KR20070051766A - 클로스트리디움 보튤리넘 ｃ３ 엑소트랜스퍼라제 조성물 및이를 이용한 암전이 치료 방법 - Google Patents

클로스트리디움 보튤리넘 ｃ３ 엑소트랜스퍼라제 조성물 및이를 이용한 암전이 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체로 구성된 약학적 조성물들을 제공하며, 이때 상기의 약학적 조성물들은 포유동물의 암전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식, 확산 및 이동을 억제 또는 예방하는데 유용할 뿐만 아니라, 종양세포의 증식, 이동, 혈관신생 및 종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제의 분비과정 중 적어도 한 개 이상의 과정을 억제할 수 있다.

Description

클로스트리디움 보튤리넘 Ｃ３ 엑소트랜스퍼라제 조성물 및 이를 이용한 암전이 치료 방법{CLOSTRIDIUM BOTULINUM C3 EXOTRANSFERASE COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING TUMOUR SPREADDING}
본 발명은, 전이암(metastatic cancer)과 관련된 암의 증식 예방 및 암치료에 유용한 조성물 및 이를 이용한 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤린넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 포유류의 전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 전이의 예방 또는 억제에 유용한 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
포유동물에 있어서 암은 포유동물 조직 내에 종양세포 집단의 비정상적인 분열에 의해 특성화될 수 있다. 만약, 이러한 세포집단이 조직 내에 위치하게 되면, 종양(악성) 또는 암세포의 비정상적인 분열은 조직 내에 최초의 종양을 형성할 수 있다. 만약, 한 개 또는 그 이상의 종양세포 또는 세포집단이 최초 부위에서 두 번째 부위 또는 추가적인 조직 내로 이동, 정착 및 비정상적인 증식을 하게 되면, 그 부위는 아마 최초 암 부위의 가장 가까운 부위거나 멀리 떨어진 부위, 예를 들면, 해부학적으로 최초 암 조직 부위에서 멀리 떨어진 다른 기관 또는 조직일 것이며, 이렇게 형성된 두 번째 암 또는 추가적인 암은 이동된 한 개의 종양세포 또는 세포들의 비정상적인 분열의 결과로서 각각 두 번째 위치 또는 추가적인 위치에서 발생하게 된다. 두 번째 부위에서 성장하는 세포 부위에서 다른 부위로 한 개 또는 그 이상의 종양세포가 이동하는 것은 종종 발생할 수 있고, 포유동물에 있어서는 한 개 또는 그 이상의 조직 부위에서 악성종양을 발생할 수 있다. 이러한 악성종양의 성장은 종종 신생 모세혈관의 발달과정인 혈관신생(angiogenesis) 또는 혈관의 발달 및 튜브 네트워크의 형성과정인 혈관화(vascularization)를 포함하는 종양 발달과정과 관련되어 있다. 특히, 새로운 혈관화 과정은 지속적인 종양 성장에 필요한 영양물질 및 성장인자와 같은 다양한 인자들을 제공한다.
따라서, 암은 비조절성 및 증식성을 띠는 과도한 세포분열로 인해 기인된 조직의 비정상적인 덩어리이며, 신생종양(neoplasm)이라고 불린다. 또한, 암은 양성종양 또는 악성종양으로 나뉠 수 있다.
지금까지, 다양한 방법들이 예를 들면, 암 및 일반적으로 몇 개의 지속적 또는 인접한 비-암조직을 조직상 암 부위로부터 제거하는 수술적인 절차를 포함하여, 인간을 포함하는 포유류의 암을 치료하는데 사용되고 있다. 암을 제거한 후, 잔존하는 일부분의 조직은 포유동물에서 제거된 암 부위 근처에 존재하게 된다. 그러나, 단독적인 수술에 의한 치료방법은 많은 환자들 특히, 유방암, 뇌종양, 결장암, 피부암(흑색종), 신장암 및 간암으로 분류된 특정 암을 가진 환자들에게 있어 최소한 한 개의 추가적인 또는 두 번째 암으로 형성 및 증식하는 형태로 재발을 유도할 수 있는데, 이런 경우에는 최초의 암 부위를 제거한 후 잔존하는 일부분의 정상 부위 또는 종종 이와 다른 조직이나 기관 및 최초의 암 부위에서 발달 또는 멀리 떨어진 부위에서 암이 발생하게 된다.
그러므로, 많은 암들은 수술에 추가적으로, 예를 들면, 빈그리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 시스플라틴(cisplatin), 메소트렉세이트(methotrexate), 5-FU 등과 같은 화학적 치료요법 및/또는 방사선 치료와 같은 복합적인 치료가 필요하다. 그러나, 이러한 치료 방법을 이용하는데 있어서는 몇 가지 어려움이 있는데, 예를 들면 방사선 및 화학적인 치료제들은 치료적 투여량에서 정상세포에 독성을 일으키며, 종종 환자들의 생명을 위협하는 부작용이 발생할 수 있다는 것이다. 이러한 암 치료방법들은 종종 높은 실패율/소실율을 일으키며, 환자들의 생명을 앗아갈 수도 있다. 보다 최근의 몇몇 치료방법들은 유방암에 있어서는 타목시펜(tamoxifen) 및 만성골수성 백혈병에 있어서는 글리벡(GleevecR)과 같 은 변형되거나 상향조절된 유전자 산물에 의해 암세포에서의 신호전달 붕괴를 유도하는 것을 특징으로 한다.
상기 방법들의 추가적인 어려움은, 국소적 재발 및 국소적 질병 조절이 여전히 악성종양 치료에 있어서 주요한 과제로 남아 있다는 점이다. 미국에서는 해마다 600,000명 이상의 환자들이 전이의 증거가 없는 국소적 악성종양 환자로 분류되고 있는데, 이는 비-흑색종 피부암 또는 원위치 암종(carcinoma in situ)을 포함하지 않는 악성종양으로 진단받은 환자들의 약 64%에 해당된다. 이러한 환자들 대부분에 있어서, 절제 수술법은 가장 빠른 회복의 기회(예를 들면, 400,000명의 환자들은 초기 치료 후 회복될 것이다)를 줄 수 있지만, 불행히도 약 200,000명(국소적 암 환자들의 1/3)은 초기 치료 후 재발할 수 있다. 이렇게 재발된 환자들 중에서, 암이 발생된 부위에서의 재발생으로 인해 재발되는 수는 해마다 약 133,000명에 해당된다(국소적 암 환자의 약 21%). 또한, 암전이에 의해 재발되는 환자의 수는 해마다 약 68,000명 정도이다(또는, 국소적 암환자들 중 약 11%). 또한, 해마다 약 100,000명의 환자들은 국소적으로 발생한 암 성장을 조절할 수 없어서 직접적으로 사망할 수 있다.
뇌종양은 특히 치명적인 암종이다. 모든 주된 신경교종 중 약 1/3이 치명적이며(신경교종은 모든 뇌종양의 약 1/3임), 신경교종 환자의 평균 수명은 약 10-12개월이다. 또한, 5년 정도의 생존율은 약 9%이다. 신경교종은 신경아교세포로부터 유래된 뇌종양이며, 성상세포로부터 유래된 성상세포종, 희소돌기아교세포로부터 유래된 희소돌기아교세포종, 뇌실막세포로부터 유래된 상의세포종 등을 포함하고 있다. 많은 연구보고들은 이러한 공격적인 암을 치료하는데 복합적 치료가 필요하다고 보고하였다. 대부분의 일반적인 형태의 뇌종양은 전이에 의해 발생되며, 미국에서 1년에 약 100,000-170,000명의 뇌종양 환자로 진단받고 있다. 평균수명은 약 2.9개월-3.4개월 정도가 된다. 전이성 뇌종양은 주로 방사선 수술 또는 암 제거 수술에 의해 치료되고 있다. 또한, 수술과 방사선의 병행 치료가 단독적인 방사선 치료보다 더 좋은 치료 결과를 나타내는 것으로 보고되었다. 뇌로 전이되는 암의 대부분의 공통의 기원은 유방암, 위장암, 신장암 및 악성 흑색종을 포함한다. 전이성 뇌종양은 임상적으로 원발암성 종양의 제거 후에 특히 위험하다. 중추신경계 종양(여기서는 뇌종양 및 뇌암을 포함)을 지닌 개체들은 두통, 구역질 또는 구토, 발작, 정신착란, 언어장애, 환각 및/또는 마비 상태와 같은 임상적인 증상으로 확인되었다. 포유동물에서 원발성 중추신경계 암전이를 억제하는 방법은 또한 본 발명의 범위안에 있다.
혈관신생( Angiogenesis )
정상적인 조직에서 혈관신생을 조절하는 많은 기작들은 악성종양의 존재하에서 암 증식에 변화를 초래한다. 암의 형성 및 전이는 병리학적인 혈관신생과 관련되어 있다. 건강한 조직처럼, 암은 영양물질 및 산소를 얻기 위하여, 또한 세포 분비물을 제거하기 위하여 혈관과의 연결이 필요하다. 그러므로, 병리학적인 혈관신생은 암의 성장 및 확대에 매우 중요하다. 혈관신생이 중요한 암종으로는 청신경초종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종과 같은 양성종양뿐만 아니라 악성종양(고형암)을 포함하고 있다. 전이에 있어서, 병리학적인 혈관신생은 적어도 두 개의 관점에서 중요하다. 암에 있어서의 혈관형성은 암세포가 혈류를 타고 온 몸 으로 순환하도록 가능하게 한다. 혈관신생은 암세포에 의해 발생된 새로운 종양(여기서는 원발성 부위 또는 최초의 암)의 형성 및 성장을 지원한다.
혈관신생은 혈관형성의 복잡한 과정이다. 이 과정은 생화학 및 (1)혈관신생 촉진에 의한 혈관내피세포의 활성; (2)세포 기질의 퇴화, 활성화된 혈관내피세포의 주변 조직으로의 침윤 및 혈관 촉진인자로의 이동; 및 (3)새로운 혈관형성을 위한 혈관내피세포의 성장 및 분화의 단계를 포함하는 세포의 변화 모두를 포함하고 있다(Forkman et al., J. Biol. Chem., 267, 10931-10934, 1991).
혈관신생 조절은 혈관신생 촉진자 및 억제자를 포함하는 고도로 조절된 과정이다. 건강한 사람 및 동물에 있어서, 혈관신생은 특이적, 제한적인 상황하에서 발생한다. 예를 들면, 혈관신생은 정상적으로 태아 및 배아의 발달, 정상적인 조직 및 기관의 발달 및 성장, 상처치료 및 황체, 자궁내막 및 태반의 형성과정에서 관찰된다.
본 발명의 다른 실시태양은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 예를 들면, BA-05와 같은 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)에 의한 혈관신생의 억제를 포함한다.
또한, 본 발명의 또다른 실시태양은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 예를 들면, BA-05와 같은 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 약학적 조성물의 유효량에 의한 혈관신생의 억제를 포함한다.
Rho 신호전달 및 암
Rho(Ras 유사체로 알려짐)족 단백질은 암과 관련되어 연구되어오고 있다. Ras 및 2차 표적로서의 RhoB는 단백질 번역 후 구조변형을 억제하는 분자에 의한 전이의 표적이다. 그러나, 이러한 치료적 연구보고들은 주로 Ras에 초점을 맞추고 있으며 Rho족의 구성원 중 Rho B에 한정되어 있지만 본 발명에서는 RhoA, RhoB 및 RhoC 신호전달에 영향을 줄 수 있는 가능성을 제시하고 있다. RhoA, RhoB 및 RhoC는 특히, BA-05 융합 단백질에 의해 억제되는 Rho족 구성원이다. 몇몇 보고들에서는 Rho 연관성 및 중요한 변화에 대한 분자 프로브로 이용되고 있는 C3 엑소효소는 세포 형질전환과 같은 암에 있어서 중요하게 고려되는 파라미터로서 확인되었다. 이러한 연구보고들에서, C3는 조직배양액에서의 연장된 배양으로부터 외래 유전자 발현에 이르는 방법에 의하여 적용되고 있다. 본 발명에 있어서, BA-05와 같은 본 발명의 조성물과 방법 및 BA-05의 주입은 낮은 농도에서 암세로포 투입되어 빠르게 Rho 단백질을 불활성화시킴으로써 C3에 비해 보다 큰 장점을 제공한다. 또 다른 장점으로써, 본 발명은 BA-07과 같은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는데 이 융합 단백질은 암세포 및 융합 단백질의 부재시에 암의 성장을 위해 신생혈관을 공급할 수 있는 혈관내피세포 모두에 침투할 수 있는 능력을 가지고 있다.
Rho족의 조절 단백질에서의 변이는 임상적으로 악성종양 부위에서 발견되었다. 이러한 예로는, 간세포암에서의 DLC1 유전자, 신경교종 및 성상세포종에서의 변이된 게놈 부위(p-190-A), 백혈병에 있어서 기능손실 돌연변이를 가진 GRAF 및 급성골수성 백혈병에서 발견된 몇 개의 유전자 융합(LARG) 등이 포함된다. 이로 인해, 유전적으로 조작된 점 돌연변이는 RhoA를 활성화시키고, 시험관내에서 세포의 형질전환을 유도하게 된다.
인간 악성종양에서의 Rho 그룹의 유전자 발현
소형 GTPase인 Rho는 BA-05에 대한 세포내 표적이며, 악성 흑색종 및 유방암과 같은 몇몇 암종에서 활성화된다.
또다른 소형 GTPase인 Rho와는 대조적으로 Rho GTPase는 비록, 암에서 Rho 유전자 발현의 불균형에 대한 증거가 축적되고 있다 하더라도, 전통적인 접근방법에 의해서는 아직까지 종양 유전자로 확인되지는 않았다. 예를 들면, 증가된 RhoA mRNA 레벨은 고환암에서 관찰되었고, 증가된 RhoC mRNA 레벨은 염증성 유방암 및 췌장암에서 관찰되었다.
암 게놈해부 프로젝트(Cancer Genome Anatomy Project, CGAP)는 종양 부위에서의 유전자 발현과 관련되어 있다. 상기 관련 자료는 종양 및 정상세포로 구성된 라이브러리의 전사 단계에서 이용가능하다(NCBI, 2002). 전사 단계는 유전자를 특이적으로 한정할 수 있는 10bp의 올리고뉴클레오티드인 태그(tags)를 이용하여 측정되었다. RhoA, RhoB 및 RhoC의 이용할 수 있는 자료 중 본 발명자들은 RhoA의 활성화를 조사하였고 보다 구체적으로, 뇌종양 및 유방암에서의 RhoC를 조사하였다. RhoA 서열 태그는 정상조직에 비해 소뇌암 및 유방암으로 구성된 라이브러리에서 더욱 빈번하게 관찰되었다. 발현 레벨은 성상세포종이 아닌 교아종에서 증가하였다. 이러한 결과는, 성상세포암 부위에서 RhoA의 단백질 레벨이 감소되는 것과 상응한다. RhoC mRNA 레벨은 유방암에서 과발현되고 몇몇 뇌종양에서는 약하게나마 증가하며 결장암에서는 저해된다.
그러나, 이러한 라이브러리에서 Rho cDNA의 상대적인 레벨은 많은 다른 유전자 산물이 관련하는 복잡한 조절을 수행하는 세포에서의 Rho 활성과 직접적인 관련은 없을 것으로 보인다.
암 및 암세포주에서의 Rho 단백질
사람에 있어서, Rho 단백질 발현은 몇몇 암 부위에서 조사되어 왔다. 결장암, 유방암 및 폐암에서 증가된 단백질 레벨이 관찰되었다. RhoA 및 RhoB 레벨은 두경부 편평상피세포암을 5 ㎛ 두께로 박편하여 이 단백질에 대한 다클론 항체를 이용한 후 VectaStatin kit(Vector Labs) 및 이미지 분석을 통하여 확인하였다. 이어, "비-신생종양" 부위를 대조군으로 이용하였다. 비록, RhoA 단백질 레벨은 암 발달과 함께 증가하지만, RhoB 단백질 레벨은 조직내 암 및 잘 분화되는 암과 비교했을 때 침윤성 암에서 감소하였고, 그 활성상태는 조사되지 않았다.
RhoA 및 RhoA의 과발현은 정상조직에 비해 유방암 및 폐암에서 발생한 것이며, 반면, Rho 단백질의 발현은 성상세포종에서 감소될 수 있다. 즉, 이것은 가역 적으로 II 내지 IV 단계의 종양과 관련이 있다.
Rho 및 전이
Rho는 세포의 이동 및 이동성 조절과 관련되어 있는 단백질이다. RhoA 변이체(Val14 또는 Val14Ile41)를 MM1 렛트 간암세포에 형질도입시킨 경우, Rho의 지속적인 활성화를 초래한다. 시험관내 침윤 분석에서 중피세포층으로 침투할 수 있는 이식된 세포의 백분율은 형질도입된 RhoA Val14의 발현 수준과 관련이 있다. 이러한 활성화된 RhoA가 형질도입된 세포를 생체내의 복강내로 투입했을 경우, 대조군 형질도입체에 있어서는 8건의 이식체 중 2건에서 종양결절이 생기는데 반해, 10건의 이식체 중 6건에서 종양결절이 발생하였다. 이러한 결과는, 활성화된 Rho결절은 종양형성 가능성과 관련되어 있음을 의미한다.
두 가지 전이성 흑색종 모델인 사람 및 마우스에서의 전체적인 유전자 발현 양상을 마이크로어레이로 비교분석해 보면, RhoC 발현이 전이 증가 레벨에 따라 변화하는 유사성을 공통적으로 보였다(Clark et al., 2000). 덧붙여, 유전자 발현을 실험적으로 조작했을 경우, RhoC 과발현은 사람 흑색종 세포주로 하여금 낮은 전이성에서 높은 전이성으로의 연결을 유도함을 알 수 있었다. 비록, RhoA는 과발현됨을 관찰할 수는 없었지만, 우성-음성 돌연변이(N19RhoA)는 전이성을 감소시켰다.
또한, 사람 유방암에서 전이와 관련된 70개의 유전자 발현이 보고되었다(van't Veer et al., 2002). 비록, Rho 유전자는 확인되지 않았지만, 예후 인자로 서 이용될 수 있는 질병 마커의 가치와, 치료를 위한 타겟으로서의 그 가치가 반드시 관련되어 있어야 하는 것은 아니므로, Rho 그룹 신호전달에 있어서, 전사 레벨의 단독적인 측정에 의해, 분명하지는 않지만 효소활성의 복잡한 조절 및 단백질-단백질 반응이 있음을 알 수 있다.
본 발명의 각각의 융합 단백질들은 종종 BA-05, BA-07 및 이와 유사한 명칭으로 언급되었다.
본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 암전이 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적인 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 종양 또는 암 절제부위에 인접하는 숙주 조직 및 절제부위 내 잔존하는 전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 투여는 포유동물에 잔존하는 암 절제부위 표면, 절제부위 표면 하부 또는 절제 후 근처에 잔존하는 조직 내로 직접적으로 적용되며, 상기 투여는 암 절제 또는 제거 전과 후에 투여 또는 암 절제 또는 제거 전 또는 후에 일정한 간격으로 수행될 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 숙주 조직에서의 악성종양으로부터 종양성장을 예방하는 방법을 제공한다. 이때, 상기의 융합 단백질은 악성종양세포의 이동, 악성종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 악성종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 악성종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase, MMP)의 분비과정 중 적어도 두 개의 과정을 동시에 억제 및 예방한다.
본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에 있어서 암의 1차 종양의 절제 또는 제거 부위에 인접한 숙주조직의 절제 경계부위내에서의 암의 잔류 종양세포를 포함하는 2차 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 투여는 포유동물에 있어서, 절제부위 표면 또는 절제부위 표면 하부 또는 절제부위 근처에 잔존하는 조직 내로 직접적으로 수행되고, 상기 투여는 최초의 암 절제 또는 제거 전과 후에 투여하거나 암 절제 또는 제거 전 또는 후에 일정한 간격으로 수행될 수 있다. 이때, 상기의 융합 단백질은 잔존하는 종양세포의 이동, 잔존하는 종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 잔존하는 종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 잔존하는 종양세포로부터 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase, MMP)의 분비과정 중 적어도 두 개의 과정을 동시에 억제 및 예방한다.
아울러, 본 발명은 상기 방법을 수행하기 위하여 상기에서 언급한 약학적 조성물의 용도 또는 상기 방법을 수행하기 위한 약물의 제조방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 예를 들면, BA-05와 같은 융합 단백질과 같은 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 중추신경계(central nervous system, CNS)로 침투하는 암 전이 억제방법을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-05와 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 치료적 유효량의 약학적 조성물은 항-혈관신생 활성을 나타내며 암 치료에 유용하다.
일 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 암전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방하는 방법을 제공한다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 암 적출부위에 인접한 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이때 상기 투여는 암 절제 경계부위 표면, 절제 경계부위 표면 하부 또는 암 절제 후 근처에 잔존하는 조직내로 직접적으로 수행되고, 상기 투여는 암 적출 또는 제거 전과 후에 투여하거나 암 적출 또는 제거 전 또는 후에 일정한 간격으로 투여하는 것을 특징으로 한다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 숙주조직에서의 악성종양세포로부터 형성된 암의 성장을 예방하는 방법을 제공하며, 이때 상기의 융합 단백질은 악성종양세포의 이동, 악성종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 악성종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 악성종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 한다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 최초의 암 적출 또는 제거부위에 인접한 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 암세포를 포함하는 2차 암의 증식을 예방하는 방법을 제공하며, 이때 상기 투여는 최초의 암 적출 또는 제거 전 또는 후에 투여하거나 암 적출 또는 제거 전과 후에 일정한 간격으로 투여하는 것을 특징으로 하며, 이때 상기 융합 단백질은 잔존하는 종양세포의 이동, 잔존하는 종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 잔존하는 종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 잔존하는 종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 한다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 암전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
여섯 번째 측면에서, 본 발명은 포유동물의 암 적출부위 근처에 있는 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서의 폴리펩티드 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 이때 상기 투여는 암 절제 경계부위 표면, 절제 경계부위 표면 하부 또는 암 절제 후 근처에 잔존하는 조직내로 직접 투여하는 것이 바람직하며, 또한 상기 투여는 암 적출 또는 제거 전과 후에 투여하거나 암 적출 또는 제거 전 또는 후에 일정한 간격으로 투여하는 것이 바람직하다.
일곱 번째 측면에서, 본 발명은 상기 융합 단백질에 있어서, 포유동물의 숙주조직에 잔존하는 종양세포로부터 형성된 암의 성장을 예방하기 위한 약물의 제조의 있어서, 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 악성종양세포의 이동, 악성종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 악성종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 한다.
여덟 번째 측면에서, 본 발명은 상기 융합 단백질에 있어서, 최초의 암 적출 또는 제거부위 근처에 있는 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 암세포를 포함하는 2차 암의 증식을 예방하기 위한 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 악성종양세포의 이동, 악성종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 악성종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 측면들에 있어서, 상기 융합 단백질 접합체는 BA-05인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 측면들에 있어서, 상기 암은 유방암, 뇌종양, 결장암, 피부암, 신장암 및 간암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 이때 상기 암은 신경교종, 뇌종양, 송과선종, 수막종, 신경초종, 림프종, 기형암 및 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 위장암으로부터 유래된 뇌부위에 위치한 전이암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뇌종양이다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 이때 상기 암은 역형성 성상세포종(anaplastic astrocytoma), 다형성교아종(glioblastoma multiform), 털모양 성상세포종(pilocytic astrocytoma), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 상의세포종(ependymoma), 점액유두상 상의세포종(myxopapillary ependymoma), 상의하세포종(subependymoma), 맥락총 유두종(choroid plexus papilloma), 신경아세포종(neuroblastoma), 신경절모세포종(ganglioneuroblastoma), 신경절신경종(ganglioneuroma), 수아세포종(medulloblastoma), 송과체모세포종(pineoblastoma) 및 송과체종양(pineocytoma), 수막종(meningioma), 뇌막혈관주위세포종(meningeal hemangiopericytoma), 뇌막육종(meningeal sarcoma), Schwannoma(신경초종, neurolemmoma) 및 신경섬유종(neurofibroma), 호지킨스 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨스 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 아류형(subtype), 비-호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 아류형(subtype), 두개인두종(craniopharyngioma), 유표피낭(epidermoid cysts), 유피낭(dermoid cysts) 및 교질낭(colloid cysts)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뇌종양이다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물의 치료적 유효량은 조직 cc당 약 0.001 ㎍ 내지 약 50 ㎍이다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물의 치료적 유효량은 조직 cc당 약 0.0001 ㎍ 내지 약 100 ㎍이다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물의 치료적 유효량은 ㎖당 약 1 ㎍ 내지 10 ㎍ 내지 50 ㎍이다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 주사, 국소 투여 또는 이식에 의하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 관절강내(intrarticular), 안구내(intraocular), 비내(intranasal), 신경내(intraneural), 피부내(intradermal), 골내(intraosteal), 혀밑(sublingual), 구강(oral), 국소부위(topical), 방광내(intravesical), 뇌척수강내(intrathecal), 혈관내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 두개골내(intracranial), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 흡입(inhalation), 원자화(atomization) 및 흡입, 암에 직접 투여, 환부에 직접 투여, 암 적출 후 잔존하는 경계부위 또는 경계부위 하부에 직접 투여, 경장(eternal), 위시경 절차와 함께 사용하는 경장 및 ECRP로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위는 약 5개 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기의 클로스트리디움 보튤리넘 Ce 엑소트랜스퍼라제 유닛은 융합 단백질 BA-05의 서열로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기의 기능적으로 유사한 그 유사체는 자연형 클로스트리디움 보튤리넘 Ce 엑소트랜스퍼라제의 50% 내지 500% 범위의 활성을 가지는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate), PVA], 부분적으로 가수분해된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트-코-비닐 알코올)[poly(ethylene-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)], 가교된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 가교되며 부분적으로 가수분해된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 가교된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트-코-비닐 알콜)[poly(ethylene-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)], 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락트산, 폴리글리콜릭산(ployglycolic acid, PGA), 락트산과 글리콜릭산의 코폴리머, 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리발레롤락톤(polyvalerolactone), 폴리(엔하이드라이드)(polyanhydrides), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 폴리카프롤락톤의 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리락트산의 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 그들의 조합 및 혼합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 액상 젤라틴, 액상 단백질, 폴리머 담체, 가교제 및 그들의 혼합물을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 기질을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 멸균수, 완충식염수, 완충액, 항산화제, 아스코르브산(ascorbic acid), 적어도 1개 이상의 저분자량을 가진 폴리펩티드, 약 2개 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 적어도 1개 이상의 단백질, 적어도 1개 이상의 아미노산, 사람의 필수아미노산, 적어도 1개 이상의 카르보하이드레이트(carbohydrate), 적어도 1개 이상의 카르보하이드레이트에서 유래된 물질, 비-환원당, 글루코즈, 소르비톨(sorbitol), 트레할로스(trehalose), 마니톨(mannitol), 말토덱스트린(maltodextrin), 덱스트린(dextrin), 싸이클로덱스트린(cyclodextrin), 킬레이팅 시약(chelating agent), EDTA, DTPA, 2가 금속이온을 제거하는 킬레이팅 시약, 3가 금속이온을 제거하는 킬레이팅 시약, 글루타치온(glutathione), 비특이적 항체 알부민 및 그들의 화합물을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 멸균상태인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 멸균가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 멸균화된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 하나의 바이알에 일 단위 투여용량이 함유되거나 일 단위 투여용량의 정수배가 함유되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 건조된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 탈수화된 기질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이전의 측면들의 다른 측면을 제공하는데, 상기 약학적 조성물은 냉동건조된 기질의 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
Rho 의 저해와 세포사멸
암에 있어서 세포증식을 조절하는 기작은 비정상적으로 조절된다. EL4 마우스 T 림프종 세포에서의 증가된 세포사멸은 재조합된 C3 엑소효소에 의해 Rho를 불활성화시킨 후에 발생한다. NIH3T3 세포에 있어서, Rho 키나아제 억제제인 Y-27632는 고정-비의존성 성장을 현저하게 억제하였다. 본 발명의 일 실시태양에서, Rho의 불활성화는 암세포의 성장을 억제할 수 있으며, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-07와 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)에 의한 암세포 성장 감소 또는 지연, 또는 세포사멸의 유도를 포함한다. 또다른 일 실시태양에서, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 유효량에 의한 암세포 성장의 감소 또는 지연, 또는 세포사멸의 유도를 포함한다.
