CN104910237A - 降甲基齐墩果烷型三萜皂苷及其活性组合物的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及两个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物黄蜡果皂苷，所述的两个降甲基齐墩果烷型三萜具有如下结构，本发明还包括两个化合物的组合物及其制备方法和在抗炎、镇痛、保肝、利尿药物、保健品和功能食品中的开发与应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及两个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物黄蜡果皂苷，即：3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-Arabinopyranosyl-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)]30-norolean-12-en-28-oic acidα-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester和3β,20α,24-trihydroxy-29-norolean-12-en-28-oic acid24-O-6′-O-acetyl-β-D-glucopyranoside，以及包含这两个新化合物的活性组合物及其分离、制备和在抗炎、镇痛、保肝、利尿药物、保健品和功能食品中的开发与应用。
背景技术
黄腊果(Stauntonia brachyanthera Hand-Mazz)为木通科野木瓜属植物，广泛分布在我国南方地区。因其果实形态与猪腰子相似，因此在当地俗称“猪腰子”。黄腊果整株植物都具有较大的药用价值，广泛应用于炎症、疼痛等疾病的治疗，其藤茎具有清热利尿、通经活络、镇痛排脓、通乳等功效；果皮民间用于结石病的治疗；叶子用于治疗外感风寒，头痛胸闷，吐泻腹胀等症。尽管黄腊果具有极大的药用价值，但时至今日国内外仍无任何有关其化学成分及药用机理的相关报道，极大的限制了其应用。我们前期研究中发现，这一植物提取物具有较好的抗炎、镇痛、保肝和利尿的生物活性。以活性指导分离制备得到了2个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物黄蜡果皂苷，即：
Comp.1：3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-Arabinopyranosyl-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)]30-norolean-12-en-28-oic acidα-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester
Comp.2：3β,20α,24-trihydroxy-29-norolean-12-en-28-oic acid24-O-6′-O-acetyl-β-D-glucopyranoside及他们的活性组合物。
发明内容
本发明的目的是提供两个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物。
Comp.1：3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-Arabinopyranosyl-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)]30-norolean-12-en-28-oic acidα-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester
Comp.2：3β,20α,24-trihydroxy-29-norolean-12-en-28-oic acid 24-O-6′-O-acetyl-β-D-glucopyranoside。
本发明还包括两个化合物的制备方法和在抗炎、镇痛、保肝、利尿药物、保健品和功能食品中的开发与应用。
本发明的另一个目的是提供包含两个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物Comp.1、Comp.2的活性组合物及其制备方法，和在抗炎、镇痛、保肝、利尿药物、保健品和功能食品中的开发与应用。
本发明所述的两个降甲基齐墩果烷型三萜具有如下结构：
本发明提供的两个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷，以及包含这两个新化合物的活性组合物，是通过以下方法制备得到，
(1)分别取干燥黄蜡果(Stauntonia brachyanthera Hand-Mazz)药材，包括其根、茎、叶、果实，粉碎后经溶剂提取法，分别采用35％-95％的乙醇或甲醇水溶液，优选60％-80％的乙醇或甲醇水溶液，浸泡后回流提取、浸渍提取、或超声提取2-3次，合并提取液，减压回收至醇浓度低于5％；
(2)步骤(1)所得粗提物溶于水或悬浮于水，依次用石油醚或环己烷或正己烷、二氯甲烷或氯仿萃取后，再经乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；或步骤(1)所得粗提物溶于水或悬浮于水后，经大孔吸附树脂柱，用甲醇/水或乙醇/水梯度(0：100-100：0)洗脱，得到35％-85％醇洗脱部位，优选40％-70％的醇洗脱部位；减压回收溶剂；
(3)上述步骤(2)所得乙酸乙酯或正丁醇层萃取物，或大孔吸附树脂洗脱流分经硅胶色谱柱色谱法分离，以氯仿甲醇混合溶剂梯度洗脱得到洗脱流份，洗脱溶剂为20:1-2:1的氯仿或二氯甲烷/甲醇；
(4)上述步骤(3)中所得流分经ODS柱色谱处理，以甲醇/水或乙腈/水为流动相洗脱，其比例为1:9-7:3的甲醇/水混合溶剂、或1:15-4:3的乙腈/水混合溶剂，得到化合物1、2和3。
