CN113030365A - 一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂及检测方法 - Google Patents

一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂及检测方法，包括以下重量份的组分：黄连，1～30份；黄芩，1～20份；栀子，1～20份；黄柏，1～20份；检测方法采用鉴别方式和/或含量测定方式对中药制剂进行检测；鉴别方式采用薄层色谱鉴别方法对中药制剂中的黄连、黄芩、黄柏进行鉴别；含量测定采用高效液相色谱法测定中药制剂中黄连的含量。本发明的中药制剂具有良好的治疗效果，检测方法能够有效提高检验的可靠性，保证产品质量的稳定性。

Description

一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂及检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药制剂及检测方法，特别是一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂及检测方法。
背景技术
火热实证的产生，或为感受火热之邪，或由阳盛有余，或为气血郁滞，或为病邪的郁结，导致火热内扰，机能亢奋。“火为热之极，热为火之渐”，火与热在病机与临床表现基本是一致的，只是程度的差异。分而论之，感受火热之外邪，直接形成火热之证；若素体阳气偏盛，“气有余便是火”，机能亢奋，火邪内生；感受外邪风、湿、燥、寒在病理变化中皆能化燥生火,即六气化火，同时痰浊、瘀血等也可郁而化火；由于精神情志的刺激造成的气机郁结而化火，即为五志化火，五志过极皆为热甚,《素问玄机原病式》中说：“五之志者,怒、喜、悲、思、恐也,若志过甚则劳,劳则伤本脏,凡五志所伤皆热也。”总而言之，实火者，多源于阳气有余，或因邪郁化火，或因五志化火，一般来说起病急，病程短，热邪炽盛而机体正气尚盛。证见面红目赤、心烦、发热，大便秘结或泻下粘秽、小便短赤，舌红苔黄，脉数实有力，或兼见神昏谵语、狂躁不安、疮疡红肿、热痛、吐血、衄血、尿血、便血以及发斑等。因此，火热证的共同特点是：热(发热、恶热、喜冷)、赤(面赤、目赤、舌红)、燥(口渴、咽干、便燥)、动(神情烦躁，脉数)。
为了保证中药制剂的生产质量，往往需要对生产得到的中药制剂进行质量检测，以此来保证产品质量。但是，现有对中药制剂的质量检测方法的检验可靠性较低，无法保证产品药效的一致性和质量的稳定性。因此，现有的技术存在着检验可靠性较低的问题。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂及检测方法。本发明具有能够有效提高检验可靠性的特点。
本发明的技术方案：一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂，包括以下重量份的组分：黄连，1～30份；黄芩，1～20份；栀子，1～20份；黄柏，1～20份。
前述的主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂中，包括以下重量份的组分：黄连，30份；黄芩，15份；栀子，10份；黄柏，12份。
前述的主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂中，制备方法为：
A、取黄连用75％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩，得药渣和醇溶液；
B、将药渣与黄芩、栀子和黄柏，加水煎煮三次，滤过，得滤液和混合药渣；
C、将滤液与醇溶液合并，减压浓缩成稠膏，干燥、粉碎和过筛后，与辅料混合、过筛和混匀，加水和炼蜜制成浓缩水蜜丸；
D、将浓缩水蜜丸制成相应的制剂。
前述的主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂中，中药制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、口服液、喷雾剂、注射剂、混悬液或微球制剂中的任一种。
一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法，采用鉴别方式和/或含量测定方式对中药制剂进行检测；鉴别方式采用薄层色谱鉴别方法对中药制剂中的黄连、黄芩、黄柏进行鉴别；含量测定采用高效液相色谱法测定中药制剂中黄连的含量；
所述中药制剂为前述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂。
前述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法中，黄连的具体鉴别方法为：取3～4g生药粉的该中药制剂，加80％甲醇30～50ml，加热回流0.5～1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水8～10ml使溶解，用乙醚振药提取2～4次，每次10～30ml，弃去乙醚液，水液加稀盐酸8～10ml，置水浴中加热0.5～1小时，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取2～4次，每次20～30ml，合并乙酸乙酯，用水30～50ml洗涤，弃去水液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1～2ml使溶解，作为供试品溶液；
另取黄连对照药材0.5～1.5g，同法制成对照药材溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3～4μl、对照药材溶液3～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝10～8：8～6：1～0.5为展开剂，展开、取出和晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热数分钟，置365nm的紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
前述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法中，黄芩的鉴别方法具体为：取2～3g生药粉的该药中药制剂，加乙醇30～50ml，加热回流1～2小时，滤过，滤液浓缩至15～20ml，加盐酸3～6ml，加热回流0.5～1小时，加水8～10ml，放冷，加入60～90℃石油醚15～25ml，振摇提取3～4次，每次20～25ml，石油醚蒸干，残渣用无水乙醇7～10ml溶解，作为供试品溶液；
另取黄芩素、汉黄芩素对照品，加无水乙醇制成1ml含0.45mg的溶液，作为对照品溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液7～8μl、对照品溶液2～3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝20～17：3～1.5：0.2～0.1为展开剂，薄层板置展开缸中预饱和5～10分钟，展开、取出和晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
