CN109966330A

CN109966330A - 从三叶木通提取有利尿作用的活性组分、制备方法及应用

Info

Publication number: CN109966330A
Application number: CN201910443730.1A
Authority: CN
Inventors: 陈伟康; 钟瑞建; 袁铭铭; 周国平; 郑洋滨; 胡寿荣; 闵志良; 邓会云; 周雷罡
Original assignee: Jiangxi Institute For Drug Control
Current assignee: Jiangxi Institute For Drug Control
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: CN109966330B

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体公开了从三叶木通提取有利尿作用的活性组分、制备方法及应用。该活性组分从三叶木通提取，包括以下步骤：（1）制备总浸膏，（2）溶剂萃取，（3）萃取液的洗涤与浓缩，（4）硅胶柱层析纯化。经上述方法步骤所得到的活性组分，以质量计含有40%‑90%的总皂苷；所述的总皂苷中包含Saponin PH、Akemisaponins E、Saponin PJ1、Scheffoleoside A四种皂苷，所述的四种皂苷以质量计占活性组分中总皂苷的60%以上；本发明中从三叶木通提取的活性组分，所含四种皂苷具有相互协同作用，不需进行组分分离与纯化，直接用于制备利尿药物。

Description

从三叶木通提取有利尿作用的活性组分、制备方法及应用

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及从三叶木通提取有利尿作用的活性组分、制备方法及应用。

背景技术

三叶木通（Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz.），俗称八月瓜藤、三叶拿藤、八月楂，为木通科，木通属落叶木质藤本植物。其干燥的藤茎具有利尿通淋，清心除烦，通经下乳之功效，用于淋证，水肿，心烦尿赤，口舌生疮，闭经乳少，湿热痹痛。自古以来，三叶木通就用于治疗淋症，《药性论》有记载：“主治五淋，利小便，开关格。治人多睡，主水肿浮大，除烦热。”现代研究表明，木通属植物中的三萜皂苷具有显著的利尿作用，《中华本草》中记载：“木通科木通属植物的主要化学成分为三萜皂苷，具有显著的利尿活性。”目前文献报道有三叶木通化学成分的报道，但如何用简单的方法，有效富集利尿活性强的三萜化合物，提取制备大量可供临床使用的三萜皂苷活性组分研究方面存在空白。

临床上常用的利尿药有噻嗪类（氯噻嗪、氯噻酮、氢氯噻嗪）、髓袢利尿剂（速尿）、保钾利尿剂（螺内酯、安体舒通）、渗透利尿剂（甘露醇、尿素），这些利尿药物都存在不同程度的不良反应，比如心脏毒性、低钾血症、影响糖代谢及脂代谢等。相比之下，三叶木通自古以来临床应用表明，其毒副作用小，从天然药物中开发新的利尿药是非常必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有的常见利尿药存在着不同程度的不良反应等缺陷与不足，提供一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分及其制备方法和在制备利尿药物中的应用。本发明结合古籍记载，及对三叶木通研究现状和临床用途，在对三叶木通进行系统的化学成分研究基础上，优化、简化纯化方法，使三叶木通中四个有较强利尿活性的皂苷在活性组分中含量达到60%以上。本发明从三叶木通提取的活性组分，提取制备过程简单，成本低，利尿效果显著，在开发利尿药物方面具有创新性。

本发明采用如下技术方案，来实现发明目的。

一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分，该活性组分以质量计含有40%-90%的总皂苷；所述的总皂苷中包含Saponin PH、Akemisaponins E、Saponin PJ1、Scheffoleoside A四种皂苷。

所述的Saponin PH、Akemisaponins E、Saponin PJ1、Scheffoleoside A，其结构式依次如下式（1）、式（2）、式（3）、式（4）所示：

式（1）：saponin PH；式（2）：Akemisaponins E；

式（3）：saponin PJ1；式（4）：Scheffoleoside A；

所述的四种皂苷以质量计占活性组分中总皂苷的60%以上。

优选地，所述的活性组分以质量计，含有10-30％的Saponin PH、5-15％的Akemisaponins E、15-35％的Saponin PJ1、2-10％的Scheffoleoside A 。

