CN101455750A - 黄连解毒汤活性部位的提取方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药复方黄连解毒汤活性部位的提取方法及其在制备抗血管性痴呆药物中的应用，本发明所公开的提取方法采用了膜微滤、大孔树脂吸附等工业化的分离精制技术，大大降低了制剂的得膏率，最大限度地保留了有效成分，提高了原料药中有效成分的转移率及制剂中有效成分的纯度，所提取的活性部位包括3类已知的化学成分，分别是：生物碱类、黄酮苷类和环烯醚萜苷类，该活性部位具有抗血管性痴呆的作用。

Description

黄连解毒汤活性部位的提取方法及应用

一、技术领域

本发明涉及一种中药复方黄连解毒汤活性部位的提取方法及其在制备抗血管性痴呆药物中的应用，属于中药复方活性部位提取方法技术领域。

二、背景技术

随着世界人口的老龄化，老年痴呆成为威胁老人晚年生活的主要疾病之一，研究对于此病的治疗药物具有重要作用。老年痴呆分为血管性痴呆(vasculardisease，VD)和老年性痴呆(alzheimer disease，AD)两大类。

为了寻找治疗老年痴呆的药物，世界各国学者都在努力寻找抗老年痴呆的新药和新的治疗方法。目前已经有多种治疗药物，如乙酰胆碱酯酶抑制剂它克林、毒扁豆碱、加兰他敏、齐多哌啶、石杉碱甲等，此类药物能够增强AD病人的认知能力，但因其具有中枢或外周系统副作用而使其应用受到限制。近年来，以中医理论为指导，探讨老年痴呆的病因病机，采用辨证论治、辨证与辨病相结合、专方专药等方法，开展中医药治疗老年痴呆的相关研究，取得了满意的进展。对于VD病因病机的认识大体趋于一致，认为该病病位在脑，与肾关系密切，且涉及心、肝、脾等脏腑。病性属以虚为本，以实为标。由于脏腑虚衰，阴精亏空，不能上充于脑，复加痰浊淤血等毒血内生，使虚、痰、瘀互结于上，损伤脑络而元神失聪。根据现代中医“毒损脑络”学说，清热解毒中药用于防治老年痴呆成为一条有意义的、新的重要途径。

黄连解毒汤作为清热解毒的经典方，已在国内外临床用于治疗脑血管障碍后遗症，但目前该复方制剂的质量和科技含量仍亟待提高。

三、发明内容

技术问题：

本发明提供了一种利用膜与树脂联用技术从中药经典复方黄连解毒汤中提取有效部位的方法及其在制备治疗血管性痴呆药物中的应用。

技术方案：

本发明的技术解决方案为：

一种黄连解毒汤活性部位的提取方法，步骤为：a.按质量比为9:6:6:9称取黄连(Rhizoma Coptidis)、黄芩(Radix Scutellariae)、黄柏(Cortex PhellodendriChinensis)、栀子(Fructus Gardeniae)四种原料；b.将四种原料混合均匀，加水煎煮2-3次，每次煎煮1-2小时，过滤，合并各次的煎煮液，放冷至室温后离心，取药液；收集沉淀，得沉淀物I；c.将上述离心所得的药液通过无机陶瓷膜进行微滤，收集得到微滤液；d.将上述微滤液过AB-8大孔吸附树脂柱，乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液在60-70℃下减压浓缩回收乙醇，得浸膏II；e.沉淀物I减压烘干后，以乙醇索氏提取，提取液在60-70℃下减压浓缩回收乙醇，得浸膏III；f.将浸膏II与浸膏III合并，混合均匀，干燥得黄连解毒汤干浸膏，即为黄连解毒汤活性部位，该活性部位按质量百分含量计含有以下主要成分：盐酸小檗碱10-15％、黄芩苷15-20％、栀子苷10-15％。