Rho 의 저해와 세포 이동
전이암 세포들은 높은 이동성을 가지고 있다. Rho의 불활성화는 여러 암세포종에서 세포의 이동을 저해할 수 있다. C3 트랜스퍼라제 및 Rho 키나아제 억제제인 Y-27632는 인간 결장암 세포의 침윤을 억제하였다. v-Crk를 유도하는 랫트 섬유아세포 3Y1 세포주에 있어서, C3 및 Y-27632는 v-Crk를 억제하였으며, 결국 이것은 세포의 이동성을 감소시켰다. 독소루비신, 방사선 또는 탁솔을 처리한 RhoB -/- 세포, RhoB +/- 세포 또는 RhoB -/- MEF 세포에서의 감소된 세포사멸은 RhoB 단백질의 결핍에 의한 것이다.
본 발명의 일 실시태양에서, Rho의 길항작용은 세포의 이동 및 전이를 저해할 수 있는데, 본 발명에서는 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)에 의한 세포 이동의 억제를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-05와 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 유효량에 의한 세포 이동의 억제를 포함한다.
Rho 의 저해와 MMP( Matrix metalloproteinase )
침윤하는 암세포들은 세포외 기질을 분해할 수 있는 분비성 프로테아제에 의해 암세포 주위에 있는 세포외 기질을 분해할 수 있는 특징을 가지고 있다. 암세포들에 의해 분비되는 프로테아제 중 하나가 바로 MMP이다. 이러한 효소들은 암세포들이 침윤 및 확산할 수 있도록 기질에 통로를 만든다. 또한, 암세포들은 서로 다른 종류의 MMP들을 생산할 수 있으며 종종 MMP는 활성화될 때 절단 및 방출되도록 전-효소(pro-enzyme) 형태로 만들어진다. MMP-1은 콜라겐 기질을 절단하며, MMP-2는 폐암세포들의 침윤에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려졌다. 또한, MMP-9는 암세포의 침윤과 관련되어 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)에 의한 암세포상에서의 MMP 발현, MMP 진행 또는 MMP 분비 억제를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-05와 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 유효량에 의한 MMP 발현, MMP 진행 또는 MMP 분비 억제를 포함한다.
Rho 의 길항제인 BA -05 및 BA -07
BA-05 및 BA-07은 C3 엑소효소(exoenzyme)를 유전적으로 조작한 형태이다. C3 엑소효소는 ADP-리보오스 그룹을 작은 조절 GTPase, RhoA, RhoB 및 RhoC의 아스파라긴 잔기에 전달하는 몇 종의 클로스트리디움 보튤리넘에서 발견된 박테리오파지로부터 유래된 분비성 단백질이다. C3는 ADP-리보실화(ribosylation)가 Rho의 활성을 억제하기 때문에 Rho를 불활성화시킨다. BA-05와 BA-07를 구별할 수 있는 신규한 변형체는 세포질내로 효율적으로 진입할 수 있는 C-말단 전달 펩티드를 포함하고 있으며 이것은 더욱 강력한 Rho 길항제로서 작용한다. BA-05 및 BA-07은 비효소활성 부위에 서로 다른 침묵 돌연변이를 가지고 있다. BA-07의 발현은 치료제로서 이용할 수 있는 단백질 분리를 위해 통상적인 발현벡터를 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 BA-07과 같은 융합 단백질은 신호전달에 중요한 단백질-단백질 결합의 세포 투과성 저해제로서 생각될 수 있다.
본 발명은 항-신생종양 및 항-전이성 조성물로서 폴리펩티드성 세포-막 수송부위의 아미노산 서열이 다양화, 단축, 연장 또는 절단될 수 있는 BA-05 변이체 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-05와 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)와 같은 BA-05 및 BA-07 변이체를 제공할 뿐만 아니라 암 및 다른 종양질환을 치료할 수 있는 상기 조성물을 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시태양에서, 조성물 및 방법은 치료적 용도에 안전한 약학적으로 허용가능한 담체에서의 제형화를 위하여 대량의 BA-07 분리 능력을 강화시키도록 플라스미드에서 발현되는 BA-07 DNA 염기서열을 변형시킬 수 있다.
본 발명의 융합 단백질인 BA -05 및 BA -07
본 발명에서는 ADP-리보실화 Rho의 효소적 활성을 유지하기 위하여, 프롤린-풍부 수송 서열을 가지고 있는 BA-05 및 충분한 C3 트랜스퍼라제의 변이체들을 포함하고 있다.
본 발명에 의하면, 세포벽막을 통과하여 전달되는 치료적으로 활성화된 물질을 포함하는 접합체 또는 융합 단백질을 제공하며, 이때 상기의 접합체 또는 융합 단백질은 활성화 물질 부위에 추가적으로, 수송 서브도메인(들) 또는 부위(들)을 포함하고 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 의하면, 접합체 또는 융합 단백질과 같은 치료적 유효 물질은 치료적 활성 단위로서, 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 제공하며, 이때, 상기의 치료적 활성 물질은 암세포 전이 억제, 암세포의 세포사멸 촉진, 혈관신생 억제 및 암성장과 관련된 MMP 생산을 억제할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 있어서, 본 발명의 단일 화합물은 암성장 및 확산을 매우 다양한 방법으로 억제하는 복합 치료방법으로 작용하기 때문에 암 확산 및 전이를 저해하는 기존의 약물보다 더욱 향상된 장점을 가지고 있다. 또한, BA-07를 포함하는 조성물과 같은 본 발명의 조성물은 암세포의 이동, 암세포의 성장, 암부위에서의 혈관신생 및 활성화된 MMP의 분비를 예방, 방해 또는 억제할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 약학적으로 활성화된 화합물은 수용체에 근간을 둔 막 전달 기작에 상관없이 암세포에 침투할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 본 발명의 약학적으로 활성화된 화합물은 Rho 그룹 GTPase의 구성성분들을 불활성화시킬 수 있으며 Rho 길항제로서 작용할 수 있는 장점을 가지고 있다.
본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 암세포의 비정상적인 성장 및 전이성 신생종양 세포의 확산 또는 이동을 억제 및 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 암 절제 부위에 인접한 숙주조직의 절제된 부위 및 절제된 부위에 잔존하는 전이성 신생종양세포의 비정상적인 성장 및 확산 또는 이동을 억제 및 예방하는 방법을 제공하며, 이때, 상기 투여는 암 절제부위 표면, 절제부위 표면 하부 또는 절제 후 근처에 잔존하는 조직 내로 직접적으로 적용되며, 상기 투여는 암 절제 또는 제거 전과 후에 투여하거나 암 절제 또는 제거 전 또는 후에 일정한 간격으로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적인 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 숙주 조직에서의 악성종양세포로부터 종양의 성장을 예방하는 방법을 제공하며, 이때 상기 융합 단백질은 악성종양세포의 이동, 악성종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 악성종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 악성종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase, MMP)의 분비과정 중 적어도 두 개의 과정을 동시에 억제 또는 예방한다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적인 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법과 포유동물의 최초 암 제거부위 또는 암 절제부위에 인접한 숙주 조직상에 절제된 부위 및 암 절제 후 잔존하는 암세포를 포함하는 2차적 암의 증식을 예방하는 방법을 제공하며, 이때, 상기 투여는 암 절제부위 표면, 절제부위 표면 하부 또는 절제 후 근처에 잔존하는 조직 내로 직접 투여하는 것을 특징으로하며, 상기 투여는 암 절제 또는 제거 전과 후에 투여하거나 암 절제 또는 제거 전 또는 후에 일정한 간격으로 투여하며, 이때, 상기 융합 단백질은 잔존하는 종양세포의 이동, 종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 잔존하는 종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 잔존하는 종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase, MMP)의 분비과정 중 적어도 두 개의 과정을 동시에 억제 또는 예방한다.
이러한 점에서, 본 발명은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-07와 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 중추신경계(CNS)내로 전신성 암의 전이를 억제하는 방법을 포함한다.
이러한 점에서, 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 유사한 유사체, 예를 들면, BA-07와 같은 융합 단백질을 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 치료적 유효량의 약학적 조성물은 항-혈관발달 활성을 가질 수 있으며 암치료에 유용하다.
본 발명에 의하면, 본 발명에서 이용할 수 있는 융합 단백질의 활성화 인자 부위는 ADP-리보실 트랜스퍼라제 C3 부위 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함한다. 또한, 본 발명에 의하면, 상기에서 언급된 ADP-리보실 트랜스퍼라제 C3는 클로스트리디움 보튤리넘으로부터 유래된 ADP-트랜스퍼라제 및 재조합된 ADP-리보실 트랜스퍼라제로 구성된 그룹으로부터 선택되었다.
종종, C3는 C. 리모세뭄(C. limosemum) 또는 스테필로코커스 아우레우스(Staphlococcus aureus)와 같은 다른 균으로부터 유래될 수 있다. 이러한 균으로부터 분리된 C3는 ADP가 Rho 리보실화하거나 Rho를 불활성화시키는데 효과적인 C. 보튤리넘 유래의 C3와 같은 효소적 활성을 가지고 있다.
본 발명에 있어서, 폴리펩티드성 세포-막 수송부위는 프롤린-풍부 수송 영역을 포함할 수 있다. 이러한 프롤린-풍부 수송부위 및 영역의 예들은 미국특허출원 제10/118,079에서 확인할 수 있으며, 본 발명에서는 상기 문헌의 전체가 본 발명의 참고문헌으로 인용된다. 본 발명에서 사용된 "프롤린-풍부 부위"는 펩티드 또는 단백질을 포함하는 분자 내에 존재하는 펩티드 아미드결합에 의해 서로 연결된 10개의 아미노산의 어떤 선상의 염기서열을 의미하며, 이때, 상기의 선상에 있는 염기서열은 10개의 아미노산 중 적어도 3개의 아미노산을 특징으로 하며, 이때 각각의 프롤린은 자신의 아미노부위에서 펩티드 아미드와 공유결합하며 자신의 카르복실(카르보닐)부위에서는 또다른 펩티드 아미드와 공유결합하고 있다.
펩티드 내 어떤 10개의 아미노산 서열에 있는 프롤린-풍부 부위는 2개 이상의 프롤린 잔기 및 8개 이하의 비-프롤린 아미노산을 포함한다.
예를 들면, 일 실시태양에서는 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 내 10개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 있는 프롤린-풍부 부위는, 10개의 아미노산 사이에 어떠한 조합으로도 2개의 프롤린 잔기 및 8개의 비-프롤린 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
또한, 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 내 10개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 있는 프롤린-풍부 부위는, 10개의 아미노산 사이에 어떠한 조합으로도 3개의 프롤린 잔기 및 7개의 비-프롤린 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
또한, 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 내 10개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 있는 프롤린-풍부 부위는, 10개의 아미노산 사이에 어떠한 조합으로도 4개의 프롤린 잔기 및 6개의 비-프롤린 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
또한, 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 내 10개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 있는 프롤린-풍부 부위는, 10개의 아미노산 사이에 어떠한 조합으로도 5개의 프롤린 잔기 및 5개의 비-프롤린 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
또한, 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 내 10개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 있는 프롤린-풍부 부위는, 10개의 아미노산 사이에 어떠한 조합으로도 6개의 프롤린 잔기 및 4개의 비-프롤린 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
또한, 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 내 10개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 있는 프롤린-풍부 부위는, 10개의 아미노산 사이에 어떠한 조합으로도 7개의 프롤린 잔기 및 3개의 비-프롤린 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
또한, 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 내 10개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 있는 프롤린-풍부 부위는, 10개의 아미노산 사이에 어떠한 조합으로도 8개의 프롤린 잔기 및 2개의 비-프롤린 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
또한, 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 내 10개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 있는 프롤린-풍부 부위는, 10개의 아미노산 사이에 어떠한 조합으로도 9개의 프롤린 잔기 및 1개의 비-프롤린 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
또한, 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 내 10개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 있는 프롤린-풍부 부위는, 10개의 아미노산 사이에 어떠한 조합으로도 4개의 프롤린 잔기를 포함할 수 있다.
또한, 프롤린-풍부 부위는 일반적으로 자연형 단백질에서 관찰되는 프롤린(예를 들면, 인간 게놈에 의해 코딩되는 단백질)보다 더 많은 프롤린을 포함하는 단백질의 아미노산 서열 부위를 의미한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 펩티드의 프롤린-풍부 부위는 세포막을 통과하는 본 발명의 융합 단백질 전달 효율을 증가시킬 수 있다.
펩티드 또는 단백질의 비-프롤린-풍부 부위는, 0 또는 1개의 프롤린 잔기를 포함하는 부위에 있어서 펩티드 공유결합으로 연결된 10개의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 중 세포막 수송을 증가시키는 펩티드는 서로 펩티드 결합에 의해 공유결합되는 각각 동일한 또는 서로 다른 프롤린-풍부 아미노산 서열을 적어도 1개 이상 포함하거나 비-프롤린-풍부 아미노산 서열이 10개 이상의 아미노산을 포함하는 경우에는 동일한 또는 서로 다른 아미노산 서열을 갖는 적어도 1개 이상의 비-프롤린-풍부 부위를 포함하는 펩티드와 펩티드 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 조성물 및 방법에 이용하기 적합한 폴리펩티드성 세포-막 수송부위는 막투과 서열과 관련된 Rojas의 문헌(Rojas, 16, 370-375, 1998); Tat과 연관된 단백질 전달과 관련된 문헌(Vives, 272, 16010-16017, 1997); 폴리아르긴 서열과 관련된 문헌(Wnder et al., PNAS, 14, 13003-13008, 2000); 안테나페디아(antennapedia)와 관련된 문헌(Derossi, 271, 18188-18193, 1996); 안테나페디아(antennapedia)의 호메오도메인을 포함하는 접합체와 관련된 캐나다 특허 문헌(제2,301,157);및 TatHIV 단백질(본 발명에서는, TatHIV 단백질은 종종 Tat으로 언급)의 아미노산을 포함하는 접합체와 관련된 미국 특허 문헌(제5,652,122; 제5,670,617; 제5,674,980; 제5,747,641;및 제5,804,604)에 개시된 바와 같이 본 발명에서 이용가능하도록 변경 및 개조된 방법에 의해 준비될 수 있다; 상기 문헌은 본 발명의 전체에 걸쳐 참고문헌으로 인용된다.
몇몇 수용체와 연관된 수송 전략들은 ADP 리보실라제의 기능을 검사 및 향상시키는데 이용되어 왔다. 이러한 전략 또는 방법은 C2와 C3 서열의 융합(Wilde, et al., 276, 9537-9542, 2001) 및 디프테리아 독소 수용체(Aulo, et al., 12, 921-931, 1993)를 이용한 수용체-매개 수송의 용도를 포함한다. 이러한 전략들은 BA-05를 이용했을 때와 달리, C3 활성을 크게 증가시키지는 않았다. 덧붙여, 상기의 전략들은 수용체와 연관된 수송을 필요로 하며 수송율을 현저하게 향상시키는 특이적인 수용체 및 충분한 양의 수용체를 발현시키는 표적화된 세포를 필요로 한다. 디프테리아 독소의 경우, 모든 세포들은 적절한 수용체를 발현시킬 수 없는데, 이는 디프테리아 독소의 이용에 한계가 있음을 의미한다. 이러한 전략과 달리, 예를 들면, BA-05와 같은 폴리펩티드성 수송부위를 포함하는 본 발명의 조성물은 수용체-비의존성 기작에 의해 세포막을 관통할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기에서 언급한 조성물은 융합 단백질 접합체에 있어서 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체의 C-말단 부위에 첨가된 프롤린-풍부 아미노산 서열을 포함하는 프롤린-풍부 폴리펩티드성 세포-막 수송부위를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체를 포함하며, 상기의 융합 단백질로는 BA-05가 보다 바람직하다. 또한, 본 발명에서 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체의 N-말단 부위에 첨가된 프롤린-풍부 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 조성물들은 종종 BA-05 유사체로서 언급되었다.
본 발명에 있어서, 상기에서 언급한 조성물은 융합 단백질 접합체에 있어서, 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체의 N-말단 부위에 첨가된 프롤린-풍부 아미노산 서열을 포함하는, 프롤린-풍부 폴리펩티드성 세포-막 수송부위를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체를 포함한다. 또한, 본 발명에서 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체의 N-말단 부위에 첨가된 프롤린-풍부 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 조성물들은 종종 BA-05의 유사체로 언급되었다.
본 발명의 BA-05 유사체 및 BA-07 변이체는 각각 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 그와 기능적으로 유사한 유사체를 포함한다. 또한, 로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛의 기능적인 유사체는 생물학적으로 활성화된 단편 및 변형된 아미노산 서열을 가진 BA-05의 유사체와 같은 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이때, 상기의 단편 및 변형된 아미노산 서열을 가진 BA-05의 유사체의 생물학적 활성은 필수적으로 BA-05와 유사한 활성기작으로부터 유래되었다. 이러한 단편들은 BA-05에 상대적인 적어도 1개 이상의 아미노산 단편을 가진 아미노산 서열을 포함하고 있다. 또한, 이러한 단편들은 BA-05에 있는 아미노산 서열에 상대적인 적어도 1개 이상의 아미노산 단편(또는 제거)을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 이때 상기 단편은 아미노기, N-말단, 카르복실기, C-말단 또는 단백질 서열의 안쪽으로부터 유래된 것이다. 본 발명의 BA-05 유사체 및 변이체는 적어도 1개의 아미노산을 삽입 또는 치환하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 유용한 단편, 유사체 및 변이체를 포함하는 본 발명의 조성물들은 Rho GTPase의 불활성화 및 적어도 1개 이상의 Rho GTPase를 불활성화시킬 수 있는 BA-05의 생물학적 특성을 가진다.
또한, 본 발명의 조성물 및 방법은 외래 아미노산 서열을 포함하거나 융합된 BA-05 아미노산 서열 또는 이의 절단된 서열을 포함하는 키메릭 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 상기의 외래 서열은 BA-05와 키메라를 형성했을 때, 바람직하게는 Rho GTPase를 불활성화시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 적어도 1개 이상의 Rho GTPase를 불활성화시킬 수 있는 적어도 1개 이상의 생물학적 또는 면역학적 특성을 가지는 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시태양에서, 본 발명은 BA-05 단백질 또는 BA-07 키메릭 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질전환 또는 형질도입된 숙주세포를 포함한다. 일 실시태양에서, 적어도 1개 이상의 생물학적 특성, 바람직하게는 Rho GTPase를 불활성화시키는 특성, 보다 바람직하게는 적어도 1개 이상의 Rho GTPase를 불활성화시키는 특성을 가진 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 생산하는 숙주세포가 이용될 것이다. 대표적인 숙주세포형의 예로는 박테리아, 효모, 식물, 곤충 및 포유동물 세포가 있다. 덧붙여, BA-05 단백질 및 BA-05 키메릭 단백질은 형질전환 동물에서도 생산될 수 있다. 또한, 형질전환 또는 형질도입된 숙주세포 및 형질전환 동물은 분자 생물학을 전공으로 하는 당업계 종사자들이 이용하는 물질 및 방법을 통하여 얻을 수 있다. 이러한 숙주세포는 BA-05 단백질을 코딩하는 전장 유전자를 포함하는 핵산을 포함하며 또한, 선도서열 및 C-말단 막 고정서열을 포함할 수 있다. 종종, 숙주세포는 1개의 선도서열이 결핍 또는 선도서열 양쪽 모두가 결핍되거나 또는 C-말단 막 고정서열이 결핍되거나 또는 이러한 서열들의 조합이 결핍된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 덧붙여, 각각 BA-05의 생물학적 활성을 가질 수 있는 폴리펩티드 단편, 폴리펩티드 변이체, 또는 폴리펩티드 유사체를 코딩하는 핵산서열은 또한 그러한 숙주발현 시스템에 존재할 수 있다.
재조합 단백질인 Rho 대립자는 당업계에 알려진 재조합 단백질 기술 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 단백질은 박테리아 세포추출물로부터 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 BA-05 및 이와 관련된 융합 단백질은 적합한 발현 비히클 또는 벡터내에 BA-05의 전체 또는 일부분을 코딩하는 DNA 단편을 형질전환(예를 들면, 형질감염에 의한, 형질도입에 의한, 감염에 의한)에 의해 생산될 수 있다. 또한, 적합한 발현 비히클은 플라스미드, 바이러스 입자 및 파지를 포함하며, 곤충세포에서는 베큘로바이러스 발현벡터를 이용하는 것이 적합하다. 발현벡터 또는 비히클 대부분 또는 그이 일부는 당업계에 알려진 방법을 통해 숙주세포의 게놈내로 삽입될 수 있다. 일 실시태양에서는, 유도성 발현벡터를 이용하는 것이 더 바람직할 수도 있다.
당업계 종사자들은 보다 넓고 보다 다양한 발현 시스템들이 재조합 단백질을 제공하는데 이용될 수 있다는 것을 알고 있다. 정확한 숙주세포의 이용은 일반적으로 본 발명에서는 중요하지 않다. 본 발명의 BA-05와 기능적으로 유사한 유사체 , 변이체 및 단편들을 포함하는 융합 단백질은 원핵 숙주세포(예를 들면, 대장균 또는 B. subtilis) 또는 진핵 숙주세포(예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 피키아(Pichia); COS, NIH3T3, CHO, BHK, 293 또는 HeLa와 같이 본 발명에서 이용된 포유동물세포; 또는 곤충세포)에서 생산될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상대적인 또는 효율적인 Rho 대립자 활성을 결정하기 위하여, 조직배양 바이오 분석 시스템이 이용될 수 있으며, 이때 이용할 수 있는 BA-05의 농도범위는 약 0.01 내지 10 ㎍/ml이며, 이 농도에서는 어떠한 세포독성도 나타나지 않았다.
BA-05는 37℃에서 적어도 24시간까지는 안정한 상태이다. BA-05의 안정성은 하기와 같이 조직배양을 통하여 조사되었다. 구체적으로, BA-05는 조직배양액에 희석하여, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 본 발명에서 언급한 바이오 분석 시스템에 첨가하였고, 이때 실험대상 세포로써 망막 신경절 세포를 이용하였다. 이러한 세포는 37℃에서 24시간 동안 보관한 C3로 처리했을 때 억제성 기질상 에서, 신경돌기를 증가시킬 수 있으며 최소 24시간 동안은 그 안정성이 유지된다.
상기 조성물이 Rho의 길항제인지 확인하는 또다른 방법으로는, 효소 활성을 검출할 수 있는 방사능활성 분석법을 이용할 수 있다.
또한, 상기 활성을 검출하는 또다른 방법으로는, 효소 활성을 검출할 수 있는 형광분석법을 이용할 수 있다. 예를 들면, BA-05는 글리코하이드롤라제 및 ADP-리보실 트랜스퍼라제와 같은 적어도 2개의 유전적인 효소 활성을 가지고 있다. 이러한 효소 활성은 모노-ADP 리보실레이트에 순차적인 방식으로 작용하고 GDI-1과 복합체를 형성하여 ADP-리보실화된 Rho를 트랩핑(trapping)함으로써 GTP-결합 단백질 RhoA를 불활성화시킬 수 있다. 이러한 반응의 첫 단계에서, 글리코하이드롤라제 활성은 (NAD+)분자에 있는 니코틴아미드와 ADP-리보오스 사이에서 N-글리코시드 결합을 가수분해한다. ADP-리보실트랜스퍼라제를 촉매로 한 두 번째 단계에서는 ADP-리보오스-RhoA의 형성을 초래한다. 또한, 효소분석법은 ADP-리보오스의 형성에 의한 BA-05 및 BA-07과 같은 본 발명의 융합 단백질의 글리코하이드롤라제 활성을 측정할 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체 및 본 발명의 조성물, 바람직하게는 본 발명의 융합 단백질을 치료적인 유효량으로 포함하는 악성종양의 형질전환 및 전이를 억제하는데 유용한 약학적 조성물을 포함한다.
일 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 본 발명에 기재된 약물전달체, 약물 접합체 및 융합 단백질(예를 들면, 약학적으로 허용가능한 화학적 균등물을 포함하는)로부터 선택된 활성화 그룹을 포함한다.
본 발명의 BA -05 및 다른 조성물의 제형
본 발명의 조성물 및 방법들은 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체 및 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포함할 수 있다. 따라서, 보다 다양한 폴리펩티드성 담체들이 본 발명의 제형으로 이용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드성 담체의 대표적인 예로는, [폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), PVA] 및 경우에 따라, 약 40%까지 가교될 수 있는 부분적으로 가수분해된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트-코-비닐 알코올)과 같은 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트); 저분자량 올리고머 및 그의 고분자량 폴리머를 포함하는 폴리-D,L-락트산; 저분자량 올리고머 및 그의 고분자량 폴리머를 포함하는 폴리-L-락트산; 폴리글라이콜릭산(PGA); 락트산과 글리코산의 코폴리머; 폴리카프롤락톤; 폴리(엔하이드라이드); 폴리에틸렌 글라이콜을 가진 폴리카프롤락톤의 코폴리머, 폴리에틸렌 글라이콜; 및 그의 조합 및 혼합물을 포함한다.
코폴리머들은 모노머 유닛의 약 1% 중량 내지 99% 중량을 포함할 수 있다. 또한, 첫 번째 폴리머와 두 번째 폴리머의 혼합물은 첫 번째 폴리머의 약 1% 중량 내지 99% 중량 및 두 번째 폴리머의 약 99% 중량 내지 1% 중량을 포함할 수 있다.
