶剂，所得流分利用薄层色谱和HPLC技术（210nm检测），筛选富集以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效流分；

(4)上述步骤(3) 中所得有效流分经半制备或制备型HPLC 色谱分离，以甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水为流动相洗脱，得到以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物。

方法二：

(1)粉碎选定的中药（木通科植物或富含一系列以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的药材），然后利用闪式提取技术，溶剂提取法或超声提取法，采用20%-95%的乙醇提取，过滤，合并滤液, 减压回收提取液至醇浓度低于5％，得总提取液；

(2) 将上述总提取液分别用氯仿或二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，收集得到氯仿或二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物，正丁醇萃取物经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，各洗脱部位利用薄层色谱和HPLC 技术（210nm检测），筛选富集以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效部位，得到10％ -100％醇洗脱下来的流分为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效部位，即得粗总皂苷；

(3)上述粗总皂苷或乙酸乙酯萃取物采用正相硅胶柱色谱法分离，以不同比列的氯仿/二氯甲烷-甲醇-水，乙酸乙酯-甲醇-水，石油醚-丙酮或氯仿/二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂洗脱，或经反相柱色谱，或经快速中低压反相柱色谱，以甲醇-水或乙醇-水梯度洗脱，减压回收溶剂，所得流分利用薄层色谱和HPLC技术（210nm检测）， 筛选富集以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效流分；

(4) 上述步骤(3) 中所得有效流分经半制备或制备型HPLC 色谱分离，以甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水为流动相洗脱，得到以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，所述方法一和方法二中的步骤(2) 的醇为乙醇，其梯度洗脱浓度为10％ -100％。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，所述方法一和方法二中的步骤（2）的大孔吸附树脂选自XAD-4，Diaion HP-20，D101、D102、D401，D1、D2、D3、D4，HPD-100，X-5、D-201，HPD-300，AB-8XAD-6、XAD-7、XAD-8、HPD400、HPD600中的一种。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，所述方法一中的步骤（3）为粗总皂苷经正相硅胶柱色谱法处理，洗脱溶剂为氯仿/二氯甲烷-甲醇-水、石油醚-丙酮、氯仿/二氯甲烷-甲醇，洗脱比例分别为50:1：0.1-1:5:1、10:1-1:1、20:1-1：1的洗脱部位为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的流分。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，所述方法二中的步骤（3）为粗总皂苷经正相硅胶柱色谱法处理，洗脱溶剂为氯仿/二氯甲烷-甲醇-水、石油醚-丙酮、氯仿/二氯甲烷-甲醇，洗脱比例分别为50:1：0.1-1:5:1、10:1-1:1、20:1-1：1的洗脱部位为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的流分。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，所述方法一和方法二中的步骤（3）中反相色谱柱的填料可为RP-18，RP-8或RP-2。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，所述方法一中的步骤（3）为粗总皂苷经反相柱色谱或快速中低压柱色谱法处理，洗脱溶剂为1:10-10:1的甲醇-水或乙醇-水，混合比例1:9-9:1的流分为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的流分。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，所述方法二中的步骤（3）为步骤(2)的乙酸乙酯萃取物和总皂苷经反相柱色谱或快速中低压柱色谱法处理，洗脱溶剂为1:10-10:1的甲醇-水或乙醇-水，混合比例1:9-9:1的流分为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的流分。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，所述方法一中的步骤(4)为步骤（3）中所得流分经高效液相色谱分离，流动相为甲醇-水、乙腈-水或甲醇-乙腈-水，从甲醇-水混合溶剂比例为1:10-10:1、乙腈-水混合溶剂比例为1:10-3:1、甲醇-乙腈-水混合溶剂比例为1:1:10-4:4:2的流分中得到以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类单体化合物。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，所述方法二中的步骤(4)为步骤（3）中所得流分经高效液相色谱分离，流动相为甲醇-水、乙腈-水或甲醇-乙腈-水，从甲醇-水混合溶剂比例为1:10-10:1、乙腈-水混合溶剂比例为1:10-3:1、甲醇-乙腈-水混合溶剂比例为1:1:10-4:4:2的流分中得到以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类单体化合物。