其中，步骤b中各次加水量为：第1次加水量为四种原料总质量的10倍，第2次或第3次加水量各为四种原料总质量的8倍；步骤c所述的无机陶瓷膜为0.2μm的Al₂O₃陶瓷膜；步骤d中的洗脱步骤所用的乙醇的体积百分浓度为60-80％，所述洗脱液减压浓缩至密度为1.02-1.10；步骤e中的索氏提取所用的乙醇的体积百分浓度为60-80％，所述提取液减压浓缩至密度为1.02-1.10；步骤f中的干燥步骤为低于80℃温度下减压干燥。

按照上述方法提取的黄连解毒汤活性部位在制备抗血管性痴呆药物中的应用：按照上述方法提取的黄连解毒汤活性部位与药学上可接受的载体混合，制成片剂、胶囊剂或颗粒剂。

其中，片剂的制备方法为：黄连解毒汤干浸膏10～12份质量份，加入辅料硬脂酸镁0.03～0.06份质量份，微晶纤维素0.001～0.003份质量份，淀粉2～4份质量份，糊精1～2份质量份，混匀，制粒，压片，质检，分装，制成片剂。

胶囊剂的制备方法为：黄连解毒汤干浸膏13～15份质量份，加入辅料淀粉2～4份质量份，糊精1～2份质量份，混匀，制粒，装胶囊，质检，制成胶囊剂。

颗粒剂的制备方法为：黄连解毒汤干浸膏3～5份质量份，加入辅料淀粉1～3份质量份，混匀，制粒，分装，质检，制成颗粒剂。

有益效果：

本项发明提供了一种中药复方黄连解毒汤的有效部位的提取方法及其在制备治疗血管性痴呆药物中的应用。在本发明中，我们根据现代中医“毒损脑络”学说，从清热解毒经典方黄连解毒汤中分离得到用于制备治疗血管性痴呆药物的活性成分，并在此基础上研制中药复方新制剂。

黄连解毒汤在传统的水煎煮提取时产生大量的沉淀，如果简单地将沉淀作为杂质去除，沉淀中存在的大量有效成分小檗碱、黄芩苷等也将被作为杂质去除，造成原料浪费和提取物的药效降低，因此，本发明在沉淀离心步骤后进行了醇提取处理，不仅保留了大量的有效成分，而且去除了沉淀中大分子蛋白质、淀粉和细微的药渣、泥沙等无效成分，合理地利用了沉淀中的药效成分。

同时，本发明亦考虑到黄连解毒汤的传统水煎煮提取得膏率在25％左右，如果制成片剂、胶囊、颗粒剂等现代用药剂型，由于提取物所含的大量无效杂质，其最终产品临床服用量大，病人适宜性较差；并且产品的吸湿性较强，不易保存；运用现代分析技术，如高效液相色谱法、薄层色谱法检查对产品进行有效成分的定量测定和定性鉴别时，需要大量的前处理工作，造成检测结果偏差较大。考虑到上述原因对黄连解毒汤在临床应用上造成的限制，本发明人在前期大量实验工作的基础上，采用膜微滤、大孔树脂吸附等工业化的分离精制技术来提取复方黄连解毒汤的有效部位，突出效果表现在：

①大大降低了制剂的得膏率，最大限度地保留了有效成分，尽可能地去除了水煎液中的大量高分子无效成分，如蛋白质、淀粉、树脂、鞣质等，以及许多微粒、亚微粒、絮状物等杂质，提高了原料药中有效成分的转移率及制剂中有效成分的纯度。试验表明，采用膜与树脂联用的方法，小檗碱、栀子苷转移率可达85％，黄芩苷转移率可达80％。

