CN104013710A

CN104013710A - 一种栀柏组合物及其检测方法

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Publication number: CN104013710A
Application number: CN201310064852.2A
Authority: CN
Inventors: 边宝林; 王宏洁; 司南; 杨健; 赵海誉
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2013-03-01
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2033-03-01
Also published as: CN104013710B

Abstract

本发明提供了一种栀柏芩连组合物及其制剂以及组合物及其制剂的检测方法。本发明是以黄连、黄芩、黄柏、栀子按照(3∶2∶2∶3)的比例关系，按照常规制法制成的提取物及临床可接受的剂型，如丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等中成药制剂。这些制剂具有治疗热甚心烦、牙龈肿痛、齿衄、大便秘结、小便涩痛、舌红苔黄、脉数等一切实热火毒、三焦热盛之证的功效。本发明提供一种栀柏芩连组合物及其制剂的检测方法，本发明检测方法能够同时对组合物或其制剂中的多个成分同时进行定性定量的检测，且含量测定方法干扰少，精密度重现性良好，能够全面的对本组合物制剂进行全面的控制，保证产品的质量。

Description

一种栀柏组合物及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种栀柏组合物及其检测方法，属于中药检测方法及中药技术领域。

背景技术

中国传统医学认为黄芩既可以单独入药，也可以与其它药材联合使用，以达到临床所需的疗效。栀柏组合物主要成份为黄连、黄芩、黄柏、栀子。黄连味苦性寒，泻心中之余火，清肠中湿热，适用于心火旺盛，肠胃湿热、湿热瘟毒。本方证乃火毒充斥三焦所致。火毒炽盛，内外皆热，上扰神明，故烦热错语；血为热迫，随火上逆，则为吐衄；热伤络脉，血溢肌肤，则为发斑；热盛则津伤，故口燥咽干；热壅肌肉，则为痈肿疔毒；舌红苔黄，脉数有力，皆为火毒炽盛之证。综上诸症，皆为实热火毒为患，治宜泻火解毒。方中以大苦大寒之黄连清泻心火为君，兼泻中焦之火。臣以黄芩清上焦之火。佐以黄柏泻下焦之火；栀子清泻三焦之火，导热下行，引邪热从小便而出。四药合用，苦寒直折，三焦之火邪去而热毒解，诸症可愈。

栀柏组合物中的主要活性成分有生物碱类(小檗碱、巴马亭等)，环烯醚萜苷类(京尼平苷、京尼平-1-O-β-D龙胆双糖苷等)和黄酮类(黄芩苷、汉黄芩素等)。黄连、黄柏的特征性成分主要为生物碱类成分：小檗碱(据文献报道小檗碱具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、降糖以及神经调节等广泛的活性^[1，2])。黄芩的特征性成分主要为黄酮苷类：黄芩苷(据文献报道黄芩苷具有抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗病毒、抗心律失常、抗动脉粥样硬化、调节免疫、解热及降压镇静等活性^[3，4])；栀子的特征性成分主要为环烯醚萜类成分：栀子苷(京尼平苷)。(据文献报道栀子苷具有保肝利胆、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血栓、降糖以及神经保护等多种药理活性活性^[5，6])。

发明内容

本发明提供了一种以黄连、黄芩、黄柏、栀子(3∶2∶2∶3)制成的栀柏组合物，按照常规制法制成的提取物和/或临床可接受剂型，如丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等。

本发明提供了一种栀柏组合物，是由黄连、黄芩、黄柏和栀子四味中药，按照3∶2∶2∶3的比例制成的。具有清热泻火解毒之功效，主治一切实热火毒，三焦热盛之症。常用于大热烦躁，口燥咽干，错语，不眠；或热病吐血，衄血；或热甚发斑，身热下痢，湿热黄疸；外科痈疽疔毒，小便黄赤，舌红苔黄，脉数有力。