本发明提供的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，制备方法简便可靠，提取分离效率高，可操作性强，易于实现工业化大生产，所制备的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物具有抗肿瘤、抗炎和利尿的活性。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1从黄腊果根中制备降甲基齐墩果烷型三萜类化合物

(1)黄腊果根粉碎后利用溶剂提取法，采用70％的乙醇回流提取三次，减压回收提取液至醇浓度低于5％，得总提取液；

(2)总提取液经非极性大孔树脂（HPD-100）处理，依次用水和40%，70%，90%乙醇梯度洗脱，各洗脱部位利用薄层色谱技术，以氯仿-甲醇-水为展开剂，以硫酸-乙醇溶液为显色剂，筛选确定70%和90%乙醇洗脱部位富集降甲基齐墩果烷型三萜类成分的有效部位，得粗总皂苷；

(3)90%乙醇洗脱部位的粗总皂苷经正相硅胶柱色谱处理，以不同比列的氯仿-甲醇作为洗脱剂梯度洗脱，各洗脱流分利用薄层色谱技术或HPLC技术（210nm）筛选确定粗总皂苷20:1-1:2的洗脱部位为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的流分；

(4)步骤(3) 中所得流分经制备型HPLC 色谱分离，以甲醇-水，乙腈-水为洗脱剂洗脱，或采用重结晶等方法分离纯化得到如下所示的4个降甲基齐墩果烷型三萜类化合物。

R₁ R₂

1 Ara H

2 Ara Glc-(1®6)-Glc

3 4

实施例2从野木瓜中制备降甲基齐墩果烷型三萜类化合物

(1)野木瓜粉碎后利用溶剂提取法，采用65%的乙醇回流提取三次，减压回收提取液至醇浓度低于5％，提取液分别用氯仿或二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，收集得到氯仿或二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；

(2)正丁醇萃取物经非极性大孔树脂(HPD-100)柱色谱处理，依次用水和40%，70%，90%乙醇梯度洗脱，各洗脱部位利用薄层色谱技术（210nm检测），筛选确定70%、90%乙醇洗脱部位富集降甲基齐墩果烷型三萜类成分的有效部位，即得粗总皂苷；

(3)取上述粗总皂苷采用快速中低压反相柱色谱处理，依次用20%，25%，30%，35%， 40%， 50%的甲醇梯度洗脱，各洗脱流分利用薄层色谱技术和高效液相色谱技术（210nm检测），筛选确定30%，35%，40%，50%的洗脱部位为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的流分；

(4)步骤(3) 中所得流分经半制备型HPLC 色谱，正相硅胶柱色谱以甲醇-水为流动相，或重结晶等分离纯化得到如下所示的 6个降甲基齐墩果烷型三萜类化合物。

R₁ R₂

1 Ara-(1®3)- Ara Rha-(1®4)-Glc-(1®6)-Glc

2 Glc-(1®3)-Rha-(1®2)-Ara Glc-(1®6)-Glc

3 Glc-(1®3)-Rha-(1®2)-Ara Rha-(1®4)- Glc-(1®6)-Glc

4 Ara Glc-(1®6)-Glc

5 Rha-(1®2)-Ara Glc-(1®6)-Glc

6 Ara-(1®3)- Ara H

实施例3从黄腊果中以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的体外抗肿瘤活性的测定

采用MTT法，，在体外通过高通量筛选，测定了所分离得到的以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的体外抗肿瘤活性。实验结果如表1 中所示。

试验操作

(1)细胞培养

取对数生长期的六种人体肿瘤细胞（人急性髓性白血病细胞株（HL-60）、人前列腺癌细胞株（PC-3MIE8）、人胃癌细胞株（BGC-823）、人乳腺癌细胞株（MDA-MB-435）、人肝癌细胞株（Bel-7402）、人宫颈癌细胞株（HeLa）），以内含10%（v/v）胎牛血清（fetal bovine serum）的RPMI-1640培养液稀释为5×104个/L的细胞悬浮液，接种于96孔板中，100 μL/孔，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养24 h。

(2)添加试药

样品用DMSO溶解后，用含10%（v/v）胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释。将上述含药培养液加入96孔板中，放置于与细胞培养相同条件的培养箱中培养48 h。

