CN107550932A - 一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肿瘤研究和治疗领域,具体涉及一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法。通过小鼠血糖的动态监测能够直接反应胰岛素瘤细胞的增殖情况,当小鼠的胰岛素达到一定的限度,小鼠将死于胰岛素分泌过多导致的严重低血糖,其原因为MIN6细胞本身增殖所致,小鼠体内存在的肿瘤微环境促进了这种增殖,从而证明同种条件下生存的小鼠易于罹患肿瘤,为肿瘤易感小鼠模型。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤研究和治疗领域,具体涉及一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法。
背景技术
肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下,局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth),因为这种新生物多呈占位性块状突起,也称赘生物(neoplasm)。肿瘤发病机制和肿瘤治疗的研究主要分为两方面:一是针对肿瘤细胞本身,二是针对肿瘤细胞生长所需的环境。
目前,为了研究肿瘤的发病机制和提出新的防治策略,很多研究者已经建立了各种小鼠研究模型,其中包括接种人源的肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠,通过测量小鼠体内肿瘤大小来反映肿瘤细胞的生长和侵袭等特性,从而评价肿瘤细胞的生长,这一模型被广泛用于肿瘤细胞治疗药物的筛选和评价研究中。另外,还有研究者应用接种鼠源的肿瘤细胞系到小鼠体内,通过测量肿瘤大小来反映肿瘤细胞的生长。这一模型也被广泛用于肿瘤细胞治疗药物的筛选和评价的研究中,还可以评价肿瘤生长的微环境。
上述小鼠模型存在以下缺点:第一,肿瘤细胞在小鼠体内生长的初期无法被监测,肿瘤生长的测量和评价有一定的滞后性;第二,肿瘤块的大小需要在小鼠活体进行测量,测量存在主观因素的干扰,数据不够精确;第三,肿瘤细胞可能存在组织转移,只有体表的肿瘤块可以被监测,此种模型不能评价肿瘤的转移,不能真实反映肿瘤生长和迁移的特性;第四,免疫缺陷小鼠处于人为制造的非正常免疫功能环境中,不能全面真实的反映生理性微环境的情况;第五,免疫缺陷小鼠成本高,对饲养条件要求高,其应用也因此受到限制。
因此,研发一种判断肿瘤易感小鼠模型的新型方法成为目前亟待解决的新课题。
发明内容
本发明的目的在于:提供一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,该方法能够针对肿瘤细胞生长的微环境状态,更加直观准确的反映肿瘤在体的生长状况。
本发明的目的是这样实现的:一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
(1)培养小鼠胰岛素瘤细胞MIN6细胞株;
(2)将小鼠胰岛素瘤细胞MIN6细胞株接种到C57Bl/ 6小鼠体内;
(3)对小鼠血糖进行动态监测,得到相关数据;
(4)通过小鼠的血糖和死亡,判断该类小鼠的同类模型为肿瘤易感小鼠模型。
所述步骤(1)中,培养MIN6细胞株是利用DMEM高糖培养基,在5% CO2、37℃条件下进行培养。
所述DMEM高糖培养基的成分为:15% FBS,5 μL/L β-巯基乙醇、100 units/mL 青霉素,100 μg/mL 链霉素。
所述步骤(2)的接种方法为:首先测量待接种C57Bl/6小鼠血糖作为基础数据,测量后对小鼠进行肩胛背侧局部脱毛,面积约1.5×1.5 cm, 24小时后接种MIN6细胞株,以避免化学脱毛剂相关成分对小鼠的局部刺激以及对接种细胞产生的不良影响。
所述接种方式为注射接种,注射的MIN6细胞计数浓度为3×107个/mL,注射体积为100 μL/只,注射剂量为3×106个/只。
所述在小鼠肩胛背侧脱毛中心处皮下接种MIN6细胞株,肉眼可见接种后皮下有皮丘,手指轻柔接种部位以减少细胞外溢,确保MIN6细胞株充分接种。
所述步骤(3)的动态监测为:自接种之日起,每天固定时间测量一次血糖,观察血糖变化。
所述C57Bl/ 6小鼠为免疫功能正常的小鼠,经过普通SPF级饲养。
通过该判断方法得到的同种条件下生存的小鼠模型用于临床上作为肿瘤实验模型,或进行基因功能研究和致癌物筛选研究。
本发明的原理在于:胰岛素瘤细胞的特点是能够分泌胰岛素,胰岛素导致小鼠血糖的下降,其下降的程度与胰岛素瘤细胞的多少,即胰岛素瘤细胞的增殖情况成正比。胰岛素瘤细胞的增殖受两个因素调节,一为MIN6细胞本身的增殖快慢,二为肿瘤微环境对MIN6细胞增殖和迁移的调控。
