CN104000881A

CN104000881A - 一种具有抗菌活性的葎草有效部位及其应用

Info

Publication number: CN104000881A
Application number: CN201410258812.6A
Authority: CN
Inventors: 蒋建勤; 徐保磊; 阳文波
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2014-06-12
Filing date: 2014-06-12
Publication date: 2014-08-27

Abstract

本发明公开了一种葎草有效部位及其抗菌活性和在制备抗菌药物中的用途。以葎草全草为原料，用水或5％-100％的醇提取，经初步处理后，再通过大孔树脂-聚酰胺树脂联用技术或硅胶柱层析方法得到葎草有效部位，主要为黄酮类化合物，总黄酮含量为20％-90％，其组成以芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等为主。该有效部位具有显著地抗菌活性，尤其对临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、大肠屎球菌和大肠粪球菌显示了较强的抑菌活性；其可作为药物原料，制成抗菌药物片剂、胶囊等，尤其是制备成治疗细菌感染引起的腹泻、肠胃炎及肾盂肾炎、急性肾炎等泌尿系统疾病的药物和具有助消化、预防和保健功能的食品。

Description

一种具有抗菌活性的葎草有效部位及其应用

技术领域

本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种葎草的有效部位黄酮类化合物，以及该有效部位的抗菌活性及其在制备抗菌药物中的用途。

背景技术

近年来，由于抗生素的滥用和细菌的进化，临床上细菌感染耐药问题愈发严重，作为抗生素生产和使用大国，耐药感染性疾病已成为我国临床感染性疾病死亡的主要因素。因此，研制低毒、有效的耐药性抑制剂具有广泛的应用价值和良好前景。研究发现某些中草药具有广谱抗菌作用、且可提高机体免疫力，所以由抗生素应用引起的耐药性问题使国内外医药研发人员把注意力转向具有抗菌活性的中草药，中草药抗菌活性成分与抗生素联合用药将大大降低病菌的耐药性。为进一步充分发挥我国中草药资源优势，寻找具有抗耐药菌活性的中药有效部位或成分解决耐药菌感染问题无疑将是一条行之有效的途径。

葎草Humulus scandens(Lour.)Merr.为桑科(Moraceae)葎草属(Humulus)植物葎草的干燥全草，为一年或多年生草本，除青海、新疆以外，全国各地均有分布，另外东北亚、北美洲也有分布。别名剌刺秧、降龙草、簕草、五爪龙、割人藤等，葎草味甘苦，性寒，归肾、肺经，具有清热解毒、利尿通淋的功效，始载于《唐本草》；内服用于肺结核潮热、感冒发热、痢疾、肠胃炎、肾盂肾炎、急性肾炎、膀胱炎、泌尿系结石等病症；外用可治痈疽肿毒、湿疹、毒蛇咬伤等。该植物主要含有黄酮类、萜类、挥发油类、甾体类等化合物。纵观国内外报道，对葎草提取物及药理活性的研究，多集中在葎草提取物对抗炎镇痛、抗结核、抗氧化等方面的报道，目前鲜有对葎草有效部位抑制细菌生长的研究，尤其是没有针对临床耐药菌抗菌活性的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葎草有效部位及其制备方法，该部位主要为具有一定含量的黄酮类化合物及其成分组成。

本发明的另一个目的在于提供葎草有效部位的抗菌活性，尤其是对临床耐药菌的抗菌活性。

本发明的进一步的目的在于提供葎草有效部位的制剂及其在治疗细菌感染性引起的腹泻、肠胃炎及肾盂肾炎、急性肾炎、膀胱炎等泌尿系统疾病的药物联合用药方面的应用和制备助消化、预防和保健食品方面的应用。

本发明的目的是通过以下途径实现的：

本发明提出的葎草有效部位系从葎草干燥全草中提取富集纯化得到的，其制备工艺过程为：

(1)提取：取葎草全草，采用水或5％-100％的醇(甲醇、乙醇、正丁醇中的的任意一种或几种的混合物)提取，过滤，得提取液。

(2)初步处理：取步骤(1)中制得的提取液，减压回收浓缩，加入适当乙醇使乙醇浓度达到50％-90％，静置沉淀，过滤得滤液，减压回收至滤液无醇味，得滤液A备用，或者取步骤(1)中制得的提取液，用石油醚萃取除去脂溶性成分，得滤液B备用。