(3)结果测定

MTT法操作流程如下：

MTT法：接种细胞预培养（24h），药物处理（48h），加MTT染色（4h），离心除去上清液，加DMSO溶解，酶标仪570 nm下测定OD值。

数据分析按照以下方法计算：

细胞生长抑制率=[1-给药组OD值/对照组OD值]´100%。

采用LOGIT法计算药物半数抑制浓度（IC50）。

试验结果如表1中所示。

表1

实施例4从黄腊果中分离的以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的体外抗炎活性的测定

采用体外小鼠腹腔巨噬细胞筛选体系，测定了所分离得到的以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NO合成与释放的抑制作用及对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α合成与释放的抑制作用，结果见表2和表3。

1）以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NO合成与释放的抑制作用

试验操作

(1)细胞培养

小鼠腹腔注射15mg/ml玉米淀粉盐水溶液1.5ml/只，3天后取腹腔巨嗜细胞，以内含10%（v/v）胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养液稀释为1×106个/ml的细胞悬液，接种于96孔平底培养板中，100μl/well，置于37℃、饱和湿度、0.05CO2培养箱中培养。

(2)添加试药

供试样品：供试药物溶解于DMSO 中，并用含10%（v/v）胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养液稀释为0.3,1.0,8.0,30.0,100.0μg/ml五个梯度。

空白对照组：LPS, 不含药物的样品溶解于DMSO 中，并用含10%（v/v）胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养液稀释为0.3,1.0,8.0,30.0,100.0μg/ml五个梯度。

阳性对照组：100μM的NaNO2用含10%（v/v）胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养液稀释为0.3,1.0,8.0,30.0,100.0μg/ml五个梯度。

阴性对照组：含10%（v/v）胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养液。

细胞在培养2h 后，加入20μl/ml脂多糖（LPS）10μl/well，然后再加入上述配制好的各组样品溶液，放置于与上述培养条件相同的环境下继续培养48h。

(3)结果测定

0.2%的N-1-萘基乙二胺双氯化物溶液（NED）与0.2%的磺胺溶液（SA）等体积混合配成Gress试剂，每孔中加入0.1mlGress试剂。混合均匀，10min后于550nm波长下测OD值。

数据处理：

Inhibition rate (IR) %=（

_LPS-

_sample）/（

_LPS-

_{negativecontrol}）×100%。

采用上述方法，我们考察了以降甲基齐墩果烷型为母核的三萜类化合物对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NO合成与释放的抑制作用。其与阳性对照组相比，OD值如表2中所示。

表2

2）以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α合成与释放的抑制作用

(1)细胞培养

取对数生长期的L929细胞，用0.1%胰蛋白酶及0.02%EDTA混合液消化。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔平底培养板中，100μl/well，置于37℃、饱和湿度、0.05CO2培养箱中培养24h。

(2)添加试药

供试样品：供试药物溶解于DMSO 中，并用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释为0.3,1.0,8.0,30.0,100.0μg/ml五个梯度。

空白对照组：磷酸盐缓冲液（PBS），并用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释为0.3,1.0,8.0,30.0,100.0μg/ml五个梯度。

阳性对照组：TNF, 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释为0.3,1.0,8.0,30.0,100.0μg/ml五个梯度。

阴性对照组：含10%小牛血清的RPMI-1640培养液。

细胞在培养24h 后，加入0.05ml的放线菌素D（0.5-1μg/ml），然后再加入上述配制好的各组样品溶液，放置于与上述培养条件相同的环境下继续培养24h。

(3)结果测定

MTT染色，570nm下测OD值。

数据处理：

Inhibition rate (IR) %=（ _LPS-

_sample）/（

_LPS-

_{negativecontrol}）×100%。

采用上述方法，我们考察了以降甲基齐墩果烷型为母核的三萜类化合物对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α合成与释放的抑制作用。其与阳性对照组相比， OD值如表3中所示。

表3

实施例5 从黄腊果中分离的以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的体内抗炎活性

采用昆明种小鼠为筛选体系，测定了以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物对二甲苯致小鼠耳肿胀、棉球肉芽肿增生的抑制作用及对增高小鼠腹腔毛细血管通透性的作用, 结果见表4、表5和表6。

1）以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用

(1)小鼠分组

昆明种小鼠60只，18-22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12只，分别为空白对照组、总皂苷、吲哚美辛组。