因此,通过小鼠血糖的动态监测能够直接反应胰岛素瘤细胞的增殖情况,当小鼠的胰岛素达到一定的限度,小鼠将死于胰岛素分泌过多导致的严重低血糖,其原因为MIN6细胞本身增殖所致,小鼠体内存在的肿瘤微环境促进了这种增殖,从而证明同种条件下生存的小鼠易于罹患肿瘤,为肿瘤易感小鼠模型。
与现有技术相比,本发明的优势在于。
第一:相比其他模型监测的滞后性,本发明可在接种MIN6细胞后早期动态监测小鼠血糖,尽早的反映胰岛素瘤大小和评价胰岛素瘤的生长状况,并可凭此检测指标更加灵敏验证细胞注射成功与否。
第二:相比较其他肿瘤模型实验小鼠诱导肿瘤后自然死亡,接种MIN6细胞的小鼠最后会出现因胰岛素过量分泌导致的严重低血糖,首先缩短了实验的周期,另外通过监测小鼠血糖变化和生存率,指标也更客观准确。
第三:本模型应用的是免疫功能正常的小鼠,更真实全面反映肿瘤生长的生理环境,优于免疫缺陷小鼠的实验。
第四:本模型小鼠可以普通SPF级饲养,简化了实验操作难度,降低小鼠饲养的成本。
附图说明
图1为本发明方法的流程图。
图2为Nrf2-KI小鼠和Nrf2-(φ)KO小鼠接种MIN6细胞后小鼠血糖的动态变化。
图3为接种MIN6细胞小鼠死亡后解剖观察到的肿瘤组织。
图4为Nrf2-KI小鼠和Nrf2-(φ)KO小鼠接种MIN6细胞后的生存曲线图。
图5为接种Nfe2l1低表达和对照Scramble MIN6细胞后小鼠血糖的动态变化图。
图6为接种Nfe2l1低表达和对照Scramble MIN6细胞后小鼠的生存曲线图。
图7为同时接种Nfe2l1低表达和Scramble MIN6细胞的小鼠体内肿瘤大小情况图
A:小鼠死亡后解剖并游离肿瘤块进行称重,B:照相。
具体实施方式
实施例一:应用此方法评价巨噬细胞Nrf2特异性敲除小鼠(Nrf2-(φ)KO)模型是否肿瘤易感。
具体实验方法、材料、过程、数据和结论如下:
1. 主要试剂:DMEM培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(以色列Biological Industries公司);青链霉素(以色列Biological Industries公司);胰酶(美国Gibco公司);血糖试纸。
2. 主要仪器:超净工作台(美国Nuair公司);二氧化碳恒温培养箱(美国Thermo公司);倒置显微镜(德国Zeiss公司);小鼠饲养所用独立通风系统(苏州市苏杭科技器材有限公司);血糖仪(FreeStyle血糖检测仪)。
3. 细胞培养:MIN6细胞株应用DMEM高糖培养基(15% FBS,5 μL/L β-巯基乙醇、100 units/mL 青霉素,100 μg/mL 链霉素)正常培养于5% CO2、37 ℃条件下。
4. 小鼠来源和饲养:Nrf2组织特异性小鼠模型由本课题组自行建立,见参考文献(Xue P, et al. Adipose deficiency of Nrf2 in ob/ob mice results in severemetabolic syndrome. Diabetes. 2013;62(3):845-54)。巨噬细胞特异性表达Cre(B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/NJU) 购自南京大学—南京生物医药研究院。通过Cre-Loxp系统杂交获得巨噬细胞特异性Nrf2敲除小鼠 (Nrf2-(φ)KO),雄性小鼠8-12周龄用于本实验。饲养温度控制在23℃度,光照时间为早6点到晚6点。小鼠饲养在独立通风系统中进行。
5. 小鼠细胞接种实验:首先测量待接种Nrf2-(φ)KO小鼠和对照Nrf2-KI小鼠的血糖作为基础代谢数据值,测量后实验小鼠进行肩胛背侧局部脱毛约1.5 cm × 1.5 cm备用,24小时后注射胰岛素瘤MIN6细胞以减少化学脱毛剂相关成分对小鼠的局部刺激以及对注射MIN6细胞产生不良反应。正常培养的MIN6细胞株由胰酶消化,应用细胞计数板计数后调整MIN6细胞浓度为3×107个/mL。注射体积为100 μL/只,注射剂量约为3×106个/只,肩胛背侧脱毛中心处皮下注射MIN6细胞,肉眼可见注射后皮下有皮丘,手指轻按注射部位以减少细胞外溢。保证两组小鼠采用相同方法接种,根据对照原则严格控制接种剂量、部位、时间以及血糖测量等一系列操作,保证实验对象周龄、性别一致减小个体差异对实验数据的干扰。
6. 小鼠血糖测定:自接种起每四天测量一次血糖,实现动态监测过程。用剪刀剪小鼠尾巴约1毫米,采血1滴,用快速血糖仪测量血糖浓度。尽量使血液自然流出,避免挤压,避免小鼠应激导致数据不稳定。