前述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法中，黄柏的鉴别方法具体为：取8～10g生药粉的该药中药制剂，加乙醇40～50ml，搅匀，超声处理70～90分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水40～50ml使溶解，滤去不溶物，滤液用60～90℃的石油醚振摇提取3～4次，每次40～50ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加60～90℃的石油醚1ml使溶解，作为供试品溶液；
另取黄柏对照药材1.5～2g，加水40～50ml，加热回流30分钟，放冷，用脱脂棉滤过，滤液用石油醚振摇提取3～4次，每次30～50ml，合并石油醚提取液，蒸干，残渣加60～90℃的石油醚0.5～1ml使溶解，作为对照药材溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各9～12μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃的石油醚：三氯甲烷：乙酸乙酯＝2～1：1～0.5：2～1为展开剂，展开、取出和晾干，喷以5％磷钼酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
前述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法中，黄连含量测定方法是以盐酸小檗碱对照品为对照，以甲醇：0.4％磷酸溶液＝50：50为流动相的液相色谱法。
前述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法中,黄连的含量测定方法具体为：
黄连中盐酸小檗碱的含量测定：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：0.4％磷酸溶液＝50：50为流动相，检测波长为360nm，板数按盐酸小檗碱计算不低于2500；
对照品溶液的制备；取盐酸小檗碱对照品，加80％甲醇制成每1ml含盐酸小檗碱20μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备；取1.5g生药粉的该药中药制剂，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，密塞，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀、滤过，得续滤液；量取续滤液25ml，加入盐酸5ml，置90℃水浴中加热水解1小时，取出冷却，转移至50ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
测定法；分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
与现有技术相比，本发明通过严格限定中药制剂的组分和配比、以及该中药制剂的制备工艺和参数，使得最终得到的中药制剂具有良好的治疗实热火毒，三焦热盛之证的效果。同时，本发明对主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法中增加了黄连、黄芩、黄柏的鉴别项目和黄连的含量测定项目。其中黄连的含量测定方法具有操作简单，成本低，检验时间短，同时具有分离效果好、灵敏、准确等优点；黄连、黄芩、黄柏的鉴别方法具有准确度高、精密度高、回收率高、稳定性高、专属性强、重复性较好、无干扰等优点。本发明能够有效的检测产品是否合格、质量是否优劣，保证了药效的一致性和质量的稳定性，进一步确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。综上所述，本发明具有能够有效提高检验可靠性的特点。
附图说明
图1是HPLC测定盐酸小檗碱的系统适应性图；
图2是盐酸小檗碱对照品的HPLC图；
图3是缺黄连阴性对照样品的HPL图；
图4是用聚酰胺薄膜薄层板的黄连薄层鉴别效果图；
图5是用硅胶G薄层板的黄连薄层鉴别效果图；
图6是黄连鉴别供试品点样量从左至右分别为1、2、3、4、5μl的薄层展开效果图；
图7是黄连对照药材点样量从左至右分别为1、2、3、4、5μl的薄层展开效果图；
图8是黄连薄层鉴别的专属性考察试验效果图；
图9是厂家1薄层板的黄连薄层鉴别效果图；
图10是厂家2薄层板的黄连薄层鉴别效果图；
图11是厂家3薄层板的黄连薄层鉴别效果图；
图12是温度20℃、湿度50％条件下的黄连薄层鉴别效果图；
图13是温度25℃、湿度55％条件下的黄连薄层鉴别效果图；
图14是温度35℃、湿度70％条件下的黄连薄层鉴别效果图；
上述图4-5及图8-14中，1、2、3分别为3个批次的黄连解毒丸样品，S为黄连对照药材，S1为缺黄连阴性样品。
图15是黄芩鉴别供试品点样量从左至右分别为1、2、3、5、7、10、11μl的薄层展开效果图；
图16是黄芩素、汉黄芩素对照品点样量从左至右分别为1、2、3、4、5、6、7μl的薄层展开效果图；
图17是黄芩薄层鉴别的专属性考察试验效果图；
图18是厂家1薄层板的黄芩薄层鉴别效果图；
图19是厂家2薄层板的黄芩薄层鉴别效果图；
图20是厂家3薄层板的黄芩薄层鉴别效果图；
图21是温度20℃、湿度50％条件下的黄芩薄层鉴别效果图；
图22是温度25℃、湿度55％条件下的黄芩薄层鉴别效果图；
图23是温度35℃、湿度70％条件下的黄芩薄层鉴别效果图；
上述图15-23中，1、2、3分别为3个批次的黄连解毒丸样品，S为黄芩素、汉黄芩素对照品，S1为缺黄芩阴性样品。
图24是黄柏鉴别供试品点样量从左至右分别为4、6、8、9、12、14μl的薄层展开效果图；
图25是黄柏对照药材点样量从左至右分别为2、4、6、8、10、14μl的薄层展开效果图；
图26是黄柏薄层鉴别的专属性考察试验效果图；
图27是厂家1薄层板的黄柏薄层鉴别效果图；
图28是厂家2薄层板的黄柏薄层鉴别效果图；
图29是厂家3薄层板的黄柏薄层鉴别效果图；
图30是温度20℃、湿度50％条件下的黄柏薄层鉴别效果图；
图31是温度25℃、湿度55％条件下的黄柏薄层鉴别效果图；
图32是温度35℃、湿度70％条件下的黄柏薄层鉴别效果图；
上述图24-32中，1、2、3分别为3个批次的黄连解毒丸样品，S为黄柏对照药材，S1为缺黄柏阴性样品。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1。一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂，包括以下重量份的组分：黄连，1～30份；黄芩，1～20份；栀子，1～20份；黄柏，1～20份。
包括以下重量份的组分：黄连，30份；黄芩，15份；栀子，10份；黄柏，12份。
制备方法为：A、取黄连用75％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩，得药渣和醇溶液；B、将药渣与黄芩、栀子和黄柏，加水煎煮三次，滤过，得滤液和混合药渣；C、将滤液与醇溶液合并，减压浓缩成稠膏，干燥、粉碎和过筛后，与辅料混合、过筛和混匀，加水和炼蜜制成浓缩水蜜丸，制1000g；D、将浓缩水蜜丸制成相应的制剂。中药制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、口服液、喷雾剂、注射剂、混悬液或微球制剂中的任一种。