本发明还提供一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分的制备方法，包括以下步骤：（1）制备总浸膏；（2）溶剂萃取；（3）萃取液的洗涤与浓缩；（4）硅胶柱层析纯化。

步骤（1）中所述的制备总浸膏，具体为：将三叶木通的根、茎或叶晒干切片或粉碎，加5-12倍重量的70-95%的甲醇或乙醇水溶液作为提取溶剂，回流提取1-5次，滤过，减压浓缩或蒸干得总浸膏。

步骤（2）中所述的溶剂萃取，具体为：将总浸膏加2-5倍水分散，依次用等体积的二氯甲烷和正丁醇萃取，各萃取1-4次，收集正丁醇萃取液。

步骤（3）中所述的萃取液的洗涤与浓缩，具体为：依次用等体积氨试液和水对正丁醇萃取液进行洗涤，各洗涤1-4次，弃去洗涤液，减压浓缩或蒸干得正丁醇萃取浸膏。

步骤（4）中所述的硅胶柱层析纯化，具体为：将正丁醇萃取浸膏与1.5倍硅胶拌样上柱，依次用1-5倍柱体积的二氯甲烷或氯仿:甲醇=7:1洗脱溶剂、1-5倍柱体积的二氯甲烷或氯仿:甲醇=1:1洗脱溶剂、2-3倍柱体积的甲醇洗脱溶剂进行洗脱；收集氯仿或二氯甲烷:甲醇=1:1的洗脱流出液，经浓缩结晶得到具有利尿通淋作用的活性组分。

经上述方法步骤所得到的活性组分，以质量计含有40%-90%的总皂苷；所述的总皂苷中包含Saponin PH、Akemisaponins E、Saponin PJ1、Scheffoleoside A四种皂苷；所述的四种皂苷以质量计占活性组分中总皂苷的60%以上。

所述的活性组分以质量计，含有10-30％的Saponin PH、5-15％的AkemisaponinsE、15-35％的Saponin PJ1、2-10％的Scheffoleoside A 。

作为利尿药物的皂苷类活性组分既可从三叶木通中提取，也可从木通、白木通等其它木通品种中提取。但本发明优选从三叶木通中提取，是因为采用的三叶木通不仅具有资源分布广泛、价格便宜，生产工艺简单、较容易大规模生产，更主要的还是从三叶木通中提取的皂苷类活性组分，所含四种主要皂苷类化合物含量之和高达60％以上。而其它木通品种如木通、白木通等，虽然也具有资源分布广泛、价格便宜等特点，但经提取分离后所得的组合物中所含皂苷类化合物含量少而杂，远不如三叶木通多，尤其是四种主要皂苷类化合物含量较少。

另外，本发明还提供一种从三叶木通提取的活性组分在制备利尿药物中的应用。

所述利尿药物其剂型包括：片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、口服液、合剂等常用剂型，或以三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分作为配伍，制成具有协同作用的药物。

有益效果：

（1）本发明从三叶木通中提取的皂苷类活性组分作为利尿药物，该活性组分成分明确，药理作用强，具有良好的药用前景。

（2）本发明采用的三叶木通具有资源分布广泛、价格便宜，生产工艺简单、较容易大规模生产，活性组分中四种主要皂苷类化合物含量之和高达60％以上，所含四种皂苷具有相互协同作用，不需进行组分分离与纯化，具有提取工艺简单、提取成本低廉、提取收率高等特点。

（3）本发明中从三叶木通提取的活性组分在制备利尿药物中，采用的是制药过程中的常用辅料，并可制成如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、口服液、合剂等常用剂型；或者以三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分作为配伍，制作成具有协同作用的药物。