本发明将一定比例的黄连、黄芩、黄柏和栀子四味中药按照常规制法制成临床可接受的剂型，如丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等中成药制剂。这些剂型具有治疗热甚心烦、牙龈肿痛、齿衄、大便秘结、小便涩痛、舌红苔黄、脉数等一切实热火毒，三焦热盛之证的功效。

本发明提供了一种栀柏组合物的检测方法，包括其定性鉴别及含量测定方法。本发明检测方法先进，能够同时对本方剂或中成药中的多个成分同时进行定性定量的检测，且含量测定方法干扰少，精密度重现性良好，能够全面的对本组合物及其制剂进行全面的控制，保证产品的质量。

同时，本发明采用高效液相色谱法检测栀柏组合物中的有效成分的组成和含量，可以准确地检测出此混合物制剂中单成分的含量。

为了控制本发明药物组合物及其制剂的质量，保证其疗效，采用高效液相-质谱联用(HPLC-MS)和薄层鉴别(TLC)的方法对该组合物及其制剂进行了定性鉴别；同时采用高效液相-紫外或二极管阵列检测法(HPLC-UV/DAD)检测法，在同一色谱条件下同时测定栀子苷、黄芩苷、小檗碱的含量，并对此方法进行了方法学研究。通过本发明的定性及定量方法，可有效的控制制剂产品的质量。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

本发明的目的是通过如下技术方案实现：

本发明栀柏组合物及其制剂的检测方法包括如下定性鉴别和含量测定中的一种或几种：

A定性鉴别方法：

(1)照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，联用质谱(HPLC-MS)，通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，指认出栀柏组合物及其制剂中18个色谱峰代表的化合物。分别为Gardenoside、羟异栀子苷、Jaminosides B、鸡屎藤次苷甲酯、京尼平-1-O-β-D-龙胆双糖苷、栀子苷(京尼平苷-Geniposide)、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马亭、6”-0-对香豆酰京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、千层纸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A。

(2)取本发明栀柏组合物及其制剂粉末1～5g，加甲醇50～100ml，超声处理20～60分钟，滤过，滤液浓缩至5～10ml，作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸表小檗碱和盐酸黄连碱对照品，分别加甲醇制成每1ml各含0.1～1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述五种溶液各1～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)为展开剂，置用浓氨试液预饱和20分钟的层析缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)取本发明栀柏组合物及其制剂粉末1～5g，加甲醇50～100ml，超声处理20～60分钟，滤过，滤液浓缩至5～10ml，作为供试品溶液。另取黄芩素、汉黄芩素对照品，加甲醇制成每1ml各含0.1～1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各1～10μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)为展开剂，预饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显三个相同的暗色斑点。

(4)取本发明栀柏组合物及其制剂粉末1～5g，加甲醇50～100ml，超声处理20～60分钟，滤过，滤液浓缩至5～10ml，作为供试品溶液。另取盐酸黄柏碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.1～1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述对照品溶液2～10μl，供试品溶液3～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(30∶15∶4)的下层溶液为展开剂，置氨蒸气饱的层析缸内，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(5)取本发明栀柏组合物及其制剂粉末1～5g，加50～80％甲醇10～50ml，超声处理20～60分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含1～10mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述二种溶液各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

B含量测定方法

照高效液相色谱法测定(HPLC)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-1～5％磷酸/水＝14-100∶86-0为流动相；紫外或二极管阵列检测器；理论板数按栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱峰计算应均不低于4000。分别取栀子苷、黄芩苷及盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含0.1～0.3mg的溶液，即得对照品溶液。取本发明栀柏组合物及其制剂粉末10～100mg，精密称定，加甲醇1～10倍体积份，超声处理20～80分钟，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl注入液相色谱仪，检测。