②提取过程中以膜微滤技术取代传统的醇沉淀去除大分子杂质的流程，大大缩短了生产时间、降低了生产成本、节约了能源。

③提取过程采用目前已实现工业化的膜微滤、大孔树脂吸附技术，便于由实验室技术转化为大生产工艺。

④本方法制得的药物组合物纯度高，其得膏率在6％左右，便于制成片剂、胶囊、颗粒剂等现代用药剂型，产品临床服用量小，病人适宜性较强。

⑤本方法制得的药物组合物及其制剂，可运用现代分析技术高效液相色谱法、薄层色谱法等进行有效成分的定量测定和定性鉴别，方法可靠，精确度高。

因此，本发明制得的药物组合物及其制剂服用量小，疗效显著，毒副作用小，对提高中医药治疗老年痴呆的水平及加快中药现代化与产业化进程，有着极其重要的意义。

同时，本发明所涉及的中药材药源丰富、价格低廉、服用方便、无明显毒副作用，在国内外有广阔的市场和良好的开发前景，推广应用后将会取得显著的社会效益和经济效益。

五、具体实施方式

实施例1：黄连解毒汤胶囊的制备

取黄连、黄芩、黄柏、栀子，按照9:6:6:9质量比投料6000克，混合均匀，加水煎煮2次，第一次加水60升，煎煮1.5小时，第二次加水48升，煎煮1.5小时，过滤，合并两次的煎煮液；放冷至室温后入管式离心机，以6000r/min的转速高速分离，取药液，同时收集沉淀I备用；离心所得药液过0.2μm的Al₂O₃陶瓷膜进行微滤，收集得微滤液；微滤液上AB-8大孔吸附树脂柱，树脂量为2.5倍药材量，蒸馏水6倍柱体积冲洗后，以体积百分浓度为70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，在60～70℃下减压浓缩回收乙醇，减压浓缩至相对密度1.02-1.10，得浸膏II备用；沉淀物I减压烘干后，以体积百分浓度为70％的乙醇索氏提取，提取液在60～70℃下减压浓缩回收乙醇，减压浓缩至相对密度1.02-1.10，得浸膏III；合并浸膏II和III，混合均匀，低温(低于80℃)减压干燥得黄连解毒汤干浸膏，即为要提取的黄连解毒汤活性部位。

上述黄连解毒汤干浸膏340克，加入淀粉90克，糊精30克，混匀，制粒，装0号胶囊，每粒0.4克制成胶囊剂。

实施例2：黄连解毒汤片剂的制备方法

取黄连、黄芩、黄柏、栀子，按照9:6:6:9重量份投料6000克，混合均匀，加水煎煮2次，第一次加水60升，煎煮1.5小时，第二次加水48升，煎煮1.5小时，过滤，合并两次的煎煮液；放冷至室温后入管式离心机，以6000r/min的转速高速分离，取药液，同时收集沉淀I备用；离心所得药液过0.2μm Al₂O₃陶瓷膜进行微滤，收集得微滤液；微滤液上AB-8大孔吸附树脂柱，树脂量为2.5倍药材量，蒸馏水6倍柱体积冲洗后，以体积百分浓度为60％的乙醇洗脱，收集洗脱液，在60～70℃下减压浓缩回收乙醇，减压浓缩至相对密度1.02-1.10，得浸膏II备用；沉淀物I减压烘干后，以体积百分浓度为60％的乙醇索氏提取，提取液在60～70℃下减压浓缩回收乙醇，减压浓缩至相对密度1.02-1.10，得浸膏III；合并浸膏II和III，混合均匀，低温(低于80℃)减压干燥得黄连解毒汤干浸膏，即为要提取的黄连解毒汤活性部位。

上述黄连解毒汤干浸膏350克，加入淀粉80克、糊精25克；再加入质量为干浸膏质量0.5％的硬脂酸镁、质量为干浸膏质量0.01％的微晶纤维素，混匀，制粒，按每片0.4克压制成片剂。