附图说明

图1 为混合对照品色谱图；

图2 为三叶木通活性组分供试品色谱图

图3 化合物（1）Saponin PH的¹H NMR分析图谱；

图4 化合物（1）Saponin PH的¹³C NMR分析图谱；

图5 化合物（2）Akemisaponins E的¹H NMR分析图谱；

图6 化合物（2）Akemisaponins E的¹³C NMR分析图谱；

图7 化合物（3）Saponin PJ1的¹H NMR分析图谱；

图8 化合物（3） Saponin PJ1的¹³C NMR分析图谱；

图9 化合物（4）Scheffoleoside A的¹H NMR分析图谱；

图10 化合物（4）Scheffoleoside A的¹³C NMR分析图谱。

其中图1与图2中的四个色谱峰分别为：1、化合物Saponin PH；2、化合物Akemisaponins E；3、化合物Saponin PJ1；4、化合物Scheffoleoside A。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1：从三叶木通的茎中制备活性组分

将晒干后三叶木通（Akebia trifoLiata (Thunb. )Koidz.）的茎100kg，切片，置于2T容量的提取罐中，加10倍重量的75%乙醇溶液进行热回流3次，滤过，减压浓缩至干得总浸膏。将总浸膏加水1:2分散，依次用等体积的二氯甲烷和正丁醇萃取，各萃取三次，收集正丁醇萃取液。对正丁醇萃取液，依次用等体积氨试液和水洗涤，各洗涤两次，弃去洗涤液，收集正丁醇萃取液，减压浓缩至干得正丁醇液浸膏。正丁醇液浸膏进行硅胶柱层析，1.5倍硅胶拌样上柱，依次用四倍柱体积的氯仿:甲醇=7:1、四倍柱体积的氯仿:甲醇=1:1、三倍柱体积的甲醇洗脱。收集氯仿:甲醇=1:1洗脱流出液，经浓缩结晶得到具有利尿作用活性组分2051g。

实施例2：从三叶木通的根中制备活性组分

将晒干后三叶木通（Akebia trifoLiata (Thunb. )Koidz.）的根100kg，粉碎，置于2T容量的提取罐中，加12倍重量的95%甲醇溶液进行热回流2次，滤过，减压浓缩至干得总浸膏。将总浸膏加水1:4分散，依次用等体积的二氯甲烷和正丁醇萃取，各萃取四次，收集正丁醇萃取液。对正丁醇萃取液，依次用等体积氨试液和水洗涤，各洗涤三次，弃去洗涤液，收集正丁醇萃取液，减压浓缩至干得正丁醇液浸膏。正丁醇液浸膏进行硅胶柱层析，1.5倍硅胶拌样上柱，依次用两倍柱体积的二氯甲烷:甲醇=7:1、两倍柱体积的二氯甲烷:甲醇=1:1、两倍柱体积的甲醇洗脱。收集二氯甲烷:甲醇=1:1洗脱流出液，经浓缩结晶得到具有利尿作用活性组分2186g。

实施例3：从三叶木通的叶中制备活性组分

将晒干后三叶木通（Akebia trifoLiata (Thunb. )Koidz.）的叶100kg，置于2T容量的提取罐中，加5倍重量90%乙醇溶液进行热回流5次，滤过，减压浓缩至干得总浸膏。将总浸膏加水1:5分散，依次用等体积的二氯甲烷和正丁醇萃取，各萃取两次，收集正丁醇萃取液。对正丁醇萃取液，依次用等体积氨试液和水洗涤，各洗涤四次，弃去洗涤液，收集正丁醇萃取液，减压浓缩至干得正丁醇液浸膏。正丁醇液浸膏进行硅胶柱层析，1.5倍硅胶拌样上柱，依次用五倍柱体积的氯仿:甲醇=7:1、五倍柱体积的氯仿:甲醇=1:1、三倍柱体积的甲醇洗脱。收集氯仿:甲醇=1:1洗脱流出液，经浓缩结晶得到具有利尿作用活性组分2011g。