一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法，采用鉴别方式和/或含量测定方式对中药制剂进行检测；鉴别方式采用薄层色谱鉴别方法对中药制剂中的黄连、黄芩、黄柏进行鉴别；含量测定采用高效液相色谱法测定中药制剂中黄连的含量；所述中药制剂为主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂。
黄连的具体鉴别方法为：取3～4g生药粉的该中药制剂，加80％甲醇30～50ml，加热回流0.5～1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水8～10ml使溶解，用乙醚振药提取2～4次，每次10～30ml，弃去乙醚液，水液加稀盐酸8～10ml，置水浴中加热0.5～1小时，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取2～4次，每次20～30ml，合并乙酸乙酯，用水30～50ml洗涤，弃去水液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄连对照药材0.5～1.5g，同法制成对照药材溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3～4μl、对照药材溶液3～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝10～8：8～6：1～0.5为展开剂，展开、取出和晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热数分钟，置365nm的紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
黄芩的鉴别方法具体为：取2～3g生药粉的该药中药制剂，加乙醇30～50ml，加热回流1～2小时，滤过，滤液浓缩至15～20ml，加盐酸3～6ml，加热回流0.5～1小时，加水8～10ml，放冷，加入60～90℃石油醚15～25ml，振摇提取3～4次，每次20～25ml，石油醚蒸干，残渣用无水乙醇7～10ml溶解，作为供试品溶液；另取黄芩素、汉黄芩素对照品，加无水乙醇制成1ml含0.45mg的溶液，作为对照品溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液7～8μl、对照品溶液2～3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝20～17：3～1.5：0.2～0.1为展开剂，薄层板置展开缸中预饱和5～10分钟，展开、取出和晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
黄柏的鉴别方法具体为：取8～10g生药粉的该药中药制剂，加乙醇40～50ml，搅匀，超声处理70～90分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水40～50ml使溶解，滤去不溶物，滤液用60～90℃的石油醚振摇提取3～4次，每次40～50ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加60～90℃的石油醚1ml使溶解，作为供试品溶液；
另取黄柏对照药材1.5～2g，加水40～50ml，加热回流30分钟，放冷，用脱脂棉滤过，滤液用石油醚振摇提取3～4次，每次30～50ml，合并石油醚提取液，蒸干，残渣加60～90℃的石油醚0.5～1ml使溶解，作为对照药材溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各9～12μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃的石油醚：三氯甲烷：乙酸乙酯＝2～1：1～0.5：2～1为展开剂，展开、取出和晾干，喷以5％磷钼酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
黄连含量测定方法是以盐酸小檗碱对照品为对照，以甲醇：0.4％磷酸溶液＝50：50为流动相的液相色谱法。
黄连的含量测定方法具体为：
黄连中盐酸小檗碱的含量测定：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：0.4％磷酸溶液＝50：50为流动相，检测波长为360nm，板数按盐酸小檗碱计算不低于2500；
对照品溶液的制备；取盐酸小檗碱对照品，加80％甲醇制成每1ml含盐酸小檗碱20μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备；取1.5g生药粉的该药中药制剂，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，密塞，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀、滤过，得续滤液；量取续滤液25ml，加入盐酸5ml，置90℃水浴中加热水解1小时，取出冷却，转移至50ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
测定法；分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
为了确保本发明检测方法科学、合理、可行，对本发明的检测方法进行了研究和考察。
一、黄连的含量测定方法学考察：
黄连为黄连解毒丸(本发明制剂)中的君药，盐酸小檗碱是其主要有效成分，故选择以盐酸小檗碱作为本制剂内在质量的指标成分，采用酸水解进行前处理样品，采用高效液相色谱法进行样品测定，经试验，结果表明，该方法操作简单，成本低，检验时间短，同时具有分离效果好、灵敏、准确等优点。
1、仪器、试剂和样品
Agilent Technologies 1200series高效液相色谱仪，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，甲醇(分析纯20130411，上海申博化工有限公司)，HCl(分析纯20140328，上海申博化工有限公司)，乙腈(色谱纯20140721，上海申博化工有限公司)，磷酸(分析纯20140421，上海申博化工有限公司)，盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，编号为112542-201405)，其他均为分析纯。黄连解毒丸(20140304、20140201、20140202、20140401、20140402、20140403、20140404、20140405、20140501、20140502、20140503，本发明制剂，由贵州百灵制药股份有限公司提供)。
2、色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50：50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按盐酸小檗碱计算不低于2500。
3、对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含盐酸小檗碱20μg的溶液，即得。