实施例3：黄连解毒汤颗粒剂的制备方法

取黄连、黄芩、黄柏、栀子，按照9:6:6:9质量比投料6000克，混合均匀，加水煎煮3次，第一次加水60升，煎煮1.5小时，第二和第三次各加水48升，每次煎煮1.5小时，过滤，合并三次的煎煮液；放冷至室温后入管式离心机，以6000r/min的转速高速分离，取药液，同时收集沉淀I备用；离心所得药液过0.2μm Al₂O₃陶瓷膜进行微滤，得微滤液；微滤液上AB-8大孔吸附树脂柱，树脂量为2.5倍药材量，蒸馏水6倍柱体积冲洗后，以体积百分浓度为80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，在60～70℃下减压浓缩回收乙醇，减压浓缩至相对密度1.02-1.10，得浸膏II备用；沉淀I减压烘干后，以体积百分浓度为80％的乙醇索氏提取，提取液在60～70℃下减压浓缩回收乙醇，减压浓缩至相对密度1.02-1.10，得浸膏III；将浸膏II和III合并，混合均匀后，低温(低于80℃)减压干燥得黄连解毒汤干浸膏，即为要提取的黄连解毒汤活性部位。

上述黄连解毒汤干浸膏350克，加入淀粉90克，混匀，制粒，制成颗粒剂。

实施例4  黄连解毒汤干浸膏中三种成分的结构鉴定

取黄连解毒汤干浸膏100克，用硅胶(0.063～0.200mm)柱层析分离，二氯甲烷-甲醇(100:0～100:20)梯度洗脱，每份0.05体积份，共收集1000份。其中二氯甲烷-甲醇100∶5洗脱部分合并后，经Sephadex LH-20柱层析(甲醇-水1:1)纯化后，重结晶得小檗碱；二氯甲烷-甲醇100:10洗脱部分合并后，再经硅胶(0.063～0.200mm)柱层析分离，二氯甲烷-甲醇(100:5～100:15)梯度洗脱，每份0.05体积份，共收集200份，其中二氯甲烷-甲醇100:8洗脱部分合并后，经Sephadex LH-20柱层析(甲醇-水1:1)纯化后，重结晶得栀子苷；二氯甲烷-甲醇100:15洗脱部分合并后，再经硅胶(0.063～0.200mm)柱层析分离，二氯甲烷-甲醇(100:10～100:18)梯度洗脱，每份0.05体积份，共收集400份，其中二氯甲烷-甲醇100:13洗脱部分合并后，经Sephadex LH-20柱层析(甲醇-水1:1)纯化后，重结晶得黄芩苷。

上述3个化合物的结构经理化常数测定及波谱学方法予以确定。其理化性质及波谱学数据如下：

小檗碱(berberine)，橙黄色针晶，分子式C₂₀H₁₈NO₄，分子量336，mp145～146℃，溶于甲醇、热水中。与碘化铋钾试剂反应生成红色沉淀。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)谱数据：δ9.90(1H，s，H-7)，8.97(1H，s，H-14)，8.20(1H，d，J＝9Hz，H-9)，8.01(1H，d，J＝9Hz，H-10)，8.00(1H，s，H-4)，7.09(1H，s，H-1)，6.18(2H，t，-CH2-)，4.94(2H，t，H-16)，4.09(3H，s，OCH₃-19)，4.07(3H，s，OCH₃-20)，3.21(2H，t，H-17).¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)谱数据：δ105.5(C-1)，150.0(C-2)，147.9(C-3)，108.6(C-4)，121.5(C-5)，137.6(C-6)，126.8(C-7)，133.2(C-8)，123.7(C-9)，120.5(C-10)，143.8(C-11)，150.5(C-12)，120.3(C-13)，145.7(C-14)，62.0(C-16)，26.5(C-17)，130.9(C-18)，57.3(C-19)，55.4(C-20)，102.3(C-21).

栀子苷(geniposide)，白色粉末，分子式C₁₇H₂₄O₁₀，分子量388，mp158～159℃，溶于甲醇，Molish反应阳性。IR v _max ^KBrcm^-1：3450(-OH)，1710(C＝O)，1640(C＝C).¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)谱数据：δ7.34(1H，s，H-3)，5.65(1H，br.s，H-7)，5.05(1H，d，J＝6.8Hz，H-1)，4.61(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)，4.05(2H，q，H-10)，3.54(3H，s，H-12).¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)谱数据：δ98.4(C-1)，155.0(C-3)，110.9(C-4)，37.8(C-5)，34.3(C-6)，125.5(C-7)，144.0(C-8)，45.7(C-9)，59.2(C-10)，166.8(C-11)，51.0(C-12)，99.2(C-1′)，73.1(C-2′)，77.2(C-3′)，69.8(C-4′)，76.5(C-5′)，60.8(C-6′).