(3)粗制和精制：取步骤(2)中的滤液A或滤液B通过大孔树脂吸附洗脱，洗脱剂采用水、10％-95％醇(乙醇或甲醇)进行梯度洗脱，分段收集10％-95％醇洗脱物，浓缩后得粗制物，取粗制物通过聚酰胺树脂吸附洗脱，洗脱液采用水、20％-95％醇(乙醇或甲醇)进行梯度洗脱，分段收集20％-95％醇洗脱物，浓缩干燥后得葎草有效部位；或者取步骤(2)中的滤液A或滤液B进行硅胶柱层析，洗脱剂采用体积比为50∶1-40∶1的氯仿-甲醇混合液、20∶1-5∶1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比为20∶1-5∶1的氯仿-甲醇洗脱液，浓缩干燥后得葎草有效部位。

本发明提出的葎草有效部位主要为黄酮类化学成分，其组成主要包括芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、牡荆素、蒙花苷及N-p-香豆酰酪胺等；上述葎草有效部位中黄酮类成分百分含量为20％-90％。

本发明提出的葎草有效部位具有显著地抗菌活性，体外抗菌试验证实其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(含耐药金黄色葡萄球菌)、表皮葡萄球菌(含耐药表皮葡萄球菌)、肺炎克雷伯杆菌、大肠屎球菌、大肠粪球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等均具有较明显的抑菌活性，尤其对临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、大肠屎球菌、大肠粪球菌显示了较强的抑菌活性。

本发明提出的葎草有效部位可作为药物原料，进一步制成抗菌药物片剂、胶囊等，尤其是制备成治疗细菌感染性引起的腹泻、肠胃炎及肾盂肾炎、急性肾炎、膀胱炎等泌尿系统疾病的药物和具有助消化、预防和保健功能的食品。

本发明采用在我国广泛分布、具有较强生命繁殖能力的葎草作为原料制备抗菌活性有效部位，药材来源极为丰富，通过对葎草资源的有效利用，将有助于推进对葎草植物侵略扩张的防控，具有潜在的经济和生态效益。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进行详细说明，但不局限于所列举的实例。

实施例1

(1)提取和初步处理：取葎草全草，采用5％-100％的醇(甲醇、乙醇、正丁醇中的的任意一种或几种的混合物)约8倍量，在70℃下回流提取2h，反复2次，得葎草提取液；取葎草提取液减压回收浓缩，加入适当乙醇使乙醇浓度达到50％-90％，静置沉淀，过滤得滤液，减压回收至滤液无醇味，得滤液；或者取葎草提取液，用石油醚萃取除去脂溶性成分，得滤液。

(2)粗制和精制：将步骤(1)中的滤液采用大孔树脂吸附洗脱，洗脱剂采用0-30％稀醇(甲醇或乙醇)溶液洗脱进行除杂，用40％-90％醇(甲醇或乙醇)溶液进行洗脱，收集40％-90％醇洗脱液，减压回收浓缩干燥得粗制物；取大孔树脂粗制物以水或稀醇溶解通过聚酰胺树脂吸附洗脱，洗脱剂采用0-20％醇(甲醇或乙醇)溶液洗脱进行除杂，用30％-90％醇(甲醇或乙醇)溶液进行洗脱，收集30％-90％乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩干燥得葎草有效部位1，其总黄酮含量为20％-80％，主要为芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等。

实施例2

(1)提取和初步处理：取葎草全草，采用5％-100％的醇(甲醇、乙醇、正丁醇中的的任意一种或几种的混合物)约8倍量，在70℃下回流提取2h，反复2次，得葎草提取液；取葎草提取液减压回收浓缩，加入适当乙醇使乙醇浓度达到50％-90％，静置沉淀，过滤得滤液，减压回收至滤液无醇味，得滤液，或者取葎草提取液，用石油醚萃取除去脂溶性成分，得滤液，将上述所得滤液浓缩干燥得粗提物。

(2)精制：将步骤(1)中制得的粗提物进行硅胶柱层析，洗脱剂采用体积比为50∶1-40∶1的氯仿-甲醇混合液进行洗脱除杂，再用体积比20∶1-5∶1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比为20∶1-5∶1的氯仿-甲醇洗脱液，浓缩干燥后得葎草有效部位2，其总黄酮含量为30％-80％，主要为芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等。

实施例3

对实施例1和实施例2所得的葎草有效部位进行单体化合物的分离，经反复硅胶柱层析、MCI柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex-LH20(CHCl₃-MeOH＝1∶1，MeOH)柱层析、ODS反相柱色谱和重结晶等分离方法，从中分离得到芹菜素、木犀草素、牡荆素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、蒙花苷和N-p-香豆酰酪胺等单体化合物，其中以芹菜素、木犀草素、牡荆素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等黄酮类化合物为主。