4、供试品溶液的制备：取本品内容物约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，精密加入盐酸5ml，置90℃水浴中加热水解1小时，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5、阴性对照溶液的制备：按处方比例及制备工艺，配制不含黄连药材的阴性样品，按“5项”同法制备阴性样品溶液。
6、方法学验证
6.1、系统适应性试验：按照上述色谱条件及样品处理方法，进行系统适应性试验，盐酸小檗碱峰与其他成分达到基线分离，且峰形良好；阴性样品试验结果表明其它成分对盐酸小檗碱的测定无干扰。结果见图1、图2、图3。
6.2、线性与范围的考察：取4项下的对照品溶液5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μL分别进样，按上述色谱条件记录色谱图，测定峰面积，以峰面积的对数值为纵坐标，盐酸小檗碱对照品进样量的对数值为横坐标，进行线性回归，得回归方程：Y＝1.1465X+4.5823(Y为峰面积，X为浓度)，r＝0.9999。结果表明，盐酸小檗碱在5.5850～27.9250μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
6.3、精密度试验：取4项下的对照品溶液，按3项色谱条件进行实验，进样量均为20μl，连续进样5次，测得其峰面积积分值，RSD为0.72％，表明仪器精密度良好。
6.4、重复性试验：取同一个批号的黄连解毒丸(批号：20140304)，平行取样6份，按3项下方法操作并检测。盐酸小檗碱平均质量分数为5.37mg/g，RSD为0.10％，表明方法重复性较好。
6.5、稳定性试验
取同一批号的供试品溶液(批号：20140304)，按3项色谱条件进行试验，于0、4、8、12、16、20、24h各进样一次，进样量均为20μL，按峰面积积分值计算，盐酸小檗碱的RSD值为0.14％，表明供试品溶液中盐酸小檗碱在24h内具有良好的稳定性。
6.6、加样回收率试验
称取已知盐酸小檗碱含量的样品(质量分数为5.28mg/g)9份，分成3组(每组3份)，置锥形瓶中，每组分别精密加入2.5204mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液4、5、6mL，精密称定，按5项下自“精密加入80％甲醇50mL”起，同法操作，并按3项下色谱条件进样，进样量均为20μl，测定峰面积，计算回收率。结果见表1。
表1盐酸小檗碱加样回收率试验结果(n＝9)
Figure BDA0002969330180000091
由表1结果分析，加样回收率均值为99.90％，RSD为1.57％，表明该方法的准确度高。
6.7、耐用性试验：选取实验中对不同流动相比例、柱温和流速3个因素，按照“4”和“5”项下处理方法，分别对上述因素进行考察。
6.7.1、不同流动相比例的考察：色谱柱：Venusil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；体积流量0.8mL/min；进样量10μl。按照“4”和“5”项下对对照品溶液和同一批(20140304)供试品溶液分别进样，按表2不同流动相组成比例进行测定，结果见表2。
表2.不同流动相组成比例考察
Figure BDA0002969330180000092
由表2结果表明，流动相为甲醇：0.4％磷酸＝60～50:40～50上下浮动，RSD值为0.38％，说明依然准确测定样品中盐酸小檗碱的含量。
6.7.2、不同柱温的考察：色谱柱：Venusil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；甲醇-0.4％磷酸溶液(50：50)为流动相；体积流量0.8mL/min；进样量10μl。按照“4”和“5”项下对对照品溶液和同一批(20140304)供试品溶液分别进样，按表3不同柱温进行测定，结果见表3。
表3.不同柱温考察
Figure BDA0002969330180000101
由表3结果表明，柱温在25℃～30℃上下浮动，RSD值为0.11％，说明柱温的短小变化，依然准确测定样品中盐酸小檗碱的含量。
6.7.3、不同流速的考察
色谱柱：Venusil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；甲醇-0.4％磷酸溶液(50：50)为流动相；进样量10μl。按照“4”和“5”项下对对照品溶液和同一批(20140304)供试品溶液分别进样，按表4不同柱温进行测定，结果见表4。
表4.不同流速考察
Figure BDA0002969330180000102
由表4结果表明，流速在1.0～0.4ml/min范围内，RSD值为0.11％；在1.5ml/min波动较大。故选取流速在1.0～0.4ml/min范围，较合适，能准确测定样品中盐酸小檗碱的含量。
6.8、11批样品含量测定结果
取11批样品，按5项下方法处理样品，作为供试品溶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，各取续滤液10μL，注入高效液相色谱仪，按3项色谱条件测定，用外标两点法对数方程计算样品中盐酸小檗碱的含量，结果见表5。
表5.11批黄连解毒丸盐酸小檗碱含量测定结果(n＝3)
Figure BDA0002969330180000111
由表5结果分析，选取最低结果含盐酸小檗碱5.19mg·g－1下浮30％，可将含量限度定为：前列泰胶囊含黄连以盐酸小檗碱计，每1g不得少于3.5mg。
二、黄连的鉴别：
黄连为报春花科植物黄连Lysimachia christinae Hance的干燥全草，收载于2020年版中国药典(一部)。黄连作为黄连解毒处方的君药，本实验将选取黄连对照药材作为对照，先采用萃取法除杂，后用双相酸水解的方法提取黄连解毒丸中黄连的特征性成分，对黄连药材进行薄层鉴别，并考察不同展开介质、不同点样量、不同厂家薄层板、不同温度、不同湿度对该制剂中黄连药材薄层色谱的影响。试验结果表明：以黄连对照药材为对照品，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)为展开系统，对黄连药材薄层鉴别特征明显，专属性强，可作为黄连解毒丸中黄连药材的薄层鉴别方法，故列入本发明检测项目。
2.1仪器、试剂和样品
KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DGG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)，十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，甲醇(分析纯20130411，上海申博化工有限公司)。乙酸乙酯(分析纯20140528，上海申博化工有限公司)，浓盐酸(分析纯20130721，上海申博化工有限公司)，黄连对照药材(中国药品生物制品检定所，供鉴别用，编号为111532-201402)，黄连解毒丸(20140304、20140201、20140202，本发明制剂，由贵州百灵企业集团制药股份有限公司提供)。
2.2供试品溶液制备：取本品内容物3g，加80％甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振药提取2次，每次10ml，弃去乙醚液，水液加稀盐酸10ml，置水浴中加热1小时，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯，用水30ml洗涤，弃去水液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解。