其中，所述步骤(2)中，提取物溶于水或悬浮于水后，其体积与生药材的重量比为1:2-2:1；
所述步骤(2)中萃取所用的石油醚的沸程为30-60℃或60-90℃，萃取溶剂与提取液的体积比为1:2-2:1；萃取次数为2-4次。
所述步骤(2)中大孔吸附树脂可选用非极性树脂(XAD-4，DiaionHP-20，D101、D102、D401，D1、D2、D3、D4，HPD-100，X-5)、弱极性树脂(D-201，HPD-300，AB-8)和中等极性树脂(HPD-400，XAD-6、XAD-7、XAD-8)等。
步骤(2)中所得乙酸乙酯或正丁醇萃取物，或大孔吸附树脂35％-85％醇洗脱物，为含有新化合物Comp.1和Comp.2，即3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-Arabinopyranosyl-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)]30-norolean-12-en-28-oic acidα-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester和3β,20α,24-trihydroxy-29-norolean-12-en-28-oic acid24-O-6′-O-acetyl-β-D-glucopyranoside的活性组合物。
所述的活性组合物包含所述的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷和化合物3-14中的一种或几种：
上述降甲基齐墩果烷型三萜皂苷或活性组合物，以及药学上可接受的赋形剂，组成一种药物组合物。
本发明所述的新降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物1和2，和包含这两个成分的活性组合物，以及药物组合物，具有抗炎、镇痛、保肝、利尿的活性，可用于抗炎、镇痛、保肝、利尿的药物以及保健品和功能食品中的开发和应用。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
黄腊果根4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的35％醇80℃下加热提取三次，(第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至醇浓度小于5％，加水稀释至4升，按1:2的比例，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取4次，合并正丁醇萃取液，回收溶剂，得到浸膏，用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.5克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(20.1mg)、1(9.2mg)。
实施例2
黄腊果根4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的95％醇室温下温浸提取三次，(第一次4小时，第二次4小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至无醇味后，加水稀释至2升，用非极性大孔吸附树脂D-101分离，流动相为甲醇/水，依次经水、40％、85％甲醇洗脱，得到40％醇洗脱物，进一步用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.5克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。取10:1-2:1的流分用ODS分离，经1:15、1:10、3:20、1:5、1:4、1:3、2:5、1:1、4:3的乙腈/水梯度洗脱，依次得到化合物2(5.6mg)、1(4.3mg)。
实施例3
黄腊果茎3kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的60％醇80℃下加热提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至醇浓度小于5％，加水稀释至6升，按1:1的比例，用环己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取2次，目标化合物主要富集于正丁醇层，合并正丁醇萃取液，回收溶剂，得到浸膏，用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.5克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。取10:1-2:1的流分用ODS分离，经1:15、1:10、3:20、1:5、1:4、1:3、2:5、1:1、4:3的乙腈/水梯度洗脱，依次得到化合物2(20.1mg)、1(11.6mg)。
实施例4
黄腊果茎3kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的80％醇80℃下加热回流提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩无醇味，加水稀释至6升，用非极性大孔吸附树脂HPD-100分离，流动相为乙醇/水，依次经水、40％、70％乙醇洗脱，得到70％醇洗部分，回收溶剂，得到浸膏，用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(3.7mg)、1(3.2mg)。
实施例5
黄腊果根3kg，用12倍，10倍和8倍的60％甲醇室温下超声提取三次，(第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩无醇味，加水稀释至3升，按1:2的比例，用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取3次，目标化合物主要富集于乙酸乙酯层，合并、回收溶剂，得到浸膏；进一步用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(25.3mg)、1(17.4mg)。