实施例4：从木通的茎中制备活性组分

将晒干后木通（Akebia quinata (Thunb.) Decne.）的茎100kg，切片，置于2T容量的提取罐中，加10倍重量的75%乙醇溶液进行热回流3次，滤过，减压浓缩至干得总浸膏。将总浸膏加水1:2分散，依次用等体积的二氯甲烷和正丁醇萃取，各萃取三次，收集正丁醇萃取液。对正丁醇萃取液，依次用等体积氨试液和水洗涤，各洗涤两次，弃去洗涤液，收集正丁醇萃取液，减压浓缩至干得正丁醇液浸膏。正丁醇液浸膏进行硅胶柱层析，1.5倍硅胶拌样上柱，依次用四倍柱体积的氯仿:甲醇=7:1、四倍柱体积的氯仿:甲醇=1:1、三倍柱体积的甲醇洗脱。收集氯仿:甲醇=1:1洗脱流出液，经浓缩结晶得到组合物1525g。

实施例5：从白木通的茎中制备活性组分

将晒干后白木通（Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz. Var. australis (Diels)Rehd).）的茎100kg，切片，置于2T容量的提取罐中，加10倍重量的75%乙醇溶液进行热回流3次，滤过，减压浓缩至干得总浸膏。将总浸膏加水1:2分散，依次用等体积的二氯甲烷和正丁醇萃取，各萃取三次，收集正丁醇萃取液。对正丁醇萃取液，依次用等体积氨试液和水洗涤，各洗涤两次，弃去洗涤液，收集正丁醇萃取液，减压浓缩至干得正丁醇液浸膏。正丁醇液浸膏进行硅胶柱层析，1.5倍硅胶拌样上柱，依次用四倍柱体积的氯仿:甲醇=7:1、四倍柱体积的氯仿:甲醇=1:1、三倍柱体积的甲醇洗脱。收集氯仿:甲醇=1:1洗脱流出液，经浓缩结晶得到组合物1655g。

实施例6：对三叶木通活性组分中四种主要化合物分离、鉴定

采用制备HPLC分离出其中主要成分并进行核磁共振验证，制备液相采用C₁₈反相分析柱，DAD检测器，以乙腈-水（21:79）为流动相进行洗脱，得到4个主要化合物，对其进行核磁测定，数据如下：

化合物（1）：白色粉末，ESI-MS m/z：947 [M - H]^-。¹H-NMR(600 MHz，C₅D₅N) δ：6.21(1H，d，J =7.8 Hz，glc-H-1)，5.90(1H，br s，rham-H-1)，5.43(1H，br s，H-12)，4.94(1H，d，J = 7.8 Hz，glc′-H-1)，4.72(1H，s，H-29a)，4.66(1H，s，H-29b)，4.22(1H，d，J = 10.8 Hz，H-23a)，3.72(1H，d，J = 10.8 Hz，H-23b)，1.68(3H，d，J = 6.0 Hz，rham-H-6)，1.13(3H，s，H-26)，1.12(3H，s，H-27)，1.11(3H，s，H-25)，1.08(3H，s，H-24)；¹³C-NMR (150 MHz，C₅D₅N)δ：48.0(C-1)，69.4(C-2)，78.6(C-3)，44.1(C-4)，48.3(C-5)，19.0(C-6)，32.3(C-7)，40.5(C-8)，48.6(C-9)，38.9(C-10)，24.4(C-11)，123.0(C-12)，144.0(C-13)，42.6(C-14)，28.7(C-15)，24.0(C-16)，48.3(C-17)，47.8(C-18)，42.1(C-19)，148.8(C-20)，30.5(C-21)，38.1(C-22)，66.8(C-23)，14.9(C-24)，18.0(C-25)，18.1(C-26)，26.5(C-27)，176.3(C-28)，107.9(C-29)，96.2(glc-C-1)，74.3(glc-C-2)，79.1(glc-C-3)，71.5(glc-C-4)，78.6(glc-C-5)，69.8(glc-C-6)，Glc2 105.4(glc′-C-1)，75.9(glc′-C-2)，77.0(glc′-C-3)，78.4(glc′-C-4)，77.6(glc′-C-5)，61.7(glc′-C-6)，102.8(rham-C-1)，73.1(rham-C-2)，73.2(rham-C-3)，74.4(rham-C-4)，70.3(rham-C-5)，18.8(rham-C-6)。化合物结构鉴定为：Saponin PH。