所得混合对照品高效液相色谱图中，由左至右依次为：栀子苷-黄芩苷-小檗碱；供试品与对照品图谱比较，相应成分保留时间相同的色谱峰即是与该物质相同成分的特征峰，并根据峰面积按外标法计算含量。本组合物及其制剂按干燥品计，含栀子苷(C₁₇H₂₄O₁₀)不得少于1.0％；黄芩苷(C₂₁H₁₈O₁₁)不得少于2.0％；以盐酸小檗碱计，小檗碱(C₂₀H₁₇NO₄)不得少于1.5％。

本发明所指药物组合物及其制剂的原料药组成及配比如下(按重量份)：

黄连 3份黄芩 2份黄柏 2份栀子 3份

以上四味中药，按照常规方法制成临床可接受剂型，如丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等中成药剂型。

本药物组合物及其制剂的制备方法可以是：

以上四味，加水浸泡1～2小时，加水煎煮1～3次，(优选2次)滤过，合并滤液，浓缩成稠膏，减压干燥，粉碎成粉，得到提取物。以上述提取物为原料，选用适当的辅料及粘合剂，按照常规制法，制成丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等临床可接受剂型。

本发明栀柏组合物定性鉴别及含量测定方法，可以应用于该组合物处方配比下制成的各种剂型，如丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等临床可接受剂型。由于不同剂型的制剂每日用量中，含有的生药量相同，因此各个剂型在进行含量测定时，样品量可根据生药量进行折算。

具体实施方式

下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1：定性鉴别

测定条件：仪器采用Agilent 1200 HPLC-DAD高效液相色谱仪；Agilent 6320 Iron-trap MS(Agilent Technologies，Inc.)；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱；检测波长260nm。

材料采用本发明栀柏组合物经水提取制成的提取物。该提取物加甲醇进行提取制备供试品溶液。应用HPLC-DAD-MS/MS以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂进行检测，具体条件如下：仪器：Agilent 1200 HPLC system(MA，USA)配备DAD检测器和Agilent6320 MSD离子阱检测器.；色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm，Agilent)；柱温：30℃.梯度条件：甲醇(A)1％甲酸(B).梯度：0-10min，10％A；10-12min，10-30％A；12-30min，30-35％A；30-35min，35-40％A；35-40min，40-55％A；40-50min，55-66％A；50-60min，66-100％A.；流速：1mL/min，进样5μl.检测波长254nm。

正离子扫描模式，电喷雾质谱离子源(ESI)，质量范围m/z100 to 1000.质谱条件：喷雾器压力45psi(N2)，干燥器流速12L/min，毛细管温度350℃.，毛细管电压4000V.分流比1∶2.分析软件：LC-MS Solution version3.41 software.

通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，推断出18个色谱峰代表的化合物。分别为Gardenoside、羟异栀子苷、Jaminosides B、鸡屎藤次苷甲酯、京尼平-1-O-μ-D-龙胆双糖苷、京尼平苷、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马亭、6”-O-对香豆酰京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、千层纸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A。结果见图1。

实验例2：薄层鉴别

材料采用以本发明栀柏组合物制成的水提取物为原料，加入适当的辅料及粘合剂制成的浓缩水蜜丸剂(黄连解毒丸)。

对照品、对照药材和试剂

黄连对照药材(批号：120913-201008)，黄芩对照药材(批号120955-201008)，黄柏对照药材(批号：121510-201105)，栀子对照药材(批号：120986-200303)，盐酸小檗碱(批号：713-9204；110713-200609)，盐酸巴马汀(批号：110732-200907)，黄芩苷(批号：715-200010)，黄芩素(批号：111595-200905)，汉黄芩素(批号：111514-200403)，黄柏碱(批号：111895-201001)，栀子苷(批号：110749-200410)均由中国药品生物制品检定所(中国食品药品检定研究院)提供；盐酸黄柏碱购买自江苏南京泽朗医药科技有限公司；表小檗碱(批号：B-064-111027)以及黄连碱(批号：H-052-110312)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。薄层层析板：Merck；聚酰胺薄膜：浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；苯、甲苯、环己烷、乙酸乙酯、异丙醇、三氯甲烷、甲醇、丙酮、甲酸、氨水、三乙胺：北京化工厂生产。