2.3对照品溶液的制备：取黄连对照药材0.5g，按“2.2项”同法处理。
2.4阴性样品的制备：按处方比例及制备工艺，配制不含黄连药材的阴性样品，按“2.2项”同法制备阴性样品溶液。
2.5展开系统：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10：8：1)。
2.6显色剂：5％三氯化铝乙醇溶液。
2.7薄层色谱条件的考察
2.7.1薄层板的选择：分别吸取供试品溶液3μl和对照品溶液4μl，以薄层硅胶G板和聚酰胺薄膜2种不同类型材料薄层板，进行展开，取出，晾干，喷以显色剂，105℃加热5min，于365nm紫外灯下检视。见图4、图5。
由图4、图5可见，聚酰胺薄膜板并未将供试品分离；硅胶G板分离效果良好，斑点圆整，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色斑点。故选取硅胶G板展开。
2.7.2最佳点样量考察：分别吸取供试品溶液和对照品溶液1、2、3、4、5μl，分别点于不同薄层硅胶G板上，进行考察，展开，取出，晾干，喷以显色剂，105℃加热5min，于365nm紫外灯下检视。见图6、图7。
由图6、图7可见，供试品3μl点样量效果最佳，当点样量大于3μl时，供试品主斑点出现拖尾现象；对照品最佳点样量4～6μl皆可，故选择点样量为4μl。
结合上述2种因素考察实验结果，可确定薄层板为硅胶G板，供试品和最佳点样量为3μl，对照品最佳点样量为4μl。经预实验验证，确定黄连的薄层鉴别方法，并按照《中国药典》2020版一部附录ⅩⅧA中药质量标准分析方法验证指导原则进行方法学验证。
2.8方法学验证
2.8.1专属性考察：用三个批次的黄连解毒丸样品，照上述方法进行专属性实验，结果见图8。
由图8可见，阴性样品无干扰，主斑点Rf值约为0.42；在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色清晰斑点，斑点圆整，分离效果好。表明该方法专属性强，斑点显色清晰。
2.8.2耐用性试验
用三个批次的黄连解毒丸样品，分别对3个不同厂家薄层板进行对比，3种不同温度及湿度作为变动因素，照上述鉴别方法进行实验。
2.8.2.1不同厂家薄层板试验，结果见图9-图11。
3个不同厂家耐用性实验结果表明，黄连解毒丸中黄连的薄层鉴别图主斑点分离效果均表现好，斑点圆整，不同厂家薄层板对主斑点影响不大，重复性较好。
2.8.2.2不同温度及湿度试验
不同温度及湿度设定参数见表6。试验图谱见图12-图14。
表6不同温度及相对湿度的考察
Figure BDA0002969330180000131
通过不同温度及相对湿度的考察实验图谱可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰，分离效果好，Rf值适中，阴性对照无干扰。由此可知，温度及相对湿度在通常环境范围内变动，不影响该鉴别方法的有效性。
三、黄芩的鉴别
黄芩为毛茛科植物黄芩Clematis chinensis Osbeck、棉团铁线莲Clematishexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根和根茎。收载于2020年版中国药典(一部)。黄芩作为黄连解毒处方的臣药，黄芩素、汉黄芩素为其主要的有效活性成分，因此，本实验将选取黄芩素、汉黄芩素作为指标性成分参照中国药典2020年版一部“黄芩”下的TLC方法进行试验，以黄芩素、汉黄芩素对照品作为对照进行薄层鉴别，并考察不同点样量、不同厂家薄层板、不同温度及不同湿度对黄连解毒丸中黄芩药材薄层色谱的影响。试验结果表明以黄芩素、汉黄芩素对照品作为对照，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20:3:0.2)为展开系统，对黄芩药材薄层鉴别特征明显，专属性强。故可作为黄连解毒丸中黄芩药材的薄层鉴别方法，故列入本发明检测项目。
3.1仪器、试剂和样品
KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DGG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)，十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，乙醇(分析纯20130411，上海申博化工有限公司)，石油醚(分析纯20140318，上海申博化工有限公司)，甲苯(分析纯20140721，上海申博化工有限公司)，黄芩素、汉黄芩素对照(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，编号为112542-201405)，黄连解毒丸(20140304、20140201、20140202，本发明制剂，由贵州百灵企业集团制药股份有限公司提供)。
3.2供试品溶液制备：取本品内容物2g，加乙醇50ml，加热回流2小时，滤过，滤液浓缩至20ml，加盐酸3ml，加热回流1小时，加水10ml，放冷，加石油醚(60～90℃)25ml振摇提取4次，每次25ml，石油醚蒸干，残渣用无水乙醇10ml溶解。
3.3对照品溶液的制备：取黄芩素、汉黄芩素对照品，加无水乙醇制成1ml含0.45mg的溶液。
3.4阴性样品的制备：按处方比例及制备工艺，配制不含黄芩药材的阴性样品，按“3.2项”同法制备阴性样品溶液。
3.5展开系统：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20：3：0.2)。
3.6显色剂：10％硫酸乙醇溶液。
3.7最佳点样量考察：分别吸取供试品溶液1、2、3、5、7、10、11μl，对照品溶液1、2、3、4、5、6、7μl，分别点于不同薄层硅胶G板上，进行考察，展开，取出，晾干，喷以显色剂，105℃加热5min，于365nm紫外灯下检视。见图15、图16。
由图15、图16可见，供试品最佳点样量7μl，对照药材最佳点样量为3μl。
3.8方法学验证
3.8.1专属性考察：用三个批次的黄连解毒丸样品，照上述方法进行专属性实验，结果见图17。
由图17可见，阴性样品无干扰；在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色清晰斑点，斑点圆整，分离效果好。表明该方法专属性强，斑点显色清晰。
3.8.2耐用性试验：用三个批次的黄连解毒丸样品，分别对3个不同厂家薄层板进行对比，3种不同温度及湿度作为变动因素，照上述鉴别方法进行实验。
3.8.2.1不同厂家薄层板试验，结果见图18-图20。
3个不同厂家耐用性实验结果表明，黄连解毒丸中黄芩的薄层鉴别图斑点分离效果均表现好，斑点圆整，不同厂家薄层板对黄芩主斑点影响不大，重复性较好。
3.8.2.2不同温度及湿度试验
不同温度及湿度设定参数见表7。试验图谱见图21-图23。
表7.不同温度及相对湿度的考察
Figure BDA0002969330180000151
通过不同温度及相对湿度的考察实验图谱可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰，分离效果好，Rf值适中，阴性对照无干扰。由此可知，温度及相对湿度在通常环境范围内变动，不影响该鉴别方法的有效性。
四、黄柏的鉴别