化合物（2）：白色粉末，ESI-MS m/z：965 [M + Na]+。¹H-NMR(600 MHz，C₅D₅N) δ：6.23(1H，d，J = 7.8 Hz，glc-H-1)，5.88(1H，br s，rham-H-1)，5.45(1H，br s，H-12)，5.21(1H，br s，H-21)，4.99(1H，d，J = 7.8 Hz，glc′-H-1)，4.17(1H，m，H-23a)，3.71(1H，d，J =10.2 Hz，H-23b)，1.72(3H，d，J = 6.0 Hz，rham-H-6)，1.60(3H，s，H-29)，1.19(3H，s，H-27)，1.16(3H，s，H-26)，1.13(3H，s，H-25)，1.09(3H，s，H-24)；¹³C-NMR (150 MHz，C₅D₅N) δ：47.8(C-1)，69.0(C-2)，78.3(C-3)，43.8(C-4)，48.1(C-5)，18.7(C-6)，32.6(C-7)，40.2(C-8)，48.3(C-9)，38.5(C-10)，24.1(C-11)，123.2(C-12)，143.7(C-13)，42.2(C-14)，28.7(C-15)，26.0(C-16)，45.2(C-17)，42.2(C-18)，36.9(C-19)，132.8 (C-20)，117.5(C-21)，36.8(C-22)，66.8(C-23)，14.5(C-24)，17.6(C-25)，17.7 (C-26)，27.1(C-27)，176.3 (C-28)，23.3(C-29)，95.8(glc-C-1)，73.9(glc-C-2)，78.4(glc-C-3)，71.1(glc-C-4)，78.7(glc-C-5)，69.6(glc-C-6)，105.2(glc′-C-1)，75.4(glc′-C-2)，76.6(glc′-C-3)，78.6(glc′-C-4)，77.2(glc′-C-5)，61.5(glc′-C-6)，102.8(rham-C-1)，72.6(rham-C-2)，72.8(rham-C-3)，74.1(rham-C-4)，70.4(rham-C-5)，18.5(rham-C-6)。化合物结构鉴定为：Akemisaponins E。

化合物（3）：白色粉末，ESI-MS m/z：1113 [M + Na]⁺。¹H-NMR(600 MHz，C₅D₅N) δ：6.26(1H，d，J = 7.8 Hz，glc-H-1)，5.91(1H，br s，rham-H-1)，5.42(1H，br s，H-12)，5.27(1H，d，J = 7.8，1.8 Hz，xyl-H-1)，4.97(1H，d，J = 7.8 Hz，glc′-H-1)，4.22(1H，d，J =10.8 Hz，H-23a)，3.72(1H，d，J = 10.8 Hz，H-23b)，1.69(3H，d，J = 6.0 Hz，rham-H-6)，1.16(3H，s，H-27)，1.16(3H，s，H-26)，1.13(3H，s，H-25)，1.09(3H，s，H-24)，088(3H，s，H-29)，0.88(3H，s，H-30)；¹³C-NMR (150 MHz，C₅D₅N) δ：47.7(C-1)，68.8(C-2)，78.2(C-3)，43.6(C-4)，47.8(C-5)，18.6(C-6)，34(C-7)，39.9(C-8)，48.1(C-9)，38.3(C-10)，23.9(C-11)，122.7(C-12)，144(C-13)，42.1(C-14)，28.2(C-15)，23.3(C-16)，46.8(C-17)，41.5(C-18)，46.1(C-19)，30.7(C-20)，32.7(C-21)，32.4(C-22)，66.3(C-23)，14.3(C-24)，17.4(C-25)，17.5 (C-26)，25.9(C-27)，176.4 (C-28)，32.9 (C-29)，23.6 (C-30)，95.6(glc-C-1)，73.8(glc-C-2)，78.7(glc-C-3)，71(glc-C-4)，77.9(glc-C-5)，69.2(glc-C-6)，104.9(glc′-C-1)，75.3(glc′-C-2)，76.3(glc′-C-3)，77.1(glc′-C-4)，77.1(glc′-C-5)，61.2(glc′-C-6)，102.4(rham-C-1)，72.1(rham-C-2)，83.3(rham-C-3)，73.0(rham-C-4)，70.0(rham-C-5)，18.5(rham-C-6)，107.4(xyl-C-1)，75.7(xyl-C-2)，78.3(xyl-C-3)，71.1(xyl-C-4)，67.3(xyl-C-5)。化合物结构鉴定为：Saponin PJ1。