BA -05를 이용한 종양 확산 억제
항-신생종양성 및 항-전이성 조성물과 같은 본 발명의 조성물들은 여러 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들면, 일 실시태양에서 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물은 미세구체(microsphere)를 포함할 수 있으며, 이때 상기의 융합 단백질은 약학적으로 허용가능한 담체(경우에 따라서, 약 0.1% 내지 15%의 증류수가 존재하는 제형;및 수용액에 현탁된 미세구체의 제형), 약학적으로 허용가능한 식염수, 약학적으로 허용가능한 계면 활성제, 약학적으로 허용 가능한 카르보하이드레이트, 약학적으로 허용 가능한 완충용액 및 그 유사체를 포함하는 기질내에 포매될 수 있다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물은 반죽, 크림, 연고, 좌약, 약학적으로 허용가능한 오일과의 현탁 및 그의 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물은 필름을 포함할 수 있으며, 이때, 상기의 융합 단백질은 액상 젤라틴, 액상 단백질 또는 폴리머 담체 또는 종종 가교할 수 있는 가교제를 이용한 그와의 혼합물, 필름 베이스 또는 보조제 또는 기질을 이용한 필름 또는 라미네이트로 코팅한 혼합물, 및 열을 가하거나 냉동건조시켜 건조된 또는 탈수화된 혼합물과 같은 약학적으로 허용가능한 담체와의 조제 또는 혼합된다. 또한, 상기의 필름들은 유닛 용량 형태 또는 용적 및 유닛 용량 형태를 나누거나 절단하여 준비될 수 있다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물은 종종 긴장 조절제를 포함하는 액상 완충 용액, 각각 초임계 또는 37℃ 및 대기압조건에서 기체상태인 이산화탄소, 프로판, 저분자 플루오로카르본, 플루오로하이드로카르본, 또는 브로모플루오로카르본 및 그의 유사체와 같은 약학적으로 허용가능한 유체에 현탁 또는 액화된 단백질과 같은 사용하기 적합한 조성물(예를 들면, 흡입제 또는 조직표면에 이용할 수 있는 스프레이와 같은 분무제)인 분무제, 스프레이형 또는 분무제형 조성물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물들은 BA-05와 같은 융합 단백질 및 추가적인 항-신생종양성 및 항-전이성 인자 또는 약물를 포함하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물들은 예를 들면, 녹는점이 약 30℃인 폴리에틸렌 글라이콜을 이용함으로써 약학적으로 허용가능한 가소제의 결합과 관련된 신축성, 또는 기질에 있어서의 가교율, 또는 가수분해율, 또는 기질의 용해도, 또는 증류수와 같은 담체가 융합단백질을 기질 밖으로 전달 및 포유동물의 표적부위 또는 부위 안으로 전달할 수 있도록 기질내에 작은 구멍을 낼 수 있는 기질의 구성성분을 보다 잘 용해하는 것과 관련된 어떤 물리적 특성을 가지는 제형화된 융합 단백질 제형을 제공하기 위하여 여러가지의 추가적인 화합물들을 포함하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 어떤 제형에 포함된 조성물들은 예를 들면, 본 발명의 미세구체 중 적어도 2개 이상의 조성물들을 적어도 1개 이상의 항-신생종양성 및 항-전이성 인자를 동시에 빠르게 또는 느리게 또는 연장되게 방출하는 것과 같은 본 발명의 융합 단백질의 변형된 순(net) 방출율을 얻기 위하여 조합될 수 있다.
또한, BA-05를 포함하는 융합 단백질과 같은 본 발명의 조성물들은 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 약학적 및 생리학적으로 화합하는 첨가제, 희석제, 긴장조절제, 완충액 및 그의 유사체와 혼합하여 투여될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 담체들은 본 발명에서 사용되는 융합 단백질이 치료적 유효 농도 및 용량으로 혼합하여 사용했을 때 수용체에서 어떠한 독성도 나타나지 않는다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물의 제조는 증류수, 약학적으로 허용가능한 식염수 또는 완충용액, 아스코르브산과 같은 약학적으로 허용가능한 항산화제, 적어도 1개 이상의 폴리펩티드(예를 들면, 약 2개 내지 10개의 아미노산 잔기를 가진 펩티드), 적어도 1개 이상의 단백질, 사람의 필수아미노산과 같은 적어도 1개 이상의 아미노산, 글루코스, 수크로스, 솔비틀, 트레할로즐, 마니톨, 말토덱스트린, 덱스트린, 사이클로덱스트린 및 그의 혼합물, Maillard 반응(환원당 및 아미노산, 펩티드 또는 단백질과 같은 화합물들이 서로 반응할 때 일어나는 반응임)을 피할때에는 비-환원당과 같은 비-환원 카르보하이드레이트를 포함하는 바람직한 카르보하이드레이트, Maillard 반응이 일어날 때는 환원당과 같은 환원카르보하이드레이트를 포함하는 바람직한 카르보하이드레이트, 2가의 금속이온(예를 들면, Ca+2, Fe+2 및 그 유사체) 또는 3가의 금속이온(예를 들면, Fe+3, Y+3, Ln+3, Eu+3, 란탄족 원소 및 라탄족 원소를 포함하는 그 유사체)과 같은 금속이온을 제어하는 EDTA 또는 DTPA와 같은 킬레이드제, 글루타치온 및 단백질 물질의 제형분야에서 알려진 다른 안정제 및 첨가제와 같은 담체 중 적어도 1개 이상의 조성물과 본 발명의 융합단백질이 치료적인 유효량으로 조합되는 것을 포함한다.
또한, 상기의 담체들은 pH 범위가 약 6 내지 8인 멸균된 완충 식염수 및 약학적으로 허용가능한 비특이적인 혈청 알부민과 혼합된 식염수를 포함하는 멸균된 등장성 조성물을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물들은 멸균상태, 멸균가능한 상태 및 멸균화될 수 있다. 보다 바람직한 멸균 방법은 무균 환경에서 0.2 마이크론 필터를 이용하여 약학적인 조성물을 여과하는 단계를 포함한다. 멸균 여과된 조성물은 무균 질소 또는 아르곤과 같은 비활성 기체상태에서 1 유닛 용량 도는 1 유닛 이상의 용량(예를 들면, 2 유닛 용량, 3 유닛 용량, 4 유닛 용량 등)의 바이알, 바람직하게는 멸균 바이알에 담고 이 바이알을 크림프 캡(crimp cap)과 같은 약학적으로 허용가능한 마개로 봉합할 수 있다. 또한, 상기의 약학적 조성물은 바이알을 봉합 및 마개를 담기 전에 본 발명의 융합 단백질 포함하는 건조된 또는 탈수화된 기질을 제공하기 위하여 예를 들면, 냉동건조 또는 탈수와 같은 건조과정을 통하여 각 바이알로부터 제거될 수 있는 액상배지와 같이 물을 제거함으로써 건조된다. 또한, 상기의 담체는 본 발명의 화합물 또는 융합 단백질과 함께, 약학적으로 허용가능한 비-환원성 카르보하이드레이트와 화합하는 첨가제 또는 약학적으로 허용가능한 기질형성 물질의 멸균한 또는 멸균할 수 있는 삼투압이 높은 수용액을 포함할 수 있으며, 이때 상기의 삼투압이 높은 수용액은 마개로 바이알을 봉합할 수 있는 융합 단백질 및 기질형성 첨가제를 포함하는 기질을 제공하기 위하여 바이알 및 건조된(예를 들면, 냉동건조에 의한) 상태에서 보관될 수 있다.
또한, 사용하기 전 멸균수는 상기의 융합 단백질의 수용액 또는 현탁액을 제공하기 위하여 기질을 용해하여 예를 들면, 멸균 주사기 또는 캐뉼러의 바이알에 첨가될 수 있다. 이러한 충분한 물은 주사용 또는 이식용에 적합한 등장성 수용액으로서 재형성된 수용액 또는 현탁액을 제공하기 위하여 첨가될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물들은 여러 다른 경로들을 통하여 치료가 필요한 포유동물의 환부에 투여하기 적합하도록 제공되어야 한다. 바람직한 투여 경로는 예를 들면, 관절강내, 안구내, 비내, 신경내, 근육내, 피부내, 골내, 혀내, 구강, 구소부위, 방광내, 뇌척수강내, 혈관내, 복강내, 두개내, 근육내, 피하내, 흡입 또는 원자화 및 흡입, 또는 종양, 환부, 종양 절단 후 잔존하는 부위 또는 부위하부에 직접 투여하는 경로를 포함한다. 또한, 다른 대표적인 투여 경로로는 위시경내 절차 및 결장경 검사법을 추가적으로 포함하는 경장(enteral)을 포함하며, 이때 각각은 외래환자의 절차 방법일 수 있으며 완전한 수술실 절차 및 연장된 입원을 필요로하지는 않지만 담당의사가 필요한 방법이다.
본 발명에서 제공된 약학적 조성물들은 상기 약물의 설명서 및 약물를 약물함에 보관해야 한다. 통상적으로, 이러한 설명서에는 약효농도, 제형의 종류, 첨가된 구성성분 또는 희석제(예를 들면, 물, 식염수 또는 완충용액)의 확인 등이 포함되어 있다. 덧붙여, 상기의 조성물들은 항-신생종양성 및 항-전이성 조성물 또는 혼합 및 분쇄할 수 있는 증류수를 첨가함으로써 약학적으로 허용가능한 유동액 또는 현탁액을 위한 약학적 조성물의 재조합(재구성)이 필요할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물들은 보다 폭넓고 다양한 수술 절차에 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 어떤 특성을 가진 약학적 조성물(예를 들면, 원자화된, 분제화된 또는 스프레이형태로 이용가능한 유동액, 현탁액 또는 분말, 또는 필름으로 코팅된 것)은 최초로 발생한 암을 수술로 제거하기 전, 제거하는 동안 또는 제거 후 치료가 필요한 환부 및 추가적으로 암(종양부위)의 절제된 부위 주변에 있는 정상조직으로부터 암과 가장 가까운 부위에 있는 정상조직부위를 분무기(분무형 또는 에어로졸형) 또는 적층(필름)에 의하여 이용될 수 있다.
이러한 점에서, 본 발명의 절차는 환자에서 최초의 암 제거 후 암 주위에 있는 정상조직에서의 2차적인 암전이 증가를 억제, 실질적인 지연 또는 예방할 수 있다. 또한, 본 발명의 절차는 주변 조직으로 질병(예를 들면, 암)의 확산을 예방할 수 있다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물(예를 들면, 스프레이형 또는 에어로졸형)은 내시경 절차를 통하여 전달될 수 있다. 이때, 상기 조성물은 내시경 방법으로 접근 또는 확인할 수 있는 환자내 암 및/또는 암 주위조직 및 암 근처에 있는 조직부위에 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 스프레이형 또는 에어로졸형태로 환부에 코팅된다. 또한, 암 부위 근처 또는 절제된 암 부위 근처에 있는 조직에 상기의 약학적 조성물을 코팅하면 이 조직부위에서 발생하는 혈관신생을 억제할 수 있다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 융합 단백질 및 추가적으로 폴리머 담체를 포함하는 코팅된 장치를 제조하기 위하여 수술용 메쉬(mesh), 와이어, 스탠트, 보철 장치 및 그 유사체와 같은 이식 장치의 표면에 코팅될 수 있으며, 이때 상기의 코팅된 장치는 악성 또는 양성 종양의 수술적 제거와 같은 환자의 수술적 치료 부분인 조직 또는 기관에 이식 가능하며, 이로 인해 약학적 조성물은 이식된 장치 부위 근처에 있는 2차적 종양의 증식을 예방, 억제, 지연 또는 방해할 수 있고, 또다른 면에서 이식된 장치 부위로부터 멀리 떨어진 조직 또는 기관에서 형성된 2차적 종양의 증식을 예방, 억제, 지연 또는 방해할 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질의 농도는 장치에 코팅되는 담체 중량의 약 0.01% 내지 20% 이며, 코팅두께의 약 20 ㎛ 내지 1 ㎛이다. 또한, 상기의 코팅은 코팅 장치에 기술된 코팅방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 코팅은 약학적 조성물을 용매를 포함하는 액체 또는 유체안에 용해함으로써 또는 스프레이나 에어로졸로써 이용 중 또는 이용 후 탈수화 할 수 있고, 장치 표면에 분무되거나 에어로졸화되는 액체 또는 유체에 현탁함으로써 스프레이 또는 에어로졸 기구를 이용하는 방법으로 장치표면에 코팅될 수 있다. 종종, 상기의 코팅된 조성물은 올레핀 또는 무수물(anhydride)기 또는 활성 에스테르 또는 카르보닐기에 결합된 탄소-탄소 이중결합과 같은 미카엘(Michael) 반응 수용체와 같은 반응 화학 기능기들을 포함할 수 있으며, 이때 상기의 이중결합은 단백질의 아민, 펩티드, 또는 담체 단백질과 같은 젤라틴과 반응할 수 있고 이때 상기의 반응 화학 기능기들은 담체에 의한 팽창(반응 화학기의 농도에 따른 기능 또는 코팅된 장치를 UV 또는 감마 방사선과 같은 가교상태에 노출하는 시간)을 제한, 변형 또는 조절할 수 있으며 용해도를 방해할 수 있다.
또한, 상기의 팽창 조절은 본 발명의 융합 단백질을 장치로부터 이 장치 근처에 있는 조직으로, 더욱 바람직하게는 환자의 신체로 이동하는 비율을 조절하는 데 유용할 수 있다. 또한, 당업계에 잘 알려진 폭넓고 다양한 가교성 화학물질은 융합 단백질의 생물학적 활성이 중지 또는 제거되지 않는 한 본 발명에서 유용할 수 있다. 만약, 유기적 용매, 초임계 유체 또는 액화가스가 코팅과정에서 이용되는 경우, 이때 약학적으로 허용가능한 담체는 이식부위 근처에 있는 조직에 존재하는 액상 배지에 즉각적으로 용해되지 않고, 액상 배지 내로 융합 단백질이 투과할 수 있는 것으로 선별될 수 있다.
다른 코팅 방법으로는, 본 발명의 약학적 조성물은 침적도포(dip coating), 페인팅, 컬튼 코팅 및 라미네이션과 같은 방법이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 상기의 장치 표면은 최초의 코팅 또는 본 발명의 약학적 조성물을 순차적으로 코팅하는 프라이머층으로 코팅할 수 있다. 이때, 상기의 프라이머층은 금속 또는 폴리메릭 장치의 표면에 고착 및 두 번째 코팅층의 담체에 고착하는 것으로 선별될 수 있다. 또한, 이 프라이머층은 두 번째 층과 기교결합을 형성할 수 있는 고정화된 화학 기능기(예를 들면, 프라이머층에 있어서 폴리머에 고착될 수 있는)를 포함할 수 있다. 또한, 이 층은 종종, 예를 들면, 두 번째 층으로 이동할 수 있고, 그 안에서 가교성 분자 브리지를 형성하는 화학 기능기와 반응할 수 있는 적어도 2개 이상의 반응 기능기를 포함하는 상대적으로 이동성 분자들을 포함할 수 있다.
또다른 일 실시태양에서, 약학적 허용가능한 세 번째 층은 두 번째 층과 종종 융합 단백질이 없는 세 번째 층으로 이중 코팅될 수 있다. 세 번째 층은 예를 들면, 물에 대한 융합 단백질의 용해도, 팽창 또는 투과성을 증가함으로써 또는 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 두번째 층이 조직의 액상 배지로 노출되는 시점에서 기능하는 융합 단백질로써 상기 장치로부터 융합 단백질의 방출량을 조질 또는 변경할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 와이어 또는 폴리머 메쉬(mesh)를 포함하는 수술용 메쉬(mesh)장치는 잔존하는 조직구조 보조물을 제공하기 위하여 환자(예를 들면, 결장암 절제에 있어서)에 있어서 비정상적인 암 절제 수술과정 동안 환자에 이용 또는 이식될 수 있다. 이러한, 코팅된 메쉬(mesh) 장치는 코팅된 장치의 이식 부위 근처에 있는 2차적 암 증식을 예방함으로써 암의 재발생을 예방하는데 충분한 약학적 조성물의 치료적인 유효량의 활성 조성물(BA-07과 같은)을 방출할 수 있다. 또한, 상기의 융합 단백질은 이식된 장치 근처에 있는 조직에서 치료적으로 유효한 농도를 충분히 제공하도록 이 장치로부터 이동할 수 있다.
이때, 바람직한 농도 범위는 조직 cc당 약 0.0001 ㎍ 내지 100 ㎍ 이며, 보다 바람직한 치료적 유효농도 범위는 조직 cc당 약 0.001 ㎍ 내지 50 ㎍이다.
또다른 일 실시태양에서, 코팅된 메쉬(mesh) 장치는 코팅된 장치의 이식 부위 근처에서 멀리 떨어진 2차적 암 증식을 예방함으로써 암의 재발생을 예방하는데 충분한 약학적 조성물의 치료적인 유효량의 활성 조성물(BA-07과 같은)을 방출할 수 있다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, 본 발명의 방법들은 최초의 암 절제 후 이 절제 부위에 잔존하는 조직에 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 포함하는 최초의 암 절제 부위에 잔존하는 환부(암 절제부위)를 치료하는데 제공되며, 이로 인해 최초의 암 절제부위에 잔존하는 절제부위에서의 새로운 혈관신생 및 2차적 암의 재발생이 억제된다. 본 발명의 일 실시태양에서, BA-07을 포함하는 약학적 조성물과같은 본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면, sabbing, 브러싱, 페인팅, 스프레이, 에어로졸, 주사, 세척, 흡수 또는 약학적 조성물을 암의 절제 부위에 코팅함으로써 암 절제부위에 잔존하는 조직에 직접 투여할 수 있다. 종종, 수술용 연고, 연고, 크림, 현탁, 겔 및 그 유사체 형태로 BA-07을 포함하는 약학적 조성물과 같은 본 발명의 약학적 조성물은 상기의 조직 표면에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 악성종양인 간암 절제부위에 잔존하는 조직에 이용될 수 있다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들면, 뇌종양 제거와 관련된 뇌종양 수술 후에 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면, 유방암, 결장암, 뇌종양 및 간암을 포함하는 다양한 암종의 종양 절제 후 잔존하는 조직에 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시태양에서 BA-05와 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 최초의 암 절제 후 이 절제된 최초의 뇌종양 부위에 인접한 잔존하는 조직에 투여될 수 있으며, 이로 인해 상기의 잔존하는 조직으로의 암세포 확산, 2차적 암 형성 및 최초의 암 절제부위에 있는 조직에서의 새로운 혈관신생이 억제된다.
뇌는 각각의 특정한 해부학적 주위가 특정한 기능을 수행하도록 특성화된 고도로 기능적인 부위이다. 환자의 뇌에 있어서 암의 분포(및 뇌 병리학)는 조직형태 또는 암 형태보다 더 중요하다. 즉, 뇌의 중요 부위에 있어서 상대적으로 작은 종양 또는 외상은 상대적으로 덜 중요한 뇌 부위에 있는 보다 큰 손상에 비해 훨씬 터 위험할 수 있다. 뇌표면에 있어서의 외상은 상대적으로 수술적인 절제가 용이하나, 이와 비교할 수 있는 크기의 뇌에 깊이 위치한 종양은 이 종양으로의 도달 또는 근접 및 이 종양을 제거하는데 많은 중요한 부위를 절제해야 하는 연결조직의 파괴를 필요로 하기 때문에 상대적으로 수술적 절제가 용이하지 않다. 덧붙여, 뇌의 양성 종양들은 환자에게 위험할 수도 있다. 이러한, 양성종양이 뇌의 중요 부위에서 성장하게 되면 주위 뇌조직 및 기능에 막대한 손상을 초래하게 된다. 비록, 양성종양이 수술적인 절제에 의해 치료된다 하더라도 조직 깊이 존재하는 종양의 제거에 있어서는 불가능하다. 또한, 이러한 양성종양을 인지하지 못했다면 이 종양은 성장, 부피의 증가 및 증가된 두개골 내 압박을 초래할 수 있으며, 이러한 상태를 치료하지 않는다면 뇌의 주요 부위가 압박받게 되고 결국엔 환자의 사망을 초래하게 된다. 중추신경계(CNS) 종양의 발생률은 100,000명당 약 8 내지 16명이며, 이러한 뇌종양의 예후는 수술적인 절제에 의한 환자에서조차도 1년 미만의 평균생존율을 나타낼 정도로 치명적이다. 뇌종양 특히, 신경교종은 수술적인 절제 후 최초 종양부위의 약 2 ㎝ 내에서 다시 재발할 수 있는 우세적인 국소질환이다.
본 발명에 기재된 조성물 및 방법들을 이용하여 치료할 수 있는 뇌종양의 대표적인 예로는, 역형성 성상세포종, 다형성교아종, 털모양 성상세포종, 희소돌기아교세포종, 상의세포종, 점액유두성 상의세포종, 뇌경막하수종 및 맥락총유두종과 같은 신경교종; 신경아세포종, 신경절모세포종, 신경절신경종 및 수아세포종과 같은 뇌종양; 송과체모세포종 및 송과체종양과 같은 송과선종양; 수막종, 뇌막 혈관주위 세포종, 뇌막육종과 같은 뇌막종; 신경초종 및 신경섬유종과 같은 신경엽 세포종; 호지킨스림프종 및 비-호지킨스림프종, 호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 서브타입, 비-호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 서브타입 및 이들의 많은 서브타입을 포함하는 림프종; 두개인두종, 유료피낭, 유피낭 및 교질낭과 같은 기형종양; 및 일반적인 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 위장암으로부터 유래될 수 있는 뇌에 위치한 전이암을 포함한다.
본 발명의 일 실시태양에서, 본 발명의 약학적 조성물들은, 예를 들면, 혈관내 주사와 같이 전신성의 혈관 또는 림프관내로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 추가적인 투여형태는 복강내, 피하, 근육내, 직장(예를 들면, 좌약투약형태), 질(예를 들면, 질좌약) 및 경구투여를 포함한다. 본 발명의 투약형태는 거점부위 근처에 있는 조직내로 이동할 수 있는 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 거점으로 작용할 수 있다.
또한, 국소투여에 이용되는 조성물들은, 예를 들면, 눈, 귀, 코와 같은 기관조직으로의 전달에 적합한 크림, 바르는 약(예를 들면, 마찰에 의한 피부투여), 로숀, 오일, 연고, 붙이는 약 및 점적약(drop)과 같은 피부를 통해 침투하기에 보다 적합한 액상 또는 젤상을 포함한다.
본 발명의 일 실시태양에서, 상기의 융합 단백질은 약 240,000 Da 내지 300,000 Da의 분자량을 가질 수 있다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, 본 발명의 조성물들은 100 ㎛ 내지 2 mm 두께의 필름 또는 예를 들면, 약 25℃ 이상에서는 액체 및 약 25℃ 이하에서는 고체 또는 반-고체인 열역학적으로 활성화된 조성물로 형성될 수 있다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, 상기의 방법들은 환자로부터 암을 절제한 후 환자의 절제된 암 부위에 잔존하는 부위에 BA-05와 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 종양 절제 부위에 잔존하는 조직을 치료하는데 제공될 수 있으며, 이때 이 부위에서의 신생혈관 형성 및 국소적인 암 재발생이 억제된다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, 상기의 방법들은 암을 절제한 후 절제된 암 부위에 BA-05와 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 종양 절제부위를 치료하는데 제공될 수 있으며 이때, 이 부위에서의 신생혈관 형성 및 국소적인 암 재발생이 억제된다.
본 발명의 또다른 일 실시태양에서, 본 발명의 약학적 조성물 및 약물함을 포함하는 키트; 본 발명의 약학적 조성물 및 봉합된 바이알을 포함하는 키트; 본 발명의 약학적 조성물 및 멸균 주사기를 포함하는 키트; 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 멸균 주사기를 포함하는 키트; 본 발명의 약학적 조성물 및 스프레이 또는 에어로졸 기구를 포함하는 키트; 본 발명의 약학적 조성물 및 브러쉬 기루를 포함하는 키트; 본 발명의 약학적 조성물 및 캐뉼러를 포함하는 키트; 본 발명의 약학적 조성물 및 분말기를 포함하는 키트(이러한 분말기는 조직에 국소투여하는데 있어서 건조된 예를 들면, 냉동건조된 분말을 흩뿌리는 투여방법에 의한 분말로써 본 발명의 약학적 투약형태로 투여하는 분말기로 이용될 수 있다); 본 발명의 약학적 조성물 및 코팅된 이식 장치를 포함하는 키트 중 어느 하나를 특징으로 하는 본 발명의 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 약학적 제품들은 예를 들면, Rho 신호전달을 파괴하는 BA-05와 같은 융합 단백질을 포함하는 약물함 및 암의 수술적 절제 후 암강벽을 형성하는 조직에 BA-05와 같은 융합 단백질을 투여하는데 이용되거나 예를 들면, 악성 흑색종의 제거 후 피부에 이용될 수 있는 2차적 약물함 내 스프레이 또는 에어로졸의 투여기구, 주사기, 도구 또는 브러쉬와 같은 기구도 제공될 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물, 그 용도 및 방법은 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 한다. 몇 가지 실시태양에서는 상기 포유동물은 사람을 포함하는 것을 특징으로 하는 반면, 또다른 일 실시태양에서는 상기 포유동물은 비-인간 포유동물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 상기 및 상기 이외의 특성들은 이와 관련된 명세서 및 도면상에서 언급될 것이다.
본 발명과 관련된 보다 세부적인 절차, 장치 또는 조성물들에 관한 본 발명에서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 전문이 참조로서 본 명세서에 삽입되었다.
<BA -05와 같은 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법>
C3를 코딩하는 cDNA 염기서열을 용해성(fusogenic) 19-머 펩티드에 결합하여 제조된 본 발명의 단백질을 BA-05로 명명하였다. 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법을 평가하기 위하여, 한 예로 C3 폴리펩티드의 C-말단에 첨가된 안테나페디아(antennapedia) 염기서열이 이용될 수 있다.
구체적으로, 상기 DNA 염기서열의 3' 말단에 위치한 종결코돈은 프라이머 5'-GAA TTC TTT AGG ATT GAT AGC TGT GCC-3'(서열번호 1 참조) 및 5'-GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA-3'(서열번호 2 참조)를 이용한 PCR을 실시하여 Eco RI 부위로 치환될 수 있다. 이 PCR 산물은 pSTBlue-1 벡터(Novagen, Madison, WI, USA)에 서브클로닝 되었고, 이어 pGEX-4T 벡터의 제한효소 Bam HI 및 Not I 부위에 클로닝 되었으며, 이를 pGEX-4T/C3 벡터로 명명하였다. 또한, pGEX-4T/C3에 있어서, C3의 3' 말단에 첨가될 수 있는 안테나페디아(antennapedia) 염기서열은 pET-3a 벡터(Bloch-Gallego, 120, 485-492, 1993; 및 Derossi, 269, 10444-10450, 1994)를 주형으로 하여 PCR로 제조할 수 있으며, 이를 pSTBlue-1 블런트(blunt) 벡터에 서브클로닝 하였고, 이어 pGEX-4T/C3APL을 제조하기 위하여 제한효소 Eco RI 및 Sal I 부위를 이용하여 상기의 pGEX-4T/C3 벡터에 클로닝 하였다.
또한, DNA 염기서열 분석은 본 발명에 있어서 최상의 반응을 나타낸 염기서열을 이용하여 수행하였다.