制剂的鉴别

(1)取本品25g，粉碎。称取该粉末1g，加甲醇100ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至10ml，作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸表小檗碱和盐酸黄连碱对照品，分别加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述五种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)为展开剂，置用浓氨试液预饱和20分钟的层析缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(2)取本品25g，粉碎。称取该粉末1g，加甲醇100ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至10ml，作为供试品溶液。另取黄芩素、汉黄芩素对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)为展开剂，预饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显三个相同的暗色斑点。

(3)取本品25g，粉碎。称取该粉末1g，加1％醋酸甲醇溶液100ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至10ml，作为供试品溶液。另取盐酸黄柏碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述对照品溶液3μl，供试品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(30∶15∶4)的下层溶液为展开剂，置氨蒸气饱的层析缸内，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(4)取本品25g，粉碎。称取该粉末1g，加50％甲醇10ml，超声处理40分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述二种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

本鉴别方法，鉴别(1)系方中黄连的鉴别，参考《中国药典》2010年版一部中黄连项下鉴别方法，同时比对文献方法，制定本制剂中黄连的鉴别方法。色谱中空白溶液的制备是按处方中药味比例，自配不含黄连的群药，按其工艺制成的空白制剂，再按正文供试品溶液的制备方法制备。由图谱可见空白对上述鉴别无干扰，经三批中试产品的验证，本鉴别方法快速、可靠、简便、易行。

鉴别(2)系方中黄芩的鉴别，根据《中国药典》2010年版一部中黄芩项下鉴别方法，制定本制剂中黄芩的鉴别方法。色谱中空白样品的制备是按处方中药味比例，自配不含黄芩的群药，按其工艺制成的空白制剂，再按正文供试品溶液的制备方法制备。由图谱可见空白对上述鉴别无干扰，经三批中试产品的验证，本鉴别方法快速、可靠、简便、易行。

鉴别(3)系方中黄柏的鉴别，根据《中国药典》2010年版一部中黄柏项下鉴别方法制定本制剂中黄柏的鉴别方法。色谱中空白样品的制备是按处方中药味比例，自配不含黄柏的群药，按其工艺制成的空白制剂，再按正文供试品溶液的制备方法制备。由图谱可见空白对上述鉴别无干扰，经三批中试产品的验证，本鉴别方法快速、可靠、简便、易行。

鉴别(4)系方中栀子的鉴别，根据《中国药典》2010年版一部中栀子项下的鉴别方法，色谱中空白样品的制备是按处方中药味比例，自配不含栀子的群药，按其工艺制成的空白制剂，再按正文供试品溶液的制备方法制备。由图谱可见空白对上述鉴别无干扰，经三批中试产品的验证，本鉴别方法快速、可靠、简便、易行。

本发明方法适用于栀柏组合物及其制剂的定性鉴别，能够对制剂进行有效的质量监控。

实验例3：含量测定及方法学考察

(1)含量测定

测定条件：仪器采用岛津SIL-20A高效液相色谱仪，二极管阵列检测器(HPLC-DAD)；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)-0.1％磷酸/水(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长254nm。

分别取栀子苷、黄芩苷及盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含0.1mg的混合对照品溶液。取本品25g粉碎(过五号筛)。取粉末80mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇23ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方中药味比例，分别自配不含黄芩、不含栀子以及不含黄连和黄柏的群药，按其工艺制成阴性制剂，并按照供试品溶液制备方法，制备阴性对照溶液。

本法采用高效液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm。理论板数按栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱峰计算应均不低于4000。

按照上述色谱条件对混和对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液进行测定色谱分析，色谱图见图2～6。表明色谱分离良好，阴性对照液对测定基本无干扰，供试品溶液中栀子苷、黄芩苷、小檗碱能够同时达到良好的分离，并于杂质峰分离良好。