黄芩苷(baicalin)，黄色粉末，分子式C₂₁H₁₈O₁₁，分子量446，mp221～222℃，溶于甲醇中。盐酸-镁粉反应阳性，Molish反应阳性。IR v _max ^KBrcm^-1：3560(-OH)，1720(C＝O)，1655，1600，1565(苯环)，1060，905，820，800.¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)谱数据：δ7.03(1H，s，H-8)，6.65(1H，d，J＝1.5Hz，H-3)，5.79(1H，d，J＝7.5Hz，H-5′′)，4.66(1H，d，J＝9.7Hz，H-1′′)，7.19～7.27(3H，m，H-2′，4′，6′)，7.60～7.62(2H，m，H-3′，5′).¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)谱数据：δ151.0(C-2)，103.7(C-3)，170.6(C-4)，146.4(C-5)，130.1(C-6)，162.7(C-7)，93.7(C-8)，148.5(C-9)，105.7(C-10)，131.0(C-1′)，125.1(C-2′，6′)，127.7(C-3′，5′)，130.4(C-4′)，100.4(C-1′′)，72.7(C-2′′)，75.9(C-3′′)，70.2(C-4′′)，75.7(C-5′′)，181.7(C-6′′).

实施例5：黄连解毒汤干浸膏中三种成分的含量测定

1、仪器与药材

1.1 仪器：Agilent 1100液相色谱(Agilent 1100四元泵；DAD检测器；自动进样器；Agilent 1100LC色谱工作站)；色谱柱：Kromasil C18柱(4.6×250mm，5μm)(江苏汉邦公司)；电子天平：AEL-40SM十万分之一电子天平(Shimadzu Libror)；流动相：乙腈、甲醇为色谱纯(江苏汉邦公司)；水为纯净水：其余试剂均为分析纯。

1.2 药材：均购自南京市药材公司，黄柏批号050926，黄芩批号051015，黄连批号050926，栀子批号041106。

1.3 对照品：均购自中国药品与生物制品检定所，供含量测定用。盐酸小檗碱批号 110713-200208，黄芩苷批号 110715-200212，栀子苷批号 110749-200511。

2、实验结果

2.1 目标成分检测方法：盐酸小檗碱、黄芩苷、栀子苷3种成分HPLC检测方法如下：

流动相：A相：乙腈，B相：0.5％(体积百分比)三乙胺+磷酸调PH3.1；梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长238nm、265nm、280nm。

2.2 目标成分检测方法：

表1  黄连解毒汤干浸膏九批样品数据

实施例6：黄连解毒汤干浸膏对实验诱导损伤的PC-12细胞保护作用的初步研究

神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是一种由118个氨基酸组成的碱性蛋白质，对中枢和外周神经系统均有营养活性。NGF的主要生理作用是促进神经系统的发育，使感觉神经节和交感神经节数目增加、体积增大、神经纤维延长；保护并修复受损神经元，在神经系统损伤后起到营养和修复作用，尤其对胆碱能神经元的生长和修复具有重要意义。

老年痴呆症包括血管性痴呆和老年性痴呆，是一种慢性进行型退化疾病。动物实验证明，NGF能防止轴突损伤的基底前脑胆碱能神经元变性、死亡，并能改善老年动物的胆碱能功能。因此，人们希望能应用NGF来治疗老年痴呆症。尽管NGF存在于自然界，如蛇毒、小鼠颌下腺和牛精囊腺等，但由于其分子量较大，不能透过大脑屏障，因此没有直接的治疗作用。