현재까지, pGEX-4T/C3APL 클론(서열번호 3 참조)은 바람직한 염기서열이며, 본 발명의 바람직한 조성물인 단백질을 제공한다.
C3-유사 융합 단백질의 예로는 pGEX-4T/C3APLT(서열번호 4 참조)로 나타내었다.
다음 두 개의 PCR 프라이머는 한 종류의 재조합 구성물(BA-05)을 pET 시스템에 도입하기 위하여 제조하였으며, 정방향 프라이머는 5'-ggatctggttccgcgt catatg tctagagtcgacctg-3'(서열번호 38 참조)이며 역방향 프라이머는 5'-cgc ggatccatta gttctccttcttccacttc-3'(서열번호 39 참조)이다.
서열번호 39의 5' 말단에 있는 Bam HI는 ggatccatta 이며, TGA는 TAAT(서열번호 39에서는 atta)로 대치하였다.
또한, Pfu 중합효소를 이용하여 상기 산물을 증폭시키는 PCR 반응은 95℃에서 5분, 이어 94℃에서 2분, 56℃에서 2분, 70℃에서 2분간 10회 반복하였고, 이어 94℃에서 2분, 70℃에서 3분간 30회 반복한 후 4℃에서 유지하였다. 아가로즈 겔 슬라이스에 포함된 목적 DNA를 분리하기 위하여 QIAEXII kit(Qiagen)을 이용하였고, 삽입 인자 및 벡터는 각각 제조사의 설명서에 따라 Bam HI 및 Nde I을 이용하여 추출한 후 아가로즈 겔 전기영동 및 QIAEXII kit(Qiagen)를 이용하여 정제하였으며, 이를 제조사의 지시에 따라 T4 DNA 연결효소를 첨가하여 밤새도록 배양하였다.
이어, 상기의 연결 복합체를 E. coli(DH5alpha 또는 바람직하게는 XL1-Blue)에 형질전환시켰으며, 이 클론들은 소규모 발현유도, SDS-PAGE 및 세포 분쇄물을 항-C3 항체로 면역반응시켜 분석하였다. 플라스미드 DNA는 분리 및 정제하였다. 또한, DNA 시퀀싱은 예를 들면, 상기 클론의 전장 길이를 시퀀싱하도록 LiCor technology에 의해 수행하였다.
상기의 방법으로 제조된 최초의 산물(pET3a-BA-07, 서열번호 7 참조)은 5' 말단에서의 약간의 변화를 가진 pGEX/APLT 산물의 이론적인 DNA 염기서열과 상응하였다.
두 번째 산물(pET9a-BA-07)은 제조사의 지시에 따라 상기의 pET3a 산물을 Bam HI 및 Nde I(New England BioLabs, Beverly, MA)으로 절단한 pET3a-BA-07로부터 유래된 삽입 인자를 상기와 같은 효소로 절단한 pET9a 벡터에 서브클로닝함으로써 제조하였다. 상기의 삽입 인자 DNA 및 벡터 DNA는 아가로즈 겔 전기영동을 이용하여 정제하였고, 이 삽입 인자는 T4 DNA 연결효소(New England BioLabs, Beverly, MA)를 이용하여 새로운 벡터에 삽입하였다. 이어, 연결된 DNA를 DH5a 세포주에 형질전환시켰고, 이 DNA는 QIAGEN mini 및 maxi kit를 이용하여 분리하였다. 상기의 클론들은 제한효소에 의한 추출 및 양방향 시퀀싱(예를 들면, BioS&T, Lachine, Quebec)을 이용하여 삽입 인자의 DNA 염기서열을 분석할 수 있다. 또한, 상기의 DNA 산물은 BL21 세포주(DE3) 및 BL21(DE3)/pLysS 세포주에 형질전환시킬 수 있다.
pET9a-BA-07 단백질(서열번호 57 참조)의 발현은 BL21(DE3)/pLysS에 비해 BL21(DE3)에서 보다 증가하였다.
본 발명의 단백질은 박테리아 세포의 추출물 또는 안테나페디아(antennapedia)로부터 유래된 전이 염기서열을 가진 BA-05를 코딩하는 DNA 단편과 같은 융합 단백질을 코딩하는 DNA 단편의 전체 또는 일부분을 가진 적합한 발현 비히클은 숙주세포에 형질전환, 형질도입 또는 감염시키는 재조합 기술을 이용하여 제조하였다.
본 발명의 재조합 단백질을 제공하는데 있어서, 당업계에 종사하는 숙련자들은 여러 가지의 다양한 발현 시스템들을 이용할 수 있다. 이때, 사용되는 적합한 숙주세포는 통상적으로 본 발명에서는 중요하게 다루지 않지만, 단백질 생산량의 변화를 초래할 수 있다.
융합 단백질은 극성, 크기 및 소수성과 같은 특성을 기반으로 분자를 분리하는 수지(resin)를 이용한 친화성 분리 기술 또는 컬럼 크로마토그래피와 같은 당업계에 잘 알려진 단백질 분리 기술을 이용하여 분리할 수 있다. 또한, 유용한 친화성 기술을 이용하여 발현되는 융합 단백질에 특이적인 항체(예를 들면, GST)를 이용할 수 있다. 히스티딘-표지된 단백질은 이미다졸이 포함된 완충액을 이용하여 선택적으로 용출할 수 있다. 종종, 재조합 단백질은 면역글로불린 Fc 영역과 융합될 수도 있다. 이러한 융합 단백질은 단백질 A 컬럼을 이용하여 쉽게 분리할 수 있다.
상기의 기술들 중 어떤 것은 단백질 분리에 특이적인 상업적으로 유용한 액체 크로마토그래피 장치를 이용함으로써 보다 높은 생산량 및 높은 처리량을 제공하기 위해 자동화 및 최적화될 수 있다. 또한, 작은 분자, 펩티드 또는 상기에서 언급된 길항제와 같은 유사체들은 본 발명에 이용될 수 있다.
< BA -05와 같은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 생체 활성 평가>
Rho를 불활성화시키는 BA-05 및 BA-07의 효과는 세포 배양법을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 분석에 이용될 수 있는 조건하에서 암 세포주를 조직배양 하였다. 예를 들면, NG108 세포를 분주 및 반-밀집한 상태로 증식시켰다. NG108은 센다이바이러스에 의해 유도된 마우스 신경아세포종 클론인 N18TG 및 랫트 신경교종 클론인 C6 BU-1의 융합에 의해 형성된 신경아세포종 X 신경교종이다. 이러한 세포를 수취, 균질화 및 Rho 풀-다운 분석을 수행하였다. 이러한 풀-다운 분석은 활성화된 Rho에 결합하는 베이트(bait)를 이용하는 것이다. 예를 들면, 상기의 발명에서 본 발명자들은 로텍킨(Rhoteckin)의 Rho 결합 영역(RBD)을 이용할 수 있다. 또한, Rho 키나아제와 같은 다른 단백질들도 이용할 수 있다. 상기의 베이트는 비드와 연결되어있기 때문에 균질화를 통하여 침전시킬 수 있다. RBD은 균질화된 상태에서는 GTP-Rho와 결합하지만, GDP-Rho와는 결합하지 않는다. 이로 인해, 세포배양에서 활성화된 Rho는 정량적으로 분석할 수 있다. 따라서, 어떤 세포주에서 Rho를 불활성화시키는 BA-07의 양은 풀-다운 분석을 수행하기 전에 상기 세포주의 일부 세포를 처리함으로써 평가할 수 있다.
풀-다운 분석은 고형암에서 활성화된 Rho의 양을 결정하는데 이용될 수 있다. 암 일부를 완충용액에서 균질화시켜 풀-다운 분석을 수행한 다음 GTP Rho의 양을 비-암 조직에서 발견되는 Rho의 양과 비교할 수 있다. 활성화된 Rho를 검출할 수 있는 이 분석은 고도로 활성화된 레벨의 Rho를 가진 세포를 포함하는 암 및 예를 들면, 본 발명의 BA-07 처리한 후 반응하는 암을 진단하는데 이용할 수 있다. 활성화된 Rho의 측정은 단순히 Rho 발현 레벨을 조사하는 것보다 더욱 효과적일 수 있다.
조직 내에서의 풀-다운 분석은 조직적인 단편에서 GTP-Rho를 검출하는데 이용될 수 있다. 이러한 분석을 위하여, 암 일부를 4% PFA로 고정한 후 각각 약 16 ㎛의 두께로 동결절단(cryosection)한 후 이 단편을 RBG-GST를 포함하고 있는 박테리아 분쇄물과 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어, 상기 단편을 TBS로 3번 세척한 후, 3% BSA로 상온에서 약 1시간 정도 블로킹한 다음 항-GST 항체(Cell signaling, New England Biolabs, Mississauga, Canada) 및 특이적으로 세포를 관찰할 수 있는 세포-타입 특이적 항체와 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 이어, 이 단편을 TBS로 세척한 후, 면역활성을 관찰하기 위하여 FITC, Texas Red 또는 로다민이 결합된 2차 항체와 상온에서 2시간 동안 배양하였다.
< BA -05의 상세한 DNA 및 단백질 서열>
본 발명에 있어서, 본 발명의 유용한 BA-05 융합 단백질은 전통적인 G, A, T 및 C 명명법을 이용하여 나타낸 하기의 DNA 코딩 염기서열을 가지고 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 염기서열에 있어서, 기호 G, C, A 및 T는 그들의 전통적인 의미를 가지고 있다.
ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aatgcttatt ccattaatca 50
aaaggcttat tcaaatactt accaggagtt tactaatatt gatcaagcaa 100
aagcttgggg taatgctcag tataaaaagt atggactaag caaatcagaa 150
aaagaagcta tagtatcata tactaaaagc gctagtgaaa taaatggaaa 200
gctaagacaa aataagggag ttatcaatgg atttccttca aatttaataa 250
aacaagttga acttttagat aaatctttta ataaaatgaa gacccctgaa 300
aatattatgt tatttagagg cgacgaccct gcttatttag gaacagaatt 350
tcaaaacact cttcttaatt caaatggtac aattaataaa acggcttttg 400
aaaaggctaa agctaagttt ttaaataaag atagacttga atatggatat 450
attagtactt cattaatgaa tgtttctcaa tttgcaggaa gaccaattat 500
tacaaaattt aaagtagcaa aaggctcaaa ggcaggatat attgacccta 550
ttagtgcttt tgcaggacaa cttgaaatgt tgcttcctag acatagtact 600
tatcatatag acgatatgag attgtcttct gatggtaaac aaataataat 650
tacagcaaca atgatgggca cagctatcaa tcctaaagaa ttcgtgatga 700
atcccgcaaa cgcgcaaggc agacatacac ccggtaccag actctagagc 750
tagagaagga gtttcacttc aatcgctact tga 783
(서열번호 56 참조)
pGEX -4 TBA -05 단백질 코딩 서열
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1 5 10 15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
20 25 30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
35 40 45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
50 55 60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65 70 75 80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
85 90 95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
115 120 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
130 135 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145 150 155 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
165 170 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu
180 185 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
195 200 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
210 215 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly
225 230 235 240
Arg His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
245 (서열번호 37 참조)
BA -07을 생산하는데 유용한 프라이머 1:
ggatctggtt ccgcgtcata tgtctagagt cgacctg (서열번호 38 참조)
BA -07을 생산하는데 유용한 프라이머 2:
cgcggatcca ttagttctcc ttcttccact tc (서열번호 39 참조)
pET9a - BA -07 DNA 코딩 염기서열
pET9a - BA -07 단백질 서열
Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
1 5 10 15
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
20 25 30
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
35 40 45
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
50 55 60
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65 70 75 80
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
85 90 95
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
100 105 110
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
115 120 125
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145 150 155 160
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
165 170 175
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met
180 185 190
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
195 200 205
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
210 215 220
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225 230 235 240
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
245 (서열번호 57 참조)
아미노산 잔기는 펩티드에 내제적으로 아미노산 잔기가 위치할 때 -NH-CR1R2-CO-기를 포함한다. 이 잔기는 이와 상응하는 아미노산 NH2-CR1R2-COOH로부터 형성되며, 이때 R1 및 R2는 다른 아미노산의 질소 및 카르복시산 카르보닐기와 아미노 또는 펩티드 결합을 형성하기 위하여 H2O를 제거함으로써 아미노산의 나머지 잔기를 포함하는 아미노산의 중간에 있는 탄소에 치환된 치환기이다. 펩티드의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 펩티드에서 카르보닐기가 다른 아미노산 잔기와 펩티드 결합에 의해 결합된 NH2-CR1R2-CO-기를 포함한다. 또한, 펩티드의 C-말단에 있는 아미노산 잔기는 펩티드에서 질소가 다른 아미노산 잔기와 펩티드 결합에 의해 결합된 NH-CR1R2-COOH기를 포함한다.
본 발명의 펩티드 및 단백질 서열에 존재할 수 있는 아미노산 잔기는 종종 당업계에 통상적으로 사용되는 3개의 문자코드 또는 1개의 문자코드로 언급되었다. 이때, 상기의 코드는 Gly 또는 G인 글라이신; ALa 또는 A인 알라닌; Val 또는 v인 발린; Leu 또는 L인 류신; Ile 또는 I인 아이류신; Met 또는 M인 메치오닌; Phe 또는 F인 페닐알라닌; Trp 또는 W인 트립토판; Pro 또는 P인 프롤린; Asn 또는 N인 아스파라긴; Glu 또는 Q인 글루타민; Asp 또는 D인 아스파르트산; Glu 또는 E인 글루타민산; Lys 또는 K인 라이신; Arg 또는 R인 알기닌; 및 His 또는 H인 히스티딘을 포함한다. 필수 아미노산이 아닌 다른 아미노산들은 당업계에 잘 알려진 펩티드 합성방법 또는 엡실론 아민과 카르보닐기와의 결합을 형성하기 위하여 카르보닐기를 포함하는 활성 에스테르와 라이신 엡실론 아미노기와의 반응으로 인한 아실화, 알킬화, 우레아 형성, 우레탄 형성 및 소수성기(예를 들면, 포화, 불포화, 또는 프롤린 아미드와 같은 카르보닐기를 포함하는 C-18 알킬 및/또는 아랄킬에 대한 C-1)를 포함하는 펩티드사슬 화학기능기, 4가 암모니윰 알킬기 또는 암환자에서 발견되는 pH에서 양성자를 얻을 수 있는 기본 아미노기와 같은 양성기, 또는 이들 모두가 첨가된 그 유사체와 같은 화학적 변형에 의해 도입될 수 있다.
본 발명의 펩티드 및 단백질에 있어서, 상대적으로 비-극성 및 소수성 아미노산 잔기들은 G, A, V, L, I, M, F, W 및 P를 포함하며; 상대적으로 극성 및 친수성 아미노산 잔기들은 S, T, C, Y, N 및 Q를 포함하며; 음이온성 및 친수성 아미노산 잔기들은 D 및 E를 포함하며, 이때 각각의 D 및 E에 있어서 카르복시산 기능기는 음이온성 카르복실염의 비양성화된 형태이며; 양이온성 및 친수성 아미노산 잔기들은 양이온성 암모니윰기의 비양성화된 형태인 기본 엡실론 최초 아미노기인 K, 이미다졸리윰 양이온성기를 제공하는 양성화된 형태인 이미다졸 질소인 H 및 양성화된 아미데이트기를 포함할 수 있는 R를 포함한다.
<본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 항-전이 특성>
본 발명에 있어서, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은, 예를 들면, 포유동물에 있어서 전이성 암세포의 이동을 억제 및 치료가 필요한 최초의 암 또는 이 근처에 있는 조직, 최초의 암 부위로부터 유래된 암세포, 최초의 암이 존재하는 조직 근처 및 기능적으로 이와 관련된 건강한 또는 정상적인 조직부위에 본 발명의 코팅 방법 및 다른 방법에 의한 주사 또는 국소투여를 이용하여 주입할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 포유동물의 신장암을 포함한 이와 인접한 신장조직에 투여할 수 있으며, 최초의 암이 존재하는 신장에 있어서, 신장에 잔존하는 전이성 신장암세포가 정상적인 신장조직으로 이동하는 것을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은, 예를 들면, 포유동물에 있어서 전이성 암세포의 이동을 억제 및 치료가 필요한 최초의 암 또는 이 근처에 있는 조직, 최초의 암 부위로부터 유래된 암세포, 최초의 암이 존재하는 조직으로부터 제거 또는 기능적으로 분리된 건강한 또는 정상적인 조직 또는 기관부위에 본 발명의 코팅 또는 다른 방법에 의한 주사 또는 국소투여를 이용하여 주입할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 뇌종양을 포함하는 뇌조직에 투여할 수 있으며, 이외 간, 비장 또는 폐 조직과 같은 신체의 건강한 조직으로의 전이성 뇌종양 세포가 이동하는 것을 억제할 수 있다.
아울러, 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 투여한 경우, 악성종양세포가 전이되는 이동성을 예방 및 억제할 수 있으며, 환자에 있어서 악성종양의 확산 및 2차적인 암의 형성을 실질적으로 줄이거나 완전하게 예방할 수 있다.
< BA -07과 같은 본 발명의 융합 단백질이 세포의 이동성을 감소할 수 있는지에 대한 평가>
항-전이제로서 BA-05와 같은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 효과는, 예를 들면, 시험관내 2차원적인 세포 침윤분석을 조사함으로써 정량적으로 측정할 수 있다. 또한, 이러한 분석에 있어서, 전이성 악성종양세포의 이동은 상용화된 Boyden chamber를 이용하여 측정할 수 있다. Boyden chamber는 구획을 가지고 있으며, 이때 상부 구획과 하부 구획은 막으로 분리되어 있다. 이때, 세포이동의 양은 상부 구획에 전체 세포를 분주한 후 하부 구획으로 이동한 세포를 분획으로 나누어 그 세포수를 계산함으로써 측정할 수 있다. 또한, 세포의 이동을 증가시키기 위하여 성장 인자들을 하부 구획에 첨가시킬 수도 있다. 이러한 방법은 포유동물의 생체 내 암세포 이동 모형으로 유용하다. 암세포의 이동를 저해하기 위해 포유동물의 혈액과 등장성이 있는 멸균된 인산완충식염수에 첨가시킨 BA-07과 같은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 효능을 조사하기 위하여, 상기의 BA-07을 포함하는 조성물을 상부 구획에 있는 암세포에 서로 다른 농도로 BA-07을 첨가하였다. 융합 단백질 조성물의 존재하에서 하부 구획으로 이동한 전체 세포수의 분획은 융합 단백질이 첨가되지 않은 대조군과 비교 및 계산하였다. 대조군 실험 모형에서 이동되는 암세포의 수는 본 발명의 조성물을 처리하지 않은 암 환자에 있어서의 이동과 유사하며, 본 발명의 일정한 조성물을 처리한 상태에서 이동되는 암세포의 수는 본 발명의 일정한 조성물을 처리한 암 환자에서의 이동과 유사하다. 치료군 및 대조군 실험의 세포 이동에 있어서의 차이는 백분율로 나타낼 수 있으며, 100%(예를 들면, 전이성 암세포의 이동을 완전히 억제하는 경우) 내지 약 5%, 바람직하게는 100% 내지 약 50%, 더 바람직하게는 100% 내지 약 75%, 보다 더 바람직하게는 100% 내지 약 90%이다. 0% 양은 두 번째 대조군 비히클을 첫 번째 대조군 비히클과 비교했을 때, 최초의 대조군 비히클과 동일한 경우에 관찰될 수 있다. 이러한 백분율을 이용한 계산은 {(융합 단백질의 존재하에서 이동한 세포의 수 - 대조군에서 이동한 세포의 수)/(대조군에서 이동한 세포의 수)×100%}로 나타낼 수 있다.
항-전이제로서 BA-05와 같은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 효과는 시험관내 3차원적인 세포 침윤 분석을 이용할 수 있으며, 적어도 정성적으로 측정할 수 있다. 이러한 분석에 있어서, 전이성 악성종양세포의 이동에 대한 억제능은 융합 단백질을 포함하지 않는 담체 비히클을 대조군으로 MATRIGELTM를 이용한 악성종양세포의 이동과 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 약학적으로 허용가능한 제형을 포함한 담체로 상기의 세포를 처리한 후 MATRIGELTM를 이용한 악성종양세포의 이동을 비교함으로써 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 같은 시기에 암세포의 이동거리의 감소 또는 암세포의 이동비율의 감소와 같은 억제 변화를 초래하는 조직기질 모형에서 전이성 암세포의 이동을 억제할 수 있다.
상기의 모형 기질을 통한 악성종양세포의 이동 거리에 있어서의 상대적인 차이는, 융합 단백질 및 비히클이 존재하는 상태에서의 세포의 이동거리와 융합 단백질이 없는 대조군 비히클이 존재하는 상태에서의 세포의 이동거리의 차이를 대조군의 비히클의 이동거리로 나눈 것과 동일하다. 이러한 상대적인 차이는 백분율로 나타낼 수 있으며, 100%(예를 들면, 전이성 암세포의 이동을 완전히 억제하는 경우) 내지 약 5%, 바람직하게는 100% 내지 약 50%, 더욱 바람직하게는 100% 내지 약 75%, 보다 더욱 바람직하게는 100% 내지 약 90%이다. 0% 양은 두 번째 대조군 비히클을 첫 번째 대조군 비히클과 비교했을 때, 최초의 대조군 비히클과 동일한 경우에 관찰될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 예를 들면, 각각 막 투과를 증가시키는 아미노산 서열이 서로 다른 융합 단백질인 본 발명의 두 개의 융합 단백질 A 및 B의 효능 차이에 있어서 A 및 B에 의해 유도되는 상기 암세포의 서로 다른 이동의 백분율 저해를 보였다. 이러한 억제에 대한 상대적인 차이(B에서는 80% 저해를 나타내는 것과 달리 A에서는 100% 저해를 나타내는 절대적인 저해 % 또는 A는 B보다 더 효과적인 것과 같은 질적인 차이)는 암 종에 따라 동일하거나 차이가 날 수 있다.
이러한 점에서, 본 발명의 융합 단백질은 실질적으로(100%) 적어도 1종 이상의 전이성 암세포 이동을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 실질적으로(100%) 적어도 2종 이상의 전이성 암세포 이동을 억제할 수 있다.
이러한 유용한 분석은 인공적인 기저막(MATRIGELTM)을 통해 이동할 수 있는 침윤성 암세포에서 관찰되는 것을 근간으로 하고 있다. 이러한 분석에 있어서, 본 발명의 조성물을 처리하지 않은 MATRIGELTM을 통한 이동능은 서로 다른 암세포종에서 차이가 나기 때문에 서로 다른 전이성 침윤은 0.1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml의 본 발명의 융합 단백질의 농도 또는 용량에 노출시킴으로써 평가할 수 있다. 바람직한 농도의 범위는 조직 cc당 약 0.0001 ㎍ 내지 100 ㎍이다.
MatrigelTM 기질(BD Biosciences)은 ECM 단백질이 풍부한 암인 EHS 마우스 육종으로부터 추출된 용해성을 띤 기저막 물질이다. 상기 물질의 주성분은 라민, 콜라겐 IV, 헤파린 설페이트 프로테오글라이칸 및 엔탁틴이다. 실온에서 BD MatrigelTM 기질은 포유동물의 세포에 있는 기저막을 모방할 수 있는 생물학적으로 활성화된 기질 물질을 생산하기 위하여 중합되며, 이때 세포들은 생체내 조건과 동일한 방법으로 시험관내에서 작용할 수 있다. MatrigelTM 기질은 세포 형태학, 생화학 기능, 이동 또는 침윤 및 유전자 발현의 연구를 위한 생리학적으로 연관된 환경을 제공할 수 있다.
< BA -05와 같은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물에 의한 혈관신생 억제 및 모세혈관-유사 또는 세관 구조에서의 그의 효능>
본 발명에 있어서, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은, 예를 들면, 포유동물에 있어서 암세포 집단 또는 전이성 암세포의 혈관신생과정을 억제 및 치료가 필요한 최초의 암 또는 이 근처에 있는 조직, 최초의 암 부위로부터 유래된 암세포 또는 암세포 집단, 최초의 암이 존재하는 조직 근처 및 기능적으로 이와 관련된 건강한 또는 정상적인 조직부위에 본 발명의 코팅 또는 다른 방법에 의해 또는 주사에 의해 주입될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 포유동물의 신장암 및 이와 인접한 신장조직에 투여할 수 있으며, 최초의 암이 존재하는 신장에 있어서, 이 신장의 전이성 신장암세포가 정상적인 신장조직으로의 혈관신생과정을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은, 예를 들면, 포유동물에 있어서 전이성 암세포의 증식과 관련된 혈관신생과정을 억제 및 치료가 피료한 최초의 암 또는 이 근처에 있는 조직, 최초의 암 부위로부터 유래된 암세포, 최초의 암이 존재하는 조직으로부터 제거 또는 기능적으로 분리된 건강한 또는 정상적인 조직 또는 기관부위에 본 발명의 코팅 또는 다른 방법에 의해 또는 주사에 의해 주입할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 뇌종양을 포함하는 뇌조직에 투여할 수 있으며, 이외 간, 비장 또는 폐조직과 같은 신체의 건강한 조직으로 이동하는 전이성 뇌종양 세포의 혈관신생을 억제할 수 있다.
아울러, 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 투여한 경우, 악성종양세포의 증식 및 전이의 형성과 관련된 혈관신생이 예방 및 억제될 수 있다. 또한, 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 경우, 이 환자에 있어서 악성종양의 근원 및 확산을 예방할 수 있고, 2차적인 암의 형성과 관련된 혈관신생을 실질적으로 줄이거나 완전하게 예방할 수 있다.
혈관신생에 의한 신생혈관의 형성은 최초의 암 증식 및 전이에 의한 최초의 암세포 또는 암세포 집단으로부터 형성된 연속적인 2차적 암 증식에 있어서 매우 중요하다. BA-07과 같은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물에 의한 혈관신생의 억제는, 예를 들면, 기저막 추출물(MatrigelTM)의 존재하에서 혈관내피 세포의 배양을 포함하는 시스템 즉, 암세포의 증식에 있어서 혈관신생 연구에 유용한 시험관내 시스템을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 실험적인 관찰 조건에서, 혈관신생 또는 혈관에서의 모세혈관 형성과 관련된 모세혈관-유사구조 또는 세관(tubule)을 현미경으로 관찰할 수 있다. 또한, 암과 관련된 혈관신생의 진행 또는 진행의 파괴 또는 세관(tubule) 모양의 모세혈관 네트워크의 형성 또는 혈관신생의 진행에 있어서, BA-05와 같은 본 발명의 융합 단백질의 억제 효과는 Matrigel 분석을 이용한 세관 구조의 파괴에 의해 관찰할 수 있다.