黄柏为唇形科植物毛叶地瓜儿苗Lycopus lucidus Turcz.Var.hirtus Regel的干燥地上部分，收载于2020年版中国药典(一部)。黄柏作为黄连解毒处方的使药，本实验将选取黄柏对照药材作为对照，先采用乙醇充分超声提取特征性成分，后用萃取的方法提取黄连解毒丸中黄柏的特征性成分，对黄柏药材进行薄层鉴别，并考察不同点样量、不同厂家薄层板、不同温度、不同湿度对该制剂中黄柏药材薄层色谱的影响。试验结果表明：以黄柏对照药材为对照品，石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2：1：2)为展开系统，对黄柏药材薄层鉴别特征明显，专属性强，可作为黄连解毒丸中黄柏药材的薄层鉴别方法，故列入本发明检测项目。
4.1仪器、试剂和样品
KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DGG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)，十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，石油醚(分析纯20130411，上海申博化工有限公司)。乙醇(分析纯20140528，上海申博化工有限公司)，三氯甲烷(分析纯20130721，上海申博化工有限公司)，黄柏对照药材(中国药品生物制品检定所，供鉴别用，编号为111532-201403)，黄连解毒丸(20140304、20140201、20140202，本发明制剂，由贵州百灵企业集团制药股份有限公司提供)。
4.2供试品溶液制备：取本品内容物10g，加乙醇50ml，搅匀，超声处理90分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水50ml使溶解，滤去不容物，滤液用石油醚(60～90℃)振摇提取4次，每次50ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)1ml使溶解。
4.3对照品溶液的制备：取黄柏对照药材2g，加水50ml，加热回流30分钟，放冷，用脱脂棉滤过，滤液用石油醚(60～90℃)振摇提取4次，每次50ml(必要时离心)，合并石油醚提取液，蒸干，残渣加石油醚1ml使溶解。
4.4阴性样品的制备：按处方比例及制备工艺，配制不含黄柏药材的阴性样品，按“4.2项”同法制备阴性样品溶液。
4.5展开系统：石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2：1：2)。
4.6显色剂：5％磷钼酸乙醇溶液。
4.7薄层色谱条件的考察
4.7.1最佳点样量考察
分别吸取供试品溶液4、6、8、9、12、14μl，对照品溶液2、4、6、8、10、14μl分别点于不同薄层硅胶G板上，进行考察，展开，取出，晾干，喷以显色剂，105℃加热5min，于365nm紫外灯下检视。见图24、图25。
由图24、图25可见，供试品9～12μl点样量效果最佳，当点样量小于9μl时，供试品主斑点不清晰；对照品最佳点样量9～12μl皆可。
结合上述考察实验结果，可确定薄层板为硅胶G板，供试品和对照品最佳点样量为9～12μl。经预实验验证，确定黄柏的薄层鉴别方法，并按照《中国药典》2020版一部附录ⅩⅧA中药质量标准分析方法验证指导原则进行方法学验证。
4.8方法学验证
4.8.1专属性考察：用三个批次的黄连解毒丸样品，照上述方法进行专属性实验，结果见图26。
由图26可见，阴性样品无干扰，主斑点Rf值约为0.48；在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色清晰斑点，斑点圆整，分离效果好。表明该方法专属性强，斑点显色清晰。
4.8.2耐用性试验：用三个批次的黄连解毒丸样品，分别对3个不同厂家薄层板进行对比，3种不同温度及湿度作为变动因素，照上述鉴别方法进行实验。
4.8.2.1不同厂家薄层板试验，结果见图27-图29。3个不同厂家耐用性实验结果表明，黄连解毒丸中黄连的薄层鉴别图主斑点分离效果均表现好，斑点圆整，不同厂家薄层板对主斑点影响不大，重复性较好。
2.8.2.2不同温度及湿度试验：不同温度及湿度设定参数见表8。试验图谱见图30-图32。
表8不同温度及相对湿度的考察
Figure BDA0002969330180000171
通过不同温度及相对湿度的考察实验图谱可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰，分离效果好，Rf值适中，阴性对照无干扰。由此可知，温度及相对湿度在通常环境范围内变动，不影响该鉴别方法的有效性。
实施例2
处方：黄连300g 黄芩150g 栀子100g 黄柏120g
制备方法：以上七位，黄连用75％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩至适量。药渣与黄芩等其余6味，加水煎煮三次，每次，滤过，滤液与上述醇溶液合并，减压浓缩成稠膏，干燥，粉碎，过筛，与适量辅料混合，过筛，混匀，加水和炼蜜制成浓缩水蜜丸，制成1000g，即得。
该中药制剂的检测方法如下：
(1)取本品内容物3g，加80％甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振药提取2次，每次10ml，弃去乙醚液，水液加稀盐酸10ml，置水浴中加热1小时，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯，用水30ml洗涤，弃去水液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10：8：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热数分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取本品内容物2g，加乙醇50ml，加热回流2小时，滤过，滤液浓缩至20ml，加盐酸3ml，加热回流1小时，加水10ml，放冷，加石油醚(60～90℃)25ml振摇提取4次，每次25ml，石油醚蒸干，残渣用无水乙醇10ml溶解，作为供试品溶液。另取黄芩素、汉黄芩素对照品，加无水乙醇制成1ml含0.45mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液7μl、对照品溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20：3：0.2)为展开剂，薄层板置展开缸中预饱和10分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例3
处方：黄连300g 黄芩150g 栀子100g 黄柏120g
制备方法：黄连用75％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩至适量。药渣与黄芩等其余6味，加水煎煮三次，每次，滤过，滤液与上述醇溶液合并，减压浓缩成稠膏，干燥，粉碎，过筛，与适量辅料混合，过筛，混匀，加水和炼蜜制成浓缩水蜜丸，制成1000g，即得。
该中药制剂的检测方法如下