近年来人们发现可以透过大脑屏障的某些小分子化合物能促进脑内NGF的生物合成，故称之为NGF促进剂。细胞实验证明，许多天然小分子化合物具有NGF诱导活性，因此，通过高通量筛选，从天然产物，特别是中草药中寻找外源性NGF诱导剂，作为新药开发的前体物，成为研究治疗老年痴呆症新药的一条捷径。

PC 12(大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞)具有神经内分泌细胞的一般特征，运用PC 12细胞体外模型试验，检测单体化合物的NGF诱导活性，现已广泛应用于神经生理及神经药理研究。

1、实验材料

1.1 动物：SD大鼠，雄性，体重(250±20)g，南京中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK-(苏)2002-0012。

1.2 试剂与仪器：小牛血清购自杭州四季青生物公司；噻唑蓝(MTT)购自AMRESCO公司，批号DZ0793；RPMI1640培养基购自GIBCO公司；胰蛋白酶购自GIBCO公司；96孔培养板购自COSTA公司；氯化钾、过氧化氢、连二亚硫酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；PBS实验室自制。低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)；莱卡倒置显微镜(莱卡公司)；电子天平(北京塞多利斯天平有限公司)；电热恒温水浴锅(北京东霞科学仪器厂)；酶标仪(AD公司，SPECTRA MAX 190)；精密移液器(吉尔森公司)；全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；5％CO₂培养箱(Forma公司)。PC12细胞株由南京中医药大学陆茵教授惠赠。以高糖DMEM培养液，内含10％小牛血清0.10583mg/L青霉素，100mg/L链霉素，pH7.2培养。

2、实验方法

2.1 含药血清的制备：按照每人每日临床用量的三倍量给大鼠灌胃(8.1g生药/kg)，正常对照组给予同等体积的生理盐水，连续5d，第5d灌胃后2h(灌药前禁食12h，不禁水)10％水合氯醛腹腔注射麻醉，颈动脉取血，剪开颈部皮肤，钝性分离至肌层，暴露一侧颈动脉，结扎远心端。近心端一侧打一活结，动脉夹夹闭近心端。眼科剪做“V”接口，插入动脉插管并固定，打开动脉夹，将血引流至一次性塑料管中。将血液放置37℃水浴锅温育30min，待血液完全凝固且有血清析出时，用一干净的细铁丝拨动血凝块，2000r/min，10min，将血清收集于干净的离心管中。然后56℃、30min水浴灭活，在超净台上用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，置于-20℃冰箱保存。

2.2 PC-12细胞培养：将复苏后的PC12细胞接种于75ml培养瓶，培养液为含10％小牛血清的DMEM培养液，待37℃、5％CO₂饱和湿度下长成单层后，加入0.25％胰蛋白酶于37℃消化，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板，细胞密度为1×10⁵细胞/ml置于37℃、5％CO₂下继续培养24h后，观察黄连解毒汤各组合分离部位含药血清对PC12细胞损伤模型的影响。

2.3 MTT法测定细胞活力：于实验结束前4h加入终浓度为0.5g/L的MTT，37℃、5％CO₂下作用4h后弃去上清液，每孔加入100μL DMSO，置振荡器上振荡10min使结晶充分溶解，用酶标仪测定OD₅₇₀值，观察细胞活力，进行t检验，并计算含药血清对PC12细胞的保护率＝(含药血清组OD₅₇₀-模型组OD₅₇₀)/(正常组OD₅₇₀-模型组OD₅₇₀)×100％。

2.4 黄连解毒汤干浸膏含药血清对过氧化氢(H₂O₂)诱导的PC-12细胞损伤的影响：取长满单层PC12细胞的96孔培养板，弃去培养液，用PBS液洗涤2次，加入无血清DMEM，每孔加入终浓度200μmol/L的过氧化氢造模，然后加入10％含药血清。37℃、5％CO₂培养箱作用3h，弃去培养液用PBS液洗涤2次，加入无血清DMEM培养24h。在造模过程中及造模后，均加入相应浓度的药物血清。MTT法观察细胞活力。