化合物（4）：白色粉末，ESI-MS m/z：957 [M - H]^-。¹H-NMR(600 MHz，C₅D₅N) δ：6.23(1H，d，J = 7.8 Hz，glc-H-1)，5.85(1H，br s，rham-H-1)，5.38(1H，br s，H-12)，4.98(1H，d，J = 7.8 Hz，glc′-H-1)，4.11(1H，m，H-23a)，3.65(1H，d，J = 10.2 Hz，H-23b)，1.69(3H，d，J = 6.0 Hz，rham-H-6)，1.13(3H，s，H-27)，1.12(3H，s，H-26)，1.10(3H，s，H-25)，1.06(3H，s，H-24)，0.85(3H，s，H-29)，0.83(3H，s，H-30)；¹³C-NMR (150 MHz，C₅D₅N) δ：47.7(C-1)，68.9(C-2)，78.2(C-3)，43.7(C-4)，48.2(C-5)，18.6(C-6)，32.8(C-7)，40.0(C-8)，47.9(C-9)，38.4(C-10)，24.0(C-11)，122.8(C-12)，144.2(C-13)，42.2(C-14)，28.3(C-15)，23.3(C-16)，47.0(C-17)，41.6(C-18)，46.1(C-19)，30.7(C-20)，32.8(C-21)，32.5(C-22)，66.4(C-23)，14.4(C-24)，17.5(C-25)，17.6 (C-26)，26.1(C-27)，176.5(C-28)，33.1(C-29)，23.7(C-30)，95.7(glc-C-1)，74.0(glc-C-2)，78.1(glc-C-3)，70.9(glc-C-4)，77.2(glc-C-5)，69.2(glc-C-6)，104.9(glc′-C-1)，75.4(glc′-C-2)，76.5(glc′-C-3)，78.8(glc′-C-4)，78.2(glc′-C-5)，61.3(glc′-C-6)，102.8(rham-C-1)，72.6(rham-C-2)，72.8(rham-C-3)，74.0(rham-C-4)，70.3(rham-C-5)，18.6(rham-C-6)。化合物结构鉴定为：Scheffoleoside A。

实施例7：对木通活性组分中四个主要化合物含量测定

1、采用HPLC对木通活性组分进行定量测定：

色谱条件：依利特C₁₈色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)，DAD检测器，检测波长：200 nm，柱温：30 ℃。以乙腈-水(21:79)为流动相，流速：1.0 mL·min^-1，进样量：10 μL。

按照实施例1-5所述的的制备方法与步骤，每例重复制备试样两批，五组实施例共制得A-J十批试样，选取对照品进行对照，采用外标一点法计算上述四种化合物含量（以质量百分比计）。

十批木通活性组分中四种化合物的含量测定结果如表1所示：

表1 木通活性组分中四种化合物的含量测定结果

从上述测定结果可知：A-F六批试样中四种皂苷占活性组分总量的平均值为66.83%，而G-J四批试样中四种皂苷占活性组分总量的平均值仅为37.93%。说明从三叶木通提取的活性组分中所含四种主要皂苷类化合物含量之和高达60％以上，而从其它如木通、白木通等木通品种中提取的活性组分中所含四种主要皂苷类化合物含量少而杂，远不如三叶木通多，所以本发明优选为从三叶木通中提取具有利尿作用的活性组分。

2. 对含量测定方法进行精密度、稳定性、重复性和回收率试验等方法学研究，结果如表2所示。

表2 精密度、稳定性、重复性和回收率试验结果

实施例8：对三叶木通活性组分利尿作用的评价

实验动物：雄性SD大鼠120只，体重180～220 g。实验分为10组：具体为：1-空白对照组，2-阳性对照组（氢氯噻嗪），3-三叶木通活性组分低剂量组，4-三叶木通活性组分中剂量组，5-三叶木通活性组分高剂量组，6-单组份Ⅰ组（Saponin PH），7-单组份Ⅱ组（AkemisaponinsE），8-单组份Ⅲ组（Saponin PJ1），9-单组份Ⅳ组（Scheffoleoside A），10-木通水煎液对照组。