实施例6
黄腊果茎4kg，用12倍，10倍和8倍的80％甲醇室温下超声提取三次，(第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩无醇味，加水稀释至2升，经中等极性树脂XAD-6大孔吸附吸附树脂，流动相为甲醇/水，依次经水、45％、85％甲醇洗脱，得到85％醇洗部分，回收溶剂，得到浸膏，用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，经1:15、1:10、3:20、1:5、1:4、1:3、2:5、1:1、4:3的乙腈/水梯度洗脱，依次得到化合物2(15.3mg)、1(10.4mg)。
实施例7
黄腊果叶2kg，用12倍，10倍和8倍的75％醇室80℃提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至醇浓度低于5％，加水稀释至4升，弱极性大孔吸附树脂AB-8纯化，流动相为乙醇/水，依次经水、40％、80％乙醇洗脱，得到80％醇洗部分，回收溶剂，得到浸膏，用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(11.2mg)、1(7.5mg)。
实施例8
黄腊果果实4kg，用12倍，10倍和8倍的70％醇室80℃提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至无醇味，加水稀释至4升，按1:1的比例，用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取3次，目标化合物主要富集于正丁醇层，合并、回收溶剂，得到浸膏；进一步用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(11.2mg)、1(9.5mg)。
实施例9
黄腊果根6kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的70％乙醇室80℃提取三次(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至醇浓度低于5％，加水稀释至6升，经非极性大孔吸附树脂HPD 100以乙醇/水为流动相，依次经水、40％、70％乙醇洗脱，得到70％醇洗部分，回收溶剂，得到浸膏，用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(47.2mg)、1(29.5mg)。
实施例10
黄腊果根6kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的70％乙醇室80℃提取三次(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至醇浓度低于5％，加水稀释至6升，经非极性大孔吸附树脂HPD 100以乙醇/水为流动相，依次经水、40％、70％乙醇洗脱，得到70％醇洗部分的活性组合物。
实施例11
黄腊果茎4kg，用12倍，10倍和8倍的70％醇室80℃提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至无醇味，加水稀释至4升，按1:1的比例，用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取3次，富集于正丁醇层，合并、回收溶剂，得到活性组合物。
化合物1、2的结构鉴定数据如下：
化合物1:白色粉末(CH3OH)，254nm下无暗斑，365nm下无荧光，体积分数为10％硫酸-乙醇显紫色，HR-TOF-MS中给出准分子离子峰[2M+Na+K]2+：m/z 1500.6718(calcd.for 1500.5993)，示分子式为C67H106O33。
化合物2：白色针状粉末(CH3OH)，紫外(254nm)下无暗斑，体积分数为10％硫酸-乙醇溶液显紫色，HR-ESI-MS中给出准分子离子峰[M+Na]+；m/z:701.3880(calcd 701.3871,C37H58Na1O11)，示分子式为C37H58O11。
表1 化合物1和2降甲基三萜母核部分的核磁数据
表2 化合物1糖部分的核磁数据
表3 化合物2糖部分的核磁数据
如下实施例中所涉及的活性组合物为包含化合物1-14的组合物，即本发明步骤(3)得到的组合物。
实施例12化合物1、2及活性组合物的体外保肝活性
采用MTT法考察药物对大鼠肝干细胞样上皮细胞WB-F344(简称WB)成活率的影响。分别设正常对照组、D,L-半乳糖胺模型组、双环醇给药组和受试药物组。
结果：如表4所示。
表4 保肝试验结果
Compared with control**P<0.01Compared with model group*P<0.01
实施例13化合物1、2及活性组合物的镇痛活性
(1)醋酸扭体试验
昆明种小鼠雌雄各半，18-22g，随机分为空白组，给药组，阳性组，每组10只。分别用1、2和活性组合物生理盐水溶液灌胃7天，给药量如表5所示。最后一天阳性组和给药组同时给药1小时后，给小鼠腹腔注射0.7％醋酸0.2ml，过5分钟后，观察并记录各组小鼠在15分钟内的扭体次数。然后根据下列公式计算小鼠扭体的抑制率。
抑制率＝(样品组平均扭体次数－阳性组平均扭体次数)/样品组平均扭体次数。
结果：如表5所示。
表5 醋酸扭体试验结果
(2)热板试验
昆明种小鼠雌雄各半，18-22g，随机分为空白组，给药组，每组10只。分别用1、2和活性组合物生理盐水溶液灌胃7天，给药量如表6所示。最后一天阳性组和给药组同时给药1小时后，把小鼠放到热板上，用秒表计时，以引起小鼠舔后足或后足跳跃所需潜伏期作为痛阈指标(一分钟为极限指标)。潜伏时间延长率＝(阳性组的平均潜伏时间－样品组平均潜伏时间)/阳性组的平均潜伏时间。