(1)取本品内容物2g，加乙醇50ml，加热回流2小时，滤过，滤液浓缩至20ml，加盐酸3ml，加热回流1小时，加水10ml，放冷，加石油醚(60～90℃)25ml振摇提取4次，每次25ml，石油醚蒸干，残渣用无水乙醇10ml溶解，作为供试品溶液。另取黄芩素、汉黄芩素对照品，加无水乙醇制成1ml含0.45mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液7μl、对照品溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20：3：0.2)为展开剂，薄层板置展开缸中预饱和10分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(2)取本品内容物10g，加乙醇50ml，搅匀，超声处理90分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水50ml使溶解，滤去不容物，滤液用石油醚(60～90℃)振摇提取4次，每次50ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材2g，加水50ml，加热回流30分钟，放冷，用脱脂棉滤过，滤液用石油醚振摇提取4次，每次50ml(必要时离心)，合并石油醚提取液，蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各9～12μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％磷钼酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材相应位置上，显相同颜色的斑点。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50：50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按盐酸小檗碱计算不低于2500。
对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含盐酸小檗碱20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品内容物约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，精密加入盐酸5ml，置90℃水浴中加热水解1小时，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例4
处方：黄连300g 黄芩150g 栀子100g 黄柏120g
制备方法：黄连用75％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩至适量。药渣与黄芩等其余6味，加水煎煮三次，每次，滤过，滤液与上述醇溶液合并，减压浓缩成稠膏，干燥，粉碎，过筛，与适量辅料混合，过筛，混匀，加水和炼蜜制成浓缩水蜜丸，制成1000g，即得。
该中药制剂的检测方法如下
(1)取本品内容物3g，加80％甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振药提取2次，每次10ml，弃去乙醚液，水液加稀盐酸10ml，置水浴中加热1小时，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯，用水30ml洗涤，弃去水液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10：8：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热数分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50：50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按盐酸小檗碱计算不低于2500。
对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含盐酸小檗碱20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品内容物约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，精密加入盐酸5ml，置90℃水浴中加热水解1小时，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例5
处方：黄连300g 黄芩150g 栀子100g 黄柏120g
制备方法：黄连用75％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩至适量。药渣与黄芩等其余6味，加水煎煮三次，每次，滤过，滤液与上述醇溶液合并，减压浓缩成稠膏，干燥，粉碎，过筛，与适量辅料混合，过筛，混匀，加水和炼蜜制成浓缩水蜜丸，制成1000g，即得。或用常规方法制得片剂、丸剂、冲剂、口服液、喷雾剂、注射剂、混悬液、微球制剂等其它制剂。
该中药制剂的检测方法如下
(1)取本品内容物10g，加乙醇50ml，搅匀，超声处理90分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水50ml使溶解，滤去不容物，滤液用石油醚(60～90℃)振摇提取4次，每次50ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材2g，加水50ml，加热回流30分钟，放冷，用脱脂棉滤过，滤液用石油醚振摇提取4次，每次50ml(必要时离心)，合并石油醚提取液，蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各9～12μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％磷钼酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材相应位置上，显相同颜色的斑点。
【含量测定】照高效液相色谱法测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50：50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按盐酸小檗碱计算不低于2500。
对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含盐酸小檗碱20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品内容物约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，精密加入盐酸5ml，置90℃水浴中加热水解1小时，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

Claims (10)

1.一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂，其特征在于，包括以下重量份的组分：黄连，1～30份；黄芩，1～20份；栀子，1～20份；黄柏，1～20份。
2.根据权利要求1所述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂，其特征在于，包括以下重量份的组分：黄连，30份；黄芩，15份；栀子，10份；黄柏，12份。