Matrigel 분석에 있어서, MatrigelTM(약 12.5 mg/mL)은 약 4℃에서 동결되며, 구체적인 실험 방법은 약 50 ㎕의 MatrigelTM을 96웰 플레이트 각각에 첨가한 후 고체화시키기 위해 약 37℃에서 약 10분간 방치해 둔 다음, 고체상태의 MatrigelTM을 포함하고 있는 웰을 HUVEC(15,000/웰)과 함께 약 30분 동안 배양하였다. 세포가 고착된 상태에서 배지를 제거한 후 BA-05와 같은 본 발명의 융합 단백질을 포함한 신선한 배지로 교체한 후 37℃에서 약 6시간 내지 8시간 동안 배양하였다. 또한, 대조군의 웰은 배지만을 이용하여 배양하였다. 이어, 증식을 분석하기 위하여, 튜브 형성은 예를 들면, 약 50 배율의 현미경으로 관찰할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질(x)를 포함하는 약학적 조성물의 조사에서 관찰된 혈관신생으로부터 유래된 모세혈관 네트워크의 상대적인 평균길이(Yx)는 Northern Eclipse software를 이용하여 지시사항에 따라 정량화하였다.
예를 들면, 혈관신생으로부터 유도된 모세혈관 네트워크의 길이에 있어서, BA-05와 같은 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 효능과 관련된 전형적인 Matrigel 분석의 결과는 표 1에 기재하였다. 이로부터, 네트워크의 형성은 세포의 억제가 없는 경우, 100%의 증식을 나타내는 대조군 비히클에 의한 저해를 위해 사용된 제형 상태 및 용량하에서 대략 13% 내지 약 20% 정도 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 혈관신생에 있어서 이러한 효과는 MatrigelTM에 세포를 첨가하기 전 BA-05를 HUVEC 세포에 미리 배양시킴으로써 또는 고농도의 융합 단백질을 첨가함으로써 증가될 수 있다.
Matrigel 기질 분석의 모세혈관 네트워크의 평균 길이에 있어서 융합 단백질 BA-05를 포함하는 약학적 조성물의 항-혈관신생 효능
혈관신생과 관련된 모세혈관 네트웍의 평균 길이 비히클 대조군의 존재하에서 형성된 상대적인 모세혈관 네트워크의 평균 길이 융합 단백질(BA-05, ug/ml)을 포함하는 약학적 조성물의 존재하에서 형성된 상대적인 모세혈관 네트워크의 평균 길이
Y1 100 86.4
Y2 100 78.2
Y3 100 86.7
< BA -07과 같은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 암세포에 대한 항-증식 활성>
BA-07과 같은 본 발명의 융합 단백질이 악성종양세포의 여러 가지 표현형에 영향을 줄 수 있는지에 대한 평가는 증식 및 증가하는 세포에 결합하는 3H 사이미딘을 모니터링하여 조사하였고, 이때 세포 배양액에 첨가된 3H 사이미딘은 세포내로 침투 및 DNA를 합성하는 각각의 세포에서 이용되는 사이미딘 3인산 풀(pool)의 일부분이 된다. 3H 사이미딘은 각각의 세포에 있는 DNA 거대분자에 공유결합되어 있다. 증식하지 않는 세포 및 세포사멸 또는 세포괴사에 의해 사멸로 유도되는 세포에 있어서, 3H 사이미딘은 세포내로 침투되지 않거나 또는 세포 분쇄 후 세포 배양액으로 방출되지 않는다. 3H 사이미딘 결합은 세포증식, 세포분열, 세포평형 및 세포사멸에 대한 BA-07과 같은 본 발명의 융합 단백질 효능에 대한 전반적인 측정을 위해 사용하였다. BA-07이 3H-사이미딘 감소를 유도하는 세포주로는 인간 자궁내막종세포주(HEC 1B), 인간 대장선암세포주(CaCo2), 인간 흑생종세포주(SK-MEL-2) 및 인간 중추신경계종 세포주(A-172) 등이 포함된다.
표 2는 3H 사이미딘이 삽입된 8개 각각의 대표적인 인간 암세포종(HEC 1B, Caco-2, SK-MEL-1, HT1080, MCF7, SW480, 293S 및 A172)에 투여된 본 발명의 융합 단백질(BA-07)을 포함하는 조성물의 투여량에 따른 효능의 차이를 나타낸 것이다. 상기의 융합 단백질(BA-07)의 투여량은 약 1 ㎍/mL 내지 10 ㎍/mL 내지 또는, 1 ㎍/mL 농도의 50배인 50 ㎍/mL까지 투여하였다.
3H-사이미딘의 결합에 의해 측정된 융합 단백질(BA-07)의 투여량에 대한 사람 암세포주들의 반응
BA-07의 투여량(㎍/mL)
사람 암세포주 50 10 1
대조군인 비히클에 상대적인 융합단백질하에서의 성장률(%)
HEC 1B 10 13 30
Caco-2 21 17 30
SK-MEL-1Z 34 30 33
예상과 달리, 상기의 암세포주들은 본 발명의 융합 단백질 존재하에서 감소된 세포증식을 나타내었다. 표 2는 100%의 대조군 값에 대한 백분율 성장률을 나타낸 것이다.
암세포주들은 3H 사이미딘 결합과 관련해서 3개의 개별적인 그룹으로 나눌 수 있는데, 융합 단백질(BA-07)을 포함하는 본 발명의 조성물은 사람 자궁내막선종암세포주(HEC 1B)에서 전체 세포증식의 1/2를 억제하는 IC50가 1 ㎍/mL보다 적은 양으로 현저하게 세포증식을 억제하였다. 덧붙여, BA-07의 고농도에서는 더욱 세포 증식을 억제하는 농도-의존적 효능을 관찰할 수 있었다.
또한, 표 2에서와 같이, Caco2 및 SK-MEL-1 세포주에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은 각각의 세포주에서 낮은 레벨의 3H 사이미딘 삽입되는 결과를 통해 세포증식에 강한 억제 효능을 나타냄을 알 수 있었다.
<본 발명에서 사용된 약어>
ADP : adenine dinucleotide phosphate
ATCC : American Type culture collection
ADPC : C3 exotransferase; C3 exoenzyme; C3 transferase
FPS : Fetal bovine serum
HEPES : HEPES buffer
MMP : Matrix metalloproteinase
NAD : nicotinamide adenine dinucleotide
NCI : National Cancer Institute
PBS : phosphate buffered saline
SRB : sulforhodamine B
TCA : trichloroacetic acid
도 1은 사람 자궁내막선종 세포주(HEC1B)의 증식에 대한 융합 단백질 BA-07을 포함하는 본 발명의 조성물의 효능을 3H-사이미딘(thymidine) 결합을 통하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 비히클(10)은 인산완충식염수이며, BA-07은 1 ug/ml(11), 10 ug/ml(12) 및 50 ug/ml(13)의 농도로 이용하였고, 암세포의 증식은 농도-의존적으로 감소하였다.
도 2는 사람 흑색종세포주(SK-MEL-1)의 증식에 대한 BA-07 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물의 효능을 3H-사이미딘(thymidine) 결합을 통하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 비히클은 인산완충식염수이며, BA-07은 1 ug/ml, 10 ug/ml 및 50 ug/ml의 농도로 이용하였고, 암세포의 증식은 농도-의존적으로 감소하였다.
도3 A는 MatrigelTM 기질에서 배양된 HUVEC 내피세포의 튜브 형성을 나타낸 도면이다. 이 분석은 혈관신생에 대한 세포 배양법으로서, 튜브 형성은 본 발명의 융합 단백질을 포함하지 않는 대조군에서 관찰되었다(도 3A, 상자 30).
도 3B는 MatrigelTM 기질에서 배양된 HUVEC 내피세포의 튜브 형성에 있어서의 감소를 나타낸 도면이다. BA-07 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물을 처리한 경우, 3B 및 상자 31에서 보이는 것처럼 혈관신생 억제를 나타내는 어떠한 튜브도 관찰되지 않았다.
도 4는 BA-07 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물에 의한 사람 신장암세포주(TK-10)의 증식 억제를 sulforhodamine B(SRB) 증식 억제 분석법으로 측정하여 나타낸 그래프이다. BA-07 융합 단백질은 0.1 ug/ml, 1 ug/ml, 10 ug/ml 및 100 ug/ml의 농도로 이용하였고, 이 모든 농도에서 암세포 증식이 감소되었으며, 암세포 증식의 감소는 농도-의존적으로 나타났다. 100 ug/ml의 융합 단백질 농도에서, 본 발명의 조성물은 암세포의 세포사멸을 유도하였다.
도 5는 BA-07 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물에 의한 사람 비-소세포폐암세포주(HOP-62)의 증식 억제를 sulforhodamine B(SRB) 증식 억제 분석법으로 측정하여 나타낸 그래프이다. BA-07 융합 단백질은 0.1 ug/ml, 1 ug/ml, 10 ug/ml 및 100 ug/ml의 농도를 첨가하였고, 이 모든 농도에서 암세포 증식이 감소되었으며, 암세포 증식의 감소는 농도-의존적으로 나타났다.
도 6은 BA-07 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물에 의한 사람 중추신경계세포주(SF-286)의 증식 억제를 sulforhodamine B(SRB) 증식 억제 분석법으로 측정하여 나타낸 그래프이다. BA-07 융합 단백질은 0.1 ug/ml, 1 ug/ml, 10 ug/ml 및 100 ug/ml의 농도를 첨가하였고, 이 모든 농도에서 암세포 증식이 감소되었으며, 암세포 증식의 감소는 농도-의존적으로 나타났다.
도 7은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 투여한 다음 10 ug/ml의 융합 단백질을 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 24시간 동안 배양한 후 활성화된 RhoA의 감소된 수치를 나타낸 그래프이다.
도 8은 BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 조성물에 의한 신장암세포주(Caki-1)의 증식 억제(비히클 대조군에 대한 % 증식)를 각각 0.1 ug/ml, 1 ug/ml, 10 ug/ml 및 100 ug/ml의 융합 단백질 농도에서 SRB 분석으로 측정한 결과를 백분 율 증식으로 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 본 발명의 융합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 일반적인 유용한 방법
본 발명의 융합 단백질을 제조하는 유용한 방법을 평가하는 한 예로 C3 폴리펩티드의 C-말단에 첨가된 안테나페디아(antennapedia) 서열을 이용하였다. C-말단에 첨가된 상기의 DNA는 C3 폴리펩티드의 C-말단에 적어도 1개의 아미노산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열을 포함한다. 상기 DNA의 3' 말단의 종결코돈은 정방향 프라이머 5'-GAA TTC TTT AGG ATT GAT AGC TGT GCC-3'(서열번호 1 참조) 및 역방향 프라이머 5'-GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA-3'(서열번호 2 참조)를 이용한 PCR에 의해 형성된 산물을 Ecor RI 부위에 첨가함으로써 치환될 수 있으며, 이 PCR 산물은 pSTBlue-1 벡터(Novagen, Madison, Wisconsin)에 서브클로닝하였다. 본 발명의 벡터는 pGEX-4T/C3로 명명하였고, 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 일반적인 방법으로 제공할 수 있다. pGEX-4T/C3의 3' 말단에 첨가되는 유용한 안테나페디아(antennapedia) 서열은 이 서열(Bloch-Gallego, 120, 485-492, 1993;및 Derossi, 269, 10444-10450, 1994)을 포함하는 pET-3a 벡터를 주형으로 PCR에 의해 생산될 수 있으며, pGEX-4T/BA-14를 제조하기 위하여 상기 PCR 산물을 pSTBlue-1 블런트 벡터에 서브클로닝 한 후 pGEX-4T/C3의 제한효소 Eco RI 및 Sal I 부위에 클로닝 하였다. 상업적으로 구입가능한 효소를 이용한 플라스미드 DNA에 존재하는 이용가능한 뉴클레아제 또는 새로운 DNA 서열, 엑소뉴클레아제 II 또는 pGEX-4T/BA-14에 삽입된 목적 DNA 서열을 포함하는 두 개의 합성 올리고뉴클레오티드의 부위-특이적인 돌연변이를 일으킬 수 있는 목적 플라스미드 서열의 조작은 친화성 크로마토그래피 또는 극성에 따라 분리할 수 있는 이온 교환성과 같은 표준화된 방법, 크기에 따라 분리할 수 있는 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피 및 단백질 분리의 다른 방법에 의해 분리될 수 있는 단백질을 생산할 수 있도록 적합한 시스템에서 발현될 수 있는 새로운 DNA 서열을 제조하는데 이용될 수 있다. 상기 단백질은 세포에 침투하는 그들의 능력 및 Rho의 활성을 저해할 수 있는 그들의 능력을 평가하기 위한 분석법으로 각각 조사하였다. DNA 염기서열 분석은 대조군과 비교해, C3 엑소트랜스퍼라제에서 보다 우수한 반응을 나타내는 플라스미드 염기서열을 대상으로 수행하였다. pGEX-4T/BA-14 클론(서열번호 3 참조)은 현재까지 가장 바람직한 서열이며, 본 발명의 바람직한 조성물의 단백질을 제공할 수 있다. 이러한 C3-유사 융합 단백질의 한 예로 pGEX-4T/BA-05(서열번호 37 참조)가 있다.
본 발명의 단백질은 안정적인 발현 비히클내에 안테나페디아(antennapedia) 유래의 전이 서열을 가진 BA-05를 코딩하는 DNA 단편과 같은 융합 단백질-코딩 DNA 단편의 일부 또는 전체를 숙주세포에 형질전환, 형질도입 또는 감염시키는 재조합 기술을 이용 또는 박테리아 세포 추출물로부터 제조할 수 있다.
< 실시예 2> 융합 단백질, BA -05의 제조
실시예 1의 방법은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질(BA-05)을 제조하는데 이용될 수 있다. BA-05는 C3를 코딩하는 cDNA를 융합성 19-머 펩티드를 코딩하는 cDNA에 연결함으로써 제조된 단백질을 일컬어 명명한 것이다.
C3-유사 융합 단백질의 한 예로는 pGEX-4T/BA-05(서열번호 37 참조)가 있다.상기의 C3-유사 단백질은 안테나페디아(antennapdedia) DNA를 pGEX4T/C3 DNA에 클로닝하는 조작방법으로 제조하였다. 적어도 23개 이상의 C3-유사 단백질들을 발현시켰고 제조사의 지시에 따라 분리하였다(Amersham BioSciences, Baie D'uRfe, Quebec). 20개의 단백질들에 대한 시험관내 시스템에서 Rho를 불활성화하는 능력을 확인하기 위하여 조사하였다. 대조군 비히클 또는 대조군 GST 단백질보다 현저하게 증가시키는 신경돌기의 증식을 나타내는 Rho를 불활성화시키는 단백질들은 추가적인 분석을 수행하였다. 이러한 과정의 산물들은 일반적인 예로서 BA-14와 같은 단백질 또는 Rho 불활성 생물분석에 있어서 융합 단백질(BA-14) 분자와 다른 또는 비-융합 단백질 C3의 대조군과 다른 분자량 및 활성과 같은 특성을 가진 융합 단백질을 클로닝하는 방법으로 제조할 수 있는 신규한 융합 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 신규한 융합 단백질은 C3 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 사용된 방법에 따라 C-말단에 변형을 초래할 수도 있다.
< 실시예 3> 융합 단백질, BA -07의 제조
상기 실시예 1의 방법은 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 BA-07를 제조하는데 이용될 수 있다:
Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
1 5 10 15
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
20 25 30
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
35 40 45
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
50 55 60
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65 70 75 80
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
85 90 95
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
100 105 110
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
115 120 125
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145 150 155 160
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
165 170 175
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met
180 185 190
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
195 200 205
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
210 215 220
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225 230 235 240
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
245 (서열번호 57 참조)
두 개의 PCR 프라이머는 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있는 BA-07 단백질을 제조하기 위하여 한 종류의 재조합 산물(BA-05)을 pET-9a 벡터(Novagen, Madison, Wisconsin)에 도입할 수 있도록 구성되었으며, 이때 사용된 정방향 프라이머는 5'-ggatctggttccgcgtcatatgtctagagtcgacctg-3'(서열번호 38 참조)이며, 역방향 프라이머는 5'-cgcggatccattagttctccttcttccacttc-3'이다(서열번호 39 참조). 서열번호 39의 5' 말단에서의 Bam HI 부위는 ggatccatta이며, TGA는 TAAT로 치환되었다(서열번호 39에서는 atta).
Pfu 폴리머라제를 이용한 상기 산물을 증폭하는 조건은 95℃에서 5분, 94℃에서 2분, 56℃에서 2분, 70℃에서 2분간 10회 반복하고 다시 94℃에서 2분, 70℃에서 3분간 30회 반복한 후 4℃에서 유지하였다. QIAEXII kit(Qiagen)는 목적 DNA를 포함하는 아가로즈 겔 조각을 분리하는데 이용하였다. 삽입 단편 및 벡터는 각각 제조사(New England BioLabs, Beverly, MA)의 지시에 따라 Bam HI 및 Nde I으로 절단하여 추출하였고, 아가로즈 겔 전기영동 및 QIAEXII kit(QIAGEN)을 이용하여 분리한 후, 제조사의 지시에 따라 T4 DNA 리가제를 이용하여 함께 밤새도록 반응시켰다.
상기 연결 혼합물은 E.coli(DH5alpha 또는 바람직하게는 XL1-Blue)에 형질전환되었고, 이 클론들은 소규모발현유도 및 SDS-PAGE 에 의해 확인되었으며, 세포 전체 분쇄물은 항-C3 항체를 이용한 면역반응으로 분석하였다. 플라스미드 DNA는 분리 및 정제 정도를 측정할 수 있다. DNA 시퀀싱은, 예를 들면, 상기 클론의 전장을 시퀀싱할 수 있도록 전체 가닥을 이용한 LiCor 기술로 수행할 수 있다.
이러한 방법으로 제조된 최초의 산물(pET3a-BA-07, 서열번호 7 참조)은 클로닝 전략으로 인한 5' 말단에서의 작은 변화를 가지는 것을 특징으로 하는 pGEX/BA- 05 산물의 이론적인 DNA 서열과 상응한다.
두 번째 산물(pET9a-BA-07)은 제조사의 지시에 따라 pET3a 벡터를 Bam HI 및
Nde I(New England BioLabs, Beverly, MA)으로 절단한 후, pET3a-BA-07로부터 준비된 삽입인자를 pET9a 벡터에 서브클로닝함으로써 제조하였다. 또한, pET9a 벡터는 상기와 같은 제한효소로 절단할 수 있다. 상기의 삽입 DNA 및 벡터 DNA는 각각 아가로즈 겔 전기영동으로 분리할 수 있다. 또한, 상기의 삽입인자는 T4 DNA 연결효소(New England BioLabs, Beverly, MA)를 이용하여 새로운 벡터에 연결시킬 수 있다. 이 연결된 DNA는 DH5alpha에 형질전환하였고, 이때 DNA 분리는 QIAGEN mini 및 maxi kit를 이용하여 준비할 수 있다. 상기로부터 얻은 클론들은 제한효소를 이용한 절단 및 양방향으로 삽입인자를 DNA 시퀀싱(예를 들면, BioS&T, Lachine, Quebec에 의한)하여 동정할 수 있다. 상기 산물의 DNA는 BL21(DE3) 세포, BL21(DE3)/pLysS 세포(Novagen, Madison, WI) 또는 다른 안정적인 발현 시스템을 이용하여 형질전환할 수 있다.
< 실시예 4> 세포증식을 측정하기 위한 3 H- 사이미딘 흡수 및 암세포의 증식을 감소시키는 융합 단백질 BA -07을 분석하기 위한 일반적인 방법
3H- 사이미딘 삽입 분석
배지 및 세포주
세포주들은 실험 전에 이미 마이코플라즈마 조사를 수행하였고, 그 결과 음성 반응이 나타남을 확인하였다. 또한, 이 세포주들은 ATTC로부터 입수하였다. 세포주 HEC-1B는 10% FBS와 1% HEPES를 첨가한 E-MEM 배지에서 배양하였으며, 세포주 Caco-2는 20% FBS, 1% HEPES, 1 mM sodium pyruvate 및 0.1 mM 비-필수 아미노산을 첨가한 E-MEM 배지에서 배양하였다. 또한, 세포주 SK-MEL-1은 10% FBS와 1% HEPES를 첨가한 McCoy's 배지에서 배양하였다.
최종 부피가 200 ㎕가 되도록 각각 100 ㎕ 부피의 2×작용용액(working solution)에 포함된 융합 단백질, 양성 대조군 및 비히클 대조군을 4×103/100 ㎕의 세포를 포함하고 있는 96-웰 플레이트에 세 세트씩 분주하였고, 이를 습도가 100%이며 5% CO2를 가진 37℃ 배양기에서 배양하였다. 약 54시간 배양 후, 1.0 μCi를 포함하는 20 ㎕부피의 3H-사이미딘(ICN, Montreal, CANADA)을 각각의 웰에 첨가하였고, 이때 3H-사이미딘을 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 준비하였다. 이어, 세포들을 상기와 같은 조건에서 추가적으로 18시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 세포들은 자동화된 세포 수취기(Tomtec)로 수취하였고, 3H-사이미딘이 삽입된 cpm(counts per minute)은 microplate scintillation counter(TopCount NXY, Packard)로 측정하였다.
BA-07과 같은 본 발명의 융합 단백질이 악성종양세포의 여러가지의 표현형 에 영향을 줄 수 있다는 평가는 증식 및 증가하는 세포에 결합하는 3H 사이미딘을 모니터링하여 조사하였고, 이때 세포 배양액에 첨가된 3H-사이미딘은 세포내로 침 투 및 DNA를 합성하는 각각의 세포에서 이용되는 사이미딘 3인산 풀(pool)의 일부분이 된다. 3H 사이미딘은 각각의 세포에 있는 DNA 거대분자에 공유결합되어 있다. 증식하지 않는 세포 및 세포사멸 또는 세포괴사에 의해 사멸로 유도되는 세포에 있어서, 3H 사이미딘은 세포내로 침투되지 않거나 또는 세포 분쇄 후 세포 배양액으로 방출되지 않는다. 3H 사이미딘 결합은 세포증식, 세포분열, 세포평형 및 세포사멸에 대한 BA-07과 같은 본 발명의 융합 단백질의 효능의 측정을 위해 사용하였다. BA-07이 3H-사이미딘 감소를 유도하는 세포주로는 사람 자궁내막종세포주(HEC 1B), 사람 대장선암세포주(CaCo2), 사람 흑생종세포주(SK-MEL-2) 및 사람 중추신경계종 세포주(A-172)를 포함한다.
표 2는 3H 사이미딘이 삽입된 8개 각각의 대표적인 사람의 암세포종(HEC 1B, Caco-2, SK-MEL-1, HT1080, MCF7, SW480, 293S 및 A172)에 투여된 본 발명의 융합 단백질(BA-07)을 포함하는 조성물의 투여량에 따른 효능의 차이를 나타낸 것이다. 상기의 융합 단백질(BA-07)의 투여량은 약 1 ㎍/mL 내지 10 ㎍/mL 내지 또는, 1 ㎍/mL 농도의 50배인 50 ㎍/mL까지 투여하였다.
< 실시예 5> 혈관신생 억제를 평가하는 일반적인 방법
신생혈관의 형성은 기저막(MatrigelTM)의 기질 존재하에서 성장하는 혈관내피세포에 의한 세포배양 모델에서 연구되고 있다. HUVEC 세포는 트립신에 의해 고정 배양으로부터 수취하여, EBM-2(Clonetics), FBS, 하이드로코르티손 (hydrocortisone), hFGF, VEGF, R3-IGF-1, 아스코르브산, hEGF, GA-100, 헤파린을 포함하는 성장 배지에 현탁하였다. MatrigelTM(12.5 mg/mL)은 4℃에서 동결되며, 50 mL의 MatrigelTM을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 10분간 고체화를 위해서 배양하였다. 성장 배지에 포함된 세포(15,000 세포/웰)를 각 웰에 첨가한 후, 6시간 동안 고착하도록 배양하였다. 본 발명의 융합 단백질(BA-07)은 약 10 mg/ml 농도로 각 웰에 첨가하였고, 다른 웰에는 대조군으로서 PBS를 첨가하였다. 이어 상기 배양액을 추가적으로 6시간 내지 8시간 동안 배양하였다. 튜브의 성장은 50 배율에서 현미경으로 관찰하였고, 모세혈관의 평균 길이는 Northern Eclipse software를 이용하여 정량화하였다. 그 결과, Matrigel 분석에서 융합 단백질(BA-07)을 처리한 그룹이 튜브형성을 감소시킴을 확인하였다(도 3 참조).
< 실시예 6> 암세포 증식을 억제하는 융합 단백질의 효능을 평가하는 일반적인 방법
Sulforhodamine B( SRB )의 성장 억제 분석
시험관내에서 세포상에 존재하는 단백질의 양을 측정하기 위한 sulforhodamine B(SRB, 분자의 프로브로 이용가능한) 단백질 염색법이 계발되었고, NCI에 있어서 시험관내 항암 스크리닝(Skehan et al., 1990)에 지속적으로 이용되고 있다. SRB는 세포상에 존재하는 단백질이 기본적인 아미노산에 결합하며, 이러한 착색측정법은 세포수와 관련된 전체 단백질양을 측정하는 방법으로 이용할 수 있다. 이러한 분석법은 분석과정 중 분해 및 제거 또는 착색측정 종결점에 영향을 주지 못하는 죽은 세포들을 추측하는데 근간이 되는 방법이다.
SRB 분석 절차
이러한 분석법은 NCI 60개의 세포주 패널에서 수행되었다. 세포들은 각 세포주에 대해 ATCC에서 추천한 바에 따라 5% FBS 및 L-글루타민이 공급된 RPMI-L 1640에서 배양하였다. 대수증식기에 있는 세포들은 트립신을 처리한 후 세포수를 측정하였다. 이어, 상기 세포들은 100 ㎕의 성장 배지에서 각각의 세포주가 2배 성장하는 시점에서 96-웰 마이크로플레이트에 접종하였다. 이어, 상기의 마이크로플레이트는 세포가 기하급수적으로 성장할 때까지 24시간 동안 37℃, 5% CO2, 100% 상대습도에서 배양하였다. 24시간 후, 각 세포주의 2개의 플레이트는 시험 화합물을 첨가하는 시점(T0)에서 각 세포주에 대한 세포증식을 측정할 수 있도록 조직내에 TCA로 고정하였다. 이어, TCA를 제거하고 상기 플레이트는 건조시키기 위하여 최소 24시간 동안 실온에서 배양하였다.
본 발명의 융합 단백질을 준비한 후, 이를 냉동건조된 분말로서 저장하였다. 또한, 상기 융합 단백질은 10 mM 인산염과 완충용액(pH 7.4)의 혼합물 ㎕당 약 4.42 ㎍의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제조하기 위하여 멸균수에서 재구성하였다. 각 농도에 있어서, 농축액의 연속적인 희석은 200 ㎍/mL, 20 ㎍/mL, 2 ㎍/mL, 0.2 ㎍/mL 및 0.02 ㎍/mL의 융합 단백질을 제공하기 위하여 50 ㎍ /mL의 젠타마이신을 포함한 완전한 배지에서 준비하였다. 100 ㎕의 상기 시험 화합물의 희석액은 융합 단백질에 대한 최종 로그희석 연속농도를 얻기 위하여 이미 100 ㎕의 배지를 포함하고 있는 각 웰에 첨가하였다.