2.5 黄连解毒汤干浸膏含药血清对氯化钾(KCl)诱导的PC-12细胞损伤的影响：取长满单层PC12细胞的96孔培养板，弃去培养液，用PBS液洗涤2次，加入无血清DMEM，每孔加入终浓度800mmol/L的KCl造模，然后加入10％含药血清。37℃、5％CO₂培养箱作用15min，弃去培养液用PBS液洗涤2次，加入无血清DMEM培养24h。在造模过程中及造模后，均加入相应浓度的药物血清。MTT法观察细胞活力。

2.6 黄连解毒汤干浸膏含药血清对连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)诱导的PC-12细胞损伤的影响：取长满单层PC12细胞的96孔培养板，弃去培养液，用PBS液洗涤2次，加入无血清DMEM，每孔加入终浓度8mmol/L的Na₂S₂O₄造模，然后加入10％含药血清。37℃、5％CO₂培养箱作用3h，弃去培养液用PBS液洗涤2次，加入无血清DMEM培养24h。在造模过程中及造模后，均加入相应浓度的药物血清。MTT法观察细胞活力。

3、实验结果

表1  黄连解毒汤干浸膏含药血清对H₂O₂诱导的PC-12细胞损伤的影响

(x±s，n＝6)

注：与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

表2 黄连解毒汤干浸膏含药血清对KCl诱导的PC-12细胞损伤的影响

(x±s，n＝6)

注：与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

表3 黄连解毒汤干浸膏含药血清对Na₂S₂O₄诱导的PC-12细胞损伤的影响

(x±s，n＝6)

注：与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

4、实验结论

三种损伤细胞模型实验结果表明，全方原液及黄连解毒汤干浸膏含药血清对三种损伤模型均有保护作用。

Claims (8)

1、一种黄连解毒汤活性部位的提取方法，其特征在于步骤为：

a.按质量比为9:6:6:9称取黄连、黄芩、黄柏、栀子四种原料：

b.将四种原料混合均匀，加水煎煮2-3次，每次煎煮1-2小时，过滤，合并各次的煎煮液，放冷至室温后离心，取药液；收集沉淀，得沉淀物I；

c.将上述离心所得的药液通过无机陶瓷膜进行微滤，收集得到微滤液；

d.将上述微滤液过AB-8大孔吸附树脂柱，乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液在60-70℃下减压浓缩回收乙醇，得浸膏II；

e.沉淀物I减压烘干后，以乙醇索氏提取，提取液在60-70℃下减压浓缩回收乙醇，得浸膏III；

f.将浸膏II与浸膏III合并，混合均匀，干燥得黄连解毒汤干浸膏，即为黄连解毒汤活性部位，该活性部位按质量百分含量计含有以下主要成分：盐酸小檗碱10-15％、黄芩苷15-20％、栀子苷10-15％。

2、根据权利要求1所述的黄连解毒汤活性部位的提取方法，其特征是步骤b中各次加水量为：第1次加水量为四种原料总质量的10倍，第2次或第3次加水量各为四种原料总质量的8倍。

3、根据权利要求1所述的黄连解毒汤活性部位的提取方法，其特征是步骤c所述的无机陶瓷膜为0.2μm的Al₂O₃陶瓷膜。

4、根据权利要求1所述的黄连解毒汤活性部位的提取方法，其特征是步骤d中的洗脱步骤所用的乙醇的体积百分浓度为60-80％，所述洗脱液减压浓缩至密度为1.02-1.10。

5、根据权利要求1所述的黄连解毒汤活性部位的提取方法，其特征是步骤e中的索氏提取所用的乙醇的体积百分浓度为60-80％，所述提取液减压浓缩至密度为1.02-1.10。

6、根据权利要求1所述的黄连解毒汤活性部位的提取方法，其特征是步骤f中的干燥方法为低于80℃温度下减压干燥。

7、根据权利要求1-6任一项所述的方法提取的黄连解毒汤活性部位在制备抗血管性痴呆药物中的应用。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征是所述黄连解毒汤活性部位与药学上可接受的载体混合，制成片剂、胶囊剂或颗粒剂。