实验所用到的氢氯噻嗪从商业渠道购买得到、Saponin PH、Akemisaponins E、Saponin PJ1、Scheffoleoside A等药物，均为本实验室分离纯化得到。

实验动物筛选：雄性SD大鼠120只，预先置于代谢笼内适应环境2d，禁食不禁水18h后，用手轻压大鼠腹部，使其排尽余尿，然后按40mL·kg^-1体重灌胃给予0.9%氯化钠溶液，立即将大鼠放入代谢笼中，收集2h尿液，选用尿量达灌胃量的40%以上者为合格实验动物（水负荷模型动物）。

造模及给药：合格大鼠随机分成10组，每组10只，依次为空白对照组、阳性对照组、三叶木通活性组分高剂量、三叶木通活性组分中剂量、三叶木通活性组分低剂量、单组份Ⅰ组（Saponin PH）、单组份Ⅱ组（Akemisaponins E）、单组份Ⅲ组（Saponin PJ1）、单组份Ⅳ组（Scheffoleoside A）。各组动物均灌胃给药，连续7d，每天1次。末次给药前禁食不禁水18h，每组均按生理盐水40mL·kg^-1灌胃，造成水钠潴留状态。30min后按10mL·kg^-1灌胃给药，空白对照组给予生理盐水，阳性对照组给予氢氯噻嗪（8.33mg/kg），低、中、高剂量组分别给予三叶木通活性组分的10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg，对于单组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，分别给予20mg/kg的Saponin PH、Akemisaponins E、Saponin PJ1、Scheffoleoside A，木通水煎液对照组给予10ml/kg的木通水煎液(1公斤三叶木通干片加水煎煮1小时后并定容至10升）。给药结束后，轻压大鼠的下腹部使膀胱中尿液排尽，然后置于代谢笼内，分别于药后2、4、6h收集药液1次，共收集3次，最后一次收集尿液前轻压大鼠的下腹部使膀胱中尿液排尽，记录各组大鼠给药后0～2h、2～4h、4～6h的尿量及6 h 内的总尿量。收集6h总尿量，测定尿液pH及Na⁺、K⁺、Cl^-的浓度。

采用pH计测定大鼠尿液pH值。采用原子吸收分光光度计，以标准浓度法测定尿液中Na⁺、K⁺，配制标准溶液，建立浓度与吸光度的标准曲线，在相同条件下测定样品的吸光度，由标准曲线求得尿液中所测元素。尿液中Cl^-浓度的测定采用化学滴定法，精确吸取尿液1.00ml于锥形瓶中，加去离子水19.00ml，10%K₂CrO₄溶液4～5滴，缓缓滴加AgNO₃标准液，边滴边摇直至桔红色不再褪去为止，记录消耗AgNO₃标准液的体积，计算尿液中Cl^-浓度。

实验数据以±S 表示，采用SPSS19.0软件方差分析对数据进行统计处理。P＜0.05表示差异具统计学意义。

表3 三叶木通活性组分对水负荷大鼠尿量的影响（±S，n=10）

与空白对照组比较，^*：P＜0.05，^**：P＜0.01;与中剂量组比较，^#：P＜0.05，^##：P＜0.01

表3表明，从给药2h、4h、6h各段尿量看，三叶木通活性组分的中、高剂量组尿量在各时间段均有明显增加。从6h总尿量看，三叶木通活性各剂量组的总尿量均有显著性增加。

给药2h后，单组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与空白对照组比较，尿量亦有显著性增加。单组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的6h总尿量与空白对照组比较，亦有显著性增加。三叶木通活性中剂量组的6h总尿量与单组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组有显著性增加。说明从三叶木通中制备所得到的活性组分利尿效果显著，同时说明本发明所含的四种活性组分具有协同利尿作用。