(2)给药处理

总皂苷组:1：给予100 mg/kg供试样品的一组小鼠。

总皂苷组2：给予50 mg/kg供试样品的一组小鼠。

总皂苷组3：给予25mg/kg供试样品的一组小鼠。

空白对照组：不做任何处理的一组小鼠。

吲哚美辛组：给予5mg/kg吲哚美辛的一组小鼠。

分别连续给药7天，第7天给药后1h，于小鼠右耳两面涂二甲苯25μl，左耳不涂为正常耳，2h后，脱颈椎处死，用直径8mm打孔器打下左耳和右耳同一部位的圆片，于扭力天平上称重。

(3)结果测定：

记录重量(mg)，并计算耳肿胀率及抑制率。

数据处理：

Edema Rate (ER)（%）= [Right Ear（mg）-Left ear（mg）]/Left Ear（mg）×100%；

Inhibitory Rate (IR)（%）=（ER_control-ER_samples）/ ER_control×100%。

试验结果如表4中所示。

表4

1)*P<0.05，**P<0.01 vs control，Duncan test

2）以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物对小鼠棉球肉芽肿增生的抑制作用

(1)小鼠分组

昆明种小鼠60只，18-22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12只。

(2)给药处理

总皂苷组:1：给予100 mg/kg供试样品的一组小鼠。

总皂苷组2：给予50 mg/kg供试样品的一组小鼠。

总皂苷组3：给予25mg/kg供试样品的一组小鼠。

空白对照组：不做任何处理的一组小鼠。

吲哚美辛组：给予5mg/kg吲哚美辛的一组小鼠。

在给药第一日分别手术植入10mg灭菌棉球（每个棉球含1000U青霉素和1000U链霉素），之后分别连续给药7天，第8天脱颈椎处死小鼠，剥离肉芽组织，并于60℃烘箱中烘12h，称重。

(3)结果测定：

记录重量(mg)，并计算肉芽肿重。试验结果如表5中所示。

表5

1）**P<0.01，***P<0.001vs control，Duncan test

3）以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物对增高小鼠腹腔毛细血管通透性的作用

(1)小鼠分组

昆明种小鼠60只，18-22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12只。

(2)给药处理

总皂苷组:1：给予100 mg/kg供试样品的一组小鼠。

总皂苷组2：给予50 mg/kg供试样品的一组小鼠。

总皂苷组3：给予25mg/kg供试样品的一组小鼠。

空白对照组：不做任何处理的一组小鼠。

吲哚美辛组：给予5mg/kg吲哚美辛的一组小鼠。

分别连续给药7天，第7天给药后1h，iv伊文思兰NS溶液0.1ml/10g（2%），立即ip0.6%醋酸0.2ml/只，20min后，脱颈椎处死小鼠，剪开腹腔，用5mlNS溶液冲洗腹腔数次，收集洗涤液。

(3)结果测定：

洗涤液在721分光光度计590nm处测定吸光度值。

试验结果如表6中所示。

表6

1）**P<0.01，***P<0.001vs control，Duncan test

实施例6从黄蜡果中分离的以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物利尿活性

(1)小鼠分组

取180～200g雄性大鼠,预试,选取经水灌胃(2. 5 mL /100 g)后2 h内排尿量达到灌胃量40 %以上的大鼠40只,随机分为生理盐水组、药物高、中、低剂量组。将各组大鼠分别放入代谢笼中,每笼2只,体重相近。

(2)给药处理

高剂量药物组：给予8 g/kg供试药物的一组小鼠。

中剂量药物组：给予4 g/kg供试药物的一组小鼠。

低剂量药物组：给予2 g/kg供试药物的一组小鼠。

生理盐水组：给予生理盐水的一组小鼠。

实验前禁食24 h,生理盐水组和各个给药组的灌胃水负荷量均为2. 5 mL /100 g体重。给药后在代谢笼下放置量筒,连续收集6 h尿量。

(3)结果测定：

记录尿量体积(mL) 。

试验结果如表7中所示。

表7　

1）**P<0.01

Claims (11)