융합 단백질(약물)을 첨가한 후, 마이크로플레이트는 추가적으로 37℃, 5% CO2, 100% 상대습도에서 배양하였다. 이러한 분석법은 TCA(trichloroacetic acid)를 이용하여 웰 바닥의 세포내 단백질을 고정(fixing)함으로써 종결되었다. 이 플레이트를 건조시킨 후, 1% 아세트산을 첨가하여 0.4%(w/v)가 되는 100 ㎕의 SRB 용액을 각 웰에 분주하였다. 이어, 이 플레이트를 실온에서 10분 동안 단백질-결합 염색을 위하여 배양하였다.
염색한 후, 결합되지 않은 염료는 1% 아세트산으로 세척한 다음 제거하였고, 플레이트는 건조시켰다. 결합된 염색세포는 플레이트를 가볍게 혼합하면서 200 ㎕의 10 mM 트리즈마 베이스(Tizma base)를 첨가하여 용해시켰다. 염료의 양은 515 nm의 흡광도에서 마이크로플레이트 분석기를 이용하여 광학 밀도를 분석하여 측정하였다
결과는 엑셀 스프레드시트로 분석하였다
T0 = 융합 단백질 첨가시점에서의 평균 흡광도(0 시간)
C = 대조군에 대한 평균 흡광도(어떠한 약물도 포함하지 않은 시험화합물)
Ti = 융합 단백질 화합물에 대한 평균 흡광도(희석비율이 서로 다른 농도)
% 성장률은 각 시험 화합물의 농도에 의해 계산되었다:
% 성장률 = [(Ti-T0)/(C-T0)]×100 (Ti>T0인 농도에 대한);
% 성장 저해율 = [(Ti-T0)/T0]×100 (Ti<T0인 농도에 대한).
% 성장 저해율은 서로 다른 농도에 따른 효능을 비교하는 차트를 준비하는데 이용할 수 있다. % 성장 플롯(plot)은 도면으로 나타내었고, 농도반응 곡선이 PG값의 +50, 0 및 -50과 교차되는 시점에서는 GI50, TGI 및 LC50을 측정하는데 이용되었다. 또한, GI50 또는 50%의 성장 저해에 필요한 농도는 융합 단백질에 대한 상대적인 지표로 나타내었다.
< 실시예 7> 인간 암세포주의 세포성장 억제를 평가하기 위한 SRB 분석의 특이적인 이용
SRB 분석으로 측정한 융합 단백질에 의한 GI50(세포성장의 50% 저해 농도)
세포주 암종 GI50(㎍/ mL )
Caki -1 신장암 0.054
TK -10 신장암 0.52
SF -268 중추신경계종 0.326
HOP -62 비- 소세포폐포암 0.269
NCI - H226 비- 소세포폐포암 48.2
HS 578T 유방암 36.6
본 발명의 하나의 융합 단백질인 BA_0_은 3H-사이미딘으로 조사된 4 내지 6개의 암세포주 및 NCI에서 스크리닝한 약 10% 세포주에서 효능을 나타냈다. SRB 분석에 있어서, 상기의 융합 단백질은 세포증식 억제성을 나타내었는데, 이때 성장률은 대조군에 비해서 억제되었지만, 전체적인 단백질의 양은 0 시간(Tz)에서 측정된 양과 비교했을 때 감소되지 않았다. 이러한 결과는 생체내에서 C3 트랜스퍼라제가 동물에서 높은 독성을 나타내지 않는 결과와 상응한다. 관찰된 GI50 값은 nmol에서 μmol 범위에 있으며, 융합 단백질에 대해 약 27 kDa의 분자량이 주어졌다
< 실시예 8> 풀-다운 분석에 의한 활성화된 Rho 의 검출
NG108 세포는 5% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 세포 배지에서 배양하였다. 세포들을 안정화시킨 후(37℃에서 3-6시간 배양), BA-05를 배양액에 첨가시켰다. 이 세포들을 차가운 TBS로 세척한 다음 변형된 RIPA 용액(50 mM Tris, pH 7.2; 1% Triton X-100; 0.5% sodium deoxycholate; 0.1% SDS; 500 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 ㎍/ml 류펩틴; 10 ㎍/ml 아프로틴; 1 mM PMSF)에서 분쇄하였다. 세포 분쇄물들은 4℃, 13,000g에서 10분간 원심분리하여 수취한 후 -80℃에서 보관하였다.
GST-Rho 결합 도메인(GST-RBD)의 분리는 해동 후 1×106 세포당 500 ㎕의 RIPA 용액에 현탁시켜 분쇄한 세포 분쇄물을 이용하여 수행하였다. GST-Rho 결합 도메인(GST-RBD)을 제조하기 위하여, pGEX 벡터의 GST-RBD를 발현하는 박테리아를 100 ㎕/ml의 LB 배지에서 배양하였다. 밤새도록 배양한 배양액을 3600 ml의 LB 배지에 1/10으로 희석한 후 37℃, 2시간 동안 박테리아 진탕 배양기에서 배양하였다. 이어, Isopropyl-β-thiogalactopyranoside(0.5 mM)을 2시간 동안 배양액에 첨가시켰다. 박테리아는 5,000g에서 15분 동안 원심분리한 후 수취하였으며, 상기의 펠렛을 40 ml의 분쇄용액(50 mM Tris, pH 7.5; 1% Triton-X; 150 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 1 mM DTT; 10 ㎍/ml 류펩틴; 10 ㎍/ml 아프로틴; 1 mM PMSF)에 현탁하였다.또한, 분쇄 후, 상기 분쇄물은 4℃, 14,000rpm에서 30분 동안 원심분리하였다.
동결된 세포배양액은 RIPA 용액(50 mM Tris, pH 7.2; 1% Triton X-100; 0.5% sodium deoxycholate; 0.1% SDS; 500 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 ㎍/ml 류펩틴; 10 ㎍/ml 아프로틴; 1 mM PMSF)에서 균질화 하였다. 균질화물 및 세포 분쇄물은 4℃, 13,000g에서 10분간 2번 원심분리하여 확인하였다. 이어, 이들은 글루타민 아가로즈 비드(Sigma, Oakville, Canada)와 결합된 GST-RBD과 4℃에서 50분 동안 배양하였다. 이 비드를 4번 세척한 후 시료용액에서 용출하였다. 조직 균질체에 존재하는 GTP-결합 Rho 및 전체 Rho는 웨스턴블랏으로 검출하였다. 이 단백질들을 니트로셀룰로오즈를 통해 전달시킨 다음 단일항체 RhoA(Santa Cruz, Santa Cruz, California)을 이용하여 검출하였다. 밴드들은 페록시다제-연계된 2차 항체(Promega, Madison, Wyoming) 및 서양고추냉이 과산화효소(HRP)를 기초로 하는 화학발광반응(Pierce, Rockford, Illinois)을 이용하여 관찰하였다.
< 실시예 9> BA -07을 이용한 단백질 융합치료에 가장 잘 반응할 수 있는 암종의 결정 및 진단용 Rho 풀-다운 분석의 이용
암의 생체검사 대상물들은 대부분의 암이 제거되었을 때 절제된 부위의 일부에 잔존하는 포유동물(예를 들면, 환자)의 조직으로부터 수술적인 제거로 얻을 수 있다. 이 대상물들은 드라이아이스 또는 액체 질소에서 동결하였다. 대략 5 mm2의 절제된 조직 대상물들은 500 ㎕의 RIPA 용액(50 mM Tris, pH 7.2; 1% Triton X-100; 0.5% sodium deoxycholate; 0.1% SDS; 500 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 ㎍/ml 류펩틴; 10 ㎍/ml 아프로틴; 1 mM PMSF)에서 균질화 하였다. 이 균질화물들은 더 많은 분석을 위하여 4℃, 13,000g에서 10분 동안 2번 원심분리하여 수취하였다. 이어, 이 대상물들은 실시예 8과 같이, 글루타치온 아가로즈 비드와 연결된 GST-RBD와 4℃에서 50분 동안 배양하였다. 조직 균질화물에서 GTP-결합 Rho 및 전체 Rho는 웨스턴블랏으로 검출하였다.
생체검사 대상물에 있는 세포들에 활성화된 Rho의 특성이 있는지를 검출하기 위하여, 냉동단편을 준비하였다. RBD-GST의 박테리아 분쇄물들은 4℃, 14,000g에서 30분 동안 원심분리하여 수취하였다. 활성화된 Rho는 RBD-GST를 포함하는 박테리아 분쇄물과 상기의 단편을 배양함으로써 검출하였다. 랫트의 냉동단편된 척수(두께가 약 16 ㎛)는 4% PFA로 고정한 후에 박테리아 분쇄물과 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 이어, 이 단편들을 TBS로 3번 세척한 후 3% BSA으로 실온에서 1시간 동안 중지시킨 다음 항-GST 항체(Cell signaling, New England Biolabs, Mississauga, Canada) 및 세포형 특이적인 항체와 함께 배양하였다. 또한, 뇌종양에 있어서, 신경-특이적인 항체(NeuN) 또는 성상세포-특이적인 항체(GFAP)가 암 진단을 목적으로 하는 활성화된 Rho를 지닌 세포형을 검출하는데 이용될 수 있다. 상기의 단편들은 TBS로 세척한 후 FITC, Texas Red 또는 로다민 연계된 2차 항체(Jackson ImmunnoResearch Mississauga, Canada)와 실온에서 2시간 동안 배양하였다.
< 실시예 10> MMP 활성 감소를 검출하는 일반적인 방법
메탈로프로테아제 활성은 효소의 단백질 분해 활성이 비-환원성 상태의 폴리아크릴아미드 겔에서 분리되는 자이모그라피(zymography)에 의해 검출할 수 있다. 메탈로프로테아제 활성을 검출하기 위하여, Caki-1 결장암 세포증식에 의한 배양액의 젤라틴 분해 활성은 젤라틴 자이모그라피에 의해 검출하였다. Caki-1 세포들은 0.1, 1.0 또는 10 ㎍/ml의 BA-07 또는 대조군으로서 완충용액과 함께 24시간 동안 배양하였다. 25 ㎕의 배양액은 1 mg/ml의 젤라틴을 포함하는 7.5% 폴리아크릴아미드인 SDS/PAGE에 대상물로 제공되었고, 폴리펩티드는 비-환원성 조건에서 분리하였다. MMP 활성을 조사하기 위하여, SDS는 2.5%(v/v) Triton X-100 용액을 이용하여 실온에서 30분 동안 배양하여 제거하였다. 이 단계는 ddH2O로 5번 세척한 후에 다시 반복하였다. 이어, 상기의 겔은 50 mM Tris-HCl, pH 7.6; 0.2M NaCl; 5mM CaCl2;및 0.02%(v/v) Brij-35를 포함하는 완충용액으로 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 이어, 상기의 겔은 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색한 후에 탈염색하였다. 젤라틴 기질에 대한 효소적 활성은 푸른색 바탕에 투명한 밴드로서 검출되었다. 젤라틴효소 활성과 동일한 MMP 활성은 본 발명에 있어서 HT-1080 세포와 같은 양성 대조군을 이용하여 확인할 수 있다.
< 실시예 11> BA -07 처리 후 메탈로프로테아제 활성 감소의 검출
상기 실시예 10의 방법과 마찬가지로, 융합 단백질(BA-07)을 이용하여 분석하였고, 그 결과 메탈로프로테아제 활성의 감소가 나타남을 관찰하였다.
< 실시예 12> 멸균수에 용해된 융합 단백질의 제형
BA-07과 같은 본 발명의 융합 단백질의 치료적으로 유효한 단위 투여량은 무균상태에서 0.2 ㎛ 필터를 통해 필터된 1 유닛 투여량의 용매를 제조하기 위하여 멸균된 등장성 PBS와 같은 1 유닛 투여량의 멸균된 등장성 용매에 용해되었다. 상기의 필터된 물질은 비활성기체(예를 들면, 질소 또는 아르곤)하에 있는 멸균된 바이알에 수취하였다. 이어 이 바이알은 멸균된 격막 및 주름진 뚜껑으로 봉합한 후 실온에서 보관하였다. BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 바이알에 있는 유닛 투여량의 용매는 혈관 내 투여, 정맥 내 주입, 또는 환자 내 암과 같은 포유동물에 있는 암 내부로 직접 투여 또는 환자 내 조직과 같은 포유동물에 있는 암 절제부위 가장자리에 투여하는 것처럼 환자에 투여할 수 있다.
단위 투여량을 포함하고 있는 2개 또는 그 이상의 바이알은 각각 유사한 형태로 준비될 수 있으며, 단위 투여량은 치료가 필요한 환자에 치료적으로 유효한 투여시점에서 주사를 이용하여 주입할 수 있다. 이러한 유형에 있어서, 일련의 주입되는 단위 투여량은 환자의 조직 또는 환자의 전신에 투여할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 단위 투여량은 환자에게 하루에 한번, 또는 이틀에 한번, 또는 일주일에 한번 투여할 수 있다. 덧붙여, 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 단위 투여량은 암을 절제하기 전, 적어도 한번 이상을 전신으로 환자의 조직내 암에 투여 및/또는 수술적인 절개와 같은 암을 절제하기 전, 적어도 한번 이상을 진단학적으로 확인된 암의 가장자리에 투여, 및/또는 암을 제거하기 전, 적어도 한번 이상을 암 조직내로 직접 투여, 및/또는 암을 제거한 후 잔존하는 암의 가장자리에 직접 투여할 수 있다. 주입되는 이러한 반복 단위 투여량의 수 및 단위 투여되는 형태에 있어서의 융합 단백질의 양은, 최초의 암이 존재하에 또는 최초의 암이 제거된 후에 발생하는 2차적인 암의 증식을 예방하기 위하여 환자에 따라, 암종에 따라, 종양크기에 따라 다양하게 투여할 수 있다.
< 실시예 13> 냉동건조된 제형
이미 용해성을 띤 약학적으로 허용가능한 카르보하이드레이트(바람직하게는 약학적으로 허용가능한 비-환원성 당 또는 싸이크로덱스트린) 및/또는 약학적으로 허용가능한 완충용액염을 포함하는 약학적으로 허용가능한 등장성 액상배지에 용해된 BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물의 단위 투여량을 포함하는 용매는, 예를 들면, 0.2 ㎛ 필터로 멸균-필터링 하였고, 이 필터링된 물질은 무균된 바이알 및 동결된 상태로 보관하였고, 이때 동결액상 용매는 바이알에 융합 단백질을 포함하는 건조된 기질을 포함하기 위하여 약학적으로 허용가능한 냉동건조기의 감소된 압력하에서 무균적으로 냉동건조하였으며, 이때 상기의 바이알은 무균의 비활성 기체하에서 대기압으로 환원하고, 바이알은 예를 들면, 주름진 뚜껑과 같은 무균 덮개로 봉합하였다. 상기의 봉합된 바이알은 내용물 및 투여량을 기입하여, 융합 단백질 기질을 단위투여 형태의 용매에 재구성하기 위해 냉동건조된 융합 단백질을 포함하는 상기 바이알에 전달하기 유용한 양으로 주사하기 위한 멸균수를 포함하는 두 번째 봉합된 멸균 바이알과 함께 한 키트로 보관하였다. 또 다른 일 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 고침투성의 액상배지, 무균상태의 필터된 용매, 바이알에 채워진 필터된 물질 및 건조된 기질을 형성하기 위하여 냉동건조된 물질을 포함하는 액상 배지의 초기부피에서 용해될 수 있다. 이러한 건조된 기질은 주사하기 위해 본래의 부피보다 등장성 용액을 형성하기에 충분한 양의 부피에서 용해 및 재구성할 수 있다. 종종, 고침투성 용매는 실질적으로 희석되는 보다 많은 부피의 등장성 액상 배지를 포함하는 드립백(drip bag)으로 주입되어 투여하는데 이용될 수 있다. 추가적으로, 상기 기질을 단위 투여형태로 재구성하기에 적합한 양을 포함하는 멸균수의 부피를 포함하는 바이알은 냉동건조된 단백질과 하나의 키트로서 분류된다. 바람직하게는, 재구성된 조성물은 등장성 용매를 포함한다. 상기의 융합 단백질은 상기 실시예에서와 유사한 방법으로 이러한 제형과 함께 혈관내의 전달, 및/또는 정맥내로의 주입, 및/또는 직접적으로 암에 주입하는데 사용될 수 있다.
< 실시예 14> 폴리머 제형
BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물은 PGA 및 PLA와 혼합하여 제형화 하였다. PGA/PLA 코-폴리머는 PLA에 대한 PGA의 비율에 따라 주입 후 2-6달쯤에 분해될 수 있다. 하나의 제형으로써 PGA/PLA를 사용할 수 있으며, 0.5% 내지 50%, 바람직하게는 1.0% 내지 3.0% 농도의 비-변성 유기용매에서 용해할 수 있다. 이때 폴리머 용매는 드로다운 나이프(drawdown knife)에 분주 또는 다당류를 기반으로 하는 필름 또는 거품의 표면에 바르거나 또는 스프레이, 침적도포(dip coating), 또는 다른 유용한 방법을 이용할 수 있으며, 이어 용매의 제거를 위해 건조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 용해성 및/또는 분해가능한 폴리머를 포함하는 그물형태와 같은 복합된 그물형태는 BA-07과 같은 융합 단백질을 삽입하여 제조할 수 있으며, 그물형태가 분해됨으로써 상기 융합 단백질은 방출할 수 있게 된다. 이러한 그물형태는 암의 수술적인 절제 부위에 이식될 수 있으며, 이때 상기 융합 단백질은 어떤 잔존하는 암세포의 성장 및 전이를 예방하기 위하여 방출될 수 있다.
< 실시예 15> 제거된 암 부위를 치료하는 일반적인 방법
약학적으로 허용가능한 크림형태로 제형화된 BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물은 표피의 절제부위를 치료하는데 이용할 수 있다. 한 예로, 이러한 크림은 암의 절제부위 둘레에 있는 표피에 바름으로써 악성종양 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 크림형태의 제형은 암을 제거하기 전 표피에 바를 수 있으며, 최초의 생체검사를 하기 전과 조직학적 진단이 양성으로 나타난 중간 시점에서 암을 치료하는데 이용될 수도 있다. 이렇게 암부위에 투여된 상기의 크림은 암의 확산 및 전이를 예방할 수 있다.
< 실시예 16> 암 부위에서 발생하는 2차적인 암의 예방
BA-07과 같은 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물, 예를 들며, 상기의 액상 용매 제형 또는 고착성 피브린 또는 하이드로겔과 같은 수술용 고착젤과 같은 제형은 암의 수술적 제거부위를 치료하는데 이용될 수 있다. 한 예로, 결장암의 제거 후 건강한 결장을 치료하는데 이용할 수 있다. 암을 제거하기 전 암 주위에 있는 다른 건강한 결장조직은 암 및 이와 관련된 조직을 제거한 후, 피브린 봉합제와 같은 수술용 젤 상태인 BA-07과 같은 융합 단백질 조성물을 이용하여 치료될 수 있으며, 이는 암 제거 후 잔존하는 추가적인 손상을 예방하는데 유용할 수 있다.
< 실시예 17> 포유동물에서 임상전 효능을 평가하기 위해 사용되는 일반적인 방법
흑색종 세포주는 첫 번째 그룹의 누드마우스(Charles River Laboratories)에 피하주사로 이식되었다. 암은 첫 번째 그룹의 누드마우스에서 성장, 수취하여 개별적으로 두 번째 마우스 그룹인 다른 마우스(마우스당 한 개의 암을 가짐)에 이식하였다. 암 부피의 약 10-100 ㎍/mL에 해당되는 약학적으로 허용가능한 비히클내에 있는 BA-07과 같은 융합 단백질의 유효량을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물을 두 번째 그룹의 각각의 마우스에 매일 투여하였다. 종양 크기를 측정하였고, 암조직은 감마면역 단백질 10(IP10)과 같은 악성종양 각질 세포의 마커를 측정하는데 사용되었다. 상기의 융합 단백질을 포함하는 조성물은 두 번째 마우스에 있는 암의 성장을 예방 또는 실질적으로 억제할 수 있었다.
< 실시예 18> 유방암의 재발생을 예방하기 위해 이식된 유방 이식장치 표면에 처리된 융합 단백질을 포함하는 조성물의 용도
융합 단백질을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 약학적으로 허용가능한 유방 이식장치 표면에 코팅하였다. 암은 선택적으로 본 발명의 약학적 조성물을 동시투여(수술 전 및/또는 수술 후)함으로써 환자의 유방조직으로부터 절개되었다. 암의 절제에 의해 생산된 빈 부분은 최소한 부분적으로나마 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물로 코팅된 유방 이식기로 채워지고, 절제 및/또는 이식에 의해 생산된 상처부위는 봉합된다. 잔존하는 암 가장자리의 조직에 있는 2차적 암의 성장은 실질적으로 억제 또는 예방할 수 있다.
< 실시예 19> 융합 단백질 제조의 일반적인 방법
대표적인 융합 단백질( BA -14)의 DNA 염기서열
융합 단백질 BA -14의 뉴클레오티드 서열(서열번호 3 참조)
ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aatgcttatt ccattaatca aaaggcttat 60
tcaaatactt accaggagtt tactaatatt gatcaagcaa aagcttgggg taatgctcag 120
tataaaaagt atggactaag caaatcagaa aaagaagcta tagtatcata tactaaaagc 180
gctagtgaaa taaatggaaa gctaagacaa aataagggag ttatcaatgg atttccttca 240
aatttaataa aacaagttga acttttagat aaatctttta ataaaatgaa gacccctgaa 300
aatattatgt tatttagagg cgacgaccct gcttatttag gaacagaatt tcaaaacact 360
cttcttaatt caaatggtac aattaataaa acggcttttg aaaaggctaa agctaagttt 420
ttaaataaag atagacttga atatggatat attagtactt cattaatgaa tgtctctcaa 480
tttgcaggaa gaccaattat tacacaattt aaagtagcaa aaggctcaaa ggcaggatat 540
attgacccta ttagtgcttt tcagggacaa cttgaaatgt tgcttcctag acatagtact 600
tatcatatag acgatatgag attgtcttct gatggtaaac aaataataat tacagcaaca 660
atgatgggca cagctatcaa tcctaaagaa ttcgtgatgg aatcccgcaa acgcgcaagg 720
cagacataca cccggtacca gactctagag ctagagaagg agtttcactt caatcgctac 780
ttgacccgtc ggcgaaggat cgagatcgcc cacgccctgt gcctcacgga gcgccagata 840
aagatttggt tccagaatcg gcgcatgaag tggaagaagg agaactga 888
융합 단백질 BA -14의 단백질 서열(서열번호 4 참조)
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1 5 10 15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
20 25 30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
35 40 45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
50 55 60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65 70 75 80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
85 90 95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
115 120 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
130 135 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145 150 155 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
165 170 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
180 185 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
195 200 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
210 215 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg
225 230 235 240
Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His
245 250 255
Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala
260 265 270
Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
275 280 285
Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
290 295
본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법을 평가하기 위하여, C3 폴리펩티드의 C-말단에 첨가된 하나의 안테나페디아(antennapedia) 서열을 이용하였다. C-말단에 첨가되는 DNA 염기서열은 C3 폴리펩티드를 포함하는 펩티드의 C-말단에 적어도 하나의 아미노산이 첨가된 어떤 DNA 염기서열이 될 수 있다.
우선, pGEX2T-C3 플라스미드 DNA(N. Lamarche, McGill University)는 일반적인 방법으로 준비하였다. DNA의 3' 말단에 있는 종결코돈은 정방향 프라이머 5'-GAA TTC TTT AGG ATT GAT AGC TGT GCC-3'(서열번호 1 참조) 및 역방향 프라이머 5'-GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA-3'(서열번호 2 참조)를 이용한 PCR로 Eco RI 부위에 치환되었다. 상기의 PCR 산물은 pSTBlue-1 벡터(Novagen, Madison, Wisconsin)에 서브클로닝할 수 있으며, 이어 pGEX-4T(Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, Quebec)의 제한효소 Bam HI과 Not I 부위에 클로닝하였다. 이러한 벡터를 pGEX-4T/C3로 명명하였고, 본 발명의 융합 단백질을 준비하는 일반적인 방법으로 제공할 수 있다. pGEX-4T/C3에 있는 C3의 3' 말단에 첨가되는 유용한 안테나페디아(antennapedia) 서열(Bloch-Gallego, 120, 485-492, 1993;및 Derossi, 269, 10444-10450, 1994)은 이 서열을 포함하는 pET-3a 벡터를 주형으로 PCR에 의해 생산할 수 있으며, pSTBlue-1 블런트 벡터에 서브클로닝 한 후 pGEX-4T/BA-14를 제조하기 위하여, pGEX-4T/C3의 제한효소 Eco RI과 Sal I 부위에 클로닝하였다.
융합 단백질 BA -14의 뉴클레오티드 서열(서열번호 3 참조)
ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aatgcttatt ccattaatca aaaggcttat 60
tcaaatactt accaggagtt tactaatatt gatcaagcaa aagcttgggg taatgctcag 120
tataaaaagt atggactaag caaatcagaa aaagaagcta tagtatcata tactaaaagc 180
gctagtgaaa taaatggaaa gctaagacaa aataagggag ttatcaatgg atttccttca 240
aatttaataa aacaagttga acttttagat aaatctttta ataaaatgaa gacccctgaa 300
aatattatgt tatttagagg cgacgaccct gcttatttag gaacagaatt tcaaaacact 360
cttcttaatt caaatggtac aattaataaa acggcttttg aaaaggctaa agctaagttt 420
ttaaataaag atagacttga atatggatat attagtactt cattaatgaa tgtctctcaa 480
tttgcaggaa gaccaattat tacacaattt aaagtagcaa aaggctcaaa ggcaggatat 540
attgacccta ttagtgcttt tcagggacaa cttgaaatgt tgcttcctag acatagtact 600
tatcatatag acgatatgag attgtcttct gatggtaaac aaataataat tacagcaaca 660
atgatgggca cagctatcaa tcctaaagaa ttcgtgatgg aatcccgcaa acgcgcaagg 720
cagacataca cccggtacca gactctagag ctagagaagg agtttcactt caatcgctac 780
ttgacccgtc ggcgaaggat cgagatcgcc cacgccctgt gcctcacgga gcgccagata 840
aagatttggt tccagaatcg gcgcatgaag tggaagaagg agaactga 888
융합 단백질 BA -14의 단백질 서열(서열번호 4 참조)
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1 5 10 15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
20 25 30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
35 40 45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
50 55 60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65 70 75 80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
85 90 95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
115 120 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
130 135 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145 150 155 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
165 170 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
180 185 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
195 200 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
210 215 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg
225 230 235 240
Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His
245 250 255
Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala
260 265 270
Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
275 280 285
Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
290 295
본 발명의 융합 단백질은 박테리아 세포의 추출물 또는 안정적인 발현 비히클에 존재하는 안테나페디아(antennapedia) 유래의 전이서열을 가진 BA-05를 코딩하는 DNA 단편과 같은 융합 단백질을 코딩하는 DNA 단편의 전체 또는 일부분을 숙주세포에 형질전환, 형질도입 또는 감염시키는 재조합 기술을 이용하여 준비할 수 있다.