三叶木通活性组分的中剂量组与木通水煎液对照组比较，有显著性差异。说明采用传统的中药水煎法获得的木通水煎液，因未进行提纯精制，所含组分复杂，无法达到本发明的利尿效果。

三叶木通活性组分的低中高剂量三个组比较，尿量大小为:高剂量>中剂量>低剂量。

表4三叶木通活性组分对水负荷大鼠pH值及电解质的影响（±S，n=10）

与空白对照组比较，^*：P＜0.05，^**：P＜0.01与中剂量组比较，^#：P＜0.05，^##：P＜0.01

由表4可见，水负荷大鼠在给药6h后，三叶木通活性组分中剂量组Na⁺ 、K⁺ 、Cl^-排出量较单组份的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组有明显增加；与空白对照组比较，有显著性差异。

实验结论：本实验通过对大鼠给药7天，观察三叶木通活性组分及单组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对水钠潴留大鼠的排尿量及电解质的影响。由实验结果可以看出，本发明所含的四种活性组分具有协同利尿作用，三叶木通活性组分较单组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ能显著增加大鼠的尿液排出量，同时增加Na⁺ 、K⁺ 、Cl^-排出，改善大鼠的水钠潴留状态。该三叶木通活性组分制备简单，较单组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ利尿活性强，具有利尿药物开发前景。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。

Claims

1.一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分，其特征在于：该活性组分以质量计含有40%-90%的总皂苷；所述的总皂苷中包含Saponin PH、Akemisaponins E、SaponinPJ1、Scheffoleoside A四种皂苷。

2.根据权利要求1 所述的一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分，其特征在于：所述的Saponin PH、Akemisaponins E、Saponin PJ1、Scheffoleoside A，其结构式依次如下式（1）、式（2）、式（3）、式（4）所示：

式（1）：saponin PH；式（2）：Akemisaponins E；

式（3）：saponin PJ1；式（4）：Scheffoleoside A。

3.根据权利要求1 所述的一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分，其特征在于：所述的活性组分以质量计，含有10-30％的Saponin PH、5-15％的Akemisaponins E、15-35％的Saponin PJ1、2-10％的Scheffoleoside A 。

4.一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备总浸膏；（2）溶剂萃取；（3）萃取液的洗涤与浓缩；（4）硅胶柱层析纯化。

5.根据权利要求4所述的一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的制备总浸膏，具体为：将三叶木通的根、茎或叶晒干切片或粉碎，加5-12倍重量的70-95%的甲醇或乙醇水溶液作为提取溶剂，回流提取1-5次，滤过，减压浓缩或蒸干得总浸膏。

6.根据权利要求4所述的一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的溶剂萃取，具体为：将总浸膏加2-5倍水分散，依次用等体积的二氯甲烷和正丁醇萃取，各萃取1-4次，收集正丁醇萃取液。

7.根据权利要求4所述的一种从三叶木通提取的具有利尿作用的活性组分的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的萃取液的洗涤与浓缩，具体为：依次用等体积氨试液和水对正丁醇萃取液进行洗涤，各洗涤1-4次，弃去洗涤液，减压浓缩或蒸干得正丁醇萃取浸膏。

8.根据权利要求4所述的活性组分的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的硅胶柱层析纯化，具体为：将正丁醇萃取浸膏与1.5倍硅胶拌样上柱，依次用1-5倍柱体积的二氯甲烷或氯仿:甲醇=7:1洗脱溶剂、1-5倍柱体积的二氯甲烷或氯仿:甲醇=1:1洗脱溶剂、2-3倍柱体积的甲醇洗脱溶剂进行洗脱；收集氯仿或二氯甲烷:甲醇=1:1的洗脱流出液，经浓缩结晶得到具有利尿作用的活性组分。

9.一种从三叶木通提取的活性组分的应用，其特征在于：制备利尿药物。

10.根据权利要求9所述的一种从三叶木通提取的活性组分的应用，其特征在于：所述利尿药物其剂型包括：片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、口服液、合剂等常用剂型，或以三叶木通提取的活性组分作为配伍，制成具有协同作用的药物。