按本发明方法测定3批黄连解毒丸制剂样品中的栀子苷、黄芩苷、小檗碱含量。结果见表1。

表1.样品测定结果

(2)方法学考察

①线性关系考察

取栀子苷(Geniposide)、黄芩苷、盐酸小檗碱混合对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含0.169mg、0.210mg、0.179mg的溶液。分别精密吸取100，200，400，600，1000μl置1ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取10μl注入液相色谱仪，每个浓度连续进样3次，测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，对照品峰面积为纵坐标进行回归处理，绘制标准曲线，结果表明，栀子苷在0.169～1.69μg；黄芩苷在0.21～2.1μg；以盐酸小檗碱计，小檗碱在0.179～1.79μg范围内线性良好。其回归方程见下表，回归曲线见图7～9，实验数据见表2～4。

表2.栀子苷线性关系考察实验数据

表3.黄芩苷线性关系考察实验数据

表4.小檗碱线性关系考察实验数据

②重复性试验

取同一批号黄连解毒丸(批号：20120329)样品6份，按供试品溶液的制备方法处理方法，制备6份供试品溶液，过滤后，进行重复性试验。试验结果表明，该方法重复性良好。结果见表5～7.

表5.栀子苷重复性试验数据

表6.黄芩苷重复性试验数据

表7.小檗碱重复性试验数据

③精密度试验

取同一批号样品(批号：20120329)按供试品溶液的制备方法处理方法，制成供试品溶液，过滤后，连续测定5次，进行精密度试验。结果见表8～10。

表8.栀子苷精密度试验数据

表9.黄芩苷精密度试验数据

表10.小檗碱精密度试验数据

④样品稳定性试验

取③中所述样品(批号：20120329)，于室温下放置，每间隔一定时间测定一次含量，测至24小时，结果见下表11～13。可见样品溶液中被测成分的含量至少在24小时内稳定性良好。

表11.栀子苷稳定性试验数据

表12.黄芩苷稳定性试验数据

表13.小檗碱稳定性试验数据

⑤回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知含量同一批号的样品(批号：20120329)，根据重复性试验结果计算，制剂中被检测成分含量分别为：栀子苷1.890％，黄芩苷2.740％，小檗碱2.631％)8mg，分别精密加入混合对照品溶液2毫升(栀子苷0.0712，黄芩苷0.1012，小檗碱0.0868mg/ml)，加甲醇定容至5ml，平行处理6份，按质量标准正文中供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，按照上述色谱条件，测定，按下式计算回收率，平均回收率为：栀子苷102.98％，黄芩苷105.77％，盐酸小檗碱100.18％，RSD为：栀子苷1.23％，黄芩苷1.21％，小檗碱1.35％，实验结果表明，回收率符合含量测定的要求，结果见表14～16。

表14.栀子苷回收率试验结果

表15.黄芩苷回收率试验结果

表16.小檗碱回收率试验结果

附图说明

图1栀柏芩连组合物制剂中成分的指认

图2栀子苷、黄芩苷、小檗碱标准品HPLC色谱图(图中1、2、3号色谱峰分别是：栀子苷、黄芩苷、小檗碱)

图3黄连解毒丸HPLC色谱图(图中1、2、3号色谱峰分别是：栀子苷、黄芩苷、小檗碱)

图4黄连解毒丸空白HPLC色谱图2-黄芩空白(图中1、3号色谱峰分别是：栀子苷、小檗碱)

图5黄连解毒丸空白HPLC色谱图1-栀子空白(图中2、3号色谱峰分别是：黄芩苷、小檗碱)

图6黄连解毒丸空白HPLC色谱图3-黄连、黄柏空白(图中1、2号色谱峰分别是：栀子苷、黄芩苷)