实施例4

取实施例1、实施例2中制备的葎草有效部位及实施例3中分离得到的主要黄酮类化合物芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等进行抗菌活性试验。

(1)实验用药：葎草有效部位1(A₁)、葎草有效部位2(A₂)、芹菜素(A₃)、木犀草素(A₄)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(A₅)和大波斯菊苷(A₆)，阳性对照药：阿莫西林原料药(阿)

(2)实验菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、肺炎克雷伯杆菌、大肠屎球菌、大肠粪球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌

(3)实验方法用试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)：

以阿莫西林为阳性对照，用DMSO-H₂O混合溶剂溶解实验用药，配制实验用药初始浓度为20mg/mL，再按试管二倍稀释，用液体琼脂稀释获得各实验浓度为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL。同法配制阳性对照药物阿莫西林实验浓度为256、128、64、32、16、8、4、2μg/mL，并以DMSO-H₂O混合溶剂为空白对照，接入试验菌种后于37℃培养箱中培养24h，观察得到最低抑菌浓度(MIC)。如表1所示：

表1葎草有效部位及单体化合物对10种细菌的最低抑菌浓度(MIC，μg/mL)

体外抑菌实验显示制得的葎草有效部位对大肠杆菌、大肠屎球菌、大肠粪球菌具有较强的抗菌活性，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌显示了较明显的抑制耐药菌活性。

实施例5 胶囊剂的制备

取制得的葎草提取有效部位25g，粉碎，过80目筛，加入淀粉5g，微晶纤维素适量，混匀，用稀乙醇制粒，60℃干燥，以20目筛整粒，加入适量硬脂酸，混匀，填入胶囊即得。

实施例6 片剂的制备

取制得的葎草提取有效部位25g，粉碎，过80目筛，加入淀粉5g混合均匀，再加入淀粉浆适量制成软材，以20目筛网制粒，60℃干燥，过30目筛网整粒，加入微晶纤维素适量和硬脂酸镁1g，混匀，压片，薄膜包衣即得。

实施例7 口服液的制备

取葎草有效部位50g，粉碎，过80目筛，与蜂蜜500g、蔗糖100g、苯甲酸钠5g和蒸馏水1000mL混合均匀，加热至85-90℃，搅拌使溶解，保温30min，过滤，滤液加水稀释至2000mL，搅拌均匀，封罐灭菌。

Claims

1.一种葎草的有效部位，其特征在于系从葎草全草通过下述方法制备获得：

(2)初步处理：取步骤(1)中制得的提取液，回收浓缩，醇沉浓度50％-90％，静置沉淀，过滤得滤液，回收至滤液无醇味，得滤液A备用，或者取步骤(1)中制得的提取液，用石油醚萃取除杂，得滤液B备用。(3)粗制和精制：取步骤(2)中的滤液A或滤液B通过大孔树脂洗脱，洗脱剂采用水、10％-95％醇(乙醇或甲醇)梯度洗脱，分段收集10％-95％醇洗脱物，浓缩得粗制物，粗制物通过聚酰胺树脂洗脱，洗脱液采用水、20％-95％醇(乙醇或甲醇)梯度洗脱，分段收集20％-95％醇洗脱物，浓缩干燥得葎草有效部位；或取步骤(2)中的滤液A或滤液B进行硅胶柱层析，洗脱剂采用体积比为50∶1-40∶1的氯仿-甲醇混合液洗脱除杂，再以20∶1-5∶1的氯仿-甲醇混合液梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥得葎草有效部位。

2.如权利要求1所述的葎草有效部位，其特征在于该有效部位主要为黄酮类化合物，其总黄酮含量为20％-90％，其组成主要包括芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、牡荆素、蒙花苷及N-p-香豆酰酪胺等。

3.如权利要求1所述的葎草有效部位，其特征在于该有效部位具有显著地抗菌活性，尤其对大肠杆菌、大肠屎球菌、大肠粪球菌具有较强的抗菌活性，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌显示了较明显的抑制耐药菌活性。

4.如权利要求1所述的葎草有效部位的应用，其特征在于该有效部位在治疗细菌感染性引起的腹泻、肠胃炎及肾盂肾炎、急性肾炎、膀胱炎等泌尿系统疾病的药物联合用药方面的应用和制备助消化、预防和保健食品方面的应用。

5.如权利要求1所述的葎草有效部位在中药制剂中的应用，其特征在于该有效部位可加入药物辅料制成片剂、胶囊剂、口服液等剂型。