结果：如表6所示。
表6 热板试验结果
实施例14化合物1、2及活性组合物的抗炎活性
(1)对二甲苯诱发小鼠耳肿胀的影响:
昆明种小鼠60只，18-22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12只，分别为空白对照组、给药组和阿司匹林组；化合物给药剂量为40mg/kg，活性组合物给药剂量为150mg/kg；试验组分别ig给药，连续7天，第7天给药后1h，于小鼠右耳两面涂二甲苯25μl，左耳不涂为正常耳，2h后，脱颈椎处死，用直径8mm打孔器打下左耳和右耳同一部位的圆片，于扭力天平上称重，计算耳肿胀率及抑制率。结果见表7。
Edema Rate(ER)(％)＝[Right Ear(mg)-Left ear(mg)]/Left Ear(mg)×100％Inhibitory Rate(IR)(％)＝(ERcontrol-ERsamples)/ERcontrol×100％
结果：如表7所示。
表7 小鼠耳肿胀试验结果
*P<0.05，**P<0.01vs control，Duncan test
(2)对小鼠棉球肉芽肿增生的抑制作用
昆明种小鼠60只，18-22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12只，分别为空白对照组、给药组和阿司匹林组；化合物给药剂量为40mg/kg，活性组合物给药剂量为150mg/kg；试验各组分别ig给药，连续7天，在给药第一日手术植入10mg灭菌棉球(每个棉球含1000U青霉素和1000U链霉素)，第8天脱颈椎处死小鼠，剥离肉芽组织，并于60℃烘箱中烘12h，称重，计算肉芽肿重。
结果：如表8所示。
表8 小鼠棉球肉芽肿试验结果
**P<0.01，***P<0.001vs control，Duncan test
实施例15化合物1、2及活性组合物的利尿活性
取180-200g雄性大鼠，预试，选取经水灌胃(2.5mL/100g)后2h内排尿量达到灌胃量40％以上的大鼠40只，随机分组，将各组大鼠分别放入代谢笼中，每笼2只，体重相近。实验前禁食24h，生理盐水组和各个给药组的灌胃水负荷量均为2.5mL/100g体重。给药后在代谢笼下放置量筒，连续收集6h尿量，记录尿量体积(mL)。
结果：如表9所示。
表9 利尿作用(n＝10,x±s)结果
**P<0.01。
Claims (10)
1.具有如下结构的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷：
2.如权利要求1所述的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别取干燥黄蜡果药材，分别采用35％-95％的乙醇或甲醇水溶液浸泡后回流提取、浸渍提取、或超声提取，提取2-3次，合并提取液，减压回收至醇浓度低于5％，得粗提物；
(2)步骤(1)所得粗提物溶于水或悬浮于水后，依次用石油醚或环己烷或正己烷、二氯甲烷或氯仿萃取，再依次经乙酸乙酯、正丁醇分别萃取，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
或步骤(1)所得粗提物溶于水或悬浮于水后，经大孔吸附树脂柱，用甲醇/水或乙醇/水溶液梯度洗脱，得到35％-85％醇洗脱部位，优选40％-70％醇洗脱部位，减压回收溶剂；
(3)上述步骤步骤(2)所得乙酸乙酯或正丁醇层萃取物或大孔吸附树脂洗脱部位经硅胶色谱柱色谱法分离，以氯仿和甲醇、或二氯甲烷和甲醇混合溶剂梯度洗脱得到洗脱流份，洗脱溶剂为氯仿：甲醇或二氯甲烷：甲醇＝20:1-2:1；
(4)上述步骤(3)中所得流分经ODS柱色谱处理，以甲醇/ 水或乙腈/水为流动相洗脱，其比例为1:9-7:3的甲醇/水混合溶剂、或1:15-4:3的乙腈/水混合溶剂，得到化合物1、2。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，黄蜡果药材包括其根、茎、叶、花和果实。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，粗提物溶于水或悬浮于水后，其体积与生药材的重量比为1:2-2:1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中萃取所用的石油醚的沸程为30-60℃或60-90℃，萃取溶剂与提取液的体积比为1:2-2:1；萃取次数为2-4次。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中大孔吸附树脂为非极性树脂、弱极性树脂或中等极性树脂，所述的非极性树脂为XAD-4，Diaion HP-20，D101、D102、D401，D1、D2、D3、D4、HPD-100或X-5；所述的弱极性树脂为D-201、HPD-300或AB-8；所述的中等极性树脂为HPD-400、XAD-6、XAD-7或XAD-8。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所得乙酸乙酯或正丁醇萃取物，或大孔吸附树脂醇洗脱部位，为含有Comp.1和Comp.2的活性组合物。
8.一种活性组合物，其特征在于，所述的活性组合物包含权利要求1所述的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷和化合物3-14中的一种或几种：
9.一种药物组合物，包含权利要求1所述的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷或权利要求8所述的活性组合物和药学上可接受的赋形剂。
10.权利要求1所述的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷或权利要求8所述的活性组合物或权利要求9所述的药物组合物在制备抗炎、镇痛、保肝、利尿的药物以及保健品和功能食品中的应用。
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