图7.栀子苷标准曲线

图8.黄芩苷标准曲线

图9.小檗碱标准曲线。

Claims

1.一种栀柏组合物，其特征在于它是由黄连、黄芩、黄柏、栀子四味中药按照3∶2∶2∶3的原料配比制成的。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于该组合物由如下方法制成：

以上四味，加水浸泡1～2小时，加水煎煮1～3次，(优选2次)滤过，合并滤液，浓缩成稠膏，减压干燥，粉碎成粉，得到提取物；以得到的提取物为原料，选用适当的辅料及粘合剂，按照常规制法，制成任何临床上可接受的常规剂型。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于该药物组合物为丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，具有治疗热甚心烦、牙龈肿痛、齿衄、大便秘结、小便涩痛、舌红苔黄、脉数等一切实热火毒、三焦热盛之证的功效。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的栀柏组合物的检测方法，其特征在于检测方法包括：

A定性鉴别方法：

(1)取组合物粉末1～5g，加甲醇50～100ml，超声处理20～60分钟，滤过，滤液浓缩至5～10ml，作为供试品溶液；另取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸表小檗碱和盐酸黄连碱对照品，分别加甲醇制成每1ml各含0.1～1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述五种溶液各1～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)为展开剂，置用浓氨试液预饱和20分钟的层析缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(2)取组合物粉末1～5g，加甲醇50～100ml，超声处理20～60分钟，滤过，滤液浓缩至5～10ml，作为供试品溶液；另取黄芩素、汉黄芩素对照品，加甲醇制成每1ml各含0.1～lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各1～10μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)为展开剂，预饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显三个相同的暗色斑点；

(3)取栀柏组合物粉末1～5g，加甲醇50～100ml，超声处理20～60分钟，滤过，滤液浓缩至5～10ml，作为供试品溶液。另取盐酸黄柏碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.1～1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述对照品溶液2～10μl，供试品溶液3～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(30∶15∶4)的下层溶液为展开剂，置氨蒸气饱的层析缸内，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(4)取本发明栀柏组合物制剂粉末1～5g，加50～80％甲醇10～50ml，超声处理20～60分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含1～10mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述二种溶液各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

6.一种如权利要求1-4任一项所述的栀柏组合物的检测方法，其特征在于检测方法包括：

照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱；联用质谱，通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，指认出所述组合物中色谱峰代表的化合物。

7.如权利要求5所述的栀柏组合物的检测方法，其特征在于检测方法还包括：

步骤(5)照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱；联用质谱，通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，指认出所述组合物中色谱峰代表的化合物。

8.如权利要求6-7任一项所述的组合物的检测方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法中，甲醇(A)-水为流动相，按以下比例进行梯度洗脱分析供试品溶液，0min，10％A；10-12min，10-30％A；12-30min，30-35％A；30-35min，35-40％A；35-40min，40-55％A；40-50min，55-66％A；50-60min，66-100％A；检测波长为254nm。

9.如权利要求5-8任一项所述的组合物的检测方法，其特征在于该检测方法还包括：

B含量测定方法

照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-1～5％磷酸/水＝14-100∶86-0为流动相；紫外或二极管阵列检测器；分别取栀子苷、黄芩苷及盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含0.1～0.3mg的溶液，即得对照品溶液；取栀柏组合物粉末10～100mg，精密称定，加甲醇1～10倍体积份，超声处理20～80分钟，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl注入液相色谱仪，检测。

10.根据权利要求5-8任一项所述的检测方法，其特征在于所述的定性鉴别方法中，同时鉴别了下述化合物中的全部或几种：Gardenoside、羟异栀子苷、Jaminosides B、鸡屎藤次苷甲酯、京尼平-1-O-β-D-龙胆双糖苷、栀子苷(京尼平苷-Geniposide)、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马亭、6”-O-对香豆酰京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、千层纸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、黄柏碱。

11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于所述的含量测定方法同时测定栀柏组合物制剂中栀子苷、小檗碱、黄芩苷的含量。