7. 记录小鼠死亡时间,用于生存曲线绘制。
8. 统计分析:用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,SanDiego, CA)软件对所得数据进行统计学分析,采用双因素方差分析的统计方法,实验数据以均值±标准差表示,p < 0.05时差异有统计学意义。
9. 实验结果。
(1)Nrf2-(φ)KO小鼠和对照Nrf2-KI小鼠接种正常MIN6细胞(3×106个/只)后,血糖随时间逐渐降低,提示MIN6细胞接种后在小鼠体内存活并增殖。如图2所示,Nrf2-(φ)KO小鼠接种MIN6细胞后在4、8、12天时,血糖均值略低于对照Nrf2-KI小鼠接种组,但差异无统计学意义。
(2)MIN6细胞接种20天后有小鼠出现死亡,死亡原因为胰岛素瘤分泌过量的胰岛素导致小鼠出现严重的低血糖。因此,接种细胞后小鼠的死亡情况也可以反应胰岛素瘤的生长情况,并且解剖死亡小鼠后在细胞接种位置发现肿瘤组织(图3)。如图4所示,Nrf2-(φ)KO小鼠和对照Nrf2-KI小鼠接种正常MIN6细胞后,Nrf2-(φ)KO小鼠比对照小鼠生存时间明显缩短,说明Nrf2-(φ)KO小鼠体内的微环境更适于MIN6细胞增殖。
10. 实验结论:应用本专利的方法建立MIN6细胞同种移植小鼠模型,成功评价Nrf2-(φ)KO小鼠体内的微环境更适于胰岛素瘤MIN6细胞存活和增殖。
实施例二:应用此方法评价脂膜类核转录因子NFE2L1对胰岛素瘤细胞MIN6增殖的影响。
具体实验方法、材料、过程、数据和结论如下。
1. 主要试剂:DMEM培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(以色列Biological Industries公司);青链霉素(以色列Biological Industries公司);胰酶(美国Gibco公司);血糖试纸。
2. 主要仪器:超净工作台(美国Nuair公司);二氧化碳恒温培养箱(美国Thermo公司);倒置显微镜(德国Zeiss公司);小鼠饲养用独立通风系统(苏州市苏杭科技器材有限公司);血糖仪(FreeStyle血糖检测仪)。
3. 细胞培养:MIN6细胞株应用DMEM高糖培养基(15% FBS,5 μL/L β-巯基乙醇、100 units/mL 青霉素,100 μg/mL 链霉素)培养于5% CO2、37 ℃条件下。Nfe2l1稳定低表达MIN6细胞系的建立:将携带Nfe2l1的shRNA和无序对照的慢病毒转染MIN6细胞,细胞培养过程中加入1.0 μg/mL 嘌呤霉素对细胞进行筛选,得到Nfe2l1-KD和Scramble细胞稳定细胞株。
4. 小鼠饲养:C57Bl/ 6野生型小鼠8-12周龄,饲养温度温度控制在23℃度,光照时间为早6点到晚6点。
5. 小鼠细胞接种实验:首先测量待接种C57Bl/6野生型小鼠血糖作为基础代谢数据值,测量后实验小鼠进行肩胛背侧局部脱毛约1.5 cm × 1.5 cm备用,24小时后注射胰岛素瘤MIN6细胞。正常培养的Nfe2l1-KD和Scramble MIN6细胞株由胰酶消化,应用细胞计数板计数后调整Nfe2l1-KD和Scramble细胞浓度为3×107个/mL。注射体积为100 μL/只,注射剂量约为3×106个/只,肩胛背侧脱毛中心处皮下注射MIN6细胞,肉眼可见注射后皮下有皮丘,手指轻按注射部位以减少细胞外溢。保证Nfe2l1-KD和Scramble细胞采用相同方法接种,根据对照原则严格控制接种剂量、部位、时间以及血糖测量等一系列操作,保证实验对象周龄、性别一致减小个体差异对实验数据的干扰。
6. 小鼠血糖测定:自接种起每三天测量一次血糖,实现动态监测过程。用剪刀剪小鼠尾巴约1毫米,采血1滴,用快速血糖仪测量血糖浓度。尽量使血液自然流出,避免挤压,避免小鼠应激导致数据不稳定。
7. 记录小鼠死亡时间,用于生存曲线绘制。
8. 统计分析:用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,SanDiego, CA)软件对所得数据进行统计学分析,采用配对t检验和双因素方差分析的统计方法,实验数据以均值±标准差表示,p < 0.05时差异有统计学意义。
9. 实验结果。
(1) C57Bl/6小鼠接种Nfe2l1-KD或Scramble MIN6细胞(3×106个/只)后,血糖随时间逐渐降低,提示MIN6细胞接种后在小鼠体内存活并增殖,小鼠的血糖反应MIN6细胞在体的增殖速度和胰岛素瘤的大小。如图5所示,Nfe2l1-KD MIN6细胞接种小鼠血糖值明显低于对照细胞接种组,小鼠最终死于严重的低血糖。