1.降甲基齐墩果烷型三萜类化合物，其特征在于：所述化合物是以降甲基齐墩果烷型为母核的三萜苷元及其糖苷类化合物，其母核结构如下：

其中在C-2，C-3，C-7，C-16， C-21位可为α-OH或β-OH 取代；C-2，C-3，C-17位可为α-OAC或β-OAC取代； C-4,C-14， C-17位可为-CH₃，-CHO，-CH₂OH，-COOH取代；C-7位可为酮基取代；在C-3，C-23，C-28位可连接糖片段，在C-11,C-13位上可有羟基取代时，12位双键开裂且与C-11位羟基缩合形成环氧取代，C-13位羟基与C-28位羧酸基缩合形成内酯。

2.根据权利要求1所述的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物，其特征在于：所述的糖片段中糖的数目为1-8个，糖的种类为呋喃糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，甘露糖，岩藻糖，阿洛糖，来苏糖，核糖，果糖，糖的类型是呋喃糖或吡喃糖，糖之间的连接方式有1-2位连接，1-4位连接，1-3位连接和1-6位连接；呋喃糖上可有一个或二个酰基取代，酰基取代类型主要为乙酰基和/或当归酰基和/或惕恪酰基。

3.一种如权利要求1所述的降甲基齐墩果烷型三萜类化合物的制备方法，其特征在于：

(1)粉碎选定的中药，然后利用闪式提取技术，溶剂提取法或超声提取法，采用20%-95%的乙醇提取，过滤，合并滤液, 减压回收提取液至醇浓度低于5％，得总提取液；

（2）将总提取液采用下述a)或b)方法之一对有效部位进行富集：

a. 总提取液经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，各洗脱部位利用薄层色谱和HPLC 技术（210nm检测），筛选富集以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效部位，得到10％ -100％醇洗脱下来的流分为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效部位，即得粗总皂苷；

b. 将上述总提取液分别用氯仿或二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，收集得到氯仿或二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物，正丁醇萃取物经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，各洗脱部位利用薄层色谱和HPLC 技术（210nm检测），筛选富集以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效部位，得到10％ -100％醇洗脱下来的流分为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效部位，即得粗总皂苷；

(3)上述粗总皂苷采用正相硅胶柱色谱法分离，以不同比例的氯仿/二氯甲烷-甲醇-水，石油醚-丙酮或氯仿/二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂洗脱，或反相柱色谱分离，或快速中低压反相柱色谱分离，以甲醇-水或乙醇-水梯度洗脱，减压回收溶剂，所得流分利用薄层色谱和HPLC技术（210nm检测），筛选富集以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的有效流分；

(4)上述步骤(3) 中所得有效流分经半制备或制备型HPLC 色谱分离，以甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水为流动相洗脱，得到以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的中药选自木通科植物或富含以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的药材。

5. 根据权利要求3 所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2) 的醇为乙醇，其梯度洗脱浓度为10％ -100％。

6.根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于：步骤（2）大孔吸附树脂选自XAD-4， Diaion HP-20，D101、D102、D401，D1、D2、D3、D4，HPD-100，X-5、D-201，HPD-300，AB-8XAD-6、XAD-7、XAD-8、 HPD400 、HPD 600中的一种。

7.根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于：步骤（3）为粗总皂苷经正相硅胶柱色谱法处理，洗脱溶剂为氯仿或二氯甲烷-甲醇-水、石油醚-丙酮、氯仿/二氯甲烷-甲醇，洗脱比例分别为50:1：0.1-1:5:1、10:1-1:1、20:1-1：1的洗脱部位为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的流分。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中反相色谱柱的填料为RP-18，RP-8或RP-2。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于： 步骤(2)的乙酸乙酯萃取物和总皂苷经反相柱色谱或快速中低压柱色谱法处理，洗脱溶剂为1:10-10:1的甲醇-水或乙醇-水，混合比例1:9-9:1的流分为以去甲基齐墩果烷为母核的三萜类化合物的流分。

10.根据权利要求3 所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)为步骤（3）中所得流分经高效液相色谱分离，流动相为甲醇-水、乙腈-水或甲醇-乙腈-水，从甲醇-水混合溶剂比例为1:10-10:1、乙腈-水混合溶剂比例为1:10-3:1、甲醇-乙腈-水混合溶剂比例为1:1:10-4:4:2的流分中得到以降甲基齐墩果烷为母核的三萜类单体化合物。

11.降甲基齐墩果烷型三萜类化合物在制备抗肿瘤、抗炎、利尿治疗药物中的应用。