< 실시예 20> 융합 단백질( BA -05)의 제조
C3-유사 융합 단백질의 예로는 pGEX-4T/C3APLT(서열번호 4 참조)로 나타내었다.
본 발명에 있어서, BA-05는 C3를 코딩하는 cDNA와 융합성 19-머 펩티드를 코딩하는 cDNA를 서로 연결함으로써 제조된 단백질을 명명한 것이다.
상기 실시예 19의 방법은 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 BA-05를 제조하는데 이용될 수 있다:
pGEX -4T/ BA -05 단백질 코딩 서열(서열번호 4 참조)
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1 5 10 15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
20 25 30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
35 40 45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
50 55 60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65 70 75 80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
85 90 95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
115 120 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
130 135 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145 150 155 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
165 170 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
180 185 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
195 200 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
210 215 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg
225 230 235 240
Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His
245 250 255
Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala
260 265 270
Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
275 280 285
Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
290 295
pGEX4T/BA-14를 제조하기 위하여, C3-유사 융합 단백질은 안테나페디아(antennapedia) DNA를 pGEX4T/C3 DNA에 클로닝하는 조작방법으로 제조할 수 있다. 구조이동 돌연변이를 가진 클론을 선별하였고, 단백질은 제조 및 평가하였다. 돌연변이가 존재하더라도 배양 시험에서 양성으로 나타난 경우, 이 플라스미드 DNA는 돌연변이를 확인하기 위하여 재시퀀싱하였다. 본 발명에서는 이러한 신규의 클론을 BA-05로 명명하였다. CAAPLT의 서열을 확인하기 위하여, 양쪽 가닥을 각각 코딩하는 염기서열을 시퀀싱하였다. 이러한 클론의 염기서열은 본 발명의 실시예에 기재하였다(BA-05의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 3 참조; BA-05의 아미노산 서열, 서열번호 4 참조).
BA-05를 제조하는 유용한 또 다른 방법은 pGEX-4T/BA-14를 제조한 다음, pGEX4T-BA14 DNA에 있어서 1개의 염기쌍이 결핍되도록 정방향 5'-CCTAAAGAAT TCGTGATGAA TCCCGCAAAC GCGCA-3'(서열번호 58 참조) 및 역방향 5'-TGCGCGTTTG CGGGATTCAT CACGAATTCT TTAGG-3'(서열번호 59 참조)와 같은 2개의 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 부위-특이적인 돌연변이 유도 기술을 이용하는 것이다. QuickChange kit(Statragene, LaJolla, CA)는 뉴클레오티드의 존재하에서 상기의 프라이머로 증폭된 산물에 결핍된 서열을 삽입하는데 이용하였다. BA-05를 제조하는데 유용한 반응 조건은 95℃에서 30초, 95℃에서 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 10.5분 동안 18회 반복하였다. 이어 상기의 DNA는 제조사의 지시에 따라 제한효소 DpnI를 처리하였다. 이어, 반응의 일부분을 E.coli인 DH5alpha 또는 XL1-Blue에 형질전환시켰다. 상기 E.coli의 개별적인 클론들은 선택적인 항생제를 포함하는 아가(agar) 플레이트에서 동정하였으며, 엠피실린이 첨가된 LB 배지에서 배양하였다. 또한, DNA는 MidiPrep Kit(Qiagen)을 이용하여 분리하였다. 선별된 5개의 클론의 DNA는 시퀀싱하였으며 염기서열의 변화를 확인하였다. 단백질은 DNA로부터 발현되었으며, Lehmann et al., 1999의 방법으로 분리하였다. 이처럼 분리된 단백질은 생물학적 시스템에 있어서 Rho 길항제로 사용할 수 있다.
재조합 BA-05(서열번호 3 참조)를 제조하기 위하여, pGEX-4T/BA-05와 상응하는 cDNA를 포함하는 플라스미드를 형질전환이 가능한 E.coli인 XL-1 blue에 형질전환시켰다. 이 박테리아는 50 ㎍/ml의 엠피실린(BMC-Roche)이 첨가된 LB 배지에 접종한 후 37℃에서 1시간 동안 300 rpm으로 진탕 배양기에서 배양하였다. 재조합 단백질을 생산하기 위하여 IPTG(Gibco)를 최종농도가 0.5 mM이 되도록 첨가하였으며, 37℃에서 6시간 동안 250 rpm으로 배양하였다.
박테리아 펠렛은 250 ml의 원심분리용 튜브를 이용하여 4℃에서 6분간 7000 rpm으로 원심분리하여 수취하였다. 각 펠렛은 1 mM의 PMSF가 첨가된 10 ml의 완충용액 A(50 mM Tris, pH 7.5; 50 mM NaCl; 5 mM MgCl2, 1 mM DTT)에서 다시 현탁시켰다. 모든 현탁된 펠렛을 모은 후 4℃, 100 ml의 플라스크 비이커에 전달하였다. PMSF를 가지고 있는 잔존하는 완충용액 A을 추가적으로 상기의 시료에 첨가하였다. 상기의 박테리아 시료는 Branson Sonifier 450 프로브 분쇄기를 이용하여 20초 간격으로 6번 분쇄하였다. 박테리아 및 프로브는 분쇄하기 전 4℃에서 1분간 냉각하였다. 상층액을 분리하기 위하여, 상기의 분쇄물은 4℃에서 12분 동안 16,000 rpm으로 Sorvall SS-33 로터를 이용하여 원심분리하였다. 이 상층액은 새로운 SS-34 튜브에 옮긴 후, 4℃에서 12분 동안 16,000 rpm으로 다시 원심분리하였다. 이어, 20 ml 이상의 글루타치온-아가로즈 비드(Sigma)를 투명화된 세포분쇄물에 첨가한 후, 2-3 시간 정도 회전 플레이트에 두었다. 이 비드는 완충용액 B(150 mM NaCl과 PMSF가 없는 완충용액 A)로 4번 세척한 다음 완충용액 C(2.5 mM CaCl2를 첨가한 완충용액 B)로 2번 세척하였다. 최종 세척액으로 비드가 두꺼운 슬러리를 형성할 때까지 계속해서 세척하였다. 재조합 단백질로부터 GST 서열을 제거하기 위하여, 20 U의 트롬빈(Bovine, Plasminogen-free, Calbiochem)를 첨가하였고, 이 비드는 4℃에서 밤새도록 회전기에서 반응시켰다. 트롬빈으로 절단한 후, 비드를 비어있는 20 ml의 컬럼에 적재하였다. 약 1 ml의 앨리콧(aliquot)이 20개 정도가 되도록 PBS로 용출하여 비드를 수취하였다. 각 앨리콧(aliquot)의 0.5 ㎕ 시료를 니트로셀룰로오즈에 스팟팅(spotting)하였고, 단백질 피크를 결정하기 위하여 아미도 블랙(Amido Black)으로 염색하였다. 이어, 융합 단백질을 포함하는 앨리콧(aliquot)을 수취한 다음 100 ㎕의 p-아미노벤자미딘(p-aminobenzamidine) 아가로즈 비드(Sigma)를 첨가하여 4℃에서 45분 동안 혼합반응시켰다. 이러한 과정의 마지막 단계에서, 재조합 단백질 시료로부터 트롬빈을 제거하였다. 상기의 재조합 단백질은 비드를 제거하기 위하여 원심분리하였으며 centriprep-10 농축기(Ambion)를 이용하여 농축하였다. 이 농축된 재조합 단백질은 PD-10 컬럼(Pharmacia, Sephadex G-25M을 포함)으로 염분을 제거하였고, 0.5 ml 앨리콧을 10개 수취하였다. 도트-블랏(Dot-blot)은 상기의 앨리콧에서 단백질 피크를 결정하기 위하여 수행하였으며, 적합한 앨리콧은 수취, 필터로 정제 및 -80℃에 보관하였다. 단백질 분석(DC 분석, Biorad)은 재조합 단백질의 농도를 결정하는데 이용되었다. 시료의 순도는 SDS-PAGE에 의해 결정되었고, 생체 활성 분석은 NG-108 세포를 대상으로 실시하였다.
이러한 과정으로부터 얻은 산물은 일반적인 실시예에 기재된 BA-14와 같은 융합 단백질 또는 BA-05와 같은 BA-14 분자 또는 대조군인 C3 단백질과는 다른 Rho의 불활성 생체반응을 나타내는 분자량 및 활성을 가지며 클로닝 방법에 의해 생산가능한 신규한 융합 단백질을 포함한다. 이러한 신규한 융합 단백질은 C3 서열을 포함하며, 상기와 같은 방법으로 C 말단에서 변형이 나타날 수 있다.
< 실시예 21> 융합 단백질( BA -07)의 제조
상기 실시예 1의 방법은 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 BA-07를 제조하는데 이용될 수 있다:
Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
1 5 10 15
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
20 25 30
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
35 40 45
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
50 55 60
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65 70 75 80
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
85 90 95
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
100 105 110
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
115 120 125
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145 150 155 160
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
165 170 175
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met
180 185 190
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
195 200 205
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
210 215 220
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225 230 235 240
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
245 (서열번호 57 참조)
두 개의 PCR 프라이머를 이용하여 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있는 BA-07 단백질을 제조하기 위하여 한 종류의 재조합 산물(BA-05)을 pET-9a 벡터(Novagen, Madison, Wisconsin)에 도입할 수 있도록 구성하였으며, 이때 사용된 정방향 프라이머는 5'-ggatctggttccgcgtcatatgtctagagtcgacctg-3'(서열번호 38 참조)이며, 역방향 프라이머는 5'-cgcggatccattagttctccttcttccacttc-3'이다(서열번호 39 참조). 서열번호 39의 5' 말단에서의 Bam HI 부위는 ggatccatta이며, TGA는 TAAT로 치환되었다(서열번호 39에서는 atta).
Pfu 폴리머라제를 이용한 상기 산물을 증폭하는 조건은 95℃에서 5분, 94℃에서 2분, 56℃에서 2분, 70℃에서 2분간 10회 반복하고 다시 94℃에서 2분, 70℃에서 3분간 30회 반복한 후 4℃에서 유지하였다. QIAEXII kit(Qiagen)를 이용하여 목적 DNA를 포함하는 아가로즈 겔 조각을 분리하였다. 삽입 및 벡터는 각각 제조사(New England BioLabs, Beverly, MA)의 지시에 따라 Bam HI 및 Nde I으로 절단하여 추출하였고, 아가로즈 겔 전기영동 및 QIAEXII kit(QIAGEN)을 이용하여 분리한 후, 제조사의 지시에 따라 T4 DNA 리가제를 이용하여 함께 밤새도록 반응시켰다.
상기 연결 혼합물을 E.coli(DH5alpha 또는 바람직하게는 XL1-Blue)에 형질전환시켰고, 이 클론들은 소규모발현유도 및 SDS-PAGE을 이용하여 확인하였으며, 세포 전체 분쇄물은 항-C3 항체를 이용한 면역반응으로 분석하였다. 플라스미드 DNA는 분리 및 정제하였다. DNA 시퀀싱은, 예를 들면, 상기 클론의 전장을 시퀀싱할 수 있도록 전체 가닥을 이용한 LiCor 기술을 이용하여 수행하였다.
이러한 방법으로 제조된 최초의 산물(pET3a-BA-07, 서열번호 7 참조)은 클로닝 전략으로 인한 5' 말단에서의 작은 변화를 가지는 것을 특징으로 하는 pGEX/BA-05 산물의 이론적인 DNA 서열과 상응한다.
두 번째 산물(pET9a-BA-07)은 제조사의 지시에 따라 pET3a 벡터를 Bam HI 및
Nde I(New England BioLabs, Beverly, MA)으로 절단한 후, pET3a-BA-07로부터 준비된 삽입인자를 pET9a 벡터에 서브클로닝하여 제조할 수 있다. 또한, pET9a 벡터는 상기와 같은 제한효소로 절단할 수 있다. 상기의 삽입 DNA 및 벡터 DNA는 각각 아가로즈 겔 전기영동으로 분리하였다. 또한, 상기의 삽입인자는 T4 DNA 연결효소(New England BioLabs, Beverly, MA)를 이용하여 새로운 벡터에 연결할 수 있고, 이 연결된 DNA는 DH5alpha에 형질전환시킬 수 있으며, 이때 DNA의 분리는 QIAGEN mini 및 maxi kit를 이용하였다. 상기로부터 얻은 클론들은 제한효소를 이용한 절단 및 양방향으로 삽입인자의 DNA 시퀀싱(예를 들면, BioS&T, Lachine, Quebec에 의한)으로 특성화할 수 있다. 상기 산물의 DNA는 BL21(DE3) 세포, BL21(DE3)/pLysS 세포(Novagen, Madison, WI) 또는 다른 안정적인 발현 시스템에 형질전환시킬 수 있다.
< 실시예 22> 세포 증식을 측정하기 위한 3H- 사이미딘 흡수의 일반적인 방법
3H- 사이미딘 삽입 분석
세포주들은 실험 전에 이미 마이코플라즈마 조사를 수행하였고, 그 결과 음성 반응이 나타남을 확인하였다. 또한, 이 세포주들은 ATTC로부터 입수하였다. 세포주 HEC-1B는 10% FBS와 1% HEPES가 공급된 E-MEM 배지에서 배양하였으며, 세포주 Caco-2는 20% FBS, 1% HEPES, 1 mM sodium pyruvate 및 0.1 mM 비-필수 아미노산이 공급된 E-MEM 배지에서 배양하였다. 또한, 세포주 SK-MEL-1은 10% FBS와 1% HEPES가 공급된 McCoy's 배지에서 배양하였다.
최종 부피가 200 ㎕가 되도록 각각 100 ㎕ 부피의 2×작용용액(working solution)에 포함된 융합 단백질, 양성 대조군 및 비히클 대조군을 4×103/100 ㎕의 세포를 포함하고 있는 96-웰 플레이트에 세 세트로 분주하였고, 이를 습도가 100%이며 5% CO2를 가진 37℃ 배양기에서 배양하였다. 약 54시간 배양 후, 1.0 μCi를 포함하는 20 ㎕부피의 3H-사이미딘(ICN, Montreal, CANADA)을 각각의 웰에 첨가하였고, 이때 3H-사이미딘은 10% FBS가 공급된 RPMI-1640 배지에서 준비하였다. 이어, 세포들은 상기와 같은 조건에서 추가적으로 18시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 세포들은 자동화된 세포 수취기(Tomtec)로 수취하였고, 3H-사이미딘의 삽입된 cpm(counts per minute)은 microplate scintillation counter(TopCount NXY, Packard)로 측정하였다. BA-07 융합 단백질을 처리한 웰로부터 얻은 값은 비히클 대조군의 값과 비교하였다. 또한, 상기의 결과는 y축을 cpm(counts per minute)으로, x축을 융합 단백질의 농도로 표시하여 그래프를 작성하였다.
본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물들은 종양세포의 이동(migration), 종양세포의 증식(proliferation), 혈관신생(angiogenesis) 또는 관상구조의 형성(tubular structure formation) 또는 종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달(capillary network growth) 및 종양세포로부터의 활성 메탈로프로테 아제(metalloproteinase, MMP)의 분비과정 중 적어도 한 개 이상의 과정을 억제 또는 예방할 수 있다.
<110> BIOAXONE THERAPEUTIQUE INC. MCKERRACHER, LISA LASKO, DANA <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING TUMOR SPREADING <130> 6FPI-03-13 <150> US 10/902,879 <151> 2004-08-02 <150> US 60/506,162 <151> 2003-09-29 <160> 59 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used to remove the stop codon from ADP-ribosyl tr ansferase C3 (Clostridium botulinum) cDNA. <400> 1 gaattcttta ggattgatag ctgtgcc 27 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used to remove the stop codon from ADP-ribosyl tr ansferase C3 (Clostridium botulinum) cDNA. <400> 2 ggtggcgacc atcctccaaa a 21 <210> 3 <211> 885 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3APL: includes ADP-ribosyl transferase C3 (Clostrid ium botulinum) and Antennapedia sequence. <220> <221> CDS <222> (1)..(885) <400> 3 gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat 48 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa 96 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa 144 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata 192 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca 240 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg 288 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat 336 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att 384 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat 432 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtc tct caa 480 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 ttt gca gga aga cca att att aca caa ttt aaa gta gca aaa ggc tca 528 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa 576 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg 624 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca 672 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 gct atc aat cct aaa gaa ttc gtg atg gaa tcc cgc aaa cgc gca agg 720 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg 225 230 235 240 cag aca tac acc cgg tac cag act cta gag cta gag aag gag ttt cac 768 Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His 245 250 255 ttc aat cgc tac ttg acc cgt cgg cga agg atc gag atc gcc cac gcc 816 Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala 260 265 270 ctg tgc ctc acg gag cgc cag ata aag att tgg ttc cag aat cgg cgc 864 Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg 275 280 285 atg aag tgg aag aag gag aac 885 Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn 290 295 <210> 4 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg 225 230 235 240 Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His 245 250 255 Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala 260 265 270 Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg 275 280 285 Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn 290 295 <210> 5 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3APS: Includes ADP-ribosyl transferase C3 (Clostrid ium botulinum) and Antennapedia sequence. <220> <221> CDS <222> (1)..(771) <400> 5 gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat 48 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa 96 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa 144 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata 192 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca 240 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg 288 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat 336 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att 384 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat 432 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtc tct caa 480 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 ttt gca gga aga cca att att aca caa ttt aaa gta gca aaa ggc tca 528 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa 576 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg 624 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca 672 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 gct atc aat cct aaa gaa ttc cgc cag atc aag att tgg ttc cag aat 720 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn 225 230 235 240 cgt cgc atg aag tgg aag aag gtc gac tcg agc ggc cgc atc gtg act 768 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile Val Thr 245 250 255 gac 771 Asp <210> 6 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn 225 230 235 240 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile Val Thr 245 250 255 Asp <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the amplification of Antennapedia sequenc e <400> 7 gaatcccgca aacgcgcaag gcag 24 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the amplification of Antennapedia sequenc e <400> 8 tcagttctcc ttcttccact tcatgcg 27 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of sequences from Antennapedi a <400> 9 aattccgcca gatcaagatt tggttccaga atcgtcgcat gaagtggaag aagg 54 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of sequences from Antennapedi a <400> 10 ggcggtctag ttctaaacca agctcttagc agcgtagttc accttcttcc agct 54 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used inthe amplification of a sequence correspond ing to amino acid 27-72 of HIV-1 Tat <400> 11 gaatccaagc atccaggaag tcagcc 26 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used inthe amplification of a sequence correspond ing to amino acid 27-72 of HIV-1 Tat <400> 12 accagccacc accttctgat a 21 <210> 13 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3-TL: Includes ADP-ribosyl transferase C3 (Clostrid ium botulinum) and HIV-1 Tat sequence. <220> <221> CDS <222> (1)..(873) <400> 13 gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat 48 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa 96 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa 144 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata 192 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca 240 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg 288 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat 336 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att 384 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat 432 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtc tct caa 480 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 ttt gca gga aga cca att att aca caa ttt aaa gta gca aaa ggc tca 528 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa 576 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg 624 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca 672 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 gct atc aat cct aaa gaa ttc aag cat cca gga agt cag cct aaa act 720 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr 225 230 235 240 gct tgt acc aat tgc tat tgt aaa aag tgt tgc ttt cat tgc caa gtt 768 Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val 245 250 255 tgt ttc ata aca aaa gcc tta ggc atc tcc tat ggc agg aag cgg aga 816 Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Arg Arg 260 265 270 cag cga cga aga gct cat cag aac agt cag act cat caa gct tct cta 864 Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr His Gln Ala Ser Leu 275 280 285 tca aag cag 873 Ser Lys Gln 290 <210> 14 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr 225 230 235 240 Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val 245 250 255 Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Arg Arg 260 265 270 Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr His Gln Ala Ser Leu 275 280 285 Ser Lys Gln 290 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of sequences from HIV-1 Tat <400> 15 aattctatgg tcgtaaaaaa cgtcgtcaac gtcgtcgtg 39 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of sequences from HIV-1 Tat <400> 16 gataccagca ttttttgcag cagttgcagc agcacagct 39 <210> 17 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3-TS: Includes ADP-ribosyl transferase C3 (Clostrid ium botulinum) and HIV-1 Tat sequence. <220> <221> CDS <222> (1)..(753) <400> 17 gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat 48 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa 96 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa 144 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata 192 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca 240 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg 288 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat 336 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att 384 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat 432 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtc tct caa 480 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 ttt gca gga aga cca att att aca caa ttt aaa gta gca aaa ggc tca 528 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa 576 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg 624 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca 672 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 gct atc aat cct aaa gaa ttc tat ggt gct aaa aaa cgt cgt caa cgt 720 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Tyr Gly Ala Lys Lys Arg Arg Gln Arg 225 230 235 240 cgt cgt gtc gac tcg agc ggc ccg cat cgt gac 753 Arg Arg Val Asp Ser Ser Gly Pro His Arg Asp 245 250 <210> 18 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 18 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Tyr Gly Ala Lys Lys Arg Arg Gln Arg 225 230 235 240 Arg Arg Val Asp Ser Ser Gly Pro His Arg Asp 245 250 <210> 19 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Includes GST sequences, ADP-ribosyl transferase C3 (C. botulinum ) sequence and a random basic amino acid sequence. <220> <221> CDS <222> (1)..(1410) <400> 19 atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc 48 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg 96 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg 144 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa 192 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct gac aag cac aac 240 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa 288 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga att gca tat agt 336 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc aag cta cct gaa 384 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 atg ctg aaa atg ttc gaa gat cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat 432 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 ggt gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat 480 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 gtt gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta 528 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 gtt tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac 576 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 ttg aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc 624 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 acg ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aaa tcg gat ctg gtt ccg cgt 672 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat 720 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 225 230 235 240 caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa 768 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 245 250 255 gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa 816 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 260 265 270 tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata 864 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 275 280 285 aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca 912 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 290 295 300 aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg 960 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 305 310 315 320 aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat 1008 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 325 330 335 tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att 1056 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 340 345 350 aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat 1104 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 355 360 365 aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa 1152 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 370 375 380 ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca 1200 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 385 390 395 400 aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa 1248 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 405 410 415 atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg 1296 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 420 425 430 tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca 1344 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 435 440 445 gct atc aat cct aaa gaa ttc aga agg aaa caa aga aga aaa aga aga 1392 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg 450 455 460 ctg cag gcg gcc gca tcg 1410 Leu Gln Ala Ala Ala Ser 465 470 <210> 20 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 225 230 235 240 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 245 250 255 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 260 265 270 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 275 280 285 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 290 295 300 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 305 310 315 320 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 325 330 335 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 340 345 350 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 355 360 365 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 370 375 380 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 385 390 395 400 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 405 410 415 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 420 425 430 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 435 440 445 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg 450 455 460 Leu Gln Ala Ala Ala Ser 465 470 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Random basic amino acid sequence of C3Basic1 <400> 21 Lys Arg Arg Arg Arg Arg Pro Lys Lys Arg Arg Arg Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of a random basic amino acid sequence in C3Basic1 <400> 22 aagagaaggc gaagaagacc taagaagaga cgaagggcga agaggaga 48 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of a random basic amino acid sequence in C3Basic1 <400> 23 ttctcttccg cttcttctgg attcttctct gcttcccgct tctcctct 48 <210> 24 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3Basic1: includes ADP-ribosyl transferase C3 (Clost ridium botulinum) sequence and a sequence encoding a random basic amino acid sequence and a Histidine tag. <220> <221> CDS <222> (1)..(789) <400> 24 gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat 48 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa 96 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa 144 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata 192 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca 240 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg 288 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat 336 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att 384 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat 432 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa 480 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca 528 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa 576 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg 624 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca 672 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 gct atc aat cct aaa gaa ttc aag aga agg cga aga aga cct aag aag 720 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys Arg Arg Arg Arg Arg Pro Lys Lys 225 230 235 240 aga cga agg gcg aag agg aga cac cac cac cac cac cac gtc gac tcg 768 Arg Arg Arg Ala Lys Arg Arg His His His His His His Val Asp Ser 245 250 255 agc ggc cgc atc gtg act gac 789 Ser Gly Arg Ile Val Thr Asp 260 <210> 25 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 25 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys Arg Arg Arg Arg Arg Pro Lys Lys 225 230 235 240 Arg Arg Arg Ala Lys Arg Arg His His His His His His Val Asp Ser 245 250 255 Ser Gly Arg Ile Val Thr Asp 260 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Random amino acid sequence of C3Basic2 <400> 26 Lys Arg Arg Arg Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of a random basic amino acid sequence in C3Basic2 <400> 27 aagcgtcgac gtagaaagaa acgtagacag cgtagacgt 39 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of a random basic amino acid sequence in C3Basic2 <400> 28 ttcgcagctg catctttctt tgcatctgtc gcatctgca 39 <210> 29 <211> 780 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3Basic2: includes sequences from ADP-ribosyl-transf erase C3 (Clostridium botulinum) and a sequence encoding a random basic amino acid sequence and a histidine tag. <220> <221> CDS <222> (1)..(780) <400> 29 gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat 48 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa 96 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa 144 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata 192 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca 240 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg 288 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat 336 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att 384 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat 432 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa 480 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca 528 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa 576 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg 624 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca 672 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 gct atc aat cct aaa gaa ttc aag cgt cga cgt aga aag aaa cgt aga 720 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys Arg Arg Arg Arg Lys Lys Arg Arg 225 230 235 240 cag cgt aga cgt cac cac cac cac cac cac gtc gac tcg agc ggc cgc 768 Gln Arg Arg Arg His His His His His His Val Asp Ser Ser Gly Arg 245 250 255 atc gtg act gac 780 Ile Val Thr Asp 260 <210> 30 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 30 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys Arg Arg Arg Arg Lys Lys Arg Arg 225 230 235 240 Gln Arg Arg Arg His His His His His His Val Asp Ser Ser Gly Arg 245 250 255 Ile Val Thr Asp 260 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse HIV-1 Tat amino acid sequence of C3Basic3 <400> 31 Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg 1 5 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of a reverse HIV Tat sequence in C3Basic3 <400> 32 agaaggaaac aaagaagaaa aagaaga 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of a reverse HIV Tat sequence in C3Basic3 <400> 33 tcttcctttg tttcttcttt ttcttct 27 <210> 34 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3Basic3: includes sequences from ADP-ribosyl tranfer ase C3 (C. botulinum) and a sequence encoding a reverse HIV-1 Tat amino acid sequence and a Histidine tag <220> <221> CDS <222> (1)..(768) <400> 34 gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat 48 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa 96 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa 144 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata 192 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca 240 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg 288 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat 336 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att 384 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat 432 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa 480 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca 528 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa 576 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg 624 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca 672 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 gct atc aat cct aaa gaa ttc aga agg aaa caa aga aga aaa aga aga 720 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg 225 230 235 240 cac cac cac cac cac cac gtc gac tcg agc ggc cgc atc gtg act gac 768 His His His His His His Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile Val Thr Asp 245 250 255 <210> 35 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 35 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu 180 185 190 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg 225 230 235 240 His His His His His His Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile Val Thr Asp 245 250 255 <210> 36 <211> 884 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3APLT: includes sequences from ADP-ribosyl transfer ase C3 (Clostridium botulinum) and a sequence encoding a proline rich region. <220> <221> CDS <222> (1)..