(2)Nfe2l1-KD MIN6细胞接种后一周有小鼠出现死亡。如图6所示,Nfe2l1-KDMIN6细胞接种小鼠明显比对照细胞接种小鼠生存时间短,说明Nfe2l1-KD MIN6细胞接种后在小鼠体内增殖更快。
(3)为比较Nfe2l1-KD和Scramble MIN6细胞生长快慢,对同一只C57B/6小鼠背部左右两侧分别注射Nfe2l1-KD和Scramble细胞。小鼠死亡后解剖分离出肿瘤组织进行重量的比较,结果如图7所示,源自Nfe2l1-KD和Scramble细胞的肿瘤大小差异有统计学意义。
10. 实验结论:应用本专利的方法建立MIN6细胞同种移植小鼠模型,成功评价Nfe2l1稳定低表达的MIN6细胞与Scramble对照细胞相比在小鼠体内增殖更快。
Claims (9)
1.一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
(1)培养小鼠胰岛素瘤细胞MIN6细胞株;
(2)将小鼠胰岛素瘤细胞MIN6细胞株接种到C57Bl/ 6小鼠体内;
(3)对小鼠血糖进行动态监测,得到相关数据;
(4)通过小鼠的血糖和死亡,判断该类小鼠的同类模型小鼠为肿瘤易感小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于所述步骤(1)中,培养MIN6细胞株是利用DMEM高糖培养基,在5% CO2、37℃条件下进行培养。
3. 根据权利要求2所述的一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于所述DMEM高糖培养基的成分为:15% FBS,5 μL/L β-巯基乙醇、100 units/mL青霉素,100 μg/mL链霉素。
4.根据权利要求1所述的一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于所述步骤(2)的接种方法为:首先测量待接种C57Bl/6小鼠血糖作为基础数据,测量后对小鼠进行肩胛背侧局部脱毛,面积约1.5×1.5 cm,24小时后接种MIN6细胞株。
5.根据权利要求4所述的一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于所述接种方式为注射接种,注射的MIN6细胞计数浓度为3×107个/mL,注射体积为100μL/只,注射剂量为3×106个/只。
6.根据权利要求4所述的一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于所述在小鼠肩胛背侧脱毛中心处皮下接种MIN6细胞株,肉眼可见接种后皮下有皮丘,手指轻柔接种部位,确保MIN6细胞株充分接种,无溢出。
7.根据权利要求1所述的一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于所述步骤(3)的动态监测为:自接种之日起,每天固定时间测量一次血糖,观察血糖变化。
8.根据权利要求1所述的一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于所述C57Bl/6小鼠为免疫功能正常的小鼠,经过普通SPF级饲养。
9.根据权利要求1所述的一种判断肿瘤易感小鼠模型的方法,其特征在于通过该判断方法得到的同种条件下生存的小鼠模型用于临床上作为肿瘤实验模型,或进行基因功能研究和致癌物筛选研究。
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CN108379568A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-08-10 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种抵抗素多肽疫苗及其在治疗乳腺癌中的应用 |
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CN1875104A (zh) * | 2003-08-29 | 2006-12-06 | 儿童医学中心公司 | 来自内皮抑素n-末端的抗血管生成肽 |
CN108379568A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-08-10 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种抵抗素多肽疫苗及其在治疗乳腺癌中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
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