3.根据权利要求1或2所述的主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂，其特征在于，制备方法为：
A、取黄连用75％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩，得药渣和醇溶液；
B、将药渣与黄芩、栀子和黄柏，加水煎煮三次，滤过，得滤液和混合药渣；
C、将滤液与醇溶液合并，减压浓缩成稠膏，干燥、粉碎和过筛后，与辅料混合、过筛和混匀，加水和炼蜜制成浓缩水蜜丸；
D、将浓缩水蜜丸制成相应的制剂。
4.根据权利要求1或2所述的主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂，其特征在于：中药制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、口服液、喷雾剂、注射剂、混悬液或微球制剂中的任一种。
5.一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法，其特征在于：采用鉴别方式和/或含量测定方式对中药制剂进行检测；鉴别方式采用薄层色谱鉴别方法对中药制剂中的黄连、黄芩、黄柏进行鉴别；含量测定采用高效液相色谱法测定中药制剂中黄连的含量；
所述中药制剂为权利要求1-4中任一项所述的主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂。
6.根据权利要求5所述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法，其特征在于,黄连的具体鉴别方法为：取3～4g生药粉的该中药制剂，加80％甲醇30～50ml，加热回流0.5～1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水8～10ml使溶解，用乙醚振药提取2～4次，每次10～30ml，弃去乙醚液，水液加稀盐酸8～10ml，置水浴中加热0.5～1小时，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取2～4次，每次20～30ml，合并乙酸乙酯，用水30～50ml洗涤，弃去水液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1～2ml使溶解，作为供试品溶液；
另取黄连对照药材0.5～1.5g，同法制成对照药材溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3～4μl、对照药材溶液3～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝10～8：8～6：1～0.5为展开剂，展开、取出和晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热数分钟，置365nm的紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
7.根据权利要求5所述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法，其特征在于,黄芩的鉴别方法具体为：取2～3g生药粉的该药中药制剂，加乙醇30～50ml，加热回流1～2小时，滤过，滤液浓缩至15～20ml，加盐酸3～6ml，加热回流0.5～1小时，加水8～10ml，放冷，加入60～90℃石油醚15～25ml，振摇提取3～4次，每次20～25ml，石油醚蒸干，残渣用无水乙醇7～10ml溶解，作为供试品溶液；
另取黄芩素、汉黄芩素对照品，加无水乙醇制成1ml含0.45mg的溶液，作为对照品溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液7～8μl、对照品溶液2～3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝20～17：3～1.5：0.2～0.1为展开剂，薄层板置展开缸中预饱和5～10分钟，展开、取出和晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
8.根据权利要求5所述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法，其特征在于,黄柏的鉴别方法具体为：取8～10g生药粉的该药中药制剂，加乙醇40～50ml，搅匀，超声处理70～90分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水40～50ml使溶解，滤去不溶物，滤液用60～90℃的石油醚振摇提取3～4次，每次40～50ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加60～90℃的石油醚1ml使溶解，作为供试品溶液；
另取黄柏对照药材1.5～2g，加水40～50ml，加热回流30分钟，放冷，用脱脂棉滤过，滤液用石油醚振摇提取3～4次，每次30～50ml，合并石油醚提取液，蒸干，残渣加60～90℃的石油醚0.5～1ml使溶解，作为对照药材溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各9～12μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃的石油醚：三氯甲烷：乙酸乙酯＝2～1：1～0.5：2～1为展开剂，展开、取出和晾干，喷以5％磷钼酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
9.根据权利要求5所述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法，其特征在于,黄连含量测定方法是以盐酸小檗碱对照品为对照，以甲醇：0.4％磷酸溶液＝50：50为流动相的液相色谱法。
10.根据权利要求9所述的一种主治实热火毒，三焦热盛之证的中药制剂的检测方法，其特征在于,黄连的含量测定方法具体为：
黄连中盐酸小檗碱的含量测定：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：0.4％磷酸溶液＝50：50为流动相，检测波长为360nm，板数按盐酸小檗碱计算不低于2500；
对照品溶液的制备；取盐酸小檗碱对照品，加80％甲醇制成每1ml含盐酸小檗碱20μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备；取1.5g生药粉的该药中药制剂，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，密塞，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀、滤过，得续滤液；量取续滤液25ml，加入盐酸5ml，置90℃水浴中加热水解1小时，取出冷却，转移至50ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
测定法；分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
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