(744) <400> 36 gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat 48 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa 96 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa 144 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata 192 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca 240 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg 288 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat 336 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att 384 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat 432 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa 480 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca 528 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt gca gga caa ctt gaa 576 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu 180 185 190 atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg 624 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca 672 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 gct atc aat cct aaa gaa ttc gtg atg aat ccc gca aac gcg caa ggc 720 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly 225 230 235 240 aga cat aca ccc ggt acc aga ctc tagagc tagagaagga gtttcacttc 770 Arg His Thr Pro Gly Thr Arg Leu 245 aatcgctact tgacccgtcg gcgaaggatc gagatcgccc acgccctgtg cctcacggag 830 cgccagataa agatttggtt ccagaatcgg cgcatgaagt ggaagaagga gaac 884 <210> 37 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 37 Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn 1 5 10 15 Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln 20 25 30 Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys 35 40 45 Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met 85 90 95 Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile 115 120 125 Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp 130 135 140 Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln 145 150 155 160 Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu 180 185 190 Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu 195 200 205 Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr 210 215 220 Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly 225 230 235 240 Arg His Thr Pro Gly Thr Arg Leu 245 <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of C3APLT in pET vector <400> 38 ggatctggtt ccgcgtcata tgtctagagt cgacctg 37 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the cloning of C3APLT in pET vector <400> 39 cgcggatcca ttagttctcc ttcttccact tc 32 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the sequencing of C3APLT <400> 40 aaattaatac gactcactat aggg 24 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used in the sequencing of C3APLT <400> 41 gctagttatt gctcagcgg 19 <210> 42 <211> 885 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3APLT in a pET vector: includes sequences from ADP -ribosyl transferase C3 (Clostridium botulinum) and a sequence en coding a proline rich region. <220> <221> CDS <222> (1)..(741) <400> 42 atg tct aga gtc gca ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat caa 48 Met Ser Arg Val Ala Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln 1 5 10 15 aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa gca 96 Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala 20 25 30 aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa tca 144 Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser 35 40 45 gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata aat 192 Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn 50 55 60 gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca aat 240 Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn 65 70 75 80 tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg aag 288 Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys 85 90 95 acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat tta 336 Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu 100 105 110 gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att aat 384 Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn 115 120 125 aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat aga 432 Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg 130 135 140 ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa ttt 480 Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe 145 150 155 160 gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca aag 528 Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys 165 170 175 gca gga tat att gac cct att agt gct ttt gca gga caa ctt gaa atg 576 Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met 180 185 190 ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg tct 624 Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser 195 200 205 tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca gct 672 Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala 210 215 220 atc aat cct aaa gaa ttc gtg atg aat ccc gca aac gcg caa ggc aga 720 Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg 225 230 235 240 cat aca ccc ggt acc aga ctc tagagctag agaaggagtt tcacttcaat 770 His Thr Pro Gly Thr Arg Leu 245 cgctacttga cccgtcggcg aaggatcgag atcgcccacg ccctgtgcct cacggagcgc 830 cagataaaga tttggttcca gaatcggcgc atgaagtgga agaaggagga ctaac 885 <210> 43 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 43 Met Ser Arg Val Ala Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln 1 5 10 15 Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala 20 25 30 Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn 50 55 60 Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn 65 70 75 80 Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys 85 90 95 Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu 100 105 110 Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn 115 120 125 Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe 145 150 155 160 Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys 165 170 175 Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met 180 185 190 Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala 210 215 220 Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg 225 230 235 240 His Thr Pro Gly Thr Arg Leu 245 <210> 44 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Antennapedia from C3APL <400> 44 Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln 35 40 45 Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn 50 55 60 <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Antennapedia from C3APS <400> 45 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Val Asp Ser <210> 46 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HIV-1 Tat from C3-TL <400> 46 Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys 1 5 10 15 Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu 20 25 30 Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln 35 40 45 Asn Ser Gln Thr His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln 50 55 60 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HIV-1 Tat from C3-TS <400> 47 Tyr Gly Ala Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Asp Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro His Arg Asp 20 <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the proline rich region of C3APLT <400> 48 Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg His Thr Pro Gly Thr Arg 1 5 10 15 Leu <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence fused to C3 protein to created C3 Tat-short <400> 49 Tyr Gly Arg Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse sequence of Tat amino acids fused to C3 protein to created C3Basic3 <400> 50 Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transport peptide rich in Proline <400> 51 Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 52 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sperm fertiline alpha peptide <400> 52 His Pro Ile Gln Ile Ala Ala Phe Leu Ala Arg Ile Pro Pro Ile Ser 1 5 10 15 Ser Ile Gly Thr Cys Ile Leu Lys 20 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence from the C3Basic3 <400> 53 Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg 1 5 <210> 54 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of C3-07Q189A <400> 54 atgtctagag tcgacctgca ggcatgcaat gcttattcca ttaatcaaaa ggcttattca 60 aatacttacc aggagtttac taatattgat caagcaaaag cttggggtaa tgctcagtat 120 aaaaagtatg gactaagcaa atcagaaaaa gaagctatag tatcatatac taaaagcgct 180 agtgaaataa atggaaagct aagacaaaat aagggagtta tcaatggatt tccttcaaat 240 ttaataaaac aagttgaact tttagataaa tcttttaata aaatgaagac ccctgaaaat 300 attatgttat ttagaggcga cgaccctgct tatttaggaa cagaatttca aaacactctt 360 cttaattcaa atggtacaat taataaaacg gcttttgaaa aggctaaagc taagttttta 420 aataaagata gacttgaata tggatatatt agtacttcat taatgaatgt ttctcaattt 480 gcaggaagac caattattac aaaatttaaa gtagcaaaag gctcaaaggc aggatatatt 540 gaccctatta gtgcttttgc aggagcactt gaaatgttgc ttcctagaca tagtacttat 600 catatagacg atatgagatt gtcttctgat ggtaaacaaa taataattac agcaacaatg 660 atgggcacag ctatcaatcc taaagaattc gtgatgaatc ccgcaaacgc gcaaggcaga 720 catacacccg gtaccagact ctag 744 <210> 55 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of C3-07Q189A <400> 55 Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln 1 5 10 15 Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala 20 25 30 Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn 50 55 60 Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn 65 70 75 80 Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys 85 90 95 Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu 100 105 110 Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn 115 120 125 Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe 145 150 155 160 Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys 165 170 175 Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Ala Leu Glu Met 180 185 190 Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala 210 215 220 Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg 225 230 235 240 His Thr Pro Gly Thr Arg Leu 245 <210> 56 <211> 783 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of BA-05 <400> 56 ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aatgcttatt ccattaatca aaaggcttat 60 tcaaatactt accaggagtt tactaatatt gatcaagcaa aagcttgggg taatgctcag 120 tataaaaagt atggactaag caaatcagaa aaagaagcta tagtatcata tactaaaagc 180 gctagtgaaa taaatggaaa gctaagacaa aataagggag ttatcaatgg atttccttca 240 aatttaataa aacaagttga acttttagat aaatctttta ataaaatgaa gacccctgaa 300 aatattatgt tatttagagg cgacgaccct gcttatttag gaacagaatt tcaaaacact 360 cttcttaatt caaatggtac aattaataaa acggcttttg aaaaggctaa agctaagttt 420 ttaaataaag atagacttga atatggatat attagtactt cattaatgaa tgtttctcaa 480 tttgcaggaa gaccaattat tacaaaattt aaagtagcaa aaggctcaaa ggcaggatat 540 attgacccta ttagtgcttt tgcaggacaa cttgaaatgt tgcttcctag acatagtact 600 tatcatatag acgatatgag attgtcttct gatggtaaac aaataataat tacagcaaca 660 atgatgggca cagctatcaa tcctaaagaa ttcgtgatga atcccgcaaa cgcgcaaggc 720 agacatacac ccggtaccag actctagagc tagagaagga gtttcacttc aatcgctact 780 tga 783 <210> 57 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of pET9a-BA-07 <400> 57 Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln 1 5 10 15 Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala 20 25 30 Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn 50 55 60 Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn 65 70 75 80 Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys 85 90 95 Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu 100 105 110 Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn 115 120 125 Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe 145 150 155 160 Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys 165 170 175 Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met 180 185 190 Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala 210 215 220 Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg 225 230 235 240 His Thr Pro Gly Thr Arg Leu 245 <210> 58 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 cctaaagaat tcgtgatgaa tcccgcaaac gcgca 35 <210> 59 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 tgcgcgtttg cgggattcat cacgaattct ttagg 35

Claims (85)

  1. 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 암전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방하는 방법.
  2. 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 암 적출부위에 인접한 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방하는 방법에 있어서, 상기 투여는 암 절제 경계부위 표면, 절제 경계부위 표면 하부 또는 암 절제 후 근처에 잔존하는 조직내로 직접 투여하는 것을 특징으로 하며, 상기 투여시기는 암 적출 또는 제거 전과 후에 투여하거나 암 절제 또는 제거 전 또는 후에 일정한 간격으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 숙주조직에서의 악성종양세포로부터 종양의 성장을 예방하는 방법에 있어서, 상기 융합 단백질은 악성종양세포의 이동, 악성종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 악성종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 악성종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 최초의 암 적출 또는 제거부위에 인접한 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 암세포를 포함하는 2차 암의 증식을 예방하는 방법에 있어서, 상기 투여시기는 최초의 암 적출 또는 제거 전 또는 후에 투여하거나 암 적출 또는 제거 전과 후에 일정한 간격으로 투여하는 것을 특징으로 하며, 상기 융합 단백질은 잔존하는 종양세포의 이동, 잔존하는 종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 잔존하는 종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 잔존하는 종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질 접합체는 BA-05를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 암은 유방암, 뇌종양, 결장암, 피부암, 신장암 및 간암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 암은 신경교종, 뇌종양, 송과선종, 수막종, 신경초 종, 림프종, 기형암 및 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 위장암으로부터 유래된 뇌부위에 위치한 전이암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뇌종양을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 암은 역형성 성상세포종(anaplastic astrocytoma), 다형성교아종(glioblastoma multiform), 털모양 성상세포종(pilocytic astrocytoma), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 상의세포종(ependymoma), 점액유두상 상의세포종(myxopapillary ependymoma), 상의하세포종(subependymoma), 맥락총 유두종(choroid plexus papilloma), 신경아세포종(neuroblastoma), 신경절모세포종(ganglioneuroblastoma), 신경절신경종(ganglioneuroma), 수아세포종(medulloblastoma), 송과체모세포종(pineoblastoma) 및 송과체종양(pineocytoma), 수막종(meningioma), 뇌막혈관주위세포종(meningeal hemangiopericytoma), 뇌막육종(meningeal sarcoma), 신경초종(Schwannoma 또는 neurolemmoma) 및 신경섬유종(neurofibroma), 호지킨스 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨스 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 아류형(subtype), 비-호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 아류형(subtype), 두개인두종(craniopharyngioma), 유표피낭(epidermoid cysts), 유피낭(dermoid cysts) 및 교질낭(colloid cysts)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뇌종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 조직 cc당 약 0.001 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 상기 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 조직 cc당 약 0.0001 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 상기 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 ml당 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 상기 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기의 투여는 주사, 국소 투여 또는 이식에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 투여는 관절강내(intrarticular), 안구내(intraocular), 비내(intranasal), 신경내(intraneural), 피부내(intradermal), 골내(intraosteal), 혀밑(sublingual), 구강(oral), 국소부위(topical), 방광내 (intravesical), 뇌척수강내(intrathecal), 혈관내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 두개골내(intracranial), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 흡입(inhalation), 원자화(atomization) 및 흡입, 암에 직접 투여, 환부에 직접 투여, 암 적출 후 잔존하는 경계부위 또는 경계부위 하부에 직접 투여, 경장(eternal), 위시경 절차와 함께 이용하는 경장 및 ECRP로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위는 약 5개 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기의 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛은 융합 단백질 BA-05의 서열로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기의 기능적으로 유사한 그 유사체는 자연형 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제의 50% 내지 500% 범위의 활성을 가지는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate), PVA], 부분적으로 가수분해된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트-코-비닐 알코올)[poly(ethylene-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)], 가교된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 가교되며 부분적으로 가수분해된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 가교된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트-코-비닐 알콜)[poly(ethylene-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)], 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락트산, 폴리글리콜릭산(ployglycolic acid, PGA), 락트산과 글리콜릭산의 코폴리머, 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리발레롤락톤(polyvalerolactone), 폴리(엔하이드라이드)(polyanhydrides), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 폴리카프롤락톤의 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리락트산의 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 그들의 조합 및 혼합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 액상 젤라틴, 액상 단백질, 폴리머 담체, 가교제 및 그들의 혼합물을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 기질을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 멸균수, 완충식염수, 완충액, 항산화제, 아스코르브산(ascorbic acid), 적어도 1개 이상의 저분자량을 가진 폴리펩티드, 약 2개 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 적어도 1개 이상의 단백질, 적어도 1개 이상의 아미노산, 사람의 필수아미노산, 적어도 1개 이상의 카르보하이드레이트(carbohydrate), 적어도 1개 이상의 카르보하이드레이트에서 유래된 물질, 비-환원당, 글루코스, 소르비톨(sorbitol), 트레할로스(trehalose), 마니톨(mannitol), 말토덱스트린(maltodextrin), 덱스트린(dextrin), 싸이클로덱스트린(cyclodextrin), 킬레이팅 시약(chelating agent), EDTA, DTPA, 2가 금속이온을 제거하는 킬레이팅 시약, 3가 금속이온을 제거하는 킬 레이팅 시약, 글루타치온(glutathione), 비특이적 항체 알부민 및 그들의 화합물을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 멸균상태인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 멸균가능한 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 멸균화된 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 하나의 바이알에 일 단위 투여용량이 함유되거나 일 단위 투여용량의 정수배가 함유되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 건조된 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 탈수화된 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 냉동건조된 기질의 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 포유동물의 암전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동의 억제 또는 예방을 위한 약물의 제조를 위한 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도.
  31. 포유동물의 암 적출부위 근처에 있는 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도.
  32. 포유동물의 숙주조직에 존재하는 종양세포로부터 형성된 암의 성장을 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도(이때, 상기 융합 단백질은 악성종양세포의 이동, 악성종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 악성종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 악성종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 한다).
  33. 최초의 암 적출 또는 제거부위 근처에 있는 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 암세포를 포함하는 2차 암의 증식을 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도(이때, 상기 융합 단백질은 종양세포의 이동, 종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 한다).
  34. 제 30항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질 접합체는 BA-05인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  35. 제 30항, 제 31항 및 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 뇌종양, 결장암, 피부암, 신장암 및 간암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 암은 신경교종, 뇌종양, 송과선종, 수막종, 신경초종, 림프종, 기형암 및 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 위장암으로부터 유래된 뇌부위에 위치한 전이암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뇌종양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  37. 제 35항에 있어서, 상기의 암은 역형성 성상세포종(anaplastic astrocytoma), 다형성교아종(glioblastoma multiform), 털모양 성상세포종(pilocytic astrocytoma), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 상의세포종(ependymoma), 점액유두상 상의세포종(myxopapillary ependymoma), 상의하세포종(subependymoma), 맥락총 유두종(choroid plexus papilloma), 신경아세포종(neuroblastoma), 신경절모세포종(ganglioneuroblastoma), 신경절신경종(ganglioneuroma), 수아세포종(medulloblastoma), 송과체모세포종(pineoblastoma) 및 송과체종양(pineocytoma), 수막종(meningioma), 뇌막혈관주위세포종(meningeal hemangiopericytoma), 뇌막육종(meningeal sarcoma), 신경초종(Schwannoma 또는 neurolemmoma) 및 신경섬유종(neurofibroma), 호지킨스 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨스 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 아류형(subtype), 비-호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 아류형(subtype), 두개인두종(craniopharyngioma), 유표피낭(epidermoid cysts), 유피낭(dermoid cysts) 및 교질낭(colloid cysts)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뇌종양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  38. 제 30항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 조직 cc당 약 0.001 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 일 투여용량으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  39. 제 30항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 조직 cc당 약 0.0001 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 융합 단백질을 일 투여용량으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  40. 제 30항 내지 제 37항 중 어느 한 항을 포함하는, 상기 약학적 조성물은 ml당 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 일 투여용량으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  41. 제 30항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사, 국소 투여 또는 이식을 위하여 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  42. 제 1항 및 제 30항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 관절강내(intrarticular), 안구내(intraocular), 비내(intranasal), 신경내(intraneural), 피부내(intradermal), 골내(intraosteal), 혀밑(sublingual), 구강(oral), 국소부위(topical), 방광내(intravesical), 뇌척수강내(intrathecal), 혈관내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 두개골내(intracranial), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 흡입(inhalation), 원자화(atomization) 및 흡입, 암에 직접 투여, 환부에 직접 투여, 암 적출 후 잔존하는 경계부위 또는 경계부위 하부에 직접 투여, 경장(eternal), 위시경 절차와 함께 이용하는 경장 및 ECRP로 구성된 그룹으로부터 선택되는 투여형태를 위해 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  43. 제 30항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 폴리펩티드성 세포- 막 수송부위는 약 5개 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  44. 제 30항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛은 융합 단백질 BA-05의 서열로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  45. 제 30항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 기능적으로 유사한 그 유사체는 자연형 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제의 50% 내지 500% 범위의 활성을 가지는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  46. 제 30항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  47. 제 46항에 있어서, 상기의 약학적으로 허용 가능한 담체는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate), PVA], 부분적으로 가수분해된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트-코-비닐 알코올)[poly(ethylene-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)], 가교된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 가교되며 부분적으로 가수분해된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 가교된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트-코-비닐 알콜)[poly(ethylene-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)], 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락트산, 폴리글리콜릭산(ployglycolic acid, PGA), 락트산과 글리콜릭산의 코폴리머, 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리발레롤락톤(polyvalerolactone), 폴리(엔하이드라이드)(polyanhydrides), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 폴리카프롤락톤의 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리락트산의 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 그들의 조합 및 혼합으로 구성된 그룹으로부터 선별되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  48. 제 46항에 있어서, 상기의 약학적으로 허용 가능한 담체는 액상 젤라틴, 액상 단백질, 폴리머 담체, 가교제 및 그들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  49. 제 46항에 있어서, 상기의 약학적으로 허용 가능한 담체는 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  50. 제 46항에 있어서, 상기의 약학적으로 허용 가능한 담체는 약학적으로 허용 가능한 멸균수, 완충식염수, 완충액, 항산화제, 아스코르브산(ascorbic acid), 적어도 1개 이상의 저분자량을 가진 폴리펩티드, 약 2개 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 적어도 1개 이상의 단백질, 적어도 1개 이상의 아미노산, 사람의 필수아미노산, 적어도 1개 이상의 카르보하이드레이트(carbohydrate), 적어도 1개 이상의 카르보하이드레이트에서 유래된 물질, 비-환원당, 글루코스, 소르비톨(sorbitol), 트레할로스(trehalose), 마니톨(mannitol), 말토덱스트린(maltodextrin), 덱스트린(dextrin), 싸이클로덱스트린(cyclodextrin), 킬레이팅 시약(chelating agent), EDTA, DTPA, 2가 금속이온을 제거하는 킬레이팅 시약, 3가 금속이온을 제거하는 킬레이팅 시약, 글루타치온(glutathione), 비특이적 항체 알부민 및 그들의 화합물을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  51. 제 30항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 멸균 상태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  52. 제 30항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 멸균가능한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  53. 제 30항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 멸균화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  54. 제 30항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 하나의 바이알에 일 단위 투여용량이 함유되거나 일 단위 투여용량의 정수배가 함유되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  55. 제 30항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 건조된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  56. 제 30항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 탈수화된 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  57. 제 30항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 냉동건조된 기질의 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  58. 포유동물의 암전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방할 수 있는 약물의 제조를 위한 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도.
  59. 포유동물의 암 적출부위 근처에 있는 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 전이성 신생종양세포의 비정상적인 증식 및 확산 또는 이동을 억제 또는 예방할 수 있는 약물의 제조를 위한 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유 닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도.
  60. 포유동물의 숙주조직에 존재하는 종양세포로부터 형성된 암의 성장을 예방할 수 있는 약물의 제조를 위한 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도(이때, 상기 융합 단백질은 악성종양세포의 이동, 악성종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 악성종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 악성종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 한다).
  61. 최초의 암 적출 또는 제거부위 근처에 있는 숙주조직의 절제 경계부위에 잔존하는 암세포를 포함하는 2차 암의 증식을 예방할 수 있는 약물의 제조를 위한 폴리펩티드성 세포-막 수송부위(polypeptidic cell-membrane transport moiety) 및 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛(Clostridium botulinum C3 exotransferase unit) 또는 기능적으로 그와 유사한 유사체를 포함하는, 세포-투과성 융합 단백질 접합체(cell-permeable fusion protein conjugate)를 포함하는 약학적 조성물의 용도(이때, 상기 융합 단백질은 종양세포의 이동, 종양세포의 증식, 혈관신생 또는 관상구조의 형성 또는 종양세포 근처에서의 모세혈관 네트워크의 발달 및 종양세포로부터의 활성 메탈로프로테아제(metalloproteinase)의 분비 중 적어도 두 개를 동시에 억제 또는 예방하는 것을 특징으로 한다).
  62. 제 58항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질 접합체는 BA-05인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  63. 제 58항, 제 59항 또는 제 61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 뇌종양, 결장암, 피부암, 신장암 및 간암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  64. 제 63항에 있어서, 상기 암은 신경교종, 뇌종양, 송과선종, 수막종, 신경초종, 림프종, 기형암 및 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 위장암으로부터 유래된 뇌부위에 위치한 전이암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뇌종양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  65. 제 63항에 있어서, 상기의 암은 역형성 성상세포종(anaplastic astrocytoma), 다형성교아종(glioblastoma multiform), 털모양 성상세포종(pilocytic astrocytoma), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 상의세포종(ependymoma), 점액유두상 상의세포종(myxopapillary ependymoma), 상의하세포종(subependymoma), 맥락총 유두종(choroid plexus papilloma), 신경아세포종(neuroblastoma), 신경절모세포종(ganglioneuroblastoma), 신경절신경종(ganglioneuroma), 수아세포종(medulloblastoma), 송과체모세포종(pineoblastoma) 및 송과체종양(pineocytoma), 수막종(meningioma), 뇌막혈관주위세포종(meningeal hemangiopericytoma), 뇌막육종(meningeal sarcoma), 신경초종(Schwannoma 또는 neurolemmoma) 및 신경섬유종(neurofibroma), 호지킨스 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨스 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 아류형(subtype), 비-호지킨스 림프종의 1차 및 2차적 아류형(subtype), 두개인두종(craniopharyngioma), 유표피낭(epidermoid cysts), 유피낭(dermoid cysts) 및 교질낭(colloid cysts)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뇌종양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  66. 제 58항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 조직 cc당 약 0.001 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 일 투여용량으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  67. 제 58항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 조직 cc당 약 0.0001 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 융합 단백질을 일 투여용량으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  68. 제 58항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 ml당 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 일 투여용량으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  69. 제 58항 내지 제 68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사, 국소 투여 또는 이식을 위하여 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  70. 제 1항 및 제 58항 내지 제 68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 관절강내(intrarticular), 안구내(intraocular), 비내(intranasal), 신경내(intraneural), 피부내(intradermal), 골내(intraosteal), 혀밑(sublingual), 구강(oral), 국소부위(topical), 방광내(intravesical), 뇌척수강내(intrathecal), 혈관내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 두개골내(intracranial), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 흡입(inhalation), 원자화(atomization) 및 흡입, 암에 직접 투여, 환부에 직접 투여, 암 적출 후 잔존하는 경계부위 또는 경계부위 하부에 직접 투여, 경장(eternal), 위시경 절차와 함께 이용하는 경장 및 ECRP로 구성된 그룹으로부터 선택되는 투여형태를 위해 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  71. 제 58항 내지 제 70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 폴리펩티드성 세포-막 수송부위는 약 5개 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  72. 제 58항 내지 제 71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제 유닛은 융합 단백질 BA-05의 서열로 구성된 아미노산 서 열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  73. 제 58항 내지 제 72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 기능적으로 유사한 그 유사체는 자연형 클로스트리디움 보튤리넘 C3 엑소트랜스퍼라제의 50% 내지 500% 범위의 활성을 가지는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  74. 제 58항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  75. 제 74항에 있어서, 상기의 약학적으로 허용 가능한 담체는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate), PVA], 부분적으로 가수분해된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트-코-비닐 알코올)[poly(ethylene-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)], 가교된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 가교되며 부분적으로 가수분해된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트 )[poly(ethylene-co-vinyl acetate)], 가교된 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트-코-비닐 알콜)[poly(ethylene-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)], 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락트산, 폴리글리콜릭산(ployglycolic acid, PGA), 락트산과 글리콜릭산의 코폴리머, 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리발레롤락톤(polyvalerolactone), 폴리(엔하이드라이드)(polyanhydrides), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 폴리카프롤락톤의 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리락트산의 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 그들의 조합 및 혼합으로 구성된 그룹으로부터 선별되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  76. 제 74항에 있어서, 상기의 약학적으로 허용 가능한 담체는 액상 젤라틴, 액상 단백질, 폴리머 담체, 가교제 및 그들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  77. 제 74항에 있어서, 상기의 약학적으로 허용 가능한 담체는 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  78. 제 74항에 있어서, 상기의 약학적으로 허용 가능한 담체는 약학적으로 허용 가능한 멸균수, 완충식염수, 완충액, 항산화제, 아스코르브산(ascorbic acid), 적어도 1개 이상의 저분자량을 가진 폴리펩티드, 약 2개 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 적어도 1개 이상의 단백질, 적어도 1개 이상의 아미노산, 사람의 필수아미노산, 적어도 1개 이상의 카르보하이드레이트(carbohydrate), 적어도 1개 이상의 카르보하이드레이트에서 유래된 물질, 비-환원당, 글루코스, 소르비톨(sorbitol), 트레할로스(trehalose), 마니톨(mannitol), 말토덱스트린(maltodextrin), 덱스트린(dextrin), 싸이클로덱스트린(cyclodextrin), 킬레이팅 시약(chelating agent), EDTA, DTPA, 2가 금속이온을 제거하는 킬레이팅 시약, 3가 금속이온을 제거하는 킬레이팅 시약, 글루타치온(glutathione), 비특이적 항체 알부민 및 그들의 화합물을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  79. 제 58항 내지 제 78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 멸균상태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  80. 제 58항 내지 제 78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 멸균가능한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  81. 제 58항 내지 제 78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 멸균화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  82. 제 58항 내지 제 81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 하나의 바이알에 일 단위 투여용량이 함유되거나 일 단위 투여용량의 정수배가 함유되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  83. 제 58항 내지 제 82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 건조된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  84. 제 58항 내지 제 82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 탈수화된 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
  85. 제 30항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 약학적 조성물은 냉동건조된 기질